Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι διαλυτές guanylyl κυκλάσης (sGC) διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε μονοξείδιο του αζώτου (NO) μεσολάβηση της μεταγωγής σήματος στο καρδιαγγειακό, νευρικό και το γαστρεντερικό σύστημα. Εναλλακτική RNA συναρμολόγηση έχει αναδειχθεί ως πιθανός μηχανισμός για να ρυθμίζει έκφραση και δραστικότητα sGC. C-α1 sGC είναι μία εναλλακτική μορφή ματίσματος που είναι ανθεκτική σε αποικοδόμηση πρωτεΐνης οξείδωση που προκαλείται και καταδεικνύει προτιμησιακή υποκυτταρική κατανομή με το οξειδωμένο περιβάλλον του ενδοπλασματικού δικτύου (ER).

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εδώ αναφέρουμε ότι μάτισμα του C-α1 sGC μπορεί να ρυθμίζεται με H

2O

2 θεραπεία σε BE2 νευροβλάστωμα και MDA-MD-468 ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το H

2O

2 θεραπεία των κυττάρων MDA-MD-468 κύτταρα μειώνεται επιλεκτικά τα επίπεδα πρωτεΐνης του PTBP1 και παραγόντων /B1 ματίσματος hnRNP Α2 ταυτοποιείται ως ρυθμιστές μάτισμα δυναμικό γονίδιο α1 με

in silico

ανάλυση. Έχουμε αποδείξει επιπλέον ότι κάτω ρύθμιση των PTBP1 από H

2O

2 λαμβάνει χώρα σε επίπεδο πρωτεΐνης με μεταβλητή ρύθμιση που παρατηρείται σε διάφορα κύτταρα καρκίνου του μαστού.

Συμπεράσματα /Σημασία

μας τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι H

2O

2 ρυθμίζει μάτισμα RNA για να επάγει την έκφραση του ανθεκτικού στην οξείδωση C-α1 sGC υπομονάδας. Μπορούμε επίσης να αναφέρουμε ότι H

2O θεραπεία

2 μεταβάλλει επιλεκτικά την έκφραση των βασικών ρυθμιστών μάτισμα. Αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής προσαρμογής σε συνθήκες οξειδωτικού στρες

Παράθεση:. Cote GJ, Zhu W, Thomas A, Martin Ε, Murad F, Sharina IG (2012) Υπεροξείδιο του υδρογόνου Alters Συγκόλληση της Διαλυτό guanylyl Κυκλάσης και επιλεκτικά Διαμορφώνει Έκφραση των Ρυθμιστικών Αρχών Συγκόλληση σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 7 (7): e41099. doi: 10.1371 /journal.pone.0041099

Επιμέλεια: Marcelo Γ Bonini, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16, Νοέμβρη, 2011? Αποδεκτές: 21 του Ιουνίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Cote et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ χορηγεί RO1 HL088128 και 3R01HL088128 και AHA South Central θυγατρικών Grant-in-Aid 09GRNT2060182 να EM και νομαρχιακό κεφάλαια εκκίνησης για την ΚτΠ Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το εναλλακτικό μάτισμα επεκτείνει την ποικιλομορφία μεταγραφικό [1], [2] και επιτρέπει στα κύτταρα να ανταποκριθεί στις απαιτήσεις ενός συνεχώς μεταβαλλόμενου εξωκυτταρικό περιβάλλον. έχουν κοινή στρεσογόνους όπως θερμικού σοκ, πείνα αμινοξύ ή τοξικότητα αιθανόλη έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει εναλλακτικό μάτισμα [3], [4]. Το οξειδωτικό στρες επιμένει συχνά σε κυτταρικό μικροπεριβάλλον όταν υπάρχει μια ανισορροπία στην παραγωγή και την εξάλειψη των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Αυτή η ανισορροπία συνδέεται με μια πληθώρα παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένης καρκινογένεσης, καρδιαγγειακές διαταραχές και νευροεκφυλισμό [5], [6], [7], [8], [9]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ο εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να επηρεαστεί από αλλαγές στην οξειδωτική ισορροπία. Υποξική και υποξία /επανοξυγόνωση συνθήκες, οι οποίες μεταβάλλουν ROS ομοιόσταση, έχει αποδειχθεί ότι τροποποιεί μάτισμα ενός αριθμού γονιδίων σε φυσιολογικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου [10], [11], [12], [13], [14]. Επιπλέον, οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι ROS μπορεί επίσης να αλλάξει την αφθονία των παραγόντων ματίσματος ή να τροποποιήσει τους δραστηριότητα. Οι χαμηλές συγκεντρώσεις του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η

2O

2), ένα πανταχού παρόν μόριο ROS, έχει αποδειχθεί ότι επάγει φωσφορυλίωση του παράγοντα ματίσματος hnRNP C που οδηγεί σε διαμόρφωση της συγγένειας πρόσδεσης RNA του [15]. Αυξημένη έκφραση hnRNP-C βρίσκεται επίσης σε έσω χιτώνα υπερπλασία και αθηροσκλήρωση, η οποία προτείνεται να συνδέεται με αυξήσεις των H

2O

2 επίπεδα που παράγονται από ενεργοποιημένα αγγειακό ενδοθήλιο [16].

Διαλυτό γουανυλυλίου κυκλάση (sGC) είναι ένα ένζυμο κλειδί της μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) μονοπάτι σηματοδότησης και παίζει σημαντικό ρόλο στην καρδιαγγειακή, νευρωνικά και γαστρεντερικές λειτουργίες [17]. Active sGC πρωτεΐνη είναι ένα σιδηρούχο αίμη περιέχει ετεροδιμερές που αποτελείται από α και β υπομονάδες, η οποία ενεργοποιείται σε απόκριση προς τη σύνδεση του ΝΟ προς χαρακτηριστική ομάδα αίμης της. οξείδωση αίμη προτείνεται να είναι ένας από τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την εξασθένιση του NO /cGMP σηματοδότηση σε συνθήκες οξειδωτικού στρες [18]. Η sGC-ειδικός αναστολέας 1Η- [1], [2], [4] οξαδιαζολο [4,3, -α] κινοξαλιν-1-όνη (ΟϋΟ) οξειδώνει sGC σιδηρούχα αίμης στην τρισθενή μορφή για να καταστείλει την σύνδεση του ΝΟ. Η έκθεση των κυττάρων και ιστών προς ΟϋΟ πυροδοτεί αποικοδόμηση sGC λόγω αποσταθεροποίηση της sGC ετεροδιμερούς μέσω ουβικιτινίωση και στοχευμένη αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [18]. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως μία νέα εναλλακτικά ματισμένες ισομορφή του sGC, C-α1, το οποίο είναι πλήρως λειτουργικό, παρά την εκτεταμένη εξάλειψη στο Ν-άκρο [19]. Παραδόξως, μορφή ματίσματος C-α1 ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στην αποικοδόμηση πρωτεΐνης που επάγεται από την αγωγή με ΟϋΟ [19] και είχε μια διαφορετική κυτταρική εντόπιση στη διαφοροποίηση βλαστικών κυττάρων από την κανονική α1 sGC [20]. Πρόσφατες μελέτες από Kraehling et al. αποκάλυψε ότι, σε αντίθεση με την κανονική α1 sGC ισομορφή, η C-α1 ισομορφή τείνει να εντοπίζεται στο περισσότερο οξειδωμένο περιβάλλον του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) στο εσωτερικό του κυττάρου [21]. Αυτές οι παρατηρήσεις μας οδήγησαν να προτείνει ότι η έκφραση της εναλλακτικής C-α1 πρωτεΐνης ισομορφή μπορεί να προκαλείται από το οξειδωτικό στρες ως μέρος του μηχανισμού προσαρμογής για τη διατήρηση δραστηριότητας sGC σε οξειδωτικές συνθήκες.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αν μάτισμα γονιδίου sGC α1 μπορεί να διαμορφωθεί ROS, συγκεκριμένα, με την κατεργασία με H

2O

2. Βρήκαμε ότι H

2O

2 επάγει την έκφραση του c-α1 μεταγραφής και C-α1 πρωτεΐνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν α1 /β1 sGC. Σε μια προσπάθεια να αποκτήσουν εικόνα για ρυθμιστικού μηχανισμού, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης αρκετών πρωτεϊνών σύνδεσης RNA δυνητικά εμπλέκονται στην μάτισμα C-α1 παραλλαγή ματίσματος. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι H

2O θεραπεία

2 μειώνει επιλεκτικά την έκφραση του υποθετικού α1 sGC ρυθμιστικές μάτισμα PTBP1 και hnRNP Α2 /Β1. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι H

2O

2-επαγόμενη αποικοδόμηση του PTBP1 διαφέρει σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που αποδεικνύει ότι H

2O

2 που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες επηρεάζει εναλλακτικό μάτισμα των sGC και επιλεκτικά ρυθμίζει το επίπεδο της πρωτεΐνης των σημαντικών παραγόντων ματίσματος.

Αποτελέσματα

H

2O

2 επάγει την έκφραση των C-α1 sGC παραλλαγή ματίσματος

για να διερευνηθεί εάν εναλλακτικό μάτισμα του GUCY1A3 (α1 γονίδιο υπομονάδας sGC) ρυθμίζεται σε απάντηση στο οξειδωτικό στρες, που αντιμετωπίζονται τα ανθρώπινα MDA468 καρκίνωμα του μαστού και ανθρώπινου νευροβλαστώματος κυτταρικές σειρές BE2 με 1 mm H

2O

2. MDA468 και BE2 κύτταρα εκφράζουν ενδογενώς α1 και β1 sGC. Η H

2O

συγκέντρωση 2 επελέγη με βάση προηγούμενες παρατηρήσεις αποδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες ορού σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας, η απορρόφηση από τις κυτταρικές μεμβράνες και εξουδετέρωση με ενζυματική συστατικά των κυτταρικών αντι-οξειδωτική άμυνα καταναλώνουν ένα σημαντικό μέρος του εξωγενώς προστιθέμενης H

2O

2 [22], [23]. MDA468 και BE2 κύτταρα έδειξαν σημαντική αύξηση στο C-α1 sGC εναλλακτική έκφραση μεταγράφου κατόπιν H

2O

2 θεραπεία (Εικ. 1 Α, Β). Η σχετική αύξηση του C-α1 ισομορφή σε σύγκριση με α1 μεταγραφής ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα BE2, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας [19]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GUCY1A3 μάτισμα μεταβάλλεται για να επιτραπεί η αναγνώριση των C-α1 ειδικό 3 ‘θέση ματίσματος στο εξώνιο 4 σε απόκριση H

2O

2 έκθεση. Αν και σε μερικά πειράματα το επίπεδο της C-α1 αυξήθηκε κατά ΟϋΟ, ούτε κυτταρική γραμμή κατέδειξε στατιστικώς σημαντικές αλλαγές στην στάθμη C-α1 μεταγραφής υποδηλώνει ότι η θεραπεία μόνη ΟϋΟ δεν είναι επαρκής για να επηρεάσει ρύθμιση ματίσματος

:. RT- PCR ανίχνευση του α1 (επάνω) και C-α1 (κάτω ζώνη) μεταγραφές sGC μετά από θεραπεία με H

2O

2 (1 mM) ή ΟϋΟ (20 μΜ), όπως υποδεικνύεται. Τα προϊόντα RT-PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 3% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Άνω ζώνη αντιπροσωπεύει το μήνυμα που κωδικοποιεί κανονική πρωτεΐνη α1 (μεταγραφές 1-4, 270 bp)? μεσαία ζώνη είναι ένα μη-ειδικό προϊόν? κάτω μπάντα δείχνει την C-α1 sGC μεταγραφή (Απομαγνητοφώνηση 5, 94 bp). Βιολογική τριπλότυπα αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται. Β: Αναλογία (μέση ± SD) της σχετικής αφθονίας των C-α1 και α1 μεταγραφές ποσοτικά με πυκνομετρία. * Ρ & lt? 0.05 με t-test του Student. C: ανίχνευση με στύπωση Western των α1 (επάνω) και C-α1 (κάτω) πρωτεΐνες. κύτταρα MDA468 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM H

2O

2, όπως υποδεικνύεται με την παρουσία ή απουσία του MG132 (10 μΜ). Ορατή κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. D: Λόγος του σχετική αφθονία των πρωτεϊνών C-α1 και α1 ποσοτικά με πυκνομετρία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την χρονική πορεία των αλλαγών σε αφθονία του α1 και C-α1 πρωτεΐνες sGC σε απόκριση H

2O

2. Συμπίπτει με αυξήσεις στην GUCY1A3 μάτισμα παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από το χρόνο διαμόρφωσης του α1 και C-α1 επίπεδα πρωτεΐνης sGC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C και D, H

2O

2 αύξησε το σχετικό περιεχόμενο του C-α1 πρωτεΐνης σε MDA468 κύτταρα. Για να εκτιμηθεί η συμβολή του πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση σε ρύθμιση των α1 μορφών ματίσματος sGC, εκτελέσαμε το πείραμα παρουσία MG132, ενός ισχυρού αναστολέα πρωτεασώματος κύτταρο-διαπερατό. Βρήκαμε ότι η προ-θεραπεία με MG132 δεν επηρέασε το ρυθμό συσσώρευσης του C-α1 παραλλαγή ματίσματος, ή το επίπεδο της κανονικής α1 sGC υπομονάδας. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η παρατηρούμενη αύξηση του C-α1 πρωτεΐνη αφθονία (Εικ. 1ϋ) είναι πιθανό να οφείλεται σε επαυξημένης C-α1 έκφραση, και όχι σε μια επιλεκτική αποδόμηση της κανονικής α1 sGC. Αξιοσημείωτο είναι ότι η θεραπεία MG132 αυξημένα επίσης τα επίπεδα ενός άγνωστου πολυπεπτιδίου που αναγνωρίζονται από αντι-α1 αντισώματα με μοριακό βάρος χαμηλότερο από C-α1 sGC (Σχ. 1D). Καθώς η ταυτότητα αυτής της πρωτεΐνης μένει να καθοριστεί, η ένταση της δεν είχε συμπεριληφθεί στην ανάλυση πυκνομετρίας.

Μαζί τα αποτελέσματά μας πρότεινε H

2O

2 προκαλεί προνομιακή μάτισμα και την έκφραση των C-α1 μορφή ματίσματος sGC σε μοντέλα κυττάρων μας.

στο silico

ανάλυση εντοπίζει πιθανούς α1 sGC (GUCY1A3) ρυθμιστές μάτισμα

Για να αποκτήσουν την αρχική εικόνα για πιθανούς μηχανισμούς της α1 μάτισμα sGC κανονισμού, πραγματοποιήσαμε

in silico

ανάλυση χρησιμοποιώντας διάφορα εργαλεία βιοπληροφορικής [24]. Η παραλλαγή ματίσματος C-α1 παράγεται με τη χρήση ενός εναλλακτικού ‘θέση ματίσματος 3 179 ζεύγη βάσεων καθοδικά του συστατική θέση (Εικ. 2Α, το Σχ. S1). Καταστατική και εναλλακτικές θέσεις ματίσματος για το εξώνιο 4 της α1 sGC ορίστηκαν με το εργαλείο UCSC γονιδίωμα Βιοπληροφορικής και η σχετική συναίνεση αξία τους εξετάζονται με τη βοήθεια του Ανθρώπου Συγκόλληση Finder [25], [26]. Το εναλλακτικό μάτισμα του εξονίου 4 παίζει κεντρικό ρόλο στην πολυμορφία μεταγραφή GUCY1A3? εκτός από την συστατική θέση, το εξώνιο περιέχει 2 εναλλακτικές θέσεις δότη και 2 εναλλακτικές θέσεις δέκτη (βλέπε Εικ. 2Α και σχ. S1). Με την εξαίρεση της συστατικής 5 ‘θέση ματίσματος του δότη, η σχετική συναίνεση ισχύς όλων των τόπων αποδείχθηκε ότι είναι χαμηλό (Σχ. S1). Αυτό είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό, εναλλακτικά, επεξεργασία εξώνια που πιστεύεται ότι διευκολύνει τη ρύθμιση από την σερίνη-αργινίνη πλούσια (SR) και ετερογενές πυρηνικό ριβονουκλεοπρωτεΐνης (hnRNP) πρωτεΐνες [2]. Η ASD, εναλλακτικό μάτισμα /εργαλείο Συγκόλληση Rainbow από την Ευρωπαϊκή Βιολογίας Εργαστήριο Μοριακής [27], χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το σχετικό εξόνιο και εγγύς ακολουθίες ιντρονίου για τους πιθανούς ρυθμιστές της εξόνιο 4 μάτισμα SR και hnRNP. Έχουμε δημιουργήσει μια σύνθετη εικόνα των θέσεων δέσμευσης ρυθμιστή χρήση των παράγωγων τιμών για μεμονωμένες SR και hnRNP πρωτεΐνες (Πίνακας S1). Αυτή η ανάλυση εντόπισε σχετικά ομοιόμορφη κατανομή των θέσεων δέσμευσης SR όλη εξόνιο 4 και τις πλευρικές περιοχές. Ταυτόχρονα, η συστατική περιοχή τοποθεσία ιντρονίου 3 ‘θέση ματίσματος έδειξε μια πυκνή κορυφή θέσεων δέσμευσης hnRNP (Εικ. 2Α). Μια πιο προσεκτική εξέταση προσδιορίζονται σε αυτήν την ακολουθία πολλές επικαλυπτόμενες θέσεις δέσμευσης για hnRNP 2Α /Β1, πρωτεΐνης πολυπυριμιδινικής-οδό-δεσμευτική 1 (hnRNP Ι, PTBP1), SRp20, SRp40 και Χου αντιγόνου R (HuR, ELAVL1) ρυθμιστές μάτισμα (Εικ. S1) . Η θέση αυτών των χώρων πρότεινε ότι αντιστοιχεί παράγοντες ματίσματος είναι πιθανό να επηρεάσουν τη χρήση και των δύο κανονικών και των εναλλακτικών θέσεων ματίσματος, προωθώντας τη γενιά της C-α1 sGC μεταγραφή

Α:. Σχηματική αναπαράσταση της GUCY1A3 εναλλακτικό μάτισμα να δημιουργούν C-α1. Η σχετική κατανομή των προβλεπόμενων SR και hnRNP θέσεις πρόσδεσης δείχνεται. Β: Ανάλυση Western των PTBP1, hnRNP2A /1B, HuR και SR έκφραση πρωτεϊνών σε έλεγχο και H

2O

2-επεξεργασία (1 mM, 24 ώρες) MDA468 κύτταρα. C: H

2O

2 δοσοεξαρτώμενη αξιολόγηση των PTBP1 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης /B1 hnRNP Α2 MDA468 κύτταρα. Ορατή κηλίδες Western είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. D, F: Ανάλυση πυκνομετρία των επιπέδων της πρωτεΐνης /B1 PTBP1 και hnRNP Α2 αναγωγή σε β-ακτίνης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

H

2O

2 μεταβάλλει επιλεκτικά την έκφραση των παραγόντων ματίσματος

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η έκφραση επίπεδα και η σχετική στοιχειομετρία των παραγόντων ματίσματος ρυθμίζουν εναλλακτικό μάτισμα [28]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση της H

2O

2 έκθεση σχετικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης των παραγόντων ματίσματος που προσδιορίζονται από μας

in silico

ανάλυση ως πιθανές ρυθμιστικές sGC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η έκθεση των κυττάρων MDA468 με H

2O

2 μειώθηκε επιλεκτικά το επίπεδο της πρωτεΐνης του PTBP1 και hnRNP Α2 καταστολείς /Β1 μάτισμα. H

2O

2 δεν επηρέασε το επίπεδο της HuR ρυθμιστή και μόνο ελαφρώς αλλαγμένα επίπεδα της SRp40 πρωτεΐνης από SR οικογένεια των ενισχυτών μάτισμα. Και οι δύο PTBP1 και hnRNP A2 /B1 πρωτεΐνες μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε MDA468 κύτταρα (Σχ. 2 C, D και F). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η παρατηρούμενη H

2O

2-εξαρτώμενη διακόπτη στο μάτισμα του γονιδίου GUCY1A3 συμπίπτει με τις αλλαγές στο επίπεδο των ρυθμιστικών παραγόντων ματίσματος. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός και η συμβολή των ειδικών παραγόντων ματίσματος στη ρύθμιση της sGC ματίσματος μένει να καθοριστεί.

Insights στο μηχανισμό H

2O

2 που προκαλείται από την υποβάθμιση της πρωτεΐνης PTBP1

Στη συνέχεια θα διερευνηθεί το δυναμικό των μηχανισμών ρύθμισης hnRNP από H

2O

2. Επιλέξαμε να επικεντρωθεί σε PTBP1 δεδομένου ότι αυτό εκτεταμένα μελετηθεί πρωτεΐνη δέσμευσης RNA παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορα στάδια της επεξεργασίας κυτταρικού mRNA, συμπεριλαμβανομένων ματίσματος, ρύθμιση της σταθερότητας, εντοπισμός και μετάφρασης [29]. Επιπλέον, PTBP1 έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης κυττάρων καρκίνου [30], [31], [32]. Η ικανότητα του H

2O

2 για τη μείωση των επιπέδων PTBP1 πρότεινε ότι, επιπλέον, μπορεί να παίξει ένα ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής προσαρμογής στις οξειδωτικές συνθήκες. Ωστόσο, η επίδραση των αυξημένων επιπέδων ROS στην έκφραση PTBP1 δεν έχει εξεταστεί προηγουμένως.

Πρέπει πρώτα ερευνηθεί αν H

2O

2 αλλάζει PTBP1 mRNA επίπεδα σταθερής κατάστασης. ανάλυση RT-qPCR διεξήχθη με δείγματα RNA απομονωμένο από MDA468 κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές H

2O

2 συγκεντρώσεις δεν βρήκε αλλαγές στα επίπεδα PTBP1 mRNA (Εικ. 3C) που δείχνει ότι PTBP1 είναι πιθανό να ελέγχονται σε επίπεδο πρωτεΐνης. Για να εξεταστεί ο ρόλος της υποβάθμισης του πρωτεασώματος, παρακολουθήσαμε τη δυναμική των αλλαγών στην PTBP1 πρωτεΐνη σε απόκριση H

2O

2 θεραπεία για μία περίοδο 16 ώρες παρουσία ή απουσία αναστολέα πρωτεασώματος MG132. Βρήκαμε ότι PTBP1 πρωτεΐνη μειώθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο ξεκινώντας στις 8 ώρες μετά την έκθεση (Σχ. 3 Α, Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης δεν εμποδίστηκε, αλλά να ενισχυθεί, με επεξεργασία MG132. Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές στα 16 ώρες και μετέπειτα χρονικά σημεία (Σχ. 3Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, ενώ η θεραπεία MG132 έδειξε ότι η πρωτεασώματος δεν είχε άμεση επίδραση στην υποβάθμιση PTBP1, το γεγονός ότι η αναστολή της επιταχύνει την υποβάθμιση συνεπάγεται έμμεσο ρόλο στη ρύθμιση, πιθανότατα μέσα από τη σταθεροποίηση μιας άγνωστης πρωτεάσης ή πρωτεΐνη συμπαράγοντα. Η προ-επεξεργασία των κυττάρων MDA468 με κυκλοεξιμίδιο (CHX, ο αναστολέας της

de novo

σύνθεση πρωτεϊνών) επίσης δεν εμπόδισε PTBP1 μείωση, υποδεικνύοντας ότι H

2O

2 επάγει μια προϋπάρχουσα οδός αποδόμησης πρωτεϊνών (Εικ. 3D). Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι κυτταρικής απόπτωσης οδηγεί σε αποικοδόμηση PTBP1 μέσω Capase-3 ενεργοποίησης [33]. Έτσι, διερευνήσαμε την πιθανότητα η κασπάση-3 μπορεί να παίζουν ένα ρόλο στην H

2O

2 επαγόμενη PTBP1 μειώνεται. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η προσθήκη της κασπάσης-3 αναστολέα IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) δεν απέτρεψε H

2O

2-επαγόμενη αποικοδόμηση PTBP1 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται), υποδεικνύοντας ότι Caspase-3 δεν εμπλέκεται στη διαδικασία αυτή. Για να προσδιοριστεί αν άλλες εξωγενείς πηγές, εκτός από την άμεση προσθήκη H

2O

2 λύση, μπορεί να επηρεάσει τη σταθερότητα της PTB1, εφαρμόσαμε οξειδάση της γλυκόζης (GO) στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Συνεπής με την άμεση ρόλο της H

2O

2 στην επαγωγή της υποβάθμισης PTBP1, σταθερή κατάσταση παραγωγή H

2O

2 με επεξεργασία GO αναπαραχθεί το αποτέλεσμα.

: υποβάθμιση PTBP1 συμβαίνει σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο και δεν εμποδίζεται από αναστολέας πρωτεασώματος MG132. κύτταρα MDA468 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Σχ. 1C με 1 mM H

2O

2 παρουσία ή απουσία του MG132 (10 μΜ). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για να απεικονίσει την έκφραση του PTBP1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα βιολογικά αντίγραφα για κάθε επεξεργασία που φαίνεται? κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Β: ανάλυση πυκνομετρία των επιπέδων της πρωτεΐνης PTBP1 αναγωγή σε β-ακτίνης. Οι μέσοι όροι για τις αντιπροσωπευτικές βιολογικές αντίγραφα για κάθε επεξεργασία που φαίνεται. C: H

2O

2 έκθεση δεν επηρεάζει τα επίπεδα PTBP1 mRNA. κύτταρα MDA468 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις H

2O

2 για 24 ώρες. Σχετική αφθονία PTBP1 mRNA σε δείγματα αναλύθηκε με ανάλυση RT-qPCR. Μέση ΔCt ± SD για τη βιολογική τριπλούν φαίνονται. D: η υποβάθμιση PTBP1 εξαρτάται από την οξείδωση θειόλης και δεν διασώθηκε από την αναστολή της

novo

σύνθεση de πρωτεΐνης. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελείται σε κυτταρολύματα MDA468 θεραπεία για 24 ώρες με αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης cycloxemide (2 μg /ml) και διάφορους παράγοντες επαγωγής οξειδωτικού στρες: 1 mM BSO (GSH εξάντληση επαγωγέα)? 1 mM HEDS (θειόλης επαγωγέα οξείδωση) και 0,01 μονάδες /ml της γλυκόζης οξειδάσης (αυξάνει την παραγωγή των ROS). Ορατή κηλίδες Western είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

H

2O

2 επάγει μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης όπως η οξείδωση των ενδοκυτταρικών θειολών και θειολικού ανιόντα. Οι τροποποιήσεις αυτές αποτελούν αναπόσπαστο τμήμα της H

2O

2 σηματοδότηση που επηρεάζουν μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών [34]. Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι σε οξειδωτικές συνθήκες PTBP1 μπορεί να σχηματίσει διμερή λόγω του σχηματισμού ενδομοριακών γεφυρών δισουλφιδίου [35]. Πράγματι, σε πειράματα μας ανιχνεύσαμε επίσης το σχηματισμό μίας ταινίας πρωτεΐνης υψηλού μοριακού βάρους που αναγνωρίζεται από τα αντισώματα PTB1 μετά την επεξεργασία των κυττάρων με MDA468 H

2O

2 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται).

για να αξιολογηθεί η συνεισφορά της οξείδωσης θειόλης σε αποικοδόμηση PTBP1, εκθέσαμε MDA468 κύτταρα σε δύο διαφορετικές ενώσεις, για τροποποίηση του κυτταρικού μεταβολισμού θειόλης. Η αγωγή με 2-υδροξυαιθυλ δισουλφίδιο (HEDS), έναν παράγοντα που δρα ως θειόλη ειδικό οξειδωτικό, μειώθηκαν σημαντικά τα επίπεδα PTBP1 (Σχ. 3D), υποδεικνύοντας ότι η άμεση οξείδωση θειόλης θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην απόκριση PTBP1 αποικοδόμηση. Για την περαιτέρω δοκιμή εάν η αποικοδόμηση PTBP1 προκαλείται από μειωμένη δραστηριότητα κυτταρική θειόλης μείωσης για την αντιμετώπιση H

2O

2, θα αντιμετωπίζονται επίσης τα κύτταρα με L-βουτθειονίνης-S, R-σουλφοξιμίνη (BSO). BSO είναι ένα μη αναστρέψιμο αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης, μειώνοντας ενδοκυτταρική πισίνα γλουταθειόνης. Δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική υποβάθμιση του PTBP1 σε απόκριση σε BSO, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα μειωμένο επίπεδο GSH δεν είναι επαρκής για να επάγει PTBP1 (Εικ. 3D) αποικοδόμηση. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί επίσης να σχετίζεται με την εγγενή ικανότητα του MDA468 κυττάρων για να αντισταθμίσει την απώλεια GSH που προκαλείται από BSO, όπως έχει προηγουμένως αναφερθεί για κυτταρικές σειρές με υψηλή έκφραση SOD [36]. Ετσι, η οξείδωση της Cys θειολών με H

2O

2 θα μπορούσε να κινήσει το σχηματισμό των διμερών PTBP1 και να συμβάλλει στην επακόλουθη αποδόμηση της πρωτεΐνης.

H

2O

2 αποτέλεσμα επί PTBP1 πρωτεΐνη επίπεδα ποικίλλει σε διάφορες καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές

Για να προσδιοριστεί η γενικότητα της H

2O

2 που προκαλείται υποβάθμιση PTBP1, ελέγξαμε πρόσθετες γραμμές καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένων: MDA-MD-453, MDA- MD-231 και MCF7. Η ανάλυση στυπώματος Western των H

2O

2-κατεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν διάφορες βαθμούς μείωσης PTBP1 σε κύτταρα MDA468, MCF7 και MDA231, αλλά καμία αλλαγή στην MDA453 κύτταρα (Σχ. 4Α). Η αποτυχία να διεγείρει αποικοδόμηση PTBP1 σε MDA453 κυττάρων παρατηρήθηκε σε H

2O

2 συγκεντρώσεις που προκάλεσε άμεσα σημαντικές μειώσεις στην MDA468 κύτταρα (σύγκρινε Σχ. 4Β του Σχ. 2Β και C). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η έκταση της H

2O

2-επαγόμενη αποικοδόμηση του PTBP1, σκέφτηκε διαδεδομένη, εξακολουθεί να είναι μάλλον κυτταρική σειρά ειδικών. Για να διερευνηθεί αν η αντοχή σε αποδόμηση πρωτεΐνης PTBP1 σχετίζεται με αυξημένη ικανότητα των κυττάρων να επιβιώσουν του οξειδωτικού στρες, συγκρίναμε H

2O

2-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε MDA468 και τα κύτταρα MDA453. κύτταρα MDA468 ήταν λιγότερο ανθεκτικά σε H

2O

2-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (IC

50 = 450 ± 60 μΜ) σε σύγκριση με MDA453 κύτταρα (IC

50 = 660 ± 2 μΜ) (Σχ. 5 ). Σε μια προσπάθεια να συνδέσει απευθείας μια μείωση στα επίπεδα PTBP1 με H

2O

2-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα πραγματοποιήσαμε siRNA μεσολάβηση PTBP1 νοκ ντάουν στην MDA453 κύτταρα. Παρά τη μείωση μεγαλύτερη από 50% σε PTBP1 mRNA (όπως ανιχνεύθηκε με RT-qPCR), οι μετρήσεις βιωσιμότητας κυττάρων αποκάλυψε μόνο ένα μικρό ασήμαντο πτώση στην αντίσταση H

2O

2 θεραπεία (Εικ. S2). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το επίπεδο έκφρασης PTBP1 από μόνη της δεν είναι κρίσιμης σημασίας για την υποστήριξη της οξειδωτικής αντοχής σε MDA435 κύτταρα

Α:. Ανάλυση Western blot έκφρασης εξετάζοντας PTBP1 στα κύτταρα MDA231, MDA453, MDA468 και MCF7 σε επεξεργασία με 1 mM Η

2O

2 για 18 ώρες. Αντιπροσωπευτικά βιολογικά διπλά κανάλια. Β: κύτταρα MDA453 είναι ανθεκτικά στην H

2O

2 που προκαλείται υποβάθμιση PTBP1.

Επάνω πίνακας

: MDA453 κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του H

2O

2 και κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντισώματα προς PTBP1 και β-ακτίνης. Ορατή κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Κάτω πίνακα

: ανάλυση πυκνομετρίας των επιπέδων της πρωτεΐνης PTBP1 αναγωγή σε β-ακτίνης επίπεδα. Οι μέσοι όροι για τις αντιπροσωπευτικές βιολογικές αντίγραφα για κάθε κατεργασία δείχνεται.

Η

καμπύλη επιβίωσης δημιουργήθηκε σε απόκριση H

2O

2 δοσολογίας χρησιμοποιώντας trypan μέθοδο αποκλεισμού και εκφράζονται ως% της επιβίωσης σε μη κατεργασμένους ελέγχους . Η μέση ± SD τριών ανεξάρτητων περάσματα εκτελούνται εις τριπλούν φαίνονται, * – p & lt?. 0.05 από t-test του Student, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Στην έκθεση αυτή αποδεικνύει ότι το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από H

2O

2 επιρροές μάτισμα του γονιδίου α1 sGC (GUCY1A3) και επιλεκτικά μειώνει το επίπεδο της πρωτεΐνης του PTBP1 και παράγοντες /Β1 ματίσματος hnRNP Α2. Έχουμε προηγουμένως αποδειχθεί ότι οι μεταγραφές GUCY1A3 υφίστανται εναλλακτικό μάτισμα και ότι το C-α1 sGC ισομορφή συρραφής κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη η οποία είναι ανθεκτική σε ΟϋΟ επαγόμενη αποικοδόμηση [19], [37]. ΟϋΟ επάγει αποικοδόμηση μέσω οξείδωσης της ομάδας προσθετικής αίμης sGC, η οποία αποσταθεροποιεί την πρωτεΐνη. Μια παρόμοια διαδικασία έχει προταθεί να προκύψει σε συνθήκες οξειδωτικού στρες και να είναι υπεύθυνος για μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης σε sGC αγγειακής φλεγμονής [23]. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε εάν sGC μάτισμα μπορεί να ρυθμίζεται με ROS ως πιθανός μηχανισμός για την υπέρ της έκφρασης οξείδωση C-α1 μορφή ματίσματος ανθεκτικά.

H

2O

2 είναι μία πανταχού παρούσα ROS μόριο που παράγεται σε κύτταρα με δισμουτάσες υπεροξειδίου ως μεταβολίτης του ανιόντος υπεροξειδίου (O

2-). H

2O

2 είναι ένα σχετικά σταθερό και ουδέτερα φορτισμένα η οποία της επιτρέπει να εύκολα σταυρό κυτταρικές μεμβράνες. Αυτές οι ιδιότητες έχουν οδηγήσει στην πρόταση ότι H

2O

2 μπορεί να εμπλέκονται στην παρακρινούς οξειδωτικό στρες σηματοδότηση [38], [39]. Έτσι, επιλέξαμε να εξετάσουμε H

2O

2 ως μεσολαβητής του οξειδωτικού στρες σε μελέτες μας πραγματοποιείται σε ανθρώπινου νευροβλαστώματος BE2 και κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος μαστού MDA468. Τα δεδομένα μας απέδειξε για πρώτη φορά ότι η έκθεση σε H

2O

2 αυξάνει την σχετική ποσότητα του C-α1 mRNA και πρωτεΐνης σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1). Αυτό το αποτέλεσμα αποδεικνύει ότι, C-α1 μάτισμα μπορεί να ρυθμίζεται με φυσιολογικώς σχετικές ένωση ROS, και προτείνει ότι μάτισμα μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση sGC ενζυματικές ιδιότητες σε απόκριση στις μεταβολές οξειδωτική ισορροπία του μικροπεριβάλλοντος. Μια επιπλέον μελέτη για την υποστήριξη αυτής της ιδέας έχει πρόσφατα αναφερθεί από Kraehling et al. [21]. Η έκθεση αυτή επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα προηγούμενα ευρήματα μας ότι η C-α1 μορφές sGC πολύ σταθερή και πλήρως ενεργά ετεροδιμερή με β1 sGC. Επιπλέον, η διαφορά στην υποκυτταρική κατανομή του C-α1 και κανονική α1 sGC υπομονάδες έχει καταδειχθεί χρησιμοποιώντας φθοριζόντως tagged πρωτείνης? το C-α1 ισομορφή εντοπίστηκε στο περισσότερο οξειδωμένο περιβάλλον από ενδοπλασματικό δίκτυο. Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου GUCY1A3 θα μπορούσαν να συμμετάσχουν στην προσαρμοστική απόκριση των κυττάρων για τη διατήρηση της λειτουργίας sGC στο οξειδωτικό στρες. Περαιτέρω μελέτες για να αξιολογηθεί η φυσιολογική σημασία αυτών προσαρμογής είναι απαραίτητη.

Για να αποκτήσουν μια εικόνα για τους πιθανούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην εναλλακτικό μάτισμα του α1 sGC, πραγματοποιήσαμε μια

in silico

ανάλυση των σχετικών εσωνίων GUCY1A3 και εξονική ακολουθίες για τον εντοπισμό δυνητικών ρυθμιστικά στοιχεία [40], [41]. Η κατανομή της προβλεπόμενης

cis-ρυθμιστικών αλληλουχιών

ήταν συνεπής με ένα μοντέλο όπου οι πρωτεΐνες SR θα ευνοήσει κανονική χρήση θέση ματίσματος, ενώ η πρόσδεση των hnRNPs, ειδικά PTBP1 και hnRNP Α2 /Β1, θα εμποδίσει την αναγνώριση της εξόνιο 4 συστατική 3 ‘θέση ματίσματος για την προώθηση της C-α1 παραγωγή ισομορφή (Σχ. 2Α και το σχ. S1). Για να ελεγχθεί το μοντέλο μας εξετάσαμε την έκφραση των παραγόντων ματίσματος πριν και μετά την έκθεση σε H

2O

2. Ενώ ρύθμιση ματίσματος συνήθως επιτυγχάνεται με ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης ρυθμιστικών παραγόντων [28], ο αντίκτυπος του οξειδωτικού στρες σε αυτή τη διαδικασία δεν έχει χαρακτηριστεί προηγουμένως. Αντίθετα με τις προσδοκίες μας, τα δεδομένα έδειξαν ότι η H

2O

2 έκθεση προκάλεσε μια επιλεκτική αναγωγή PTBP1 και hnRNP Α2 /Β1, και δεν είχε καμία επίδραση επί HuR και έκφραση SR πρωτεΐνης (Εικ. 2). πειραματικά αποτελέσματα μας δείχνουν μια πιο σύνθετη ρύθμιση των sGC μάτισμα από αυτό που προβλέπεται από

in silico

μοντέλο. Περαιτέρω έρευνες απαιτούνται για να εξηγήσουν αυτή τη διαφορά. Σε μια άλλη πλευρά, η συγκεκριμένη και δραματική μείωση των δύο βασικούς παράγοντες ματίσματος RNA πρότειναν ότι η επιλεκτική κάτω ρύθμιση των ρυθμιστικών αρχών συναρμογής θα μπορούσε να είναι ένας από τους μηχανισμούς που διέπουν τις αλλαγές στο εναλλακτικό μάτισμα για την αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες.

παίζει PTBP1 ένα κρίσιμο ρόλο σε μια σειρά από μετα-μεταγραφικών ρυθμιστικών διαδικασιών, και η δράση της έχει συνδεθεί με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την ογκογένεση και απόκριση σε υποξία [30], [42], [43], [44]. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση της H

2O

2 θεραπεία για την έκφραση PTBP1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι H

2O

2 μειώνει την έκφραση PTBP1 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2C, F και το Σχ. 3Α, Β). Καμία αλλαγή στην στάθμη PTBP1 mRNA παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω συμβαίνει μετα-μεταγραφικά (Σχ. 3C). Επιπλέον, η καθυστέρηση αρκετών ωρών σε απάντηση H

2O θεραπεία

2 υποδηλώνει μια έμμεση μηχανισμός PTBP1 ρύθμισης προς τα κάτω. Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι διευκόλυνε αναστολέα πρωτεασώματος MG132, και όχι ανέστειλε, το H

2O

2 υποβάθμιση σε PTBP1 πρωτεΐνη (Εικ. 3Α, Β). Επειδή η υποβάθμιση PTBP1 δεν απαιτούν νέα σύνθεση πρωτεϊνών (δεν έχει αποκλειστεί από την επεξεργασία κυκλοεξιμίδιο) ευρήματά μας δείχνουν ότι H

2O

2 μπορεί ενδεχομένως να ενισχύσει την υποβάθμιση του πρωτεασώματος του κάποιο άγνωστο παράγοντα υπεύθυνο για PTBP1 σταθεροποίηση. Δεδομένου ότι H

2O

2 έκθεσης είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση [45], θεωρήσαμε μια κασπάσης με τη μεσολάβηση αποικοδόμηση του PTBP1. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι PTBP1 στοχεύεται από Capase-3 κατά τη διάρκεια αποπτωτική απόκριση [33]. Ωστόσο, IV αναστολέα απέτυχε να αποτρέψει H

2O

2 διαμεσολαβούμενη μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης PTBP1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το H

2O

2 πιθανώς προκαλεί υποβάθμιση PTBP1 από διαφορετικό από περιγράφηκε προηγουμένως μηχανισμούς.

Είναι επίσης σημαντικό να επισημάνουμε ότι η υποβάθμιση PTBP1 δεν περιορίζεται στην άμεση προσθήκη H

2O

2 λύση κυττάρων. Εφαρμογή της εξωκυττάριας οξειδάση γλυκόζης (GO), η οποία καταλύει την μετατροπή της γλυκόζης σε H

2O

2 και D-γλυκονο-δ-λακτόνη, που προκαλείται επίσης μία σημαντική μείωση του PTBP1 πρωτεΐνης σε MDA468 κύτταρα (Εικ. 3D) .

Η αντίδραση της H

2O

2 με θειόλες πρωτεΐνης (R-SH) και θειολικού ανιόντα (RS

-) είναι γνωστό ότι παράγει σουλφενικού οξέα (RSOH) τροποποιήσεις και προώθηση δισουλφίδιο σχηματισμός δεσμού. Αυτές οι πρωτεΐνες εμπλέκονται σε μία ευρεία ποικιλία από βιοχημικές δράσεις μεσολαβούν ROS σηματοδότηση [34], [46]. Είναι ενδιαφέρον, διμερισμό των μορίων PTBP1 μέσω διαμοριακών σχηματισμό γέφυρας Cys προηγουμένως παρατηρήθηκε σε οξειδωτικές συνθήκες [35]. Ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι τα κάτω ρύθμιση PTBP1 πρωτεΐνης με H

2O

2 διαμεσολαβείται από οξείδωση θειόλης. Πράγματι, μη ειδική θειόλης οξειδωτική ένωση HEDS προκάλεσε μια σημαντική μείωση των επιπέδων PTBP1, παρόμοια με άμεση H

2O

2 έκθεσης (Εικ. 3D). Έτσι, διμερισμός μέσω της οξείδωσης κυστεΐνη μπορεί να στοχεύσει PTBP1 πρωτεΐνης σε μετέπειτα υποβάθμιση. Οριοθέτηση μιας ακριβής μηχανισμός που ευθύνεται για επιλεκτική ROS προκαλούμενη αποικοδόμηση της παρούσας σημαντικός ρυθμιστής μπορεί να προσφέρει επιπλέον σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την κυτταρική οξειδωτική απόκριση

Προηγουμένως, η έκφραση PTBP1 έχει συσχετισθεί με αυξήσεις στον πολλαπλασιασμό και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων.? Ωστόσο, η επίδραση αυτή ποικίλει σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [31], [32], [47], [48].