Αφηρημένο

Στόχος

Για να χαρτογραφήσει πλήρως την κατάσταση μεθυλίωσης του CpG θέσεις εντός της περιοχής ελέγχου καιρό HPV16 (LCR) σε HPV-θετικά καρκινικά κύτταρα, και να διερευνήσει περαιτέρω τις επιπτώσεις της κατάστασης μεθυλίωσης του HPV16 LCR στο κελί βιοδραστικότητα και έκφραση Ε6 και Ε7. Επιπλέον, για να αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης του LCR σε HPV-θετικά στοματοφαρυγγική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OPSCC) ασθενείς.

Μέθοδοι και Υλικά |

Η μεθυλίωση πρότυπα HPV16 LCR στο UM-SCC47, CaSki , και τα κύτταρα SiHa και δείγματα OPSCC HPV16-positiive είχαν εντοπιστεί από όξινο θειώδες-αλληλουχίας PCR και κλωνοποίησης τΑ. Για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και Ε6 και Ε7 knockdown, MTS και βαφή κυανούν τρυπανίου, αννεξίνη-ν και χρώση 7-AAD και ιωδιούχου prodidium χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ανάπτυξης των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κυτταρική απόπτωση, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αντίστοιχα. έκφραση Ε6 και Ε7 mRNA και πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και ανοσοκυτταροχημεία, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

κατάσταση υπερμεθυλίωση του LCR σε UM-SCC47 (79,8%) και τα κύτταρα CaSki ( παρατηρήθηκαν 90,0%) και unmethylation καθεστώς του LCR σε κύτταρα SiHa (0%). Κατά την απομεθυλίωση, τα κύτταρα με διαφορετικά επίπεδα μεθυλίωσης αντέδρασε διαφορετικά κατά την ανάπτυξη, την απόπτωση, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου, όπως επίσης και από την άποψη της έκφρασής τους Ε6 και Ε7. Σε ασθενείς OPSCC HPV16-θετικά, τα ποσοστά μεθυλίωσης ήταν 9,5% σε όλη την περιοχή LCR, 13,9% στην 5′-LCR, 6,0% το ενισχυτή Ε6, και 9,5% στον προαγωγό ρ97, και υπερμεθυλίωση προαγωγού ρ97 βρέθηκε σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων (20,0%, 2/10).

Συμπεράσματα

η μελέτη μας έδειξε δύο διαφορετικά επίπεδα μεθυλίωσης του LCR σε HPV16-θετικά καρκινικά κύτταρα και οι ασθενείς OPSCC, οι οποίες μπορεί να αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς μηχανισμούς καρκινογένεση του HPV-θετικών καρκίνων κύτταρα. Απομεθυλιώνοντας τις meCpGs σε HPV16 LCR θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για μια υποομάδα ασθενών HPV16-θετικά με το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα

Παράθεση:. Zhang C, Ντενγκ Ζ, Pan X, Uehara Τ, Suzuki Μ, Xie Μ (2015) Επιδράσεις της μεθυλίωσης Κατάσταση των CpG τοποθεσίες εντός της Περιφέρειας Ελέγχου Long HPV16 για HPV16-Θετική επικεφαλής και τα κύτταρα του τραχήλου. PLoS ONE 10 (10): e0141245. doi: 10.1371 /journal.pone.0141245

Συντάκτης: Scott M. Langevin, Πανεπιστήμιο του Cincinnati College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5η Μάη του 2015? Αποδεκτές: 5 Οκτωβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτ 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, (81372477 έως ΜΧ)? (https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/), η Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (KAKENHI 26.462.610 σε MS και KAKENHI 26.462.611 σε ZD)? (https://www.jsps.go.jp/english/), το Ταμείο εξειδικευμένη έρευνα για το Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης, η Κίνα (20114433110001 να ΜΧ)? (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Guangdong, Κίνα (2014A030310411 να ZD)? (https://www.gdstc.gov. cn /eng /mission.html), και μια επιχορήγηση από το Επιστημονικό και Τεχνολογικό Κέντρο Ανάπτυξης, Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (20134433120021 να ZD)? (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή Επίμονη λοίμωξη

με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HPV) έχει καθιερωθεί ως αιτιολογικός παράγοντας εκτός από την υπερβολική κατανάλωση καπνού και αλκοόλ για το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [1-4]. Αυτό ισχύει για στοματοφαρυγγική καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OPSCC) ιδίως? 50-70% των ασθενών που έχουν προσβληθεί από OPSCC με HPV16 [2-7]. Ε6 και Ε7 είναι οι δύο κύριες ιικές ογκοπρωτεΐνες υπεύθυνη για τη συντήρηση του HPV-μεσολάβηση κακοήθη μετασχηματισμό μέσω της αλληλεπίδρασής τους με διάφορες σημαντικές κυτταρικές πρωτεΐνες, όπως ρ53 και pRb [8,9]. Ε2 πρωτεΐνη μπορεί να συμβάλει σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ιικής μεταγραφής και αντιγραφής του ιικού DNA [10-13], και επάγουν διακοπή της ανάπτυξης και της κυτταρικής απόπτωσης μέσω αποτελέσματά του στην έκφραση των Ε6 και Ε7 και άλλες ιογενείς πρωτεΐνες [14-16]. Όλες αυτές οι δραστηριότητες της Ε2 εξαρτώνται από την ικανότητά του να συνδέεται προς το γονιδίωμα DNA του ιού, ειδικά το ρ97 πρώιμο προαγωγό σε ειδικές θέσεις Ε2 δέσμευσης (E2BSs) που βρίσκεται εντός της περιοχής μακράς ελέγχου (LCR) του γονιδιώματος HPV [15,17] . Ο ενισχυτής, που βρίσκεται στο 5′-άκρο του προαγωγού ρ97, συμβάλλει επίσης στη ρύθμιση της Ε6 και Ε7 έκφρασης [12].

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει την ολοκλήρωση των ιϊκών γενωμάτων στο γονιδίωμα του ξενιστή είναι συχνά σχετίζεται με διαταραχή του γονιδίου Ε2, οδηγώντας σε ανεξέλεγκτη έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7 [15,18,19], Wilson et al βρήκαν σημαντικό εμπλουτισμό των δυνητικών θέσεων ενσωμάτωσης μέσα στην Ε2 περιοχή, υποδηλώνοντας ότι Ε2 ήταν επίσης ένα κοινό τοποθεσία του διάσπαση κατά την ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή σε HNSCC [19]. Ωστόσο, μια σειρά μελετών έδειξε ότι πολλά κακοήθη HPV που σχετίζονται με καρκινώματα στερούνται ολοκληρωμένα αντίγραφα ιικού γονιδιώματος ή περιλαμβάνουν ολοκληρωμένα ιικά γονιδιώματα συνοδεύεται από επισωματική ιικά γονιδιώματα. Ακόμη και αν ορισμένοι ιικά γονιδιώματα έχουν ενσωματωθεί πλήρως, το γονίδιο Ε2 μπορεί να είναι άθικτα και πολλαπλά αντίγραφα του γονιδιώματος του HPV διατηρείται σε συστοιχίες tandem, που ονομάζεται επίσης «αλυσιδωτής σύνδεσης», όπως ο HPV16 μολυσμένα κυτταρική γραμμή CaSki [20]. Έτσι, έχουν γίνει προσπάθειες για να κατανοήσουν και άλλοι μηχανισμοί, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλίωσης ή ακολουθία παραλλαγές στην LCR, που ρυθμίζουν Ε6 και Ε7 έκφραση [7,21,22].

μεθυλίωσης του DNA αναφέρεται στη μεταφορά μιας ομάδας μεθυλίου σε κατάλοιπα κυτοσίνης που συνήθως οδηγεί σε γονιδιακή σίγηση είτε φυσικώς αναστολή της σύνδεσης των παραγόντων μεταγραφής ή της δομής της χρωματίνης αναδιαμόρφωση [15,23]. Η κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδιώματος HPV16, το οποίο περιέχει 15 θέσεις CpG δινουκλεοτίδιο στην LCR, του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές και κλινικών δειγμάτων έχει αναλυθεί, αλλά οι ρόλοι των HPV γονιδιώματος μεθυλίωσης στην καρκινογένεση παραμένουν ασαφείς [24-29]. Η αυξημένη μεθυλίωση του γονιδιώματος HPV έχει βρεθεί σταθερά σε περισσότερες περιοχές στο τραχηλικό καρκίνωμα ή υψηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (CIN) σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού CIN [24,25]. Η μεθυλίωση του γονιδιώματος HPV έχει αναδειχθεί ως βιοδείκτη για την εξέλιξη του καρκίνου στον καρκίνο του τραχήλου [15,24,30,31]. Επιπλέον, ορισμένοι ερευνητές ανέφεραν ότι η κατάσταση υπομεθυλίωση των CaSki κύτταρα που προκαλείται από έναν αναστολέα μεθυλίωσης DNA μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα, αλλά δεν επηρέασε βιοδραστικότητα σε κύτταρα HeLa που περιέχουν μια εντελώς μη μεθυλιωμένα HPV-18 γονιδίωμα [27], η οποία μας ενέπνευσε να διερευνήσει τις πιθανές νέες επιπτώσεις του HPV κατάστασης μεθυλίωσης σε καρκίνους HPV-θετικά.

Μέχρι σήμερα, ωστόσο, δεν υπάρχει καμία πληροφορία σχετικά με τις επιπτώσεις της μεταβολής της μεθυλίωσης και ο μηχανισμός ρύθμισης της στα κύτταρα HNSCC. Επιπλέον, δεδομένου ότι μεθυλιωμένες CpG (meCpG) είναι δυνητικά αναστρέψιμη, απομεθυλίωση των meCpGs του γονιδιώματος HPV μπορεί να είναι ένα πολύτιμο στόχο για θεραπεία του καρκίνου. Για να καλύψει αυτό το κενό γνώσης, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HNSCC για πρώτη φορά να χαρτογραφήσει πλήρως την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG θέσεων εντός της LCR, και να διερευνήσει περαιτέρω τις επιπτώσεις της απομεθυλιώνοντας HPV16 LCR στο κελί βιοδραστικότητα και Ε6 και Ε7 έκφρασης. Επιπλέον, πολύ λίγες μελέτες εξέτασαν δείγματα HNSCC και τα αποτελέσματά τους είναι ασυνεπής [19,32,33]? Ως εκ τούτου, έδειξε την κατάσταση μεθυλίωσης του LCR σε ασθενείς OPSCC HPV-θετικές.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dc) κατεργασία

Η HNSCC κυτταρική σειρά UM-SCC47, το οποίο αναπτύχθηκε από έναν ασθενή με καρκίνο πλευρική γλώσσα [34] (ένα δώρο από τον καθηγητή Thomas E. Carey, University of Michigan), και τα τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές CaSki ( ECACC, Salisbury, UK) και SiHa (ATCC, Tokyo, Japan) χαρακτηρίστηκαν σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Μια ολοκληρωμένη γονιδίωμα HPV16 ανιχνεύτηκε στις κυτταρικές γραμμές UM-SCC47, CaSki, SiHa και, τα οποία περιέχουν 15, 600, και 1-2 αντίγραφα του γονιδιώματος HPV16, αντίστοιχα [35,36]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (για UM-SCC47 και CaSki) ή ΕΜΕΜ (για SiHa) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοοειδών και 100 IU /mL πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Το αντιδραστήριο απομεθυλίωσης 5-αζα-dc (Sigma, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκε σε DMSO στα 50 mM και αποθηκεύεται σε κλάσματα στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-dc σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0.1-5 μΜ) για 72-120 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας που περιέχει φρεσκομαγειρεμένα 5-αζα-dc αντικαταστάθηκε κάθε 24 ώρες.

Η

Κλινικά δείγματα

Οι ιστούς όγκων συλλέχθηκαν από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία στο Τμήμα Ωτορινολαρυγγολογίας, το κεφάλι και Neck Surgery, University of the Ryukyus μεταξύ Δεκεμβρίου του 2008 και το Μάιο του 2011. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Ryukyus εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. μόλυνση HPV16 προσδιορίστηκε με ενίσχυση PCR και ανάλυση αλληλουχίας όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [5,37]. Δείγματα από 10 ασθενείς αντιπροσωπευτικές OPSCC με λοίμωξη HPV16 διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 2).

Η

τροποποίηση όξινου θειώδους, PCR ενίσχυση, κλωνοποίηση ΤΑ, και DNA αλληλούχιση

εξαγωγή DNA από κύτταρα και δείγματα ιστού διεξήχθη χρησιμοποιώντας Gentra καθαρισμός Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [5], τότε το DNA (1-2 μg) ήταν διθειώδες-μετατράπηκαν με χρήση EpiTect

® Plus Bisulfite Kit (QIAGEN, Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Το τροποποιημένο DNA ενισχύθηκε σε 3 αμπλικονίων με δοκιμασίες εκκινητή διθειώδες αλληλουχίας PCR (BSP) και ονομάζονται BSP-1, BSP-2, και BSP-3 (S1 Τραπέζι). Για UM-SCC47 και μερικά δείγματα ιστού τα οποία ήταν αρνητικά για ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας το έναυσμα θέτει BSP-1 ή BSP-2, υιοθετήσαμε το αστάρι θέτει BSP-5 και BSP-6 αντί (S1 πίνακα). Η BSP πραγματοποιήθηκε σε ένα όγκο 25 μΐ που περιείχε 0,2 mM από κάθε ένα από τα 4 dNTPs, 2 mM MgCl

2, 10 pmol από κάθε εκκινητή, 1,25 μονάδες AmpliTaq DNA πολυμεράσης (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), και 300 ng διθειώδες-τροποποιημένο DNA. Οι συνθήκες BSP ήταν 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους στους 95 ° C για 1 λεπτό, 54 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 2 λεπτά, με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Όπως έχει ήδη αναφερθεί [5], τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν Οδηγό

® SV Gel και Clean-Up Σύστημα PCR (Promega, Madison, WI) και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στον ρΟΚ ™ 4-TOPO

® φορέα (Invitrogen , Carlsbad, CA) για προσδιορισμό της αλληλουχίας. Για κάθε αμπλικόνιο, τουλάχιστον 6 επιμέρους κλώνοι αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

μεθυλίωσης-ειδική PCR

Nested PCR διεξήχθη για να αναλυθεί η συνολική κατάσταση μεθυλίωσης της LCR και μεθυλίωση μεταβολή μετά τη θεραπεία απομεθυλίωση. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ένθετη PCR φαίνεται στον Πίνακα S1, και τα προϊόντα τους καλύπτουν 7 μεθυλιωμένα /μη μεθυλιωμένο sites (Μ /U) CpG στο 5′-LCR και περιοχή ενισχυτή. Όξινο θειώδες τροποποιημένου DNA αρχικά ενισχύθηκε με PCR με το σετ εκκινητή BSP-6. Η BSP πραγματοποιήθηκε σε ένα όγκο 25 μΐ που περιείχε 0,2 mM από κάθε ένα από τα 4 dNTPs, 2 mM MgCl

2, 10 pmol από κάθε εκκινητή, 1,25 μονάδες AmpliTaq DNA πολυμεράσης (Applied Biosystems), και 100 ng διθειώδες τροποποιημένων DNA. Οι συνθήκες BSP ήταν 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 25 κύκλους στους 95 ° C για 60 s, 54 ° C για 60 s, και 72 ° C για 2 λεπτά, με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Στη συνέχεια, το προϊόν από τον πρώτο γύρο της PCR υποβλήθηκε σε ένα δεύτερο γύρο ενισχύσεως με τη χρήση σετ εκκινητή PCR μεθυλίωσης-ειδική (S1 πίνακας), έτσι μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων αλληλουχιών μπορούσαν να ενισχυθούν χωριστά. Η PCR διεξήχθη σε ένα όγκο 20 μΐ που περιείχε 0,2 mM από κάθε ένα από τα 4 dNTPs, 2 mM MgCl

2, 10 pmol του κάθε εκκινητή, 1.0 μονάδα AmpliTaq DNA πολυμεράσης (Applied Biosystems), και 3 μΐ του προϊόντος του πρώτο γύρο του BSP. Οι συνθήκες PCR ήταν 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 25 κύκλους 95 ° C για 40 s, 58 ° C για 40 s, και 72 ° C για 1 λεπτό, με μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά.

Νοκ ντάουν των Ε6 και Ε7

σιλανσιέ

® Επιλέξτε siRNA που στοχεύει HPV16 Ε6 και Ε7 (5′-GUA UGG AAC AAC AUU AGA A-3 ‘), σιλανσιέ

® siRNA που στοχεύει GAPDH (θετικός έλεγχος), και κωδικοποιημένα siRNA (αρνητικός έλεγχος) λήφθηκαν από Ambion (Life Technologies Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Για siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1.0 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από ολονύκτια ανάκτησης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν ξεχωριστά με 60 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMax

® Reagent (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε συνολική εκχύλιση RNA σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, και την αναστολή της ανάπτυξης, την απόπτωση, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν στις 96 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ανίχνευση του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης, και η ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Για την ανίχνευση αναστολής της ανάπτυξης μετά τη θεραπεία απομεθυλίωση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων (1500 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από ολονύκτια ανάκτηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία συνεχώς με πρόσφατα παρασκευασμένο 5-αζα-DC από την ημέρα 1 έως την ημέρα πολλαπλασιασμός 7. κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα CellTiter 96

® Υδατικό Ένα κυτταρικό διάλυμα Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS? Promega , Madison, WI) και η απορρόφηση (OD 490 nm) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα microreader (SH-1000? Wakenyaku, Kyoto, Japan). Μετά knockdown του Ε6 και Ε7, θα εστιάζεται κυρίως στην αναστολή του πολλαπλασιασμού κατά 96 ώρες. Έτσι, χρησιμοποιείται αποκλεισμό trypan blue για αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μετά siRNA. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων (1.0 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Σε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση των siRNAs, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και υπέστησαν χρώση με μπλε διάλυμα 0,4% trypan, και ο ρυθμός αναστολής ανάπτυξης θα μπορούσε να προσδιοριστεί με μέτρηση και σύγκριση βαφή αποκλειστική κυττάρων μεταξύ των ομάδων επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή siRNA που στοχεύει Ε6 ή Ε7 . Επιπλέον, τα νεκρά κύτταρα μετά την απώλεια του Ε6 και Ε7 θα μπορούσε να συγκριθεί μεταξύ των διαφόρων ομάδων

Για να εκτιμηθεί το ποσοστό της απόπτωσης, αννεξίνης-V και χρώση 7-AAD. (Αντιδραστήριο νεξίνη γκουάβα? Millipore, Hayward, CA) εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής (γκουάβα EasyCyte Plus κυτταρομετρητή ροής? Millipore). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1.0 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από ολονύκτια ανάκτηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-dc ή επιμολυσμένα με siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, το αρχείο καταγραφής του αννεξίνης-ν-ΡΕ και 7-AAD ήταν εμφανίζεται στην x και y άξονες του cytogram, αντίστοιχα. Annexin-V-θετικά κύτταρα απεικονίζονται στην κάτω δεξιά και πάνω δεξιά τεταρτημόρια αξιολογήθηκαν ως πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων και τα νεκρά κύτταρα αργά αποπτωτικών /, αντίστοιχα.

ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο προπίδιο για να προσδιοριστεί το περιεχόμενο DNA . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-dc ή επιμολυσμένα με siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά τη συλλογή το μέσο καλλιέργειας, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και ανεξάρτητο. Τα αποκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα στο μέσο καλλιέργειας και PBS συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Μετά την απόρριψη του υπερκειμένου και για τον καθορισμό των κυττάρων με παγωμένο αιθανόλη, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με το αντιδραστήριο κυτταρικού κύκλου γκουάβα και δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γκουάβα EasyCyte Plus κυτταρόμετρο ροής. ΜΟϋΡΙΤ LT ™ 4.0 λογισμικό (Verity Software House, Topsham, ME) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των αποτελεσμάτων του κυτταρικού κύκλου.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Για την ανίχνευση Ε6 και Ε7 έκφραση μετά από 5-αζα -DC θεραπεία ή Ε6 και Ε7 knockdown, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και μετατρέπεται σε cDNA, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [36]. β-ακτίνη υιοθετήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος? β-ακτίνη, Ε6, Ε7 και ενισχύθηκαν με τη χρήση του ΑΒΙ Prism 7300 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems) και TaqMan

® PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Foster City, CA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [32,36] . Οι σχετικές εκφράσεις του Ε6 και Ε7 υπολογίστηκαν ως Ε6 /β-ακτίνης και Ε7 /β-ακτίνης.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων με αποστειρωμένα καλυπτρίδες στο κάτω μέρος του φρεατίου και επεξεργάστηκε με 5-αζα-DC, όπως περιγράφεται παραπάνω. Αφού τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, οι καλυπτρίδες αποκλείστηκαν με 3% Η

2O

2 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα αντι-HPV 16-E6 (C1P5, 1: 100? Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ) ή αντι-HPV 16-Ε7 αντισώματος (ED17, 1: 100 ? Santa Cruz Biotechnology). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα κρένου αντι-ποντικού κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση (MTM Laboratories AG, Heidelberg, Germany) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια χρώμα αναπτυγμένη σε 3-3′-διαμινοβενζιδίνη για 3 λεπτά και με αιματοξυλίνη.

Στατιστική ανάλυση

Συγκρίσεις δύο ομάδες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test ή μη του Student παραμετρικές δοκιμασίες. Η διαφορά στις συχνότητες μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χ του Pearson ‘s

2 δοκιμή ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Οι ενώσεις μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης και το ιικό φορτίο, και ο ρυθμός Ε2 /E6 αναλύθηκαν με βαθμό συσχέτισης Spearman του. Μια τιμή P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS v12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Διαφορετικά μοτίβα μεθυλίωσης LCR σε HPV 16 θετικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Ένα σύνολο 15 CpG θέσεις που βρίσκονται εντός της LCR του γονιδιώματος HPV16, το οποίο είναι πλούσιο σε ρυθμιστικά στοιχεία, διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 1Α και S1 Εικ). Καθώς αυτή ήταν η πρώτη εξέταση της LCR των κυττάρων UM-SCC47, έχουμε αποκτήσει την αλληλουχία LCR με PCR χρησιμοποιώντας 3 σετ εκκινητή, δηλαδή, LCR-1, -2, και -3, όπως φαίνεται στον Πίνακα S1. Από 2 νουκλεοτιδίων (nt) μεταλλάξεις (nt7435 και nt31) μετέβαλε την παρουσία των CpG θέσεων (Σχ 1Β και 1Γ, και S1 Σχήμα), μόνο το 13 θέσεις CpG αξιολογήθηκαν σε κύτταρα UM-SCC47 (S1 Εικ). Σε αυτή τη μελέτη, UM-SCC47 και CaSki κύτταρα έδειξαν υπερμεθυλίωση εντός της LCR (79,8% και 90,0%, αντίστοιχα) (Σχ 2Α και 2Β). Η ιστοσελίδα CpG (nt7862) βρίσκεται μέσα E2BS-2 ήταν σχετικά μεθυλιωμένος (37,5% το UM-SCC47 και 12,5% στα CaSki), ενώ οι θέσεις CpG εντός του E2BSs εκτός από nt7862 ήταν υπερμεθυλίωση στο UM-SCC47 (97,9%) και CaSki κυττάρων (100%). Αντίθετα, όλοι οι CpG θέσεις εντός της LCR σε κύτταρα SiHa ήταν μη μεθυλιωμένο (0/120) (Σχήμα 2C). Έτσι, τα κύτταρα SiHa μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας αρνητικός έλεγχος για την περαιτέρω διερεύνηση των απομεθυλίωση των τόπων meCpG.

Α) Η δομή του HPV16 LCR και την τοποθεσία των θέσεων CpG. θέσεων σύνδεσης παράγοντα μεταγραφής φαίνονται επίσης. Β, Γ) Οι νουκλεοτιδικές μεταλλάξεις σε nt7435 (G → Α) και nt31 (C → T) των κυττάρων UM-SCC47 επηρέασε την παρουσία των CpG θέσεων.

Η

Οκτώ επιμέρους κλώνοι αλληλουχία για την αναγνώριση του παρουσία και την αλλαγή της κάθε μεθυλιωμένου δινουκλεοτιδίου CpG πριν και μετά την απομεθυλίωση επάγεται από 0,5 μΜ 5-αζα-dc για 96 ώρες σε Α) UM-SCC47, Β) κύτταρα CaSki, και C) SiHa. Μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένα CpGs (meCpGs), ανοικτοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα CpGs, και αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν την απουσία των CpG θέσεων. Δ) Μεθυλίωση CpG θέσεων σε ιστούς. Για κάθε θέση CpG, 6 κλώνοι αλληλουχήθηκαν για να προσδιορίσει την παρουσία και τη συχνότητα των meCpG κλώνων. Τα ποσοστά των meCpG κλώνων υποδεικνύονται με την αριστερή κατακόρυφη γραμμή. Στο κάτω μέρος του σχήματος, οι θέσεις των CpG θέσεων που σημειώνονται.

Η

5-Αζα-dc επάγει CpG υπομεθυλίωση εντός της LCR σε κύτταρα UM-SCC47 και CaSki

Ως ένα ισχυρό αντιδραστήριο απομεθυλίωσης, 5-αζα-dc έχει δείξει θεραπευτικά αποτελέσματα σε αιματολογικές κακοήθεις νόσους και ορισμένων συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων HNSCC [38]. Στην παρούσα μελέτη, η θεραπεία με 0,5 μΜ 5-αζα-dc για 96 ώρες έδειξε βέλτιστη δραστικότητα απομεθυλίωση (0.1-5 μΜ δοκιμάστηκε) (S2 Εικ).

Μετά από 0,5 μΜ 5-αζα-dc θεραπεία, η ποσοστά meCpGs εντός της LCR στα κύτταρα UM-SCC47 και CaSki ήταν σημαντικά μειωμένο σε 19,2% (20/104? P & lt? 0.001) και 29,2% (35/120? P & lt? 0.001), αντίστοιχα, ενώ καμία αλλαγή βρέθηκε σε κύτταρα SiHa (0%, 0/120) (Σχήμα 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κύτταρα UM-SCC47 επεξεργάστηκε με 5-αζα-dc, όχι μόνο ήταν τα meCpGs στην περιοχή προαγωγού απομεθυλιώνεται σημαντικά περισσότερο από ό, τι στο 5′-LCR και περιοχή ενισχυτή (Ρ = 0,038), αλλά επίσης meCpGs εντός E2BSs είχαν σημαντικά μεγαλύτερη διακύμανση απομεθυλίωση (P = 0,025).

LCR απομεθυλίωση μειώνεται Ε6 και Ε7 έκφραση στο UM-SCC47 και τα κύτταρα CaSki

κατά την επεξεργασία απομεθυλίωση με 0,5 μΜ 5-αζα-dc για 96 ώρες, η έκφραση του Ε6 και Ε7 mRNA μειώθηκε σημαντικά σε UM-SCC47 (Ρ = 0.021 και Ρ = 0.008, αντίστοιχα) και τα κύτταρα CaSki (Ρ = 0.017 και Ρ = 0.023, αντίστοιχα), αλλά όχι σε κύτταρα SiHa (σχήμα 3Α και 3Β ). Επιπλέον, ανιχνεύσαμε πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 στα κύτταρα UM-SCC47 και CaSki με ανοσοκυτταροχημεία. πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 εντοπίστηκαν στο κυτοσόλιο και πυρήνα των κυττάρων UM-SCC47 και CaSki, και το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων και η ένταση χρώσης μειώθηκαν σημαντικά μετά απομεθυλίωση (Σχ 3C και 3D).

απομεθυλίωση του CpG θέσεις που επάγεται από 0.5 μΜ 5-αζα-dc για 96 ώρες μειώθηκε Ε6 και Ε7 έκφραση, η οποία ανιχνεύθηκε με αντίστροφη μεταγραφή PCR Α) και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Β)? Ε6 και Ε7 ήταν σαφώς μειωμένη σε κύτταρα UM-SCC47 και CaSki, αλλά δεν υπήρχε καμία εμφανής αλλαγή στα κύτταρα SiHa. Οι τιμές (μέσος όρος ± SD) ελήφθησαν από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Γ) Ε6 και Δ) Ε7 πρωτεΐνη μετά απομεθυλίωση των θέσεων CpG ανιχνεύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία? Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών διανεμήθηκαν στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων UM-SCC47 και CaSki με ισχυρή ένταση χρώσης (× 100, bar = 100 μm), και οι δύο τα ποσοστά και την ένταση των χρωματισμένων κυττάρων ήταν σαφώς μειώθηκαν μετά απομεθυλίωση (× 100 , bar = 100 μm).

Η

υπομεθυλίωση του HPV16 LCR μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξάνει την απόπτωση, και προκαλεί τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε UM-SCC47 και CaSki κύτταρα

Για να εξεταστεί αν απομεθυλίωση HPV16 LCR με 5-αζα-dc επηρεάζει κύτταρο βιοδραστικότητα, αναλύσαμε πολλαπλασιασμό, απόπτωση, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Τα ανάπτυξης και φυσικές ιδιότητες του όλες τις κυτταρικές σειρές 3 δεν ήταν προφανώς αλλάξει τα 2 ημέρες μετά τη θεραπεία 5-αζα-DC. Ωστόσο, 4 ημέρες μετά την αγωγή, η ανάπτυξη των UM-SCC47 και CaSki κύτταρα ήταν σχεδόν πλήρως ανασταλεί (σχ 4Α), η οποία ήταν σύμφωνα με τη βέλτιστη διάρκεια της θεραπείας και την επακόλουθη απώλεια της έκφρασης Ε6 και Ε7. αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων SiHa προκύπτει από την κατεργασία 5-αζα-dc παρατηρήθηκε επίσης, η οποία μπορεί να σχετίζεται με κυτταροτοξικότητα της 5-αζα-dc που επάγεται από το συσσωρευμένο ενσωμάτωση στο κυτταρικό DNA [39]? Ωστόσο, η επίδραση ήταν μέτρια σε σύγκριση με CaSki και τα κύτταρα UM-SCC47 (Σχήμα 4Α).

Α) Μετά την απομεθυλίωση των CpG θέσεων, η κυτταρική ανάπτυξη αναστάλθηκε ισχυρώς σε κύτταρα UM-SCC47 και CaSki, αλλά όχι σε κύτταρα SiHa. Β) Ε6 και Ε7 έκφραση μειώθηκε σημαντικά μετά siRNA διαμόλυνση. Γ) Η ανάπτυξη των κυττάρων αναστάλθηκε σε 96 ώρες μετά την Ε6 και Ε7 knockdown. Όλα τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα στο Α) και C), και μέσα ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα στο Β).

Η

κύτταρα αποπτωτικά ποσοτικοποιήθηκαν με χρώση αννεξίνης-ν-ΡΕ και κυτταρομετρία ροής. Με απομεθυλίωση meCpGs με επεξεργασία 5-αζα-dc, τα αποπτωτικά ποσοστά UM-SCC47 και τα κύτταρα CaSki αυξήθηκαν σημαντικά (Ρ = 0.026 και Ρ = 0.001, αντίστοιχα). Επιπλέον, 5-αζα-dc αύξησε τον αριθμό των UM-SCC47 και CaSki κύτταρα συλλαμβάνονται κατά τη φάση S (P = 0.048 και Ρ = 0.003, αντίστοιχα) και φάση G2 /M (Ρ = 0.002 και Ρ = 0.044, αντίστοιχα) (Σχ 5). Αντιθέτως, σε κύτταρα SiHa, που έχουν ένα μόνο μη μεθυλιωμένα γονιδίωμα HPV, υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στις απόπτωση ή κύκλου κυττάρου σε S και G2 /M φάσεις παρατηρήθηκαν (Σχήμα 5).

Α) Μετά από απομεθυλίωση του CpG θέσεις, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα UM-SCC47 και CaSki, αλλά όχι σε κύτταρα SiHa. Β) Μετά την απομεθυλίωση των CpG θέσεων, ο αριθμός των κυττάρων που συνελήφθησαν κατά τη διάρκεια τόσο S και G2 /M φάσεις αυξήθηκε το UM-SCC47 και CaSki κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα SiHa. Όλα τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Οι αλλαγές των κυττάρων βιοδραστικότητα μετά τη θεραπεία απομεθυλίωση που σχετίζονται με την απώλεια της έκφρασης Ε6 και Ε7

Για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι αλλαγές βιοδραστικότητα μετά από θεραπεία 5-αζα-dc συνδέθηκαν με την απώλεια της έκφρασης Ε6 και Ε7 που προκαλούνται από απομεθυλίωση, επιμολύναμε τις 3 κυτταρικές σειρές με siRNA να γκρεμίσουμε Ε6 και Ε7 (Σχήμα 4Β). Σε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, η ανάπτυξη του UM-SCC47, CaSki και SiHa κύτταρα ανεστάλη (Ρ = 0,044, Ρ = 0.006 και Ρ = 0.022, αντίστοιχα) (Εικόνα 4C)? Επιπλέον, η απόπτωση (Ρ = 0,026, Ρ = 0.050 και Ρ = 0.016, αντίστοιχα) και G2 διακοπή /M φάση (Ρ = 0,027, Ρ = 0.035 και Ρ = 0.012, αντίστοιχα) που επάγεται (Σχήμα 6). Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα επί των κυττάρων μετά απομεθυλίωση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι σημαντικές αλλαγές βιοδραστικότητα μετά από αγωγή 5-αζα-dc θα μπορούσε να προκληθεί από μειωμένη έκφραση Ε6 και Ε7 που προκαλούνται από meCpG απομεθυλίωση. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η δραματική αναστολή της ανάπτυξης μετά την επιμόλυνση πρότεινε ο Ε6 /Ε7 siRNA είχε πιθανώς επιπτώσεις εκτός στόχου.

Α) Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε στις 96 ώρες μετά την Ε6 και Ε7 knockdown στο UM -SCC47, CaSki, SiHa και κύτταρα. Τα κύτταρα συνελήφθησαν στην G2 /M φάση σε Β) UM-SCC47 και κύτταρα C) CaSki, και στις δύο G2 M και S φάσεις D) κύτταρα /SiHa. Όλα τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Διαφορετικά μοτίβα μεθυλίωσης σε ασθενείς OPSCC HPV-θετικά

Εμείς συλλέγονται δείγματα των 10 OPSCC ασθενείς με λοίμωξη από HPV 16 για την ανάλυση της LCR τους προτύπων μεθυλίωσης (Πίνακας 2). Ο μέσος ρυθμός μεθυλίωσης στους 10 δείγματα ήταν 9,5% για το σύνολο της περιοχής LCR, 13,9% στην 5′-LCR, 6,0% το ενισχυτή Ε6, και 9,5% στον προαγωγό ρ97 (Εικ 2Δ). Περισσότερο από το 70% των θέσεων CpG (111/150) ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα, ενώ το 26,0% (39/150) είχαν ετερογενή μεθυλιώνονται (≥ 1 meCpG κλώνος). Όλοι οι κλώνοι CpG ήταν μη μεθυλιωμένα σε nt7862, η οποία είναι σύμφωνη με τη σαφή κατάσταση υπομεθυλίωση στα κύτταρα UM-SCC47 και CaSki. Ωστόσο, στις άλλες περιοχές CpG, τουλάχιστον 1 meCpG κλώνος ανιχνεύτηκε.

Αν και το μέγεθος του δείγματος ήταν σχετικά μικρό, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω ανάλυση και ταξινομούνται τα προφίλ μεθυλίωσης όπως υπερμεθυλίωση και υπομεθυλίωση. Δύο ασθενείς με καρκίνο των αμυγδαλών (OPSCC-1 και OPSCC-10) είχε μια κατάσταση υπερμεθυλίωση (41,6% και 40,0%, αντίστοιχα) στον υποκινητή ρ97. Ωστόσο, σε άλλες ασθενείς, εντοπίστηκαν μόνο σποραδικές κλώνους meCpG ή όλα τα μη μεθυλιωμένα κλώνους CpG, και ο μέσος ρυθμός μεθυλίωσης ήταν 4,1% (24/585). Τα διακριτά προφίλ μεθυλίωσης στους ασθενείς OPSCC ήταν πολύ παρόμοια με τους τύπους μεθυλίωση των HPV-θετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Επίσης, αναλύσαμε τις σχέσεις μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης και το ιικό φορτίο (Ε6 αντίγραφα), και Ε2 /E6 ποσοστό [36]. Μετά τον αποκλεισμό 2 περιπτώσεις (OPSCC-5 και OPSCC-7) με ακραίες τιμές στο διάγραμμα διασποράς, η συχνότητα της μεθυλίωσης του υποκινητή ρ97 συσχετίστηκε θετικά με Ε2 /Ε6 επιτόκιο (r = 0,759, P = 0,029). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας μεθυλίωση του υποκινητή ρ97 και το ιικό φορτίο (P = 0,220).

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες των HPV 16 LCR μεθυλίωσης βασίστηκαν κυρίως σε κύτταρα του τραχήλου και κλινικά δείγματα. Κατά ανασυνδυασμό με το κυτταρικό γονιδίωμα, κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδιώματος HPV16 μπορεί να μεταβάλλεται και εξαρτάται από τον τύπο του συμβάντος ενσωμάτωσης και πιθανώς ιικό φορτίο [30]. Στην παρούσα μελέτη, HPV16 LCR ήταν υπερμεθυλιωμένο στην αυχενική κύτταρα CaSki με διαδοχικά ολοκληρωμένο γονιδίωμα HPV16 (ένας τύπος 2 ενσωμάτωμα) και μη μεθυλιωμένη σε κύτταρα SiHa με ενσωμάτωση μεμονωμένων γονιδιωμάτων HPV16 (ένας τύπος 1 ενσωμάτωμα). Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών [7,15,25,32]. Πρέπει πρώτα προσδιορίζονται κύτταρα HNSCC UM-SCC47 που περιέχει ένα άθικτο γονίδιο Ε2 του γονιδιώματος HPV16 και υπερμεθυλιωμένων LCR όπως τραχηλικά κύτταρα CaSki, στην οποία οι HPV γονιδιωμάτων ενσωματωθεί στο κυτταρικό γονιδίωμα σε συστοιχίες tandem [20]. Η μεθυλίωση του E2BSs σε HPV16 LCR συσχετίστηκε με το επίπεδο έκφρασης του ογκογόνου Ε6 και Ε7, και απομεθυλίωση του HPV16 LCR σε κύτταρα UM-SCC47 καταστέλλεται έκφραση Ε6 και Ε7, ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, και τελικά προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση στο HPV16 LCR παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στον ιικό κύκλο ζωής σε κύτταρα HNSCC περιέχει ένα γονιδίωμα ενσωματωμένου HPV16 τύπου 2. Επιπλέον, η μεθυλίωση μπορεί επίσης να ερμηνευθεί ως εναλλακτικό μηχανισμό άμυνας για να φιμώσουν την αντιγραφή του ιού και η μεταγραφή [40], το οποίο μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο το γονιδίωμα του HPV έχει μετατραπεί από μια παραγωγική μολυσματικό παράγοντα σε μία νέα καρκινογόνος.

έχει αποδειχθεί ότι πλήρως μεθυλιωμένων γονιδίωμα HPV16 είναι μεταγραφικά αδρανής [41] και προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι τα βαρέα μεθυλίωση δεν χρειάζεται για LCR E2BSs να επηρεάσει δραστικότητα ρ97 υποκινητή [27,42]. Καταστολή του υποκινητή μπορεί να αποκαταστήσει τις συνήθεις λειτουργίες της ρ53 και pRb, καθώς και άλλοι στόχοι της Ε6 και Ε7 [43-45]. Επιπλέον, επαναφορά της Ε2 σε συνδυασμό με είτε Ε6 ή Ε7 υπό τον έλεγχο ενός E2-ανεξάρτητο προαγωγό έχει χρησιμοποιηθεί για την περαιτέρω διευκρίνιση των λειτουργιών των Ε6 και Ε7 σε μετασχηματισμένα κύτταρα [43,45]. Τα δεδομένα μας έδειξαν τις θέσεις CpG στο 5′-LCR και περιοχή προαγωγέα των κυττάρων UM-SCC47, συμπεριλαμβανομένων όλων των E2BSs, μεθυλιώθηκαν προτίμηση, και 5-αζα-dc απομεθυλίωση ήταν πιο αποτελεσματική για τις meCpGs στην περιοχή προαγωγού και E2BSs από το άλλες CpG θέσεις εντός HPV16 LCR στα κύτταρα UM-SCC47, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι ζωτικής σημασίας περιοχές και την περιοχή μπορεί να είναι ευάλωτη σε μεθυλίωση στην καρκινογένεση και απομεθυλίωση. Ωστόσο, η CpG στο nt7862, το οποίο βρίσκεται στην περιοχή συνδετήρα μεταξύ του ενισχυτή και προαγωγό, είχαν την τάση να μεθυλιωμένος εις τα δύο UM-SCC47 και CaSki κύτταρα, καθώς επίσης και δείγματα OPSCC, με παρόμοια αποτελέσματα επίσης αναφερθεί στο παρελθόν [24,25, 29,30,33]. Αυτό υποδηλώνει ότι η περιοχή CpG μπορεί να εμπλέκεται στην ιική αρχή αντιγραφής και το καθεστώς unmethylation της συχνά διατηρούνται για τη διατήρηση της ιικό κύκλο ζωής. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να εξηγήσει αυτό το φαινόμενο.

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι ο HPV-θετικά HNSCCs έχουν καλύτερη απόκριση σε ακτινοθεραπεία ή /και χημειοθεραπεία από HPV-αρνητικών HNSCCs [46,47].