Αφηρημένο

Η κυκλίνη D1 ρυθμίζει την εξέλιξη του G1. μεταγραφική ρύθμιση του είναι καλά κατανοητή. Ωστόσο, ο μηχανισμός υποκείμενη κυκλίνης D1 ουβικιτινίωση και την επακόλουθη αποδόμηση της δεν είναι ακόμη σαφής. Αναφέρουμε ότι η κυκλίνη D1 υποβάλλεται σε αυξημένη αποικοδόμηση στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της φάσης S σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων. Αυτό προκαλείται από φωσφορυλίωση στη Thr286 μέσω της δραστηριότητας του Ras /Raf /MEK /ERK καταρράκτη και την πρωτεΐνη F-box FBXW8, η οποία είναι μια Ε3 λιγάση. Η πλειοψηφία των FBXW8 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της G1 και S φάση. Σε αντίθεση, η κυκλίνη D1 συσσωρεύεται στον πυρήνα κατά τη διάρκεια της φάσης G1 και εξέρχεται μέσα στο κυτταρόπλασμα στη φάση S. Αυξημένη αποικοδόμηση κυκλίνης D1 συνδέεται με την σύνδεση με FBXW8 στο κυτταρόπλασμα, και αυξημένη φωσφορυλίωση της D1 κυκλίνης μέσω συνεχών 2 σηματοδότηση /ERK1. Η εξάντληση των FBXW8 προκάλεσε σημαντική συσσώρευση της κυκλίνης D1, καθώς και παγίδευση του CDK1 στο κυτταρόπλασμα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια σοβαρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να διασωθούν με συστατική πυρηνική έκφραση της κυκλίνης D1-T286A. Έτσι, FBXW8 παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω πρωτεόλυση της κυκλίνης D1. Μπορεί να παρουσιάσει νέες ευκαιρίες για την ανάπτυξη θεραπειών που στοχεύουν την καταστροφή της κυκλίνης D1 ή ρυθμιστή της Ε3 λιγκάσης επιλεκτικά

Παράθεση:. Okabe Η Lee SH, Phuchareon J, ΓΔ Albertson, McCormick F, Tetsu O (2006) Κριτική ρόλο για FBXW8 και ΜΑΡΚ στην κυκλίνης D1 Υποβάθμιση και Cancer Cell διάδοσης. PLoS ONE 1 (1): Ε128. doi: 10.1371 /journal.pone.0000128

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Τμήμα Βιοχημείας, Κίνα

Ελήφθη: 7 Νοεμβρίου του 2006? Αποδεκτές: 23 Νοεμβρίου του 2006? Δημοσιεύθηκε: 27 Δεκ 2006

Copyright: © 2006 Okabe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία, το Ίδρυμα ανησυχίας, η Daiichi Pharmaceuticals, η Επιτροπή κατανομής Έρευνας-αξιολόγησης UCSF, και το V Ίδρυμα να ΟΤ, τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R01 CA101359) να DGA, και το Ίδρυμα Ξύλο σε FM

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κυκλίνη D1 ρυθμίζει την εξέλιξη του G1 στα καρκινικά κύτταρα και υπερεκφράζεται σε διάφορους κακοήθεις νεοπλασίες [1 ]. Ως αποτέλεσμα, είναι ένας πιθανός στόχος για τον καρκίνο θεραπευτικά [2]. Η μεταγραφική ρύθμιση της κυκλίνης D1 έχει μελετηθεί εκτενώς και είναι καλά κατανοητή [3] – [5]. Είναι διεγείρεται όταν, για παράδειγμα, διάφορα μιτογόνα σήματα ενεργοποιούν τον καταρράκτη Ras /Raf /MEK /ERK (ΜΑΡΚ). Μετά τη σύνθεση μετά την ενεργοποίηση καταρράκτη ΜΑΡΚ, η κυκλίνη D1 συνδέεται με CDK4 /6, ρ21 Cip1 ή ρ27 Kip1 [6], [7].

Σε αντίθεση, ο μηχανισμός της κυκλίνης D1 ουβικιτινίωση και επακόλουθη υποβάθμιση του δεν ήταν πλήρως χαρακτηριστεί. Είναι γνωστό ότι η κυκλίνη D1 είναι polyubiquitinated και στη συνέχεια αποδομούνται μέσω της οδού πρωτεασώματος 26S. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τη φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε θρεονίνη (Thr) -286, το οποίο βρίσκεται κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο της [8]. Η κυκλίνη D1 μεταλλαγμένο T286A είναι ανθεκτικό σε ουβικουϊτινίωση

in vitro

και

in vivo

και είναι μια πολύ σταθερή πρωτεΐνη. Η κινάση συνθετάσης γλυκογόνου-3β (ΟδΚ3β) μπορεί να φωσφορυλιώσει κυκλίνη D1 σε Thr286, προώθηση της πυρηνικής-to-κυτταροπλασματική ανακατανομή της κυκλίνης D1 [9], [10]. Ωστόσο, ο ρόλος της ΟδΚ3β σε κυκλίνης D1 φωσφορυλίωση και σταθερότητα της έχουν αμφισβητηθεί πρόσφατα [11], [12], και ρ38 SAPK2 έχει εμπλακεί στην αποδόμηση του πρωτεασώματος της κυκλίνης D1 εξής οσμωτικό σοκ [13].

έχουμε προσπαθήσει να εντοπίσει την κινάση υπεύθυνη για φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε Thr286. Η εργασία μας δείχνει ότι η κυκλίνη D1 αποσταθεροποιείται ειδικά κατά τη διάρκεια της φάσης S σε καρκινικά κύτταρα και ότι η αύξηση της αποδόμησης διαμεσολαβείται με φωσφορυλίωση στη Thr286 μέσω της δραστηριότητας του /Raf /MEK /ΜΑΡΚ καταρράκτη σηματοδότησης Ras.

Ο ουβικιτίνης πρωτεΐνη λιγάση απαραίτητο για την αποικοδόμηση της κυκλίνης D1 δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί. Μια πρωτεΐνη F-box, SKP2, έχει προταθεί [14], [15]. Ωστόσο, SKP2 μεσολάβηση ρύθμιση της κυκλίνης D1 μπορεί να είναι, περιστροφικά ή κυτταρική γραμμή εξαρτώμενη, και μπορεί να είναι έμμεση [7]. Επιπλέον, η κυκλίνη D1 δεν συσσωρεύεται σε κύτταρα SKP2 knockout ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) [16], [17].

Ο σχηματισμός συζυγών πολυουβικιτίνης-πρωτεΐνη είναι καλά κατανοητός [18]. Τρία στοιχεία συμμετέχουν σε διαδοχικές αντιδράσεις μεταφοράς ουβικιτίνης:. Ε1, ένα ένζυμο ενεργοποίησης, E2 /Ubc, ένα ένζυμο ουβικιτίνης-σύζευξη, και Ε3, μία πρωτεΐνη λιγάση, η οποία αποδίδει ουβικιτίνης σε ένα υπόλειμμα λυσίνης σε μια πρωτεΐνη στόχο

Το καλύτερο που χαρακτηρίζεται από αυτά τα ένζυμα είναι οι λιγάσες ουβικιτίνης SCF Ε3, οι οποίες ρυθμίζουν ουβικιτινίωση του υποστρώματος σε ένα φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο [19] – [21]. Αυτές οι λιγάσες αποτελούν μια ιδιαίτερα ποικιλόμορφη οικογένεια συγκροτημάτων που ονομάζεται για τα συστατικά τους, S-φάσης κινάση πρωτεΐνης που συνδέεται με 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /CDC53), πρωτεΐνες F-box, και RBX1 /ROC1. SKP1 είναι ένα κρίσιμο υπομονάδα προσαρμογέα και επιλεκτικά αλληλεπιδρά με μια πρωτεΐνη ικρίωμα, είτε CUL1 ή Cullin 7 (CUL7), για την προώθηση της ουμπικουιτίνωση στοχευμένων υποστρώματα [22], [23]. Σύνδεσμος CUL7 με SKP1 εξαρτάται FBXW8 και σχηματίζει μια ειδική SCF-σαν σύμπλοκο [22], [23]. Η μελέτη μας δείχνει ότι η πρωτεΐνη F-box FBXW8 αναγνωρίζει ειδικά το D1 κυκλίνης σε ένα φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο και ρυθμίζει τη σταθερότητα του μέσω του μονοπατιού ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος.

Αποτελέσματα

Η κυκλίνη D1 πρωτεΐνη αποσταθεροποιηθεί ειδικά στη φάση S σε καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός και η σημασία της κυκλίνης D1 πρωτεόλυση, αξιολογήσαμε πρώτα το προφίλ έκφρασης της κυκλίνης D1 κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου από αδράνειας σε τρεις κανονικές κυτταρικές γραμμές (ΝΙΗ 3Τ3 & amp? WI -38 ινοβλάστες, και CCD841 con κύτταρα επιθηλίου κόλου) και σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (HCT 116 και SW480 του παχέος εντέρου και T98G γλοιοβλαστώματα). Τα φυσιολογικά κύτταρα (Εικ. 1Α και το Σχ. S1 [Α]) και καρκινικά κύτταρα (Εικ. 1 Β και Εικ. S1 [B]) απελευθερώθηκαν από αδράνειας προφίλ G0 /G1 φάση και κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν με ροής κυτομετρική κυτταρικού κύκλου αναλύσεις. Στους δύο τύπους κυττάρων, η έκφραση D1 κυκλίνης αυξάνεται σταδιακά μετά την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο και έφθασε ένα μέγιστο κατά τη μετάβαση G1-S. Και στις τρεις κανονικές κυτταρικές γραμμές, η κυκλίνη D1 επίπεδα παρέμεινε σταθερή κατά τη διάρκεια της φάσης S (Εικ. 1 Α και εικ. S1 [Α]), αν και παρατηρήθηκε μία μικρή μείωση στην έκφραση D1 κυκλίνης μετά την έναρξη της S φάσης. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με προηγούμενες παρατηρήσεις [24], [25]. Σε αντίθεση, και οι τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου έδειξαν μια δραματική μείωση της έκφρασης κυκλίνης D1 κατά τη διάρκεια της φάσης S (Εικ. 1 Β και Εικ. S1 [B]). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ο κύκλος εργασιών κυκλίνη D1 αυξάνεται κατά τη διάρκεια της φάσης S σε αυτά τα κύτταρα.

Κυκλίνη D1 αποσταθεροποιείται κατά τη φάση S μέσω του μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος σε καρκινικά κύτταρα. (Α, Β) προφίλ έκφρασης της κυκλίνης D1 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα απελευθερώνονται από αδράνειας. Τα φυσιολογικά κύτταρα (Α) και καρκινικά κύτταρα (Β) εξετάστηκαν. ινοβλάστες ποντικού (Α) ΝΙΗ 3Τ3 και CCD841 con επιθήλιο κανονική του παχέος εντέρου. (Β) HCT 116 και SW480 κυττάρων. κύτταρα Con CCD841 συγχρονίστηκαν σε G0 /G1 φάση με κατεργασία με ACL-4 μέσα ενημέρωσης χωρίς EGF για 24 ώρες, και στη συνέχεια διεγείρονται με πλήρη ACL 4-μέσα που περιέχουν EGF. Άλλα κύτταρα απελευθερώθηκαν από αδράνειας από τη διέγερση του ορού. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Οι κατανομές κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής και τα ποσοστά κάθε φάσης υποδεικνύεται. Western blots-διεξήχθησαν με κυκλίνη D1 και β-ακτίνη αντισώματα, αντίστοιχα. (C, D) ανάλυση παλμικής σήμανσης-εκδίωξης της κυκλίνης D1 σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (C) και HCT 116 κύτταρα (D). Κύτταρα απελευθερώθηκαν από αδράνειας και επισημαίνονται με

35S-μεθειονίνη επί 1 ώρα όταν η πλειονότητα των πληθυσμών ήταν στην φάση G1 (9 ώρες για ΝΙΗ3Τ3 και 6 ώρες για HCT 116) ή στη φάση S (21 ώρες για ΝΙΗ3Τ3 και 15 ώρες για HCT 116). Τα κύτταρα απομακρύνθηκαν με κρύο μεθειονίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και έπειτα λύθηκαν. Κυκλίνη D1 ανοσοκαταβυθίστηκε και αναλύθηκε με SDS-PAGE. Διεξήχθη αυτοραδιογραφία. Επίπεδα μεταβολικά σημασμένα-κυκλίνης D1 εκτιμήθηκε με ποσοτική σάρωσης χρησιμοποιώντας Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad) και κηλιδώθηκε στο γράφημα για να προσδιοριστεί η ημίσεια ζωή της κυκλίνης D1. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου υποδεικνύεται κάτω από τα σχήματα. (Ε) Ο κύκλος εργασιών της κυκλίνης D1 προκαλείται από την οδό ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. ΝΙΗ3Τ3 και HCT 116 κύτταρα απελευθερώνονται από αδράνειας με διέγερση του ορού και υποβάλλονται σε επεξεργασία παρουσία (+) ή απουσία (-) του MG132 για 2 ώρες πριν από τη συγκομιδή σε κάθε χρονικό σημείο. κηλίδα Western πραγματοποιήθηκε με την κυκλίνη D1 και β-ακτίνη αντισώματα. (F-Η) Polyubiquitination της κυκλίνης D1. (F) HCT 116 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΗΑ-tagged cDNA ουβικιτίνη (διαδρομές 1-3) ή χωρίς αυτό (λωρίδα 4) και στη συνέχεια να συγχρονίζεται φάσης S μέσω της διαδοχικής χειραγώγησης της στέρησης ορού και διέγερση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ MG132 (λωρίδες 3 και 4) ή χωρίς αυτό (λωρίδες 1 και 2) για μία ώρα. Τα υλικά λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκαν με αντισώματα προς τη κυκλίνη D1 αντίσωμα (λωρίδες 2-4) ή IgG ελέγχου (λωρίδα 1) και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα ΗΑ (άνω πάνελ) ή ένα αντίσωμα κυκλίνης D1 (κάτω πίνακας). Οι αστερίσκοι δείχνουν φόντο μη-ειδικές ζώνες (F-G). (G) Nuclear (Ν) και κυτταροπλασματική (C) πρωτεΐνες κλασματώθηκαν (Fr.) από κυτταρολύματα συλλέχθηκαν στον πίνακα F, διαδρομή 3. Πυρηνική και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα έναντι κυκλίνης D1 (λωρίδες 1 και 2) ή IgG ( διαδρομή 3) και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα ΗΑ (άνω πάνελ) ή ένα αντίσωμα κυκλίνης D1 (κάτω πίνακας). (H) κατανομές κυτταρικού κύκλου.

Η

Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, ΝΙΗ 3Τ3 ινοβλαστών ποντικού και HCT 116 του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα συγχρονίστηκαν στο /G1 φάση G0 και κυκλοφόρησε από την ηρεμία και υποβλήθηκαν σε παλμό-κυνηγητό ανάλυση . Σχ. 1C και D δείχνουν pulse-chase αναλύσεις σε

35S μεταβολικά σημασμένα κυκλίνη D1 σε 9 ώρες (ΝΙΗ 3Τ3) ή 6 ώρες (HCT 116), όταν τα περισσότερα κύτταρα ήταν στην φάση G1, και σε 21 ώρες (ΝΙΗ 3Τ3) και 15 ώρες (HCT 116) όταν οι περισσότεροι ήταν σε φάση S (Σχ. 1 C και D, κάτω πίνακες). Επισημασμένα κυκλίνης D1 επίπεδα του εκτιμήθηκαν με ποσοτική σάρωσης (Σχ. 1 C και D). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην ημίσεια ζωή της κυκλίνης D1 κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S στα κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3. Αντίθετα, υπήρξε μια σημαντική διαφορά στα κύτταρα HCT 116 (φάση S Τ

1/2 = 11.8 min, σε σύγκριση με Τ

1/2 = 27.5 min σε φάση G1). Έτσι, η κυκλίνη D1 αποσταθεροποιείται ειδικά στη φάση S σε HCT 116 κύτταρα.

Κυκλίνη D1 αποικοδομείται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της φάσης S μέσω του μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος σε καρκινικά κύτταρα

επόμενο προσδιοριστεί εάν κυκλίνη D1 αποσταθεροποίηση κατά την S φάση οφειλόταν σε αυξημένη πρωτεόλυση μέσω της οδού ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Εμείς αντιμετωπίζονται HCT 116 και κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 με MG132, έναν αναστολέα πρωτεασώματος, για 2 ώρες πριν από τη συγκομιδή σε κάθε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου (σχ. 1 Ε). Στην αγωγή HCT 116 κύτταρα, η κυκλίνη D1 συσσωρευτεί σημαντικά στη φάση S, χωρίς σημαντική συσσώρευση κατά τη διάρκεια της φάσης G1. Αντίθετα, η διαφορά στο συσσωρευμένο D1 κυκλίνης μεταξύ G1 και S φάση σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 φάνηκε να είναι πολύ μικρότερη. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι, σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα, κυκλίνη D1 αποσταθεροποιηθεί κατά τη διάρκεια της φάσης S μέσω του μονοπατιού πρωτεασώματος 26S.

Τα σχήματα 1F-Η επιβεβαίωση ότι η αποσταθεροποίηση της κυκλίνης D1 περιλαμβάνει polyubiquitination. Στο Σχ. 1F, HCT 116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με (διαδρομές 1-3) ή χωρίς (λωρίδα 4) ΗΑ-tagged cDNA ουμπικουϊτίνης και στη συνέχεια να συγχρονίζεται φάση S. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (λωρίδες 3 και 4) ή χωρίς αυτό (λωρίδες 1 και 2) για μια ώρα. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα κυκλίνη D1 (διαδρομές 2-4) ή IgG ελέγχου (λωρίδα 1) και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα ΗΑ. Μια ομάδα που μετακινείται βραδύτερα ζώνες ανιχνεύθηκε από το αντίσωμα ΗΑ αποκλειστικά στα αντι-κυκλίνης ανοσοϊζήματα D1 παρουσία ουβικιτίνης (διαδρομές 2 και 3) και οι μειωμένες ζώνες κινητικότητα ενισχύθηκαν περαιτέρω μετά την έκθεση σε MG132 (λωρίδα 3), υποδεικνύοντας ότι οι ζώνες αυτές περιλαμβάνονται polyubiquitinated D1 κυκλίνης. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν ότι η κυκλίνη D1 αποικοδομείται κατά την διάρκεια της S φάσης μέσω του μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος σε HCT 116 κύτταρα. Σύκο. 1Η δείχνει ότι πάνω από το 70% αυτών των κυττάρων ήταν σε φάση S.

Για να ταυτοποιηθούν όπου αποικοδόμηση κυκλίνης D1 αυξάνεται κατά τη διάρκεια της S φάσης, εξάγαμε πυρηνική (Ν) και κυτταροπλασματική (C) πρωτεΐνης από κυτταρολύματα συλλέχθηκαν σε Σύκο. 1F λωρίδα 3 (Εικ. 1 G). Ιστόνη Η1 ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στο πυρηνικό κλάσμα, ενώ ΜΕΚ1 ήταν εντελώς εκφράζεται στο κυτταροπλασματικό εκχύλισμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορούμε επιτυχώς κλασματωμένα κυτταρικά λύματα (Εικ. S1 [C]). Η πλειοψηφία της κυκλίνης D1 ήταν εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα (Εικ. S1 [C]). Πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα έναντι κυκλίνης D1 (Σχήμα 1G, λωρίδες 1 και 2) ή IgG (λωρίδα 3) και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα ΗΑ. Polyubiquitinated κυκλίνη D1 ζώνες ανιχνεύεται κυρίως στα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα. Επιπλέον, η αναστολή των πυρηνικών-to-κυτταροπλασματική εντόπιση της κυκλίνης D1 με Leptomycin Β (ΕΜΒ) δεν ενίσχυσε αυτές τις μπάντες σημαντικά στον πυρήνα (Εικ. S1 [D]). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η κυκλίνη D1 αποικοδομείται στο κυτταρόπλασμα ειδικά σε φάση S από μία πρωτεασώματος εξαρτώμενη μηχανισμός σε HCT 116 κύτταρα.

ΜΑΡΚ αλληλεπιδρά με κυκλίνη D1 μέσω ενός D-τομέα και φωσφορυλιώνει Thr286

δραστικότητα ΜΑΡΚ είναι αυξημένη και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου εξετάστηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα? [παραπομπή 4]). Διερευνήθηκε η πιθανότητα ότι το καταρράκτη σηματοδότησης Ras /Raf /MEK /ERK ΜΑΡΚ μπορούσε ρυθμίζουν τη φωσφορυλίωση υπολείμματος κυκλίνης D1 Thr286, η οποία ακολουθείται από προλίνη (Σχ 2Α?. [Παραπομπές 8.], [9])

.

ΜΑΡΚ φωσφορυλιώνει κυκλίνη D1 σε Thr286, η οποία προκαλεί μετέπειτα ουβικιτίνωσης. (Α) τον προσδιορισμό του D-τομέα στο κυκλίνης D1 (Cyc D1). Η εικονογράφηση του πλήρους μήκους ανθρώπινου Cyc D1 δείχνει τη περιοχή της D-τομέα (Α.Α. 179-193) και η θέση φωσφορυλίωσης ΜΑΡΚ Thr (Τ) 286 που ακολουθείται από προλίνη (Ρ) (στερεά ράβδος και ένα βέλος, αντίστοιχα). Η αλληλουχία αμινοξέων της D-τομέα εντός Cyc D1 ευθυγραμμίζεται με άλλες ιστοσελίδες γνωστές ΜΑΡΚ-σύνδεσης διαφόρων ERK υποστρωμάτων. Η διπλή βασική (+) και μη πολικά (φ) αμινοξέα είναι συντηρημένα κατάλοιπα στον πυρήνα μοτίβο D-τομέα L /I /V-Χ-L /I /V. Οι θέσεις αμινοξέων από τα πιο 5 ‘υπολείμματα των D-τομείς υποδεικνύονται με τους αριθμούς στην αριστερή του κάθε αλληλουχία αμινοξέων αντίστοιχα. (B, C) ρ42 ERK2

in vitro

δοκιμασίες κινάσης για κυκλίνης D1 (άνω πλαίσια). (Β) άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο T286A ανασυνδυασμένη ΟδΤ πλήρους μήκους Cyc D1 πρωτεΐνη αναμίχθηκε με

32Ρ-ΑΤΡ στην δοκιμασία κινάσης ρυθμιστικό αντίδρασης παρουσία ή απουσία καθαρισμένου ERK2. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 30 ° C για 30 λεπτά και διακόπηκε με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης δείγματος. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και

32Ρ-πρόσληψη ανιχνεύθηκε με αυτοραδιογραφία. ανάλυση ανοσοαποτύπωσης (ΙΒ) χρησιμοποιώντας αντισώματα προς τη κυκλίνη D1 παρέχεται ως αναφορά για να δείξει ποσότητες υποστρώματος. (Γ) GST μόνο (λωρίδα 1), GST-C-τερματικό πρωτεΐνης σύντηξης WT Cyc D1 διατηρώντας τη θέση δέσμευσης του ΜΑΡΚ (αμινοξέα 165-295, λωρίδα 2), T286A (λωρίδα 3) και μια πλήρη διαγραφή του D- τομέα ΔD, λωρίδα 4) χρησιμοποιήθηκαν. ανάλυση ΙΒ χρησιμοποιώντας αντισώματα προς GSTs που παρέχονται ως αναφορά για να δείξει ποσότητες υποστρώματος. (D) Ανοσοκαταβύθιση (IP) και ανάλυση ΙΒ παρακάτω έκτοπη έκφραση της Flag-tagged ERK2 μαζί είτε με ΗΑ-tagged WT ή ΔD Cyc D1 σε HCT 116 κύτταρα καρκίνου κόλου. Μια κηλίδα Western για τους ελέγχους εισόδου (10% σύνολο λύματα) παρουσιάζεται επίσης. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western με Thr286 φωσφορυλιωμένη κυκλίνη D1 (pCycD1 Thr286) και η συνολική Cyc D1 μετά από επιμόλυνση των διαφόρων μορφών ΗΑ-tagged φορείς έκφρασης Cyc D1 σε HCT 116 κύτταρα καρκίνου κόλου. (F, G)

In vitro δοκιμασίες

ουβικιτινίωση χρησιμοποιώντας κύτταρα HeLa εκχυλίσματα Κλάσμα II ως πηγή των ενζύμων αναγκαία για την σύζευξη ουβικιτίνης σε υποστρώματα και ΑΤΡ. (F) GST-πλήρους μήκους Cyc D1 WT, T286A, ή ΔD χρησιμοποιήθηκαν για μία αντίδραση είτε με ανασυνδυασμένο ERK2 (λωρίδες 3-5) ή χωρίς αυτό (λωρίδες 1-2). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα κυκλίνη D1. ΑΤΡ προστέθηκε σε όλες τις λωρίδες, και καμία ουβικιτίνης προστέθηκε σε λωρίδα 1. (G) GST-πλήρους μήκους Cyc D1 WT χρησιμοποιήθηκε με ή χωρίς ουβικιτίνης. Μετά το διαχωρισμό SDS-PAGE, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα προς τη κυκλίνη D1 (λωρίδες 1, 2) ή ουβικιτίνη (διαδρομές 3, 4). (Η, Ι) ανάλυση Pulse-chase της κυκλίνης D1 σε HCT 116 κύτταρα μετά από έκθεση σε U0126. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα HCT 116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή 10 μΜ U0126 για 30 λεπτά. (H) Τα κύτταρα επισημάνθηκαν παλμικά με

35S-μεθειονίνη και εκδιώχθηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Κυκλίνη D1 ανοσοκατακρημνίσθηκε και στη συνέχεια αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Διεξήχθη αυτοραδιογραφία. (Ι) Επίπεδα μεταβολικά σημασμένα-κυκλίνης D1. ανάλυση (J) Western blot με pCycD1 Thr286, σύνολο κυκλίνη D1, φωσφορυλίωση ειδικών ERK (pERK), και ολική ΕΚΚ αντισώματα. Οι διανομές του κύκλου (K) των κυττάρων φαίνεται.

Η

ERK /MAPK είναι μια προλίνη (Pro) -κατευθυνόμενης πρωτεϊνική κινάση [26]. Απαιτεί μια θέση πρόσδεσης κινάσης (ή D-περιοχή) επί του υποστρώματος της να αυξήσει την αποτελεσματικότητα φωσφορυλίωση (Σχήμα 2Α?. [Ref 27.]). Οι D-domains έχουν βρεθεί σε διάφορα ERK υποστρώματα, όπως Elk-1, Sap-1, Sap-2, Ets-1 και C-Myc (Σχήμα 2Α?. [. refs 27], [28]). Ψάξαμε για ένα D-τομέα για κυκλίνης D1 με το λογισμικό σάρωσης Motif (https://scansite.mit.edu). Μέσα από μια σειρά από αυστηρές αναζητήσεων, ταυτοποιήσαμε μια ιδιαίτερα σημαντική (εντός 0.041 εκατοστημόριο) D-πεδίο σε αμινοξέα 179-193 (Εικ. 2Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο καταρράκτης σηματοδότησης Ras /Raf /MEK /ERK ΜΑΡΚ μπορεί να ευθύνονται για την κυκλίνη Δ1 φωσφορυλίωση.

για να δοκιμαστεί η δυνατότητα που καθαρίζεται ΕΚΚ /ΜΑΡΚ μπορεί να φωσφορυλιώνει ανασυνδυασμένη κυκλίνη D1, καθαρίζεται ERK2 ήταν σίγουρα χρησιμοποιείται για να φωσφορυλιώνει ένα γλουταθειόνης

S

-transferase (GST) -cyclin D1 πρωτεΐνη σύντηξης (Σχ. 2Β και C). Καθαρίστηκε ERK2 αποτελεσματικά φωσφορυλιωμένη GST-πλήρους μήκους άγριου τύπου (WT) κυκλίνης D1 (σχ. 2Β, λωρίδα 2). Σε αντίθεση, ERK2 απέτυχε να φωσφορυλιώνει T286A, μια κυκλίνη D1 μετάλλαγμα (Εικ. 2Β, λωρίδα 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι Thr286 είναι η κύρια θέση φωσφορυλίωσης της ERK /ΜΑΡΚ. Ταυτόσημα αποτελέσματα ελήφθησαν με την παρουσία του καθαρισμένου CDK4 /6? ERK ήταν σε θέση να φωσφορυλιώσει κυκλίνη D1 σε Thr286, όχι μόνο σε μονομερή μορφή αλλά και εντός κυκλίνης D1-CDK4 /6 σύμπλοκα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να καθοριστεί εάν ERK /ΜΑΡΚ απαιτεί την D-domain για αποτελεσματική φωσφορυλίωση κυκλίνη D1 σε Thr286, εκτελέσαμε

in vitro δοκιμασίες κινάσης

χρησιμοποιώντας μια πλήρη διαγραφή του D-τομέα (ΔD) από την GST-C-τερματική πρωτεΐνη σύντηξης της κυκλίνης D1. Αυτή η πρωτεΐνη σύντηξης διατηρεί την θέση σύνδεσης ΜΑΡΚ. Σύκο. 2C δείχνει ότι καθαρισμένη ERK2 αποτελεσματικά φωσφορυλιωμένη WT κυκλίνης D1 (λωρίδα 2), αλλά όχι το T286A και ΔD μεταλλάκτες (διαδρομές 3 και 4).

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι ΜΑΡΚ αλληλεπιδρά με κυκλίνη D1 μέσω D-τομέα του να φωσφορυλιώνει Thr286. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η πιθανότητα, πραγματοποιήσαμε μια ανοσοκαθίζηση και ανάλυση ανοσοκηλίδωσης (IP-ΙΒ) μετά από έκτοπη έκφραση της Flag-tagged ERK2 είτε με ΗΑ-tagged WT ή ΔD κυκλίνη D1 σε HCT 116 κύτταρα καρκίνου κόλου (Σχ. 2D). ERK2 συνδέονται καλά με WT κυκλίνη D1 (λωρίδα 2) και κακώς με ΔD κυκλίνη D1 (λωρίδα 3). Για να αποδείξει τη σημασία της ΜΑΡΚ στην φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε Thr286 στα 116 κύτταρα HCT, επιμολύναμε των κυττάρων με διάφορες μορφές φορέων έκφρασης κυκλίνης D1 (Σχ. 2Ε). Η έκτοπη έκφραση της κυκλίνης D1 διακρίθηκε από την ενδογενή έκφραση από τη μειωμένη κινητικότητα του ΗΑ-tagged D1 κυκλίνης. Αναλύσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των εξωγενών έκφραση της κυκλίνης D1 σε Thr286. φωσφορυλίωση Κυκλίνη D1 μειώθηκε σημαντικά από τη διαγραφή του D-τομέα (λωρίδα 4). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι η πλειοψηφία των φωσφορυλίωσης Thr286 σε HCT 116 κύτταρα είναι μέσω δραστικότητα ΜΑΡΚ.

Ras /ΜΑΡΚ μεσολάβηση ουβικιτινίωση και αποικοδόμηση της κυκλίνης D1 συνδέεται άμεσα με τη σύνδεση των ΜΑΡΚ /ΕΚΚ με κυκλίνη D1

επόμενο διερευνηθεί αν ΜΑΡΚ μεσολάβηση φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 μπορεί να οδηγήσει ουβικιτινίωση κυκλίνης D1

in vitro

(Σχ. 2F και G). Χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα δοκιμασίας που χρησιμοποιεί ουβικιτινίωση Κλάσμα II εκχυλίσματα HeLa κύτταρο ως πηγή των ενζύμων αναγκαία για την σύζευξη ουβικιτίνης σε υποστρώματα και ΑΤΡ [29]. Polyubiquitination της κυκλίνης D1 (Σχήμα 2F, λωρίδες 1 και 2) ενισχύθηκε περαιτέρω με ERK2 (Εικ. 2F, λωρίδα 3 και το Σχ. 2G, λωρίδες 2 και 4). Βραδύτερη μεταναστεύουσα ζώνες δεν ανιχνεύθηκαν σε απουσία ουβικιτίνη (Σχ. 2G, λωρίδες 1 και 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι αποτελούνται από polyubiquitinated μορφών κυκλίνης D1 (Σχ. 2G, λωρίδες 2 και 4). Πιστεύουμε ότι η polyubiquitination απαιτείται άμεση αλληλεπίδραση του ERK2 με κυκλίνη D1 και την φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε Thr286, επειδή ουβικιτινίωση εμποδίστηκε με τη μορφή D-τομέα μετάλλαξη απαλοιφής (ΔD) και η αλανίνη για Thr286 υποκατάσταση (T286A) της κυκλίνης D1 (σε μεγάλο βαθμό Σχ. 2F, λωρίδες 4 και 5).

Η σταθερότητα της κυκλίνης D1 πρωτεΐνης ρυθμίζεται από τις δραστηριότητες /ΜΑΡΚ ERK σε HCT 116 καρκινικά κύτταρα

Εμείς καθορίζεται επίσης τη συμβολή της ERK /MAPK σε η σταθερότητα της κυκλίνης D1 σε καρκινικά κύτταρα. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση παλμού σε μεταβολικά σημασμένα-κυκλίνης D1 μετά την αναστολή των δραστηριοτήτων ΜΑΡΚ (Σχ 2Η-K?. [Παραπομπές 30.], [31]). Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα HCT 116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με U0126 για 30 λεπτά, τα οποία εξαντλούνται σημαντικά τη φωσφορυλιωμένη μορφή της ERK (pERK) και κυκλίνης D1 σε Thr286 (PCYC D1 Thr286) χωρίς να επηρεάζεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου (σχ. 2J και Κ). Επίπεδα μεταβολικά σημασμένα-κυκλίνης D1 εκτιμήθηκε με ποσοτική σάρωσης όπως περιγράφεται παραπάνω (Σχ. 2I). Μείωση δραστηριότητα ΜΑΡΚ αύξησε την ημιζωή της κυκλίνης D1 από 22,5 λεπτά έως 54,6 λεπτά. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η σταθερότητα της κυκλίνης D1 ρυθμίζεται από τη δραστηριότητα /ΜΑΡΚ ERK στα καρκινικά κύτταρα.

Η κυκλίνη D1 σταθερότητα ρυθμίζεται μέσα από την SCF ή την SCF-όπως μονοπάτι

Λόγω του αυστηρού ιδιαιτερότητα του Ε3 λιγάσες και τα υποστρώματα τους [18], η κυκλίνη D1 είναι πιθανόν να έχει το δικό της Ε3 λιγάση. Υποθέσαμε ότι η κυκλίνη D1 πρωτεόλυση διαμεσολαβείται από την SCF Ε3 λιγάσες ή ένα SCF-σαν συγκρότημα του Ε3 λιγάσες, όπου ένα F-box πρωτεΐνης καθορίζει την εξειδίκευση για το υπόστρωμά της. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, πραγματοποιήσαμε ανάλυση IP-IB (Εικ. 3Α). Η κυκλίνη D1 από εκθετικά αυξανόμενη HCT 116 κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκε και διαδοχικά γίνεται αποτύπωμα με αντισώματα έναντι κυκλίνης D1, CDK4, SKP1, CUL1 και CUL7. Κυκλίνης D1 συνδέεται με SKP1, CUL1 ή CUL7, και CDK4, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πρωτεόλυση της διαμεσολαβείται από την ΕΕΤ (πρωτεΐνη SKP1-CUL1-F-box) ή την SCF-όπως (SKP1-CUL7-FBXW8) συγκρότημα λιγάσες Ε3.

FBXW8 ubiquitinates κυκλίνη D1 σε Thr286 φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο. (Α) Ανάλυση IP-IB (αριστερά). Πρωτεΐνη από εκθετικά αυξανόμενη HCT 116 κύτταρα καταβυθίστηκε με αντισώματα προς τη κυκλίνη D1 ή IgG. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στυπώθηκαν διαδοχικά με κυκλίνη D1, CDK4, SKP1, CUL1 και αντισώματα CUL7. ανάλυση ΙΒ με 5% της συνολικής κυτταρικής λύσης παρεσχέθη ως έλεγχος (δεξιά). (Β) ανάλυση IB εξής εξάντληση της έκφρασης SKP1 για 48 ώρες μετά την επεξεργασία με siRNA SKP1 διπλό σκέλος ολιγονουκλεοτιδίων σε HCT 116 κύτταρα. Μη στόχευση siRNA (Control) και ψευδο διαμόλυνση (-) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. (C) IP-IB ανάλυση. Είκοσι-έξι F-box πλήρους μήκους που κωδικοποιεί cDNAs κλωνοποιήθηκαν σε V5 ή επιτόπιο Flag φορείς έκφρασης ετικέτα. Αυτά V5 ή Flag-tagged πλασμιδίων DNA πρωτεΐνη F-box διαμολύνθηκαν μαζί με ΗΑ-tagged κυκλίνης D1 (ΗΑ-Cyc D1) και η έκφραση CDK4 φορείς σε κύτταρα T98G. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα. Τα δείγματα καταβυθίστηκαν με ένα αντίσωμα ετικέτα επιτόπου ΗΑ. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στην συνέχεια βάφονται με V5 ή Flag (πρωτεΐνες F-box), το ΗΑ (Cyc D1) αντισώματα. ανάλυση ΙΒ με 10% των συνολικών κυτταρικών λυμάτων παρασχέθηκε (κάτω). (Δ) Ανάλυση IP-IB (κορυφή). V5-tagged πλασμίδια πρωτεΐνη DNA F-box επιμολύνθηκαν παροδικά μαζί με είτε ΗΑ-tagged κυκλίνης D1 (Cyc D1) άγριου τύπου (WT) ή T286A μετάλλαξη, και φορείς έκφρασης CDK4 σε κύτταρα T98G αντίστοιχα. Τα δείγματα καταβυθίστηκαν με ένα αντίσωμα επίτοπο ετικέτα ΗΑ. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στην συνέχεια κηλιδώθηκαν με V5 (πρωτεΐνες F-box), το ΗΑ (Cyc D1), και Thr286 φωσφορυλιωμένη κυκλίνης D1 (PCYC D1 Thr286) αντισώματα. ανάλυση ΙΒ με 10% της συνολικής κυτταρικής λύσης προβλεπόταν για σύγκριση (κάτω). (Ε)

In vitro

δοκιμασία ουβικιτίνωσης.

In vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνες F-box με ανασυνδυασμένο κυκλίνης GST-πλήρους μήκους D1 (Cyc D1) άγριου τύπου, HeLa κυττάρων εκχυλίσματα κλάσμα II με ΑΤΡ, ουμπικουϊτίνης και ERK2, και

in vitro

-translated είτε SKP1, RBX1 και CUL1, ή SKP1, πρωτεΐνες RBX1 και CUL7 επωάστηκαν στους 30 ° C για 2 ώρες. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα κυκλίνη D1. (F)

In vitro

polyubiquitination της κυκλίνης D1 μέσω του SCF-όπως (SCFL) συγκρότημα FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8). WT ή T286A ΟδΤ Cyc D1 επωάστηκε παρουσία καθαρίστηκε ERK2 (λωρίδες 1 και 3) ή η απουσία του (λωρίδα 2) στους 30 ° C για 2 ώρες. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα κυκλίνη D1. Αστερίσκος υποδηλώνει μη-ειδικές ζώνες. (G) Ανασύσταση του polyubiquitination της κυκλίνης D1 μέσω SCFL

FBXW8

in vitro

χρησιμοποιώντας καθαρισμένη Ε1 και Ε2. GST-WT Cyc D1 επωάστηκε με ανασυνδυασμένο SCFL

FBXW8 παρουσία ή απουσία του Ε1 και Ε2 /UbcH5C. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με κυκλίνη D1 αντίσωμα.

Η

Για να ελέγξετε αν τα επίπεδα της κυκλίνης D1 ρυθμίζεται κυρίως από την SCF ή την SCF-όπως μονοπάτι, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ανοσοαποτύπωσης 48 ώρες μετά την εξάντληση της έκφρασης SKP1 με siRNA διπλό σκέλος ολιγονουκλεοτιδίων σε HCT 116 κύτταρα (Εικ. 3Β). siRNA για SKP1 μείωσε σημαντικά την έκφραση SKP1 και είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση της κυκλίνης D1. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν σθεναρά την ιδέα ότι η σταθερότητα της κυκλίνης D1 ρυθμίζεται μέσα από την SCF ή την SCF-όπως μονοπατιού.

FBXW8, ένα F-box πρωτεΐνης, συσχετίζει ειδικά με την κυκλίνη D1 σε φωσφορυλίωση Thr286 τρόπο που εξαρτάται από

επόμενο εντοπίσει την πρωτεΐνη υπεύθυνη για τη σταθερότητα της κυκλίνης D1. Δοκιμάσαμε υποψήφια ανθρώπινα γονίδια πρωτεΐνης F-πλαίσιο για την αναγνώριση της μοναδικής Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης για κυκλίνης D1. εξειδίκευση υποστρώματος των συμπλοκών SCF συμβαίνει μέσω τομέων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που είναι συχνά τρυπτοφάνη-ασπαρτικό οξύ (WD) 40 μοτίβα ή πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις (ΕΚΚ) εντός των πρωτεϊνών συσκευασίας F [20], [21]. Ψάξαμε τις βάσεις δεδομένων NCBI για ανθρώπινες πρωτεΐνες F-κουτί με WD40 ή LRR μοτίβα. Βρήκαμε περίπου 70 πιθανά γονίδια. Μεταξύ αυτών, 9 είχαν WD40 επαναλαμβανόμενα μοτίβα και 17 είχαν LRR μοτίβα.

Έχουμε λάβει αυτά τα γονίδια με την πρώτη εκτέλεση αντίστροφης μεταγραφάσης-PCR (RT-PCR) χρησιμοποιώντας ολικό RNA από ΗΕΚ 293, HCT 116 ή κύτταρα WI-38 . Τα cDNA πλήρους μήκους που ανακτώνται κλωνοποιήθηκαν σε V5 ή επιτόπιο Flag φορείς έκφρασης ετικέτα. Για την αντιμετώπιση εάν οποιοδήποτε από τα προϊόντα αυτών των γονιδίων θα μπορούσε να αναγνωρίσει κυκλίνη D1, εμείς παροδικά επιμολυσμένα πλασμίδια DNA για το V5 ή Flag-tagged πρωτεΐνες F-box σε κύτταρα T98G με ή χωρίς Ν-τερματική ΗΑ-tagged κυκλίνη D1 και την έκφραση CDK4 φορείς ( Σχ. 3C). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ΙΡ-ΙΒ. Τα δείγματα καταβυθίστηκαν με ένα αντίσωμα ετικέτα επιτόπου ΗΑ και βάφτηκαν με Flag (FBXW7 και FBXL5) ή V5 (άλλα), και D1 αντισώματα κυκλίνης. Πίνακας Γ δείχνει κυκλίνης D1 συνδέει με δύο πρωτεΐνες F-box, FBXW8 (λωρίδα 7) και FBXL12 (λωρίδα 15). FBXW8 κατείχε WD40 μοτίβα και FBXL12 είχε LRR μοτίβα.

Επειδή υποστρώματα πρωτεΐνης F-box πρέπει να φωσφορυλιωθεί [19], ελέγξαμε εάν FBXW8 και FBXL12 αναγνωρίσουν κυκλίνης D1 σε Thr286 φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα T98G με V5-tagged πλασμίδια πρωτεΐνη F-box DNA και η κυκλίνη D1 (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη T286A) και φορείς έκφρασης CDK4. Τα δείγματα καταβυθίστηκαν με ένα αντίσωμα ετικέτα επιτόπου ΗΑ και στυπώθηκαν με V5, ΗΑ και Thr286 αντισώματα D1 φωσφορυλιωμένη κυκλίνης (Σχ. 3D). FBXW8 συνδέθηκε τόσο με κυκλίνη D1 άγριου τύπου και μεταλλαγμένου T286A, αλλά η πλειοψηφία ήταν υποχρεωμένη να άγριου τύπου, η οποία ήταν ως επί το πλείστον φωσφορυλιωμένη σε Thr286. Αντίθετα, δεν είδαμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ άγριου τύπου D1 κυκλίνης και η μετάλλαξη σε συνεργασία με FBXL12. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι FBXW8 αναγνωρίζει κυκλίνη D1 σε Thr286 φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά FBXL12 δεν το κάνει. Συνεπής με αυτό το εύρημα, FBXL12 δεν συμμετείχε στην κυκλίνης D1 polyubiquitination

in vitro

(Σχ. 3Ε, λωρίδα 9). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι FBXW8 μπορεί να παίζει ρόλο στην σταθερότητα της κυκλίνης D1.

FBXW8 ubiquitinates κυκλίνη D1 σε Thr-286 φωσφορυλίωση τρόπο που εξαρτάται από

Εμείς διερευνηθεί εάν

in vitro

ουβικιτινίωση κυκλίνη D1 απαιτεί FBXW8 (Σχ. 3Ε). κάθε Επωάσαμε

in vitro

-translated πρωτεΐνη F-κουτί με ανασυνδυασμένη GST-κυκλίνης D1 (Cyc D1), κλάσμα II HeLa κυτταρικών εκχυλισμάτων με ΑΤΡ, ουβικιτίνης και ERK2, και είτε

in vitro

-translated SKP1, RBX1 και CUL1, ή SKP1, πρωτεΐνες RBX1 και CUL7. Στη συνέχεια, τα καθάρισε με ένα αντίσωμα κυκλίνης D1. Η κυκλίνη D1 ουβικιτινίωση ανιχνεύθηκε στους συνδυασμούς της FBXW8 με SKP1, CUL1, και RBX1 (λωρίδα 5), ή FBXW8 με SKP1, CUL7, και RBX1 (λωρίδα 6). Ωστόσο, polyubiquitinated ζώνες δεν αυξήθηκαν σε άλλους συνδυασμούς. Για να επιβεβαιώσετε ότι τα σύμπλοκα SCF είχαν συναρμολογηθεί σωστά κατά την

in vitro

μετάφραση, πραγματοποιήσαμε ανοσοκαθίζηση με κάθε πρωτεΐνη F-box στα

35S-σημασμένο

in vitro

μεταφραστεί δείγματα (δεν φαίνεται ) και ελέγχθηκαν αν τα σύμπλοκα που περιέχουν β-TRCP ήταν λειτουργικά για polyubiquitination της β-κατενίνης (Εικ. S1 [Ε]). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η κυκλίνη D1 ουβικουϊτινίωση περιλαμβάνει FBXW8.

επόμενο διερευνηθεί εάν

in vitro

ουβικιτινίωση κυκλίνης D1 μέσω του SCF-όπως (SCFL) συγκρότημα FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8) απαιτεί φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε Thr286 (Εικ. 3F). Polyubiquitination μέσω SCFL

FBXW8 μειώθηκε δραματικά από την εξάντληση της ERK2 (διαδρομή 2). Επιπλέον, η κυκλίνη D1 polyubiquitination εμποδίστηκε σε μεγάλο βαθμό από την υποκατάσταση αλανίνης-for-Thr286 (T286A, λωρίδα 3), υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση της κυκλίνης D1 σε Thr286 είναι απαραίτητη για ουβικουϊτινίωση με SCFL

FBXW8. Αυτά τα στοιχεία είναι σε καλή συμφωνία με την παρατήρηση μας ότι FBXW8 συσχετίζει ειδικά με την κυκλίνη D1 σε Thr286 φωσφορυλίωσης-εξαρτώμενο τρόπο.

Τέλος, θα ανασυσταθεί κυκλίνη D1 polyubiquitination

in vitro

χρησιμοποιώντας καθαρισμένο Ε1 και Ε2 ένζυμα (Σχ. 3G). SCFL

FBXW8 προωθεί τη συναρμολόγηση UbcH5C καταλύεται πολυουμπικιτίνης αλυσίδας [22]. Σύκο.