Abstract

Αντοχή σε αναστολείς του επιδερμικού αυξητικού κινάσης τυροσίνης υποδοχέα παράγοντα (EGFR-ΤΚΙδ), gefitinib και erlotinib, είναι ένα κρίσιμο πρόβλημα στην αγωγή του

EGFR

μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα. Οι διάφοροι μηχανισμοί, μεταξύ των οποίων bypass σηματοδότηση από αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) -triggered ενεργοποίηση Met, εμπλέκονται ως μεσολαβητές της αντίστασης. Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), είναι μεταγενέστερος αγωγός του EGFR και σηματοδότηση ΜΕΤ, και συνεπώς θεωρείται μία θεραπευτικά ελκυστικό στόχο για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει κατά πόσον 2 κλινικά εγκεκριμένο αναστολείς mTOR, temsirolimus και everolimus, να ξεπεράσουν ΗΟΡ-εξαρτώμενη αντοχή σε EGFR-TKIs στο

EGFR

της μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τόσο temsirolimus και everolimus ανέστειλε την φωσφορυλίωση της p70S6K και 4Ε-BP1, τα οποία είναι κατάντη στόχοι της οδού mTOR, και μείωσε τη βιωσιμότητα των

EGFR

της μεταλλαγμένης κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, PC-9, και HCC827, ακόμη και στην παρουσία HGF

in vitro

. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, temsirolimus κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων PC-9 που υπερεκφράζουν το

HGF

-γονίδιο? Αυτό συσχετίστηκε με την καταστολή του μονοπατιού σηματοδότησης mTOR και αγγειογένεση όγκου. Σε αντίθεση, η erlotinib δεν καταστέλλει αυτή την μονοπάτι σηματοδότησης ή του όγκου της ανάπτυξης. Πολλαπλές μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της παραγωγής αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα από τα κύτταρα του όγκου και καταστολή της βιωσιμότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων, συμβάλλουν στην αντι-αγγειογενετική δράση του temsirolimus. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι αναστολείς mTOR μπορεί να είναι χρήσιμη για τον έλεγχο των HGF-ενεργοποιείται αντίσταση EGFR-ΤΚΙ στο

EGFR

μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα, και παρέχουν το σκεπτικό για τις κλινικές δοκιμές των αναστολέων mTOR σε ασθενείς με στρωματοποίηση από το

EGFR

μετάλλαξη και την κατάσταση της έκφρασης HGF

Παράθεση: Ishikawa D, Takeuchi S, Nakagawa Τ, Sano Τ, Nakade J, Nanjo S, et al. (2013) mTOR αναστολείς ελέγχουν την ανάπτυξη του EGFR Καρκίνο του Πνεύμονα Mutant Ακόμη και μετά την απόκτηση αντίσταση από HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10.1371 /journal.pone.0062104

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Κορέα

Ελήφθη: 29 Νοέμ 2012? Αποδεκτές: 18 του Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2013

Copyright: © 2013 Ishikawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από KAKENHI (επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα περιοχές «Ολοκληρωμένες Έρευνας για τον Καρκίνο μικροπεριβάλλον Network» (για SY) και Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (σε ΤΥ και ST)), και επιχορηγήσεις-in ενισχύσεις για το Project για την Ανάπτυξη Καινοτόμων Έρευνας για τον Καρκίνο Therapeutics (P-Direct) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας (MEXT). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Seiji Yano λάβει αμοιβές από Chugai Pharmaceutical Co., Ltd και η AstraZeneca. Seiji Yano έλαβε χρηματοδότηση της έρευνας από την Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. και Eisai Co., Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου κακοήθειας που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και περισσότερο από το 80% των περιπτώσεων ταξινομούνται ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ενεργοποίησης μεταλλάξεις, όπως το εξώνιο 19 διαγραφή και εξόνιο 21 σημείο L858R μετάλλαξη, βρίσκονται σε έναν πληθυσμό NSCLC, και συνδέονται με μια κλινική απόκριση στους αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (EGF-ΤΚΙδ), gefitinib και erlotinib [1] – [3]. Ωστόσο, σχεδόν όλοι ανταποκρίθηκαν αποκτούν αντίσταση και να αναπτύξουν υποτροπή μετά διάφορα χρονικά διαστήματα (επίκτητη αντίσταση) [4]. Επιπλέον, το 20-30% των ασθενών παρουσιάζουν δυσμενή αποκρίσεις, αν και οι όγκοι τους έχουν μεταλλάξεις στόχου (εγγενής αντίσταση) [5]. Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί, προκειμένου να οριοθετηθούν οι στρατηγικές που μπορεί να ξεπεράσει επίκτητων και εγγενή αντίσταση. Αυτές οι μελέτες έχουν ταυτοποιήσει αρκετούς μηχανισμούς της επίκτητης αντοχής, συμπεριλαμβανομένης

EGFR

μετάλλαξη Τ790Μ [6], [7],

MET

ενίσχυση [8], [9], ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) υπερέκφραση [10], η απώλεια του ΡΤΕΝ [11], μετατροπή σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) φαινότυπο [12] – [14], επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [15] – [17], η ενεργοποίηση του η οδός NFkB [18], αλλοίωση του microRNA [19], και η ενεργοποίηση του άξονα Gas6-ΑχΙ [20]. Η πολυπλοκότητα του NSCLC αντανακλάται από την συνύπαρξη διάφοροι συνδυασμοί αυτών των μηχανισμών αντοχής σε διαφορετικά άτομα. Έχουμε ήδη ανακαλύψει ότι ο HGF ενεργοποιεί την αντίσταση του EGFR ΤΚΙ με την ενεργοποίηση του άξονα /PI3K /AKT ΚΟΑ [10]. Επιπλέον, δείξαμε ότι ο HGF υπερέκφραση είναι παρούσα σε όγκους από Ιάπωνες ασθενείς με επίκτητη και ενδογενή αντίσταση όγκου προς EGFR-ΤΚΙ σε συχνότητες από περίπου 60% και 30%, αντίστοιχα [21]. Αυτό δείχνει ότι ο HGF είναι ένας ιδανικός στόχος για να ξεπεραστεί η αντίσταση του EGFR ΤΚΙ στο

EGFR

της ασθενείς με μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα. Για να ξεπεραστεί HGF-ενεργοποιείται αντίσταση, 2 σήματα από EGFR και HGF-ΚΟΑ θα πρέπει να αποκλειστεί ταυτόχρονα. Έχουμε ήδη αναφέρει ότι ΗΟΡ-εξαρτώμενη αντίσταση μπορεί να ελέγχεται από ένα αντι-ΗΟΡ αντίσωμα εξουδετέρωσης [22], ο ανταγωνιστής HGF ΝΚ4 [22], ΜΕΤ-ΤΚΙ [23] – [25], και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (αναστολείς ΡΙ3Κ) [26] σε συνδυασμό με EGFR-ΤΚΙ. Ωστόσο, αυτοί οι αναστολείς δεν είναι κλινικά εγκεκριμένα και επομένως δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο.

Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), μία κινάση σερίνης /θρεονίνης, είναι ένα προς τα κάτω στόχος του ΡΙ3Κ και οδούς ΑΚΤ , και αυτό παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό [27] – [29]. Η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και την επακόλουθη φωσφορυλίωση της mTOR εκκινεί τη φωσφορυλίωση των σημαντικών κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων ριβοσωμικό p70S6 σερίνης /κινάσης θρεονίνης (S6K1) και παράγοντα ευκαρυωτικό έναρξης (ΕΤΕ) -4E πρωτεΐνης σύνδεσης (4Ε-BP1), με αποτέλεσμα την αύξηση της μετάφραση του mRNA και την πρωτεϊνική σύνθεση cap-εξαρτώμενη, αντίστοιχα. Έτσι, mTOR κινάση είναι ένας βασικός κόμβος του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [27] – [30]. Μέχρι σήμερα, έχουν διάφορα ανάλογα αναστολέας mTOR ραπαμυκίνη έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένου του temsirolimus και everolimus, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία καρκινωμάτων νεφρικών κυττάρων και νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος. Η ραπαμυκίνη και τα ανάλογά της δεσμεύονται FK506-δέσμευσης πρωτεΐνης-12 (FKBP12) και να αλληλεπιδρούν με mTOR, αναστέλλοντας τις δραστηριότητες της κινάσης της και την ανάσχεση της μετάφρασης των πρωτεϊνών κρίσιμη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση.

Επειδή mTOR είναι κατάντη και των δύο EGFR και ΚΟΑ, υποθέσαμε ότι η αναστολή του mTOR, ακόμη και ως παράγοντας μονοθεραπεία, μπορεί να μπλοκάρει EGFR- και ΚΟΑ μεσολάβηση σηματοδότησης ταυτόχρονα και να ξεπεράσουν HGF-ενεργοποιείται αντίσταση EGFR-ΤΚΙ. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αν η κλινικά εγκεκριμένο mTOR αναστολείς, temsirolimus και everolimus, παρακάμπτουν HGF-ενεργοποιείται αντίσταση EGFR-ΤΚΙ στο

EGFR

της μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα χρησιμοποιώντας το

in vitro

και

in vivo

μοντέλα, και εκτιμήθηκε υποκείμενων μηχανισμών.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταροκαλλιέργειες και τα αντιδραστήρια

EGFR

μεταλλαγμένο ανθρώπινο πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα γραμμές PC-9 (del E746_A750) και HCC827, με διαγραφές σε

EGFR

εξόνιο 19, αγοράστηκαν από την Immuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Γκούνμα, Japan) και την American Type Culture Collection (Manassas, VA ), αντίστοιχα. Ανθρώπινα

HGF

-γονίδιο επιμολύνσεων (PC-9 /HGF) και φορέας μάρτυρας κυττάρων (PC-9 /Vec) καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσον RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικά. Όλα τα κύτταρα περάστηκαν για λιγότερο από 3 μήνες πριν από την ανανέωση από κατεψυγμένα αποθέματα νωρίς διόδων. Τα κύτταρα κανονικά ελέγχονται για μυκόπλασμα, χρησιμοποιώντας MycoAlert Mycoplasma Detection κιτ (Lonza, Rockland, ΜΕ). Οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται στο εργαστήριο του Εθνικού Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Καινοτομίας (Osaka, Ιαπωνία) με σύντομη ανάλυση διαδοχική επανάληψη. Erlotinib, το everolimus, και temsirolimus ελήφθησαν από Σέλεκ Chemicals (Houston, TX). Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη HGF παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10].

Παραγωγή HGF και VEGF σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα (2 χ 10

5) καλλιεργήθηκαν σε 2 mL μέσου με 10% FBS για 24 ώρες, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για 48 ώρες σε μέσο με 10% FBS. Σε μερικά πειράματα, προστέθηκε HGF στο μέσο. Τα μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα φυλάχτηκαν στους -70 ° C μέχρι την ανάλυση. Οι συγκεντρώσεις του HGF και VEGF προσδιορίστηκαν με IMMUNIS HGF ΕΙΑ (Ινστιτούτο Ανοσολογίας, Τόκιο, Ιαπωνία) και Quantikine VEGF ELISA (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), αντίστοιχα, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν. Χρώμα ένταση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας. Οι συγκεντρώσεις παράγοντα ανάπτυξης προσδιορίστηκαν με σύγκριση με πρότυπες καμπύλες. Τα όρια ανίχνευσης για τον HGF και VEGF ήταν 100 pg /mL και 31 pg /ml, αντίστοιχα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη μέθοδο αναγωγής της χρωστικής ΜΤΤ. Τα καρκινικά κύτταρα, επιστρώνονται στα 2 χ 10

3/100 μί RPMI 1640 συν 10% FBS /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, erlotinib, temsirolimus, everolimus, ή /και HGF προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η επώαση συνεχίστηκε για επιπλέον 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με διάλυμα ΜΤΤ (2 mg /mL? Sigma, St. Louis, ΜΟ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Κάθε πείραμα διεξήχθη με δείγματα εις τριπλούν.

Αντισώματα και κηλίδωση

υποπολλαπλάσια δυτική Πρωτεΐνη (25 μg έκαστο) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS (Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου μεμβράνες (Bio-Rad). Μετά από πλύση 4 φορές, οι μεμβράνες επωάστηκαν με Blocking One (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα σε β-ακτίνη (13E5), Met (25H2), φωσφο-MET (αντι-ρ-ΚΟΑ, Y1234 /Y1235? 3D7), π-EGFR (Y1068), ΑΚΤ ή ρ-ΑΚΤ (S473), mTOR, π-mTOR (S2448), p70S6K, pp70S6K ( T389), 4Ε-BP1, p4E-ΒΡ1 (Τ37 /46) (Cell Signaling Technology, Beverly, μΑ), ανθρώπινο EGFR (1 μg /mL), ανθρώπου /ποντικού /ERK1 αρουραίο /ERK2 (0.2 μg /mL), και ρ-ERK1 /ERK2 (T202 /Y204? 0.1 μg /mL) (R &? D Systems). Μετά από 3 πλύσεις, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας είδος. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με SuperSignal West Dura παρατεταμένη διάρκεια υποστρώματος, ένα ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Ξενομοσχεύματος μελέτες σε ποντίκια SCID

Εναιωρήματα PC-9 /Vec και PC-9 κύτταρα /HGF (5 × 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως στο πίσω μέρος του 5-εβδομάδων αρσενικών ποντικών με σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) (Clea, Tokyo, Japan). Μετά από 7 ημέρες, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε καμία θεραπεία (ομάδα ελέγχου), από του στόματος erlotinib (20 mg /kg /ημέρα), ή ενδοφλέβια temsirolimus (50 mg /kg /εβδομάδα σε νερό). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε (mm

3) σαν [(πλάτος)

2 × μήκος] /2. Όλα τα πειράματα σε ζώα συμμορφωθεί με τις κατευθυντήριες γραμμές για το Ινστιτούτο Πειραματικής Ζώα, Advanced Science Research Center, Πανεπιστήμιο Kanazawa, Καναζάβα, Ιαπωνία (αριθμός έγκρισης. AP-081088).

Οι ιστολογικές αναλύσεις

Για το ανίχνευση των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων όγκου (Ki-67), 5-μm πάχους τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, και το αντιγόνο-ανακτηθεί. Για την ανίχνευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (CD31), 5-μm πάχους κατεψυγμένες τομές ξενομοσχεύματος όγκων μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη και πλένονται με PBS. Στη συνέχεια, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση σε 3% υδατικό Η

2O

2 για 10 λεπτά. Μετά την κατεργασία με 5% κανονικό ορό αλόγου, οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε Ki-67 (MIB-1) (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark), και CD31 ποντικού (MEC13.3) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ ). Μετά από ανίχνευση με βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα συγκεκριμένα είδη, οι τομές επωάστηκαν για 30 λεπτά με σύμπλοκο υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτινυλιωμένης (ABC) χρησιμοποιώντας ένα κιτ Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Το DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική) υγρού συστήματος (Dako Cytomation) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ανοσοκηλιδώσεως. Παράλειψη των πρωτογενών αντισωμάτων χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. επιλέχθηκαν οι 5 περιοχές που περιέχουν τον μεγαλύτερο αριθμό των χρωματισμένων κυττάρων μέσα σε ένα τμήμα για ιστολογική ποσοτικοποίηση του φωτός ή μικροσκοπία φθορισμού στα 400-πλάσια μεγέθυνση. Όλα τα αποτελέσματα ανεξάρτητα αξιολογήθηκαν από 2 δύο ερευνητές (D.I. και Τ.Ν.).

Η στατιστική ανάλυση

Μεταξύ συγκρίσεις ομάδα αξιολογήθηκαν από

t-

δοκιμές δύο-ουρά του Student. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Software. Ένα

P

αξία & lt? 0,01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

αναστολείς mTOR καταστέλλουν τη βιωσιμότητα του

EGFR

της μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με την παρουσία του HGF.

PC-9 και HCC827 είναι ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα γραμμές με διαγραφές εξόνιο 19 στο

EGFR

, με αποτέλεσμα συστατική ενεργοποίηση αυτής της πρωτεΐνης. Αυτές οι κυτταρικές σειρές ήταν ευαίσθητες στην erlotinib, ενώ HGF επαγόμενη αντίσταση erlotinib (Εικ. 1). Η θεραπεία με είτε αναστολέα mTOR (temsirolimus ή everolimus) μόνη κατέστειλε ευδιάκριτα τη βιωσιμότητα αυτών των κυτταρικών σειρών. Υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες, ο HGF δεν μείωσε την ευαισθησία αυτών των κυτταρικών γραμμών σε κάθε φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς mTOR μπορεί να ελέγχει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των

EGFR

μεταλλαγμένο κύτταρα καρκίνου πνεύμονα, ανεξάρτητα από την παρουσία του HGF που θα επάγουν EGFR-ΤΚΙ αντίσταση.

PC 9-ή HCC827 κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς erlotinib, temsirolimus, ή everolimus, παρουσία ή απουσία HGF (20 ng /ml) για 72 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μπαρ δείχνουν SD. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 5 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι, σε ασθενείς με NSCLC, HGF ανιχνεύεται κυρίως σε καρκινικά κύτταρα με επίκτητη αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙδ, υποδηλώνοντας ότι η παραγωγή HGF από αυτά τα κύτταρα συμβαίνει κυρίως μέσω ενός αυτοκρινούς μηχανισμού. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση των αναστολέων mTOR σε αυτοκρινείς παραγωγή HGF, δημιουργήσαμε σταθερές

HGF

-γονίδιο επιμολύνσεων στο PC-9 κύτταρα (PC-9 /HGF). PC-9 κύτταρα /HGF εκκρίνεται υψηλές συγκεντρώσεις του HGF (28 ± 1 ng /48 ώρες), ενώ οι συγκεντρώσεις του HGF εκκρίνεται από PC-9- και τον έλεγχο των φορέων-επιμολυσμένα PC-9 /Vec κύτταρα ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης. Επιπλέον, PC-9 κύτταρα /HGF έγιναν ανθεκτικά σε erlotinib (Σχ. 2). Βρήκαμε ότι temsirolimus ή everolimus μειώνεται αισθητά τη βιωσιμότητα τόσο των PC-9 /Vec και PC-9 κύτταρα /HGF στον ίδιο βαθμό, ενώ ο συνδυασμός του αναστολέα mTOR συν erlotinib δεν είχε καμία επίδραση σε PC-9 /Vec κυττάρων παρουσία του HGF, υποδεικνύοντας ότι οι αναστολείς mTOR δεν ευαισθητοποιεί περαιτέρω αυτά τα κύτταρα να erlotinib

in vitro

(Εικ. S1). Γκρεμίζω του mTOR με siRNA είχε σαν αποτέλεσμα την αναστολή της βιωσιμότητας των PC-9 /Vec και κύτταρα /HGF 9 PC-κατά 30% (Σχ S2 Β), υποδεικνύοντας ότι ανέστειλε κυτταρική βιωσιμότητα με temsirolimus ακόμη και με την παρουσία του HGF οφείλεται mTOR αναχαίτηση. Πραγματοποιήσαμε επίσης κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V και διαπίστωσε ότι temsirolimus δεν προκάλεσε αισθητή την απόπτωση σε PC-9 /κύτταρα HGF (Εικ. S3) PC-9 /Vec ή. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι αναστολείς mTOR, όταν χρησιμοποιείται σαν απλούς παράγοντες, καταστέλλουν την ανάπτυξη του

EGFR

της μεταλλαγμένης καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μέσω αναστολής του πολλαπλασιασμού και όχι επαγωγή της απόπτωσης.

PC-9 /Vec και PC κύτταρα -9 /HGF επωάστηκαν με erlotinib (Α), temsirolimus (Β), ή everolimus (C) για 72 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μπαρ δείχνουν SD. (D) κύτταρα PC-9 /Vec και PC-9 /HGF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς erlotinib (0,3 μΜ), temsirolimus (0,3 μΜ), ή everolimus (0,3 μΜ) για 4 ώρες. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

αναστολείς mTOR καταστολή φωσφορυλίωσης p70S6K και 4EBP1 ακόμα και με την παρουσία του HGF

Για να εξερευνήσετε τον μοριακό μηχανισμό με τον οποίο οι αναστολείς mTOR κατέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα ακόμη και με την παρουσία του HGF, εξετάσαμε την έκφραση πρωτεΐνης και φωσφορυλίωση κατάσταση του EGFR, ΜΕΤ, και κατάντη μόριά τους (ERK1 /2, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, p70S6K, και 4EBP1) σε PC-9 /Vec και PC- 9 κύτταρα /HGF με κηλίδωση Western (Σχ. 2D). Vec κύτταρα PC-9 /εξέφρασε EGFR και μετεωρολογικές πρωτεΐνες, ενώ μόνο EGFR ήταν ευδιάκριτα φωσφορυλιωμένη. Η erlotinib ανέστειλε αξιοσημείωτα τη φωσφορυλίωση του EGFR, καθώς και οι μεταγενέστεροι ERK1 /2 και ΑΚΤ, αλλά οριακά ανέστειλε φωσφορυλίωση p70S6K. Ενώ ούτε temsirolimus, ούτε everolimus επηρέασε την φωσφορυλίωση του EGFR, ΚΟΑ, ERK1 /2 ή ΑΚΤ, που ανέστειλε την φωσφορυλίωση της p70S6K και 4EBP1, οι μεταγενέστεροι μόρια του mTOR.

PC 9-/κυττάρων HGF, ΚΟΑ ήταν επίσης φωσφορυλιωμένο, προφανώς λόγω HGF που παρήχθη με αυτοκρινή τρόπο. Η erlotinib ανέστειλε φωσφορυλίωση του EGFR, αλλά δεν αξιοσημείωτα αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ΚΟΑ, AKT, p70S6K, ή 4EBP1. Ενώ ούτε temsirolimus, ούτε everolimus ανέστειλε την φωσφορυλίωση του EGFR, ΚΟΑ, ERK1 /2, ή ΑΚΤ, που ανέστειλε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της p70S6K και 4EBP1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αναστολείς mTOR καταστέλλουν τη φωσφορυλίωση των κατάντη μορίων του mTOR, ανεξάρτητα από την παρουσία του HGF.

αναστολή mTOR καταστέλλει τον επαγόμενο από HGF ανάπτυξη της erlotinib ανθεκτικών όγκων

in vivo

επόμενο αξιολογηθεί κατά πόσον οι αναστολείς mTOR θα ελέγχουν την ανάπτυξη των

EGFR

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με HGF-ενεργοποιείται EGFR-ΤΚΙ-αντίσταση

in vivo

. Η στοματική χορήγηση της erlotinib κατέστειλε την ανάπτυξη του PC-9 /Vec-όγκους, αλλά όχι PC-9 όγκους /HGF, υποδεικνύοντας αντίσταση του PC-9 /HGF όγκων να erlotinib

in vivo

(Εικ. 3Α). Από την άλλη πλευρά, η ενδοφλέβια χορήγηση του temsirolimus κατέστειλε την ανάπτυξη και των δύο PC-9 /Vec όγκους και PC-9 όγκους /HGF. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του mTOR μπορεί να είναι χρήσιμη για τον έλεγχο της ανάπτυξης του HGF που επάγεται ανθεκτικών όγκων

in vivo

.

(Α) ποντίκια SCID που φέρουν PC-9 /Vec ή PC-9 /HGF όγκοι χορηγήθηκαν 25 mg /kg μία φορά την ημέρα erlotinib ή μετρήθηκε 50 mg /kg temsirolimus μια φορά την εβδομάδα από την ημέρα 8 έως την ημέρα 20. ο όγκος του όγκου χρησιμοποιώντας παχύμετρο κατά τις υποδεικνυόμενες ημέρες. Οι μέσοι όγκοι των όγκων ± SE παρουσιάζονται για ομάδες των 5 ποντικών. * Ρ & lt? 0,01 (μονόδρομη ΑΝΟνΑ). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 2 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) ποντίκια SCID με PC-9 /Vec ή PC-9 /HGF όγκους χορηγήθηκαν 25 mg /kg erlotinib άπαξ ημερησίως για 4 ημέρες ή 50 mg /kg μία φορά την temsirolimus από την ημέρα 8. Τέσσερις ώρες μετά την τελική χορήγηση erlotinib, όγκοι ήταν συγκομίζονται, και τα σχετικά επίπεδα των πρωτεϊνών στα λύματα του όγκου προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western.

η

αξιολογηθούν περαιτέρω οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους temsirolimus ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-9 /HGF-όγκους. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψαν ότι erlotinib ανέστειλε αξιοσημείωτα τη φωσφορυλίωση του EGFR, ERK1 /2, και ΑΚΤ, και ελαφρώς κατέστειλε την φωσφορυλίωση της p70S6K σε PC-9 /Vec-όγκους (Σχ. 3Β). Ενώ erlotinib αξιοσημείωτα ανέστειλε φωσφορυλίωση του EGFR, είναι μόνο ανέστειλε ελαφρώς ERK1 /2 και φωσφορυλίωση p70S6K, ενώ δεν αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε PC-9 /HGF-όγκους. Από την άλλη πλευρά, αν και temsirolimus δεν επηρέασε σημαντικά τη φωσφορυλίωση του EGFR ή ERK1 /2 και στα δύο PC-9 /Vec όγκους και PC-9 όγκους /HGF, αυτό αξιοσημείωτα ανέστειλε φωσφορυλίωση p70S6K, υποδηλώνοντας τον τρόπο δράσης αυτού του φαρμάκου ως ένας αναστολέας της mTOR.

είναι ενδιαφέρον, το temsirolimus ανέστειλε ελαφρώς την φωσφορυλίωση της Akt σε PC-9 όγκους /HGF, αλλά αυξημένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ στο PC-9 κύτταρα /HGF

in vitro

κατάσταση (Εικ. 2D). Για να διευκρινιστεί η αιτία αυτής της ασυμφωνίας, εξετάσαμε τη χρονική πορεία της θεραπείας αναστολέα mTOR στην φωσφορυλίωση της ΑΚΤ

in vivo

(Εικ S4). Βρήκαμε ότι, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του

in vitro πειράματα

, φωσφορυλίωση της ΑΚΤ στους όγκους αυξήθηκε 4 ώρες μετά τη θεραπεία temsirolimus. Στη συνέχεια, όμως, το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ μειώθηκε και ήταν ελαφρώς αναστάλθηκε σε 96 ώρες μετά την επεξεργασία, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχ. 3Β. Ως εκ τούτου, η διαφορά των αποτελεσμάτων μεταξύ Σχ. 2D και το Σχ. 3Β ήταν λόγω της διαφοράς των δειγμάτων χρονισμού συλλέχθηκαν.

αναστολή mTOR καταστέλλει την αγγειογένεση

in vivo

Η

Επίσης εξετάσαμε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Ki-67) και την αγγειογένεση (CD31) με ανοσοϊστοχημεία. θεραπεία Η erlotinib ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση σε PC-9 /Vec ξενομοσχεύματα, ενώ η erlotinib δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή αγγειογένεση σημαντικά σε PC-9 /HGF ξενομοσχεύματα (Εικ. 4). Σε αντίθεση, το temsirolimus ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση σε δύο PC-9 /Vec και PC-9 όγκους /HGF. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι temsirolimus αναστέλλει την ανάπτυξη των PC-9 όγκους /HGF (τουλάχιστον εν μέρει) με αναστολή της αγγειογένεσης.

ποντίκια SCID με PC-9 /Vec ή PC-9 /HGF όγκους χορηγήθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχ. 3Β. Τέσσερις ώρες μετά την τελική χορήγηση της erlotinib, οι όγκοι συλλέχθηκαν, και πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Α, Β: Ki-67) και την αγγειογένεση (C, D: CD31) προσδιορίστηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Β και D δείχνουν τον ποσοτικό προσδιορισμό των θετικών κυττάρων.

* Ρ & lt? 0,01, (μονόδρομη ΑΝΟνΑ). Μπαρ δείχνουν SD.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους temsirolimus ανέστειλε την αγγειογένεση, εξετάσαμε την επίδρασή της στην παραγωγή καρκινικών κυττάρων του VEGF, μια εξέχουσα προ-αγγειογενετική μόριο. Τόσο PC-9 και PC-9 /Vec κύτταρα συντακτικά παράγονται ανιχνεύσιμα επίπεδα του VEGF, το οποίο διεγείρεται από HGF (Εικ. 5Α). Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, τα κύτταρα PC-9 /HGF παρήγαγαν υψηλότερα επίπεδα VEGF από PC-9 και PC-9 /Vec κύτταρα. Temsirolimus κατέστειλε παραγωγή VEGF σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα με την παρουσία ή απουσία HGF. Γκρεμίζω του mTOR με siRNA είχε σαν αποτέλεσμα αναστολή της παραγωγής VEGF με PC-9 /Vec και PC-9 κύτταρα /HGF, όπως ακριβώς και θεραπεία temsirolimus (Σχ S2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ανέστειλαν την παραγωγή VEGF από temsirolimus ακόμη και με την παρουσία του HGF οφείλεται στην αναστολή mTOR. Εκτιμήσαμε επίσης την άμεση επίδραση του temsirolimus για τη βιωσιμότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων

in vitro

. Temsirolimus δεν ανέστειλε συστατική βιωσιμότητα των κυττάρων HMVEC στο μέσο μόνο με 10% FBS (Σχήμα 5Β). VEGF και HuMedia-MVG, τα οποία περιέχουν EGF και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-2 (FGF-2), αύξησε την βιωσιμότητα του HMVECs. Temsirolimus, σε συγκεντρώσεις 1 ηΜ και υψηλότερα, ανέστειλε αυτή την αύξηση της βιωσιμότητας. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι temsirolimus αναστέλλει την αγγειογένεση με πολλαπλούς μηχανισμούς.

(Α) Καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς HGF (50 ng /ml) με την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του temsirolimus για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων του όγκου μετρήθηκε. συγκέντρωση VEGF στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με ELISA. Τα επίπεδα του VEGF διορθώνονται από τον αριθμό των κυττάρων του όγκου που φαίνεται. (Β) HMVECs επωάστηκαν σε RPMI-1640 με 10% FBS (έλεγχος), RPMI-1640 με 10% -FBS συν VEGF, ή HuMedia-MVG με διαφορετικές συγκεντρώσεις του temsirolimus για 72 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μπαρ δείχνουν SD. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι 2 ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι οι αναστολείς mTOR κατέστειλε την ανάπτυξη του

EGFR

μεταλλαγμένο πνεύμονα καρκινικά κύτταρα, ακόμα και με την παρουσία του HGF,

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι οι αναστολείς mTOR καταστέλλουν την αγγειογένεση με αναστολή της παραγωγής VEGF και ενδοθηλιακά πολλαπλασιασμός διεγείρεται με διάφορες προ-αγγειογονικούς παράγοντες. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς mTOR, όπως μονοθεραπευτικές παράγοντες, είναι χρήσιμες για τον έλεγχο της εξέλιξης της

EGFR

καρκίνο του πνεύμονα και μεταλλαγμένο HGF-πυροδότησε αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙδ.

HGF, που ονομάζεται επίσης συντελεστής διασποράς , είναι μια πολυλειτουργική κυτοκίνη [31]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η HGF εμπλέκεται στην καρκινογένεση, εισβολή /κινητικότητα, EMT, αγγειογένεση, μετάσταση και στον καρκίνο του πνεύμονα, και είναι ως εκ τούτου συνδέεται με κακή πρόγνωση των ασθενών [32]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι HGF επάγει EGFR-ΤΚΙ-αντίσταση στο

EGFR

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα από την αποκατάσταση της ΚΟΑ /PI3K /AKT οδό σηματοδότησης [10]. HGF υπερέκφραση εμπλέκεται όχι μόνο στην επίκτητη αντοχή, αλλά και ενδογενή ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs [21]. Επιπλέον, ο HGF διεγείρει την παραγωγή του VEGF από

EGFR

μεταλλαγμένο κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, καθώς επίσης διευκολύνει την αγγειογένεση, προωθώντας έτσι την εξέλιξη του όγκου [24]. HGF υπερέκφραση συχνά συν-ανιχνευθούν με την

EGFR

-T790M φύλακα μετάλλαξη στο απέκτησε ανθεκτικά όγκους [9], [11], [21]. HGF επάγει αντίσταση σε μη αναστρέψιμη EGFR-TKIs και μεταλλαγμένων EGFR-επιλεκτική TKIs [33], τα οποία αναπτύχθηκαν για να ξεπεραστούν Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση EGFR-ΤΚΙ. Πρόσφατες κλινικές μελέτες με μη αναστρέψιμες μονοθεραπεία TKI δεν μπόρεσε να αποδείξει την αντικειμενική ανταπόκριση στο

EGFR

της ασθενείς με μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα, που ήταν ανθεκτικοί στη θεραπεία με την αναστρέψιμη EGFR-TKIs-gefitinib και erlotinib [34]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η συνύπαρξη των αλλαγμένη σηματοδότησης HGF συμβάλλει στη δυσμενή αντίδραση σε μη αναστρέψιμη EGFR-TKIs σε αυτούς τους ασθενείς [32]. Επιπλέον, η παρουσία του HGF επιταχύνει την ανάπτυξη των προϋπάρχον EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικών κλώνων που φιλοξενούν

MET

ενίσχυσης [35]. Πιο πρόσφατα, ο HGF έχει αναφερθεί ότι επάγει αντίσταση σε αλκ εκλεκτικοί αναστολείς σε

EML4-ALK

καρκίνο του πνεύμονα [36] και οι αναστολείς BRAF σε

BRAF

μεταλλαγμένο μελανώματος [37]. Τέτοια συσσώρευση στοιχεία δείχνουν ότι ο HGF είναι ένας κοινός στόχος για την υπέρβαση αντίσταση σε στοχευμένα φάρμακα σε ογκογονίδιο-εθισμένος όγκους.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι οι αναστολείς mTOR έχει πλεονέκτημα των διαφόρων μηχανισμών για να καταστείλει την ανάπτυξη της αντίστασης του EGFR ΤΚΙ ενεργοποιείται από HGF στο

EGFR

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Για παράδειγμα, αυτοί οι αναστολείς πιθανό σήματα επιβίωσης μπλοκ mTOR /p70S6K /4E-BP1 που συνήθως ασχολούνται κατά την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σε καρκινικά κύτταρα. Ο /AKT /mTOR μονοπάτι PI3K συμβάλλει στην επιβίωση του

EGFR

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα [38], [39]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι αυτή η οδός είναι επίσης ζωτικής σημασίας για την απόκτηση HGF-προκάλεσε αντίσταση σε EGFR-TKIs στο

EGFR

της μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [40]. Στην παρούσα μελέτη, τόσο temsirolimus και everolimus μερικώς κατέστειλε την φωσφορυλίωση της p70S6K και 4Ε-BP1, καθώς και ανέστειλε την επιβίωση του

EGFR

μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Έτσι, οι αναστολείς mTOR επιτευχθεί η αναστολή της ανάπτυξης με την καταστολή τόσο σήματα επιβίωσης από EGFR και σήματα αντίσταση από ΜΕΤ σε καρκινικά κύτταρα.

Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός είναι η αναστολή της αγγειογένεσης. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι mTOR μεσολάβηση σηματοδότηση διεγείρει μεταγραφή HIF-1α, η οποία ρυθμίζει VEGF, μέσω φωσφορυλίωσης 4Ε-ΒΡ1 [41]. Οι αναστολείς mTOR καταστέλλουν μεταγραφή HIF-1α και έτσι να αναστέλλουν την παραγωγή του VEGF [28], [29], [41] – [43]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι HGF ενεργοποιεί την ΚΟΑ /Gab1 οδό και αυξάνει την παραγωγή του VEGF από

EGFR

της μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [24]. Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε αυτό το εύρημα και περαιτέρω απέδειξε ότι οι αναστολείς mTOR κατέστειλε τόσο συστατική παραγωγή VEGF και HGF-διεγείρεται η παραγωγή VEGF. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ενώ οι αναστολείς mTOR δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των μη διεγερμένων ενδοθηλιακών κυττάρων, αυτά ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών διεγείρεται με διάφορες προ-αγγειογόνοι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του VEGF. mTOR ενεργοποιείται μετά την εμπλοκή αρκετών κινασών τυροσίνης υποδοχέα όπως VEGFR-2, EGFR, FGFR και-1 [41]? ως εκ τούτου, οι αναστολείς mTOR μπορεί να καταργήσει τη διέγερση που προκαλείται από πολλαπλούς προ-αγγειογόνοι παράγοντες σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς mTOR μπορεί να καταστείλει την αγγειογένεση κατά τουλάχιστον 2 τρόπους των δράσεων. Πρώτον, μπορούν να αναστέλλουν την παραγωγή του VEGF, ακόμη και με την παρουσία του HGF. Δεύτερον, μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων που διεγείρεται με διάφορες προ-αγγειογονικούς παράγοντες.

αποτελέσματα πρόσφατων κλινικών δοκιμών με στοχευμένα φάρμακα δείχνουν την σημασία της επιλογής του ασθενούς. Για παράδειγμα, το ποσοστό ανταπόκρισης των gefitinib ήταν μόνο 10-20% σε μη επιλεγμένους NSCLC [44], αλλά ήταν περίπου 80% το

EGFR

μετάλλαξη-θετικό NSCLC [43]. Η επιβίωση χωρίς εξέλιξη της

EGFR

ασθενείς με μετάλλαξη του καρκίνου του πνεύμονα ήταν επίσης πολύ μεγαλύτερη από εκείνη των NSCLC ασθενείς μη επιλεγμένων [45]. Ενώ έχει αναπτυχθεί ένας μεγάλος αριθμός αναστολέων mTOR και αξιολογούνται σε κλινικές δοκιμές στον καρκίνο του πνεύμονα, ούτε του sirolimus, temsirolimus, ή everolimus, όταν χρησιμοποιείται ως μονοθεραπευτικές παράγοντες, δείχνουν κλινική αποτελεσματικότητα σε μη επιλεγμένους NSCLC [46] [47]. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες των αναστολέων mTOR σε συνδυασμό με EGFR-ΤΚΙ επίσης απέτυχε να δείξει κλινικό όφελος σε μη επιλεγμένους NSCLC [46], [48] – [50]. τρέχουσα μελέτη μας είναι προκλινικές και αποδείξαμε ότι οι αναστολείς mTOR έδειξαν σημαντική αποτελεσματικότητα στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με αντίσταση HGF μεσολάβηση σε αντίσταση EGFR-ΤΚΙ τόσο

in vitro

και

in vivo

. Dong et al. ανέφεραν επίσης την αντικαρκινική δραστικότητα των αναστολέων mTOR έναντι EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική

EGFR

μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με την μετάλλαξη Τ790Μ φύλακα [51]. Και οι δύο HGF και Τ790Μ μεταλλάξεις φύλακα συχνά ανιχνεύονται σε ανθεκτικούς όγκους EGFR-ΤΚΙ, όπου συμβάλλει στην αντίσταση. Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις αυτές καταδεικνύουν την αναγκαιότητα των κλινικών δοκιμών με αναστολείς mTOR στο

ασθενών EGFR

μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα οι οποίοι γίνονται ανθεκτικοί στη gefitinib και erlotinib. Επιπλέον, δεδομένου ότι HGF προσδίδει αντοχή σε στοχευμένες φάρμακα σε διάφορους τύπους όγκων, οι κλινικές δοκιμές των αναστολέων mTOR δικαιολογημένη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. αναστολείς

mTOR δεν ευαισθητοποιήσει περαιτέρω

EGFR

της μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα στην erlotinib

in vitro

. Vec κύτταρα PC-9 /επωάστηκαν με ή χωρίς temsirolimus (Α) ή everolimus (Β), με την παρουσία ή απουσία HGF (20 ng /ml) και erlotinib (0,3 μΜ) για 72 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μπαρ δείχνουν SD. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062104.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Νοκ-κάτω της αύξησης ανέστειλε κυττάρων mTOR και την παραγωγή VEGF. Καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με mTOR ή ελέγχουν siRNA για 24 ώρες και (Α) τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western.