Αφηρημένο

Ένα σημαντικό πρόβλημα στην έρευνα για τον καρκίνο είναι η έλλειψη ενός προσιτό μοντέλο για την καθυστερημένη μετάσταση. Εδώ δείχνουμε ότι τα καρκινικά κύτταρα καταστέλλεται από SISgel, μία γέλη που σχηματίζει κανονικό υλικό ECM που προέρχεται από Λεπτό Έντερο Υποβλεννογόνος (SIS), σε ξενομοσχεύματα πλευρά δείχνουν ιδιότητες της καταστολής και την εκ νέου ενεργοποίηση που είναι πολύ παρόμοια με τα κανονικά καθυστέρηση της μετάστασης και προτείνουν αυτά καταστέλλεται κύτταρα μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο μοντέλο για την ανάπτυξη θεραπευτικών για τη στόχευση μικρομεταστάσεων ή καταστέλλεται καρκινικά κύτταρα. Συν-ένεση με SISgel κατέστειλε την κακοήθη φαινότυπο άκρως διεισδυτική J82 καρκινικών κυττάρων κύστης και άκρως μεταστατικά JB-V καρκινικών κυττάρων κύστης σε γυμνούς ξενομοσχεύματα πλευρό του ποντικιού. Τα κύτταρα θα μπορούσαν να παραμείνουν βιώσιμα μέχρι και 120 ημέρες χωρίς τον σχηματισμό όγκων και εμφανίστηκε πολύ πιο υψηλά διαφοροποιημένη και λιγότερο άτυπα από τους όγκους από κύτταρα συν-ένεση με Matrigel. Στο 40% των SISgel ξενομοσχευμάτων, ανάπτυξη συνεχίζεται στον κακοήθη φαινότυπο μετά από μια περίοδο καταστολής ή λήθαργου για τουλάχιστον 30 ημέρες και ήταν πιο πιθανό με την εμφύτευση του 3 εκατομμύρια ή περισσότερα κύτταρα. Τακτική τύπου Ι κολλαγόνου δεν καταστέλλουν την ανάπτυξη κακοηθών, και οι όγκοι αναπτύσσονται περίπου, καθώς και με το κολλαγόνο και με Matrigel. Ένα σαφές μήνυμα στη γονιδιακή έκφραση σε διάφορες κυτταρικές σειρές, δεν θεωρήθηκε από την ανάλυση μεταγραφικό μικροσυστοιχιών, αλλά σε αντίθεση, αντίστροφη ανάλυση πρωτεϊνών Φάση των 250 πρωτεϊνών σε 4 κυτταρικές σειρές που προσδιορίζονται Ενσωματίνης Συνδέεται κινάσης (ILK) επισημαίνοντας ότι επιβεβαιώθηκε λειτουργικά με έναν αναστολέα της ILK. Προτείνουμε ότι τα καρκινικά κύτταρα καταστέλλεται για SISgel θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως πρότυπο για το λήθαργο και την εκ νέου αφύπνιση για να καταστεί δυνατός ο προσδιορισμός των θεραπευτικών στόχων για τη θεραπεία μικρομεταστάσεων

Παράθεση:. Hurst RE, Hauser PJ, Kyker KD, Heinlen JE , Hodde JP, Hiles MC, et al. (2013) Καταστολή και ενεργοποίηση του κακοήθους φαινοτύπου από εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας σε Μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης: Ένα μοντέλο για Όγκων Κυττάρων «λήθαργου». PLoS ONE 8 (5): e64181. doi: 10.1371 /journal.pone.0064181

Επιμέλεια: Hidayatullah Γ Munshi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 12 του Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 24, 2013

Copyright: © 2013 Hurst et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από ερευνητικές επιχορηγήσεις R01CA75322, R01DK69808, μια επιχορήγηση από Cook Biotech και μια επιχορήγηση από το Κέντρο Stephenson Καρκίνου (REH)? R01 CA136944 και R43 CA135867 (ΠΣΕ) και R43CA139804 (PJH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Robert Hurst, Paul Hauser, Kim Kyker και Michael Ihnat είναι όλοι οι μέτοχοι στην DormaTarg, Inc. Michael Hiles και Jason Hodde απασχολούνται από Cook Biotech. Κανένας από τους άλλους συντάκτες έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η έκφραση του κακοήθους φαινοτύπου δεν είναι ούτε άμεση ούτε καν αναπόφευκτη συνέπεια της μετάλλαξης του γονίδια καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια. Από καιρό ήταν γνωστό ότι χωρίς την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM), τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι σε θέση να σχηματίζουν όγκους [1], [2] και ότι η ίδια η ECM περιέχει στοιχεία τόσο ανταγωνιστική και αγωνιστική του κακοήθους φαινοτύπου [1]. Η σημασία του ECM έχει γίνει πρόσφατα πιο εμφανής καθώς το φαινόμενο της νάρκης των μεταστατικών κυττάρων έχει αναγνωριστεί [3] – [5], και ότι το πρώτο δεσμευμένη βήμα στη μετάσταση είναι διαφυγή του μικρομεταστατικών κυττάρων από τοπική ανασταλτική παράγοντες που τείνουν να ευνοούν συνέχισε ληθάργου [6], [7]. Επίσης, η ανακάλυψη ότι τα κύτταρα με ανώμαλη γονιδιώματα εκφράζουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους σε ιστοπαθολογικά φυσιολογική ουροθήλιο [8] ή κυττάρων με μεταλλάξεις ρ53 χαρακτηριστική του πρωτογενούς όγκου βρίσκονται σε ιστοπαθολογικά φυσιολογική στοματική βλεννογόνο [9] δείχνει ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μεταμφίεση ως φυσιολογικά κύτταρα . Η καταστολή των κακοηθών ιδιοτήτων των κυττάρων με τη δυνατότητα για σχηματισμό όγκου μπορεί κάλλιστα να αποτελούν τη βάση της λανθάνουσας περιόδου πρωτογενούς ανάπτυξης του όγκου, καθώς και της καθυστερημένης τοπικών και άπω υποτροπή. Ίσως «λήθαργο» θα μπορούσε να συμβάλει στην αιτία που ακόμη και με νεότερα «στοχευμένες» θεραπείες και δισεκατομμύρια δολάρια στην έρευνα για τον καρκίνο, η συνολική ειδική για τον καρκίνο επιβίωση έχει αλλάξει ελάχιστα [10], [11]. Αδρανής κύτταρα δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί ως πιθανός στόχος μέχρι πρόσφατα [12], και σαφώς τέτοια κύτταρα είναι ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία, λόγω της πολύ περιορισμένη αποτελεσματικότητα των επικουρική χημειοθεραπεία [3], [13]. Αυτό που χρειάζεται είναι ένα μοντέλο με το οποίο σύστημα για τη διερεύνηση των μηχανισμών καταστολής και ενεργοποίησης των καρκινικών κυττάρων από την ECM που μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό και εξέταση φαρμάκων που στοχεύουν ECM-καταστέλλεται καρκινικών κυττάρων.

Νωρίτερα αποδείξαμε ότι ο φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης ήταν ριζικά διαφορετική σε 3-διαστάσεων οργανοτυπική καλλιέργεια όταν αναπτύσσονται σε ένα κανονικό παρασκεύασμα εξωκυτταρικής μήτρας (SISgel) σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε σε μία επιτρεπτική παρασκεύασμα καρκίνο διαμορφωμένο εξωκυττάρια μήτρα (Matrigel) [14]. SISgel είναι ένα υλικό σχηματισμού γέλης που προέρχονται από μη κυτταρικά λεπτό έντερο χοίρου υποβλεννογόνο, ενώ Matrigel είναι ένα παρασκεύασμα βασικής μεμβράνης που λαμβάνεται από ένα σάρκωμα ποντικού [15]. Όταν καλλιεργούνται επί Matrigel, τα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης ανακεφαλαίωνε το φαινότυπο που αναφέρθηκαν για τον αρχικό όγκο. Σε έντονη αντίθεση, οι περισσότερες από τις κακοήθεις ιδιότητες χάθηκαν όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί SISgel [14]. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από θηλώματα καλλιεργήθηκαν επί SISgel σχημάτισε στρώσεις δομή θυμίζει κανονικό ουροθήλιο, ενώ κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους υψηλότερο βαθμό σχηματίζεται μία μη επεμβατική στρώμα κυττάρων [14]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε φυσιολογικά ECM θα μπορούσε να προσφέρει ένα μοντέλο για τη διερεύνηση του φαινομένου της καταστολής της κακοήθειας από την κανονική ECM και το ρόλο του στη μετάσταση και στην επανάληψη.

Στην ανακοίνωση αυτή, διερευνήσαμε αν η φαινοτυπική καταστολή δει σε οργανοτυπική καλλιέργεια των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε SISgel παρατηρείται επίσης

in vivo

. Θετικά ευρήματα υποστηρίζουν την χρήση του SISgel ως πρότυπο για τις έρευνες του αδρανοποιημένων ή καταστέλλεται φαινοτύπου των κυττάρων όγκου και των μηχανισμών με τους οποίους η κανονική ECM ασκεί ανασταλτική επίδραση στην ογκογένεση και τη μετάσταση. Τα ευρήματα υποδεικνύουν έντονα ότι οι αλληλεπιδράσεις των καρκινικών κυττάρων με φυσιολογικό ECM παίζουν σημαντικό ρόλο στην υποτροπή και μετάσταση και περαιτέρω προτείνουν ότι η στόχευση κατασταλεί κύτταρα θα μπορούσε να αποτελέσει ένα μέχρι τώρα ανεκμετάλλευτο σημείο της ευπάθειας στη θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Ο φαινότυπος μιας από τις επιθετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης που καλλιεργούνται σε SISgel, το κολλαγόνο και Matrigel σε καλλιέργεια απεικονίζεται στο Σχ. 1. Μια διεισδυτική, επιθετική φαινότυπο επί Matrigel και κολλαγόνο παρατηρείται. Στις Matrigel, τα κύτταρα εισβολή, αλλά ως ένα μέτωπο, όπως παρατηρείται στην κλινική όγκους. Στις κολλαγόνο, τα μεμονωμένα κύτταρα εισβολή, ενώ μερικά κύτταρα παρέμειναν στην επιφάνεια της γέλης, καθώς και εκείνα που εισέβαλαν είχαν μια εμφάνιση μεσεγχυματικά. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Matrigel έδειξε επίσης μια σειρά από μεγέθη και προσανατολισμούς πυρηνικών ενδεικτικό της επιθετικής φαινότυπο. Αυτός ο φαινότυπος έρχεται σε έντονη αντίθεση με αυτό που παρατηρήθηκε σε SISgel, όπου τα κύτταρα απέτυχαν να εισβάλει και σχηματίζεται ένα στρώμα στην κορυφή της γέλης. Τα κύτταρα έδειξαν μία επιθηλιακά φαινότυπο, και οι πυρήνες ήταν πιο ομοιόμορφη και οργανωμένη ενδεικτική ενός κανονικοποιημένη φαινοτύπου.

Σημειώστε την απώλεια της εισβολής και της πιο ομαλή εμφάνιση των κυττάρων αναπτύχθηκαν σε SISgel. Όλες οι μεγεθύνσεις είναι 200Χ. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές μιας τουλάχιστον 4 πειράματα.

Η

επόμενο καθοριστεί αν παρατηρήθηκε επίσης η καταστολή των κακοηθών ιδιοτήτων δει σε 3-διαστάσεων του πολιτισμού

in vivo

σε ξενομοσχεύματα πλευρά. Τα τυπικά αποτελέσματα με τη χρήση των κυττάρων J82 που απεικονίζεται στο Σχ. 2. Μια εικόνα φθορισμού των κυττάρων αμέσως μετά την ένεση παρουσιάζεται στο Σχ. 2Α. Η εμφάνιση ενός όγκου που μεγάλωσε από κύτταρα συν-ένεση με Matrigel απεικονίζεται στο Σχ. 2Β. Σύκο. 2C δείχνει το τυπικό αποτέλεσμα με κύτταρα συν-ένεση με SISgel. Τα κύτταρα παραμένουν ως μια επίπεδη σημείο που λάμπει αμυδρά κάτω συναρπαστικό φωτισμό αλλά που γενικά δεν αποτελούν ένα αυξανόμενο όγκο και παραμένει ορατό για εβδομάδες. Σε ορισμένα κλάσμα αυτών των ξενομοσχευμάτων SISgel, ωστόσο, τα κύτταρα να ξεφύγουν από την καταστολή και να αρχίσει να αυξάνεται ως δραστικό όγκου, όπως απεικονίζεται στο Σχ. 2D. Όπως φαίνεται παρακάτω, το κλάσμα που διαφεύγει να επαναλάβει ενεργή ανάπτυξη εξαρτάται από τον αριθμό των κυττάρων που εγχέονται.

(Α) Κύτταρα που παρατηρήθηκε 24 ώρες μετά την εμφύτευση. κύτταρα (Β) συν-ένεση με Matrigel παρατηρήθηκε μετά από 60 ημέρες που δείχνει ενεργά αναπτυσσόμενο όγκο. κύτταρα (C) συν-ένεση με SISgel παρατηρήθηκε μετά από 50 ημέρες που δείχνει τα κύτταρα παραμένουν βιώσιμα, αλλά δεν αυξάνονται σε όγκο ( «λαμπερό σημείο»). (D) κύτταρα συν-ένεση με SISgel που διέφυγαν μετά την αρχική καταστολή δείχνεται 60 ημέρες μετά την ένεση. Τα κύτταρα παρέμειναν ως ένα λαμπερό σημείο (βλέπε C) για 45 ημέρες, μετά την επανάληψη ταχεία ανάπτυξη ως ένας όγκος. Η ανάπτυξη ορίστηκε ως δύο διαδοχικές αυξήσεις στο μέγεθος.

Η

Οι όγκοι που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα συν-ένεση με Matrigel, κολλαγόνο Ι ή ότι διέφυγε από κύτταρα συν-ένεση με SISgel εξετάστηκαν ιστοπαθολογικά μαζί με μία από οι κηλίδες της καταστέλλεται φθοριζόντων κυττάρων που απέτυχαν να αναπτυχθούν σε ένα αναπτυσσόμενο όγκο. Αυτά τα αποτελέσματα, που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3, επιβεβαιώνουν ότι τα κύτταρα καταστέλλονται από SISgel. Σύκο. 3Α δείχνει ένα τυπικό τμήμα από JB-V κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε ένα όγκο μετά από συν-ένεση με Matrigel. Η εμφάνιση είναι αυτή ενός επιθετικού όγκου με πολυάριθμα αποπτωτικά σώματα και μιτωτικά σχήματα. Τα κύτταρα είναι σημαντικά pleiomorphic και πολύ αναπλαστικό, περιοχές νέκρωσης που είναι παρόντα και τα περισσότερα πλοία εμφανίζονται ανώμαλα. Η ιστοπαθολογία του ενός από τα κατέστειλε μπαλώματα των κυττάρων συν-ένεση με SISgel φαίνεται καταφανώς στην Εικ. 2C παρουσιάζεται στο Σχ. 3Β. Σε αντίθεση με τα ενεργά αναπτυσσόμενους όγκους, τα κύτταρα είναι περισσότερο διαφοροποιημένα, λιγότερο αναπλαστικό ή pleiomorphic με φυσιολογική εμφανίζονται σκάφη, πολύ λίγοι μιτωτικά σχήματα, και mimal απόδειξη των αποπτωτικών ή νεκρωτικών περιοχών. Σύκο. 3C απεικονίζει μία τομή από ένα από τους όγκους που αναπτύχθηκαν από SISgel μετά από μια περίοδο λήθαργου των 8 εβδομάδων. Ο όγκος είναι ιστοπαθολογικά παρόμοια με το Σχ. 3Α και επιβεβαιώνει ότι όταν οι όγκοι ξεφύγουν από την καταστολή, θα συνεχίσετε με επιθετικό φαινότυπο. Σύκο. 3D δείχνει ότι τα κύτταρα συν-ένεση με κολλαγόνο επίσης να σχηματίζει μια επιθετική-εμφανίζεται όγκου με χαρακτηριστικά παρόμοια με τα Σχήματα 3Α και 3Β. Trichrome χρώση για κολλαγόνο σε όλους τους ιστούς αποκάλυψε ότι από τη στιγμή που αυτοί οι όγκοι ή μπαλώματα καταστέλλονται τα κύτταρα συλλέχθηκαν, το αρχικό κολλαγόνου στο μέσο συν-ένεση είχε εξαφανιστεί (δεν φαίνεται). Το μόνο διακριτό κολλαγόνο στο Σχ. 3Β ήταν τα πλοία. Σύκο. 4 έρχεται σε αντίθεση έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού, Κί67 και το μεσεγχυματικών δείκτη, βιμεντίνη σε ξενομοσχεύματα πλευρό και επιβεβαιώνει την ιστοπαθολογική αξιολόγηση που παρουσιάζεται στο Σχ. 3. Όπως φαίνεται, πολύ λίγα κύτταρα στην καταστολή των κυττάρων ιστών είναι στον κυτταρικό κύκλο, και υπάρχει πολύ μικρή βιμεντίνη έκφρασης. Σε αντίθεση, τα ενεργά αυξάνεται όγκοι χαρακτηρίζονται από υψηλό επίπεδο έκφρασης των δύο, που υποδηλώνει επιθετικά αυξανόμενες φαινότυπο. Όγκοι από κύτταρα J82 ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα που παρουσιάζονται για JB-V κυττάρων σε όλες τις απόψεις.

Χαρακτηριστικά προσδιορίζονται ιστοπαθολογικά δείχνονται ως ακολούθως. Οι περιοχές των κακοήθων κυττάρων με μαύρο περίγραμμα και οι περιοχές νέκρωσης που περιγράφονται στο κίτρινο. Μαύρα βέλη δείχνουν αποπτωτικά σώματα. Κίτρινα βέλη εντοπισμό μιτωτικά σχήματα. Στο επίπεδο του ζουμ εμφανίζεται εδώ αυτά είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς, αλλά εντοπίστηκαν κάτω από υψηλή ισχύ. (Α) κύτταρα συν-ένεση με Matrigel που παρουσίασε αμέσως μια κακοήθη μοντέλο ανάπτυξης. Η παθολογική περιγραφή σημείωσε μεγάλες περιοχές νέκρωσης που με οξεία φλεγμονή (τα μικρά, πυκνά κύτταρα είναι ουδετερόφιλα) με μια περιοχή άκρως άτυπων κυττάρων αποκαλύπτοντας σημειώνονται πυρηνικών πλειομορφία, όλα ενδεικτική της υψηλής νεοπλασίας βαθμού. (Β) κύτταρα συν-ένεση με SISgel που παρέμειναν στην καταστολή ή αδρανείς φαινότυπο. Αυτή η διαφάνεια διαβάστηκε ως κύτταρα με μέτρια κυτταρική ατυπία και πλειομορφισμό με ελάχιστες ενδείξεις νέκρωσης, μίτωση και η απόπτωση. (C) κύτταρα συν-ένεση με SISgel που παρουσιάζονται αρχικά καταστέλλεται φαινότυπο για 8 εβδομάδες, αλλά στη συνέχεια επανέλαβε την ανάπτυξη στον κακοήθη φαινότυπο. Αυτό έχει ως περιέχει μια περιοχή νέκρωσης με οξεία φλεγμονή και εστίες έντονα άτυπα κύτταρα μαζί με εξέχοντες μίτωση και η απόπτωση. Ορισμένα πεδία που περιέχονται πολυπύρηνα γιγαντιαία καρκινικά συνήθως ενδεικτική της υψηλής ποιότητας νεοπλασία (D) Κύτταρα συν-ένεση με κολλαγόνο Ι επίδειξη ενός κακοήθους πρότυπο ανάπτυξης παρόμοια με εκείνα που απεικονίζονται στα πλαίσια Α και C. Όλες οι εικόνες είναι σε 400Χ.

JB-V κύτταρα συν-ένεση με Matrigel και επισημανθεί προς Ki67 (Α) και βιμεντίνης (C). JB-V κύτταρα συν-ένεση με SISgel και στην καταστολή φαινότυπο σημάνθηκαν για Ki67 (Β) και βιμεντίνης (D). Έλεγχοι παραλείποντας το πρωτογενές αντίσωμα (δεν φαίνεται) ήταν απολύτως αρνητικά για τους δύο δείκτες. Εικόνες σε 200Χ.

Η

Kaplan-Meier για τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχ. 5Α με ένα καταληκτικό σημείο που αρχίζει η ανάπτυξη του όγκου? ότι είναι σε αυτή την περίπτωση «επιβίωση» συνυπολογίζεται ως επιβίωση ενός καταστέλλεται φαινότυπο. Επειδή όλα τα πειράματα περιείχαν Matrigel θετικοί έλεγχοι με τους ίδιους αριθμούς κυττάρων στις ίδιες αναλογίες όπως χρησιμοποιήθηκαν για SISgel, Σχ. 5Α συνδυάζει τα πειράματα με διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων. Όταν συν-ένεση με Matrigel, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε όγκους εντός 30 ημερών σε 100% των ζώων, ακόμη και με τόσο λίγα όσο 250.000 κύτταρα. Με SISgel, αυτό δεν ήταν σαφώς η περίπτωση, και μόνο περίπου το 40% των ζώων που τελικά εξελίχθηκε αναπτυσσόμενους όγκους μετά από μια καθυστέρηση μεταξύ τεσσάρων και για όσο διάστημα 18 εβδομάδων. Η διαφορά στην συμπεριφορά μεταξύ των κυττάρων συν-ένεση με Matrigel και SISgel ήταν ιδιαίτερα στατιστικά σημαντική (ρ categoryId=35623#)