Αφηρημένο

Ιστορικό

Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο τη διερεύνηση της λειτουργικής σημασίας της θειικής ηπαρίνης (γλυκοζαμίνη) 3

O

-sulfotransferase 2 (

HS3ST2

) υπερμεθυλίωση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

HS3ST2

υπερμεθυλίωση χαρακτηρίστηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έξι πνεύμονα και του κλινική σημασία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 298 σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί και 26 φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστούς από 324 ασθενείς με NSCLC. MS-HRM (μεθυλίωση-ειδική υψηλής ανάλυσης τήξης) και EpiTYPER

δοκιμασίες TM έδειξαν σημαντική υπερμεθυλίωση των CpG νησίδα στην περιοχή του υποκινητή του

HS3ST2

σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έξι πνεύμονα. Η σιγήσει γονίδιο απομεθυλιώθηκε και επανα-εκφράζεται με επεξεργασία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC). Μια δοκιμασία υποστηρικτής έδειξε επίσης η δράση του υποκινητή πυρήνα της HS3ST2 διεπόταν από μεθυλίωση. Η εξωγενής έκφραση HS3ST2 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα Η460 και Η23 ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων, την εισβολή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ότι νοκ ντάουν της HS3ST2 σε ΝΗΒΕ κυττάρων που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων, την εισβολή και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

στο

vitro

. Μια αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων mRNA και μεθυλίωση του HS3ST2 σε 26 φρέσκα-κατεψυγμένα όγκους ιστούς (ρ = -0.51,

P

= 0,009? Βαθμό συσχέτισης Spearman του).

HS3ST2

υπερμεθυλίωση βρέθηκε σε 95 (32%) των 298 πρωτοβάθμια NSCLCs. Οι ασθενείς με

HS3ST2

υπερμεθυλίωση σε 193 αρνητικούς λεμφαδένες σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs με διάμεση περίοδο παρακολούθησης 5,8 ετών είχαν κακή συνολική επιβίωση (αναλογία κινδύνου = 2,12, 95% διάστημα εμπιστοσύνης = 1,25 έως 3,58,

P

= 0,005) σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν

HS3ST2

υπερμεθυλίωση, μετά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, επικουρική θεραπεία, υποτροπή, και διαφοροποίηση.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι

HS3ST2

υπερμεθυλίωση μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για τη συνολική επιβίωση σε αρνητικούς λεμφαδένες σταδίου Ι-ΙΙ NSCLC

Παράθεση:. Hwang JA, Kim Υ , το Χονγκ SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et al. (2013) Επιγενετική αδρανοποίηση των ηπαράνη Sulfate (γλυκοζαμίνη) 3

O

-Sulfotransferase 2 σε καρκίνο του πνεύμονα και ο ρόλος του στην ογκογένεση. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10.1371 /journal.pone.0079634

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: May 22, 2013? Αποδεκτές: 25 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Hwang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (NCC 1110140-1 και 1.110.100-2), η Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας R & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας & amp? Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας. (A084947AA202308N100010A), και το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MEST) (αρ 2011-0029138), Δημοκρατία της Κορέας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στον κόσμο. Παρά τις σημαντικές προόδους στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η πρόγνωση παραμένει φτωχή, με τη συνολική 5-ετή αιωρείται ποσοστό επιβίωσης λιγότερο από 15% [1]. Η κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα οδηγεί σε μεγάλο βαθμό από μικρομεταστάσεων, η οποία καθιστά λιγότερο πιθανό να θεραπεύσει, και εν μέρει από το υψηλό ποσοστό υποτροπής μετά θεραπευτική εκτομή? ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου έχω μια πενταετούς επιβίωσης των & lt? 50% εάν ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε κοντινούς λεμφαδένες ή άλλες περιοχές. Περισσότερο από το 80% των υποτροπών συμβαίνουν εντός των πρώτων δύο ετών? τα ποσοστά υποτροπής μετά θεραπευτική χειρουργική εκτομή με κατάλληλες λέμφου σειρά κόμβος ανατομή από 20% έως 50%, ανάλογα με την παθολογική στάδιο [2]. Έτσι, η ανακάλυψη της μοριακής βιοδεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση και την ταυτοποίηση των ασθενών που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής είναι σαφώς σημαντικό.

θειική ηπαράνη (HS) είναι ένας γραμμικός πολυσακχαρίτης που βρίσκεται σε όλους τους ιστούς των ζώων, και αυτό συμβαίνει ως πρωτεογλυκάνη στο οποίο δύο ή τριών γραμμικών ηπαράνης θειικής γλυκοσαμινογλυκάνης (GAG) αλυσίδες συνδέονται ομοιοπολικά σε συγκεκριμένα υπολείμματα σερίνης στις μια πρωτεΐνη πυρήνα μέσω ενός συνδετήρα τετρασακχαρίτη [3]. Οι αλυσίδες HS συναρμολογούνται επί ενός πυρήνα πρωτεΐνης με ένζυμα στο σύστημα Golgi και αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαρίτη του εναλλασσόμενου γλυκουρονικό (GlcA) ή ιδουρονικού (IdoA) οξύ και

N

ακετυλ γλυκοζαμίνη (ΟΙοΝΑο). Κατά τη συναρμολόγηση, υποβάλλονται σε μια σειρά από διαδοχικές τροποποιήσεις που αρχίζουν με

Ν

-deacetylation και

Ν

-sulfation των υπολειμμάτων γλυκοζαμίνης. Δίπλα σε αυτήν την πρώτη τροποποίηση, μερικά υπολείμματα ΟΙοΑ επιμερίζεται προς ιδουρονικό οξύ από μια επιμεράση C5 και στη συνέχεια 2-Ο-θειωμένη, με περαιτέρω θείωση στις θέσεις 6-Ο και 3-Ο υπολειμμάτων γλυκοζαμίνης για να δώσει ώριμες αλυσίδες [4,5 ]. Οι τροποποιήσεις που είναι σημαντικά για τη λεπτή δομή των πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPG) και στην εξειδίκευση της αλληλεπίδρασης θειικής ηπαράνης-πρωτεΐνης.

θειική ηπαράνη

(

γλυκοζαμίνης

)

3-Ο-

σουλφοτρανσφερασών

2

(

HS3ST2

), ένα μέλος της ηπαράνης θειικό βιοσύνθεσης οικογένεια ενζύμων, διαθέτει γλυκοσαμινύλ θειική ηπαρίνη 3

O

-sulfotransferase δραστηριότητα που τροποποιεί αλυσίδες GAG [6,7].

HS3ST2

υπερμεθυλίωση έχει πρόσφατα αναφερθεί σε μία ποικιλία καρκίνων, όπως του καρκίνου του μαστού [8,9], ορθοκολικό καρκίνο [8,10,11], γαστρικού καρκίνου [12], αιματολογικές νεόπλασμα [13], ο καρκίνος του πνεύμονα [8], τον καρκίνο [8] του παγκρέατος, καρκίνο του προστάτη [14], και του καρκίνου του τραχήλου [15,16].

HS3ST2

υπερμεθυλίωση βρέθηκε σε υψηλή συχνότητα σε πορογενές καρκίνωμα in situ του μαστού [9], καθώς και σε δείγματα κυτταρολογίας της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας 3 (CIN3) [15], γεγονός που υποδηλώνει

HS3ST2

υπερμεθυλίωση πιθανώς συμβαίνει νωρίς κατά τη διάρκεια κακοήθους μετασχηματισμού του μαστού και του τραχήλου.

HS3ST2

επίσης εμφανίζει υψηλή μεθυλίωσης στον καρκίνο του προστάτη με υποτροπή [14]. Επιπλέον, η συχνότητα του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση έχει υψηλή περιεκτικότητα σε υψηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακή βλάβη (HSIL) του τραχήλου της μήτρας σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακή βλάβη (LSIL) [16]. Ωστόσο, η κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση παραμένει άπιαστο στον καρκίνο του πνεύμονα. Να αποκτήσουν καλύτερη εικόνα για το ρόλο του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), που χαρακτηρίζεται

HS3ST2

υπερμεθυλίωση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έξι πνεύμονα και διερευνήθηκε η επίδραση της υπερμεθυλίωση

HS3ST2

στο φαινότυπο και την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα σε ιστούς παραφίνης από 298 πρωτογενείς μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLCs).

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού και δείγματα ιστού

Έξι ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (Η23, Η226, Η460, Η520, H1650, και Α549) και δύο ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές (HBEC και ΝΗΒΕ) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καθορισμένο μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen, USA). Είκοσι-έξι φρέσκα-κατεψυγμένα όγκου και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών, καθώς και 298 καρκινικών ιστών σε παραφίνη-ενσωματωμένες, ελήφθησαν από ένα σύνολο 324 ασθενών με NSCLC οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή στο Τμήμα Θώρακος και της Καρδιοχειρουργικής, Samsung Medical Center, Σεούλ, Κορέα μεταξύ Αυγούστου 1994 και Νοεμβρίου 2005. η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών στο Samsung Medical Center, και γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών που λαμβάνονται από κάθε ασθενή πριν από την επέμβαση. Μετεγχειρητική παρακολούθηση για την επιβίωση ή την επανάληψη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Παθολογική στάδιο TNM προσδιορίστηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Μικτής Επιτροπής του American για τον Καρκίνο [17]

Γονιδιωματική εξαγωγή DNA και όξινο θειώδες νάτριο τροποποίηση

H & amp?. Ε (αιματοξυλίνη και ηωσίνη) χρώση των νωπών -frozen και ιστούς παραφίνης έγινε? οι περιοχές του όγκου που περιέχεται τουλάχιστον 75% νεοπλαστικό ιστό. Γονιδιωματικό DNA από καλλιεργημένα κύτταρα και από 26 φρέσκο ​​κατεψυγμένο όγκου και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί και 298 εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς όγκων εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το MagAttract DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και DNeasy κιτ Tissue (Qiagen, Valencia, CA), αντίστοιχα. Ένα μικρογραμμάριο του γονιδιωματικού DNA τροποποιήθηκε με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit (ZYMO Research, Irvine, CA).

δοκιμασία MS-HRM, EpiTYPER

TM δοκιμασία, και μεθυλίωσης-ειδική PCR

Για να βρείτε εξαιρετικά μεθυλιωμένα περιοχές του

HS3ST2

υποκινητή, μια περιοχή 2 kb που περιέχει οι 1.5 kb

HS3ST2

υποστηρικτής αναλύθηκε με μεθυλίωσης ειδικό υψηλής ανάλυσης λιώσει (MS-HRM) δοκιμασία σε LightCycler®480 πραγματικού χρόνου PCR όργανο (Roche, Switerland). Η κατάσταση μεθυλίωσης μιας περιοχής 1,5 kb που βρέθηκε να είναι άκρως μεθυλιωμένο με δοκιμασία MS-HRM περαιτέρω αναλύθηκαν ποσοτικά με τη χρήση της EpiTYPER

δοκιμασία ΤΜ (Sequenom, San Diego, CA) για να αναλύσει καταστάσεις μεθυλίωση των μεμονωμένων CpGs. αναλύονται οι περιοχές εκπροσωπούνται στο Σχήμα 1Α. Εκκινητές για κάθε δοκιμασία σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας SEQUENOM (San Diego, CA), το λογισμικό EpiDesigner (Πίνακας S1 και S2). Η κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

στα 298 μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) με δύο σετ εκκινητών (Πίνακας S3) που καλύπτει την περιοχή του προαγωγέα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως

2. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν καυτό στους 94 ° C πριν από την προσθήκη 2,5 μονάδων πολυμεράσης Taq. Η ενίσχυση διεξήχθη επί 35 κύκλους (30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, 30 s σε θερμοκρασία ανόπτησης, 30 s στους 72 ° C), που ακολουθείται από 4 λεπτά στους 72 ° C. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση MSP βαθμολογήθηκαν οπτικά από δύο συγγραφείς (Y Kim και D-H Kim). Δείγματα με ισχυρότερη ένταση ζώνης από τον αρνητικό μάρτυρα στην ειδική της μεθυλίωσης ΡΟΚ συμβολίζεται μεθυλιωμένο, και τα δείγματα χωρίς ορατή προϊόν PCR θεωρήθηκαν ως μη μεθυλιωμένη.

(Α) CpG νησί χάρτης

HS3ST2

υποκινητή και οι περιοχές που αναλύονται χρησιμοποιώντας MS-HRM και δοκιμασία EpiTYPER. κατάσταση (Β) Η μεθυλίωση του

HS3ST2

αξιολογήθηκε πρώτα σε έξι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και δύο βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών με τη χρήση MS-HRM. (Γ) κατάσταση μεθυλίωσης των μεμονωμένων CpGs σε μία περιοχή υποκινητή 1,5 kb (HRM-04, 05, 06, 07, 08, και 09) αναλύθηκε ποσοτικά στις κυτταρικές γραμμές με χρήση του EpiTYPER

δοκιμασία ΤΜ. Τα επίπεδα μεθυλίωσης που απεικονίζεται ως μια αλλαγή χρώματος σε συνεχή κλίμακα από κόκκινο (0% μεθυλιωμένες) έως λευκό (100% μεθυλιωμένες). (D) Τα επίπεδα μεταγραφής του

HS3ST2

συγκρίθηκαν μεταξύ υψηλά μεθυλιωμένη κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα και βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών από qRT-PCR (μαύρη γραμμή). Ανάκτηση του

HS3ST2

μεταγραφή εκτιμήθηκε μετά τη θεραπεία του καρκίνου κυτταρικές σειρές έξι πνεύμονα με 5-Aza-DC για 72 ώρες (γκρίζα γραμμή εναντίον λευκή γραμμή?

Τα P

-τιμές βασίζονται σε Wilcoxon signed-rank test). (Ε) κατάσταση μεθυλίωσης του CpGs γύρω από την άκρως μεθυλιωμένης περιοχής ATG του

HS3ST2

γονίδιο εκτιμήθηκε μετά από θεραπεία με 5-Αζα-DC για 72 ώρες. Ο θερμικός χάρτης δείχνει τυπικά μοτίβα της απομεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα σε απάντηση 5-Aza-dC, και τα ποσοστά που δείχνουν τα μέσα επίπεδα μεθυλίωσης.

Η

Ανάλυση της έκφρασης HS3ST2

Για να εξεταστεί η έκφραση του HS3ST2 στο επίπεδο του mRNA, cDNA συντέθηκε από δύο μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας το SuperScript

TM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA). Η έκφραση του mRNA του HS3ST2 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα LightCycler

® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς, και το σχετικό επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ΔΟ

μέθοδος T (ΔΟ

T = C

T του GAPDH – C

Τ HS3ST2). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και οι qRT-εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ίδια με αυτά στην RT-PCR. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να περιέχουν σύνδεση εξονίου-εξονίου (Πίνακας S3).

θεραπεία 5-Αζα-dC in vitro

Έξι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα επωάστηκαν με 10 μΜ 5-αζα-2 «-deoxycytidine (5-Αζα-άΟ? Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 72 ώρες. Μετά την επώαση, η έκφραση του mRNA και μεθυλίωση ποσοτικοποιήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και EpiTYPER

δοκιμασία ΤΜ, αντίστοιχα.

Reporter δοκιμασία

Serial μορφώματα διαγραφής του υποκινητή HS3ST2 δημιουργήθηκαν, και διαφορετικά μήκη των περιοχών προαγωγού (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές PCR (Πίνακας S4) και κλωνοποιήθηκε εντός του pGL3-βασικό φορέα. Η αλληλουχία προαγωγός ήταν

in vitro

μεθυλιωμένα CpG με ειδικές

Sss

Ι μεθυλάση (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Οι δραστηριότητες υποκινητή μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων κατασκευάσματα συγκρίθηκαν με δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI).

κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και εξάπλωση δοκιμασία

Για

in vitro

κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, και δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, ένας pAcGFP1-C1-

HS3ST2

κλώνος cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που παρατίθενται στον πίνακα S3, και Η460 και Η23 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μα pAcGFP1-C1-

HS3ST2

και pAcGFP1-C1 (κενός φορέας) χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση HS3ST2 επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα που κατευθύνονται στη GFP (SC-9996? Santa Cruz Biotechnology, CA) και α-τουμπουλίνης (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με επιτρέποντας στα κύτταρα να μεταναστεύουν προς τα κάτω όλη τη νύχτα στους 37 ° C μέσω ενός 8-m ένθετο φίλτρο πόρου (BD, ΗΠΑ) και στη συνέχεια με χρώση με 1% κρυσταλλικό ιώδες? τα διαλυμένα κύτταρα μετρήθηκαν στα 564 nm σε ένα VERSA

max αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, USA). Η δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε μετρώντας Diff-Quick

TM (Sysmex, Japan) χρωματισμένα κύτταρα σε Matrigel επικαλυμμένα ένθετο μετά από επώαση 48 h. Για τη δοκιμασία πολλαπλασιασμού, τα φρεάτια σπάρθηκαν με 1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και μία δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη κάθε 24 ώρες? πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα μετρήθηκαν με απορρόφηση στα 570 nm.

Νοκ ντάουν της HS3ST2

HS3ST2 ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA αλληλουχία-στόχο: Κατ. 5′-CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3 ‘αρ SI00442015, Qiagen) ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (Cat 10272810, Qiagen) μετασκευάστηκε σε κύτταρα ΝΗΒΕ. Μετά από 72 h επιμόλυνσης, αποσιώπηση του HS3ST2 επιβεβαιώθηκε με immonublotting χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα που κατευθύνονται προς HS3ST2 (Cat. Νο PA5-26522, Thermo Scientific) και κανονικοποιημένα με β-ακτίνη. Η επίδραση της HS3ST2 knockdown στην κυτταρική μετανάστευση, την κυτταρική εισβολή και πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναλύθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR

κατάσταση μεθυλίωσης CpG νησίδα στην περιοχή προαγωγέα του

HS3ST2

σε 26 φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστούς όγκων αναλύθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας PCR δοκιμασία με βάση φθορισμό ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο, MethyLight, όπως περιγράφεται από Gonzalo et al [10]. Εν συντομία, οι αντιδράσεις MethyLight διεξήχθησαν σε έναν τελικό όγκο 12,5 μΙ που περιείχε 1,0 μΙ κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA, 900 ηΜ από κάθε εκκινητή και 250 ηΜ ιχνηλάτη TaqMan. Θερμοκυκλώσεως αντιδράσεις έτρεξαν χρησιμοποιώντας 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), και το

ALU-C4

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά για την ομαλοποίηση της ποσότητας του DNA εισόδου [18]. Οι εκκινητές και φθορισμό ιχνηθετημένων ανιχνευτών TaqMan χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα S5.

Ανοσοϊστοχημεία του Ki-67

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση Ki-67 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] . Το κλάσμα του Ki-67-θετικά κύτταρα (ο δείκτης σήμανσης Κϊ-67) ορίστηκε ως το ποσοστό των πυρήνων χρωματίζονται θετικά με το αντίσωμα.

Στατιστική ανάλυση

Το τεστ Wilcoxon rank sum ( ή

t-test

) και ακριβής δοκιμασία Fisher (ή η δοκιμασία Chi-τετράγωνο) χρησιμοποιήθηκαν για την μονοπαραγοντική ανάλυση των συνεχών και κατηγορικών μεταβλητών, αντίστοιχα. επίπεδα HS3ST2 mRNA μεταξύ ιστών όγκου και φυσιολογικών ιστών συμφωνημένα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ που υπογράφηκε-rank Wilcoxon. ο συντελεστής Spearman που υπολογίστηκε για την αξιολόγηση του συσχετισμού μεταξύ της έκφρασης και της μεθυλίωσης του

HS3ST2

. Η επίδραση του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση για την επιβίωση ή την επανάληψη εκτιμήθηκε από καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier, και η σημασία των διαφορών στην πρόγνωση μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων διεξήχθη για να εκτιμηθούν οι αναλογίες κινδύνου του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση για την επιβίωση, μετά από έλεγχο για πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες.

Αποτελέσματα

Ανάλυση της μεθυλίωσης γύρω από τον υποκινητή HS3ST2

η κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

γύρω από το

HS3ST2

υποστηρικτής αναλύθηκε χρησιμοποιώντας MS-HRM (Εικόνα 1Β) και EpiTYPER

δοκιμασίες TM (Σχήμα 1C) σε έξι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα και δύο φυσιολογικά βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών. κατάσταση μεθυλίωσης μιας περιοχής 2,0 kb που περιέχει την αλληλουχία υποκινητή του

HS3ST2

αρχικά σε διαλογή με MS-HRM. Αξιοσημείωτες καμπύλη τήξης διαστάσεως παρατηρήθηκε σε έξι θραύσματα (HRM-04, 05, 06, 07, 08, και 09) μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα και κανονικό βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (Εικόνα 1Β). Επειδή μεθυλιωμένη κυτοσίνη απαιτεί υψηλότερη θερμοκρασία τήξης από μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη, οι καμπύλες τήξης των μεθυλιωμένων θραυσμάτων μετατοπίζεται προς τα δεξιά, σε σύγκριση με φυσιολογικές κυτταρικές σειρές. Για την αξιολόγηση των καθεστώτων μεθυλίωσης των μεμονωμένων CpGs στην περιοχή του υποκινητή 1.5 kb, συμπεριλαμβανομένων των έξι τμήματα, που αναλύθηκαν ποσοτικά επιμέρους CpGs με την EpiTYPER

TM δοκιμασία (Σχήμα 1C). Κανονική κυτταρικές γραμμές ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε ολόκληρο ακολουθίες 1,5 kb, αλλά ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές συνήθως υπερμεθυλιωμένο γύρω από τη θέση έναρξης μετάφρασης ATG. Αν και μερικοί CpGs στην τοποθεσία έναρξης μετάφρασης ATG του

HS3ST2

ήταν μερικώς μεθυλιωμένα σε H226 και H1650 κύτταρα, τα περισσότερα CpGs ήταν εξαιρετικά μεθυλιωμένο σε άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

5-Aza-επαγόμενο από DC απομεθυλίωση και την εκ νέου έκφραση σιγήσει HS3ST2

Για να διερευνηθεί εάν αρνητική ρύθμιση του

HS3ST2

εξαρτάται από υπερμεθυλίωση του γονιδίου, αναλύσαμε την εκ νέου -έκφραση (Σχήμα 1 D) και απομεθυλίωση (Σχήμα 1 Ε) του σιγήσει

HS3ST2 από

qRT-PCR και EpiTYPER

δοκιμασία ΤΜ μετά τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με 10 μΜ 5-αζα-dC για 72 ώρες. επίπεδα HS3ST2 mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα έξι από ό, τι δύο βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών γραμμών (μαύρη μπάρα? σχήμα 1Δ). Κατασιγασμένο

HS3ST2

επανα-εκφράζεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα μετά από αγωγή 5-Αζα-dC (λευκή ράβδος? Σχήμα 1Δ). Η αλλαγή στο επίπεδο της μεθυλίωσης σε απόκριση σε 5-Αζα-άΟ αναλύθηκε περαιτέρω σε μεμονωμένα CpGs γύρω από την άκρως μεθυλιωμένης περιοχής ATG του

HS3ST2

γονίδιο (Σχήμα 1 Ε). Αν και ο βαθμός της απομεθυλίωσης διέφεραν μεταξύ κυτταρικές σειρές, απομεθυλίωση βρέθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές μετά από αγωγή 5-Αζα-DC. Απομεθυλίωση εμφανίστηκαν πιο σημαντικά Η460 ή H1650 κυττάρων, τα οποία ήταν λιγότερο πυκνά μετουσιωμένο, από ό, τι σε πυκνά μετουσιωμένο κύτταρα H23. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι

HS3ST2

υπερμεθυλίωση μπορεί να σχετίζεται με μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω του γονιδίου.

HS3ST2

δραστηριότητα υποκινητή μειώθηκε με μεθυλίωση προαγωγού

δραστικότητα Promoter μετρήθηκε σε Η23 κύτταρα (Σχήμα 2Α) και κύτταρα ΗΕΚ-293Τ (Σχήμα 2Β) με τη δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης για να προσδιοριστεί εάν

HS3ST2

μεθυλίωση επηρεάζει τη μεταγραφή γονιδίων. Τέσσερις κατασκευές (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) για κάθε μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων υποκινητή παρήχθησαν. Μεθυλιωμένος κατασκευάσματα του

HS3ST2

υποκινητή ελήφθησαν με SSSI μεθυλάση (New England Biolabs, Inc., Beverly, ΜΑ) υπό την παρουσία S-αδενοσυλμεθειονίνης. δραστηριότητα υποστηρικτής μεταξύ μη μεθυλιωμένη κατασκευάσματα του

HS3ST2

υποκινητής δεν ήταν ανάλογη με το μήκος της κάθε κατασκεύασμα στα κύτταρα, αλλά η δραστηριότητα υποκινητή ιδίως μειώθηκε όταν διαγράφηκαν αλληλουχίες υποκινητή μεταξύ -742 bp και -495 bp. Για μεθυλιωμένα κατασκευάσματα, δραστηριότητα υποκινητή ήταν παρόμοια σε όλες τις κατασκευές και ουσιαστικά χαμηλή σε σύγκριση με εκείνη των αντίστοιχων μη μεθυλιωμένη κατασκευασμάτων. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι ο πυρήνας υποκινητής περιλαμβάνει μια περιοχή DNA του -742 bp μέσω -495 bp από τη θέση έναρξης της μεταγραφής.

Οι διπλές δραστηριότητες λουσιφεράσης των τεσσάρων HS3ST2 κατασκευάσματα υποκινητή μετρήθηκαν σε Η23 (Α) και HEK- 293Τ (Β) κυτταρικές γραμμές. Ένα κατασκεύασμα kb υποκινητή σειριακά διαγραφεί, και η δραστηριότητα λουσιφεράσης κάθε κατασκεύασμα έγινε σύγκριση μεταξύ των κατασκευασμάτων που έλαβαν θεραπεία με (γκρι γραμμή) και χωρίς SSSI μεθυλάσης (μαύρη γραμμή).

Η

HS3ST2 ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων, την εισβολή, και τον πολλαπλασιασμό

Για να διερευνήσουν τη λειτουργία

HS3ST2

στην ογκογένεση του πνεύμονα, κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, και τον πολλαπλασιασμό ήταν εξετάστηκαν σε Η460 και Η23 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

HS3ST2

cDNA κλωνοποιήθηκε σε pACGFP-C1 και επιμολύνονται σε κύτταρα Η460 και Η23: δεδομένα από Η23 κύτταρα είναι στο σχήμα S1. Η υπερέκφραση του επιμολυσμένα pACGFP-C1-

HS3ST2

παρακολουθήθηκε με RT-PCR (Σχήμα 3Α), qRT-PCR (Σχήμα 3Β) και ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 3C). Η υπερέκφραση του

HS3ST2

μείωσε σημαντικά την ικανότητα της μετανάστευσης των κυττάρων κατά 53% (

P

= 0,0017? Εικόνες 3D και 3Ε). δραστηριότητα των κυττάρων εισβολή μειώθηκε κατά 83% σε Η460 κύτταρα επιμολυσμένα με pACGFP-C1-

HS3ST2

(

P

= 0,0019? Σχήματα 3F και 3G)? τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επίσης, σημαντικά μειωμένη την πάροδο του χρόνου (amp Σχήματα 3Η &? 3θ). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι

HS3ST2

μπορεί να αναστέλλει πνευμονική ογκογένεση με τη μείωση της μετανάστευσης των κυττάρων, την εισβολή, ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο του πνεύμονα.

(AC) pACGFP-C1-

HS3ST2

ήταν επιμολύνεται σε Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Ειδικά η υπερέκφραση του

HS3ST2

σε σύγκριση με τον κενό φορέα επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Α), qRT-PCR (Β), και κηλίδωση Western (C). (ΓΔ) κύτταρα Η460 σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο Boyden με έναν κενό φορέα είτε με ένα μα pACGFP-C1-

HS3ST2

σε transwell μετανάστευση (D & amp? Ε) και προσδιορισμούς εισβολής (F & amp? G) όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Βιτρώ μεταναστεύοντα κύτταρα και εισβάλλοντα κύτταρα φαίνονται στο (D) και (F), αντίστοιχα? μεταναστεύοντα κύτταρα μετρήθηκαν με απορρόφηση στα 564 nm? εισβάλλοντας κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε σχέση με το

σε

vitro

μετανάστευση ή την εισβολή των μη επαγόμενα κύτταρα Η460 (100%). (Η &? Ι) Η460 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα ή pACGFP-C1-

HS3ST2

καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων πιάτο για να αναλύσει την επίδραση του

HS3ST2

στην κυτταρική ανάπτυξη. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE) των πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

Νοκ ντάουν της HS3ST2 αυξημένη κυτταρική μετανάστευση, κυτταρική εισβολή και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Για να επιβεβαιώσετε τα στοιχεία της HS3ST2 έκτοπη έκφραση, τα αποτελέσματα της

HS3ST2

knockdown στην κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναλύθηκαν σε βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων ΝΗΒΕ. Μετά από 72 ώρες από

HS3ST2

knockdown, σίγηση επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα (Σχήμα 4Α). Knockdown του

HS3ST2

προκάλεσε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 4Β). μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή επίσης αυξήθηκε κατά 45% και 79% σε σιγήσει κύτταρα ΝΗΒΕ, αντίστοιχα (σχήματα 4C & amp? 4D).

(Α) HS3ST2 siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΝΗΒΕ, και siRNA μεσολάβηση knockdown επιβεβαιώθηκε με Western blots. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία προσδιορίζεται με την αξιολόγηση της απορρόφησης του μετατραπέντος χρωστικής σε μήκος κύματος 570 nm. (C & amp? Α) Η επίδραση της HS3ST2 νοκ ντάουν για τη μετανάστευση των κυττάρων (C) και της εισβολής (D) μετρήθηκε επίσης στα κύτταρα ΝΗΒΕ. NC δείχνει χωρίς θεραπεία κανονικό έλεγχο.

Η

Σχέση κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά με HS3ST2 υπερμεθυλίωση

Πριν από την ανάλυση της κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση στο NSCLC, η σχέση μεταξύ του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση και η έκφρασή της αναλύθηκε σε νωπά-κατεψυγμένα ιστούς. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε φρέσκο ​​κατεψυγμένο όγκου και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς από μόνο 26 ασθενών λόγω της μικρής ποσότητας των ιστών, και ποσοτική μεθυλίωση-ειδική PCR διεξήχθη σε ιστούς όγκων από τους ασθενείς. επίπεδα HS3ST2 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε φυσιολογικούς ιστούς από ό, τι σε ιστούς όγκων (test

P

= 0,0004, Wilcoxon signed-rank? Σχήμα 5Α), και παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και της μεθυλίωσης του

HS3ST2

σε 26 ιστούς όγκων (ρ = -0.51,

P

= 0,009, βαθμό συσχέτισης Spearnman του? Εικόνα 5Β). Η κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

αναλύθηκε σε 298 εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) (Σχήμα 5C). Οι σχέσεις μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και

HS3ST2

υπερμεθυλίωση περιγράφονται στον Πίνακα 1.

HS3ST2

υπερμεθυλίωση βρέθηκε σε 95 (32%) των 298 ασθενών.

HS3ST2

υπερμεθυλίωση δεν σχετίζεται με την ηλικία των ασθενών (

P

= 0,12), το μέγεθος του όγκου (

P

= 0,14), το φύλο (

P

= 0.33), ιστολογία (

P

= 0,12), η διαφοροποίηση (

P

= 0,31), παθολογική στάδιο (

P

= 0,66), ή την υποτροπή του όγκου (

P

= 0,20). Ωστόσο,

HS3ST2

υπερμεθυλίωση συσχετίστηκε σημαντικά με το πακέτο-χρόνια του καπνίσματος (

P

= 0,01) και ήταν πιο διαδεδομένη στην τρέχουσα-καπνιστές σε σχέση με τους μη καπνιστές (

P

= 0,002).

επίπεδα (Α) HS3ST2 mRNA για πρώτη φορά σε σχέση ποσοτικά μεταξύ 26 φρέσκα-κατεψυγμένα ιστούς όγκων και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών (Wilcoxon signed-rank test,

P

= 0,0004). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος 2

-ΔC

T αξία των πειραμάτων εις τριπλούν, και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (Β) αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης και μεθυλίωση του

HS3ST2

παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση βαθμό συσχέτισης Spearman στις 26 ιστούς όγκων (ρ = -0.51,

P

= 0,009). (Γ) μεθυλίωση του

HS3ST2

προαγωγού αναλύθηκε σε ιστούς παραφίνης από ασθενείς με NSCLC που χρησιμοποιούν μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP). Τα ασθενή αριθμούς αναγνώρισης που αναφέρεται. «Μ» και «U» αντιπροσωπεύουν ενίσχυση του μεθυλιωμένου και μη-μεθυλιωμένου αλληλόμορφο, αντίστοιχα. «Pos» αντιπροσωπεύει τα θετικά δείγματα αναφοράς για τα μεθυλιωμένα και μη μεθυλιωμένων αλληλίων. Αρνητικών δειγμάτων ελέγχου χωρίς DNA συμπεριλήφθηκαν για κάθε PCR. (D) Έκφραση Ki-67 αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Οι αριθμοί δείχνουν αντιπροσωπευτικά παραδείγματα θετική έκφραση του Ki-67 σε αδενοκαρκίνωμα (αριστερά) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (δεξιά) (Μεγέθυνση: χ 200). (Ε) Σύνδεσμος

HS3ST2

υπερμεθυλίωση με Ki-67 δείκτης πολλαπλασιασμού εκτιμήθηκε σε 298 NSCLCs. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα. «Adenoca» και «πλακωδών» δείχνουν αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, αντίστοιχα. «Met (+)» και «Met (-)» αντιπροσωπεύουν την παρουσία και απουσία του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση αντίστοιχα

Η

Η

HS3ST2

υπερμεθυλίωση.

Η Κατηγορία

Υποκατηγορία

Όχι (Ν = 203)

Ναι (Ν = 95)

P

-τιμή

Ηλικία

A62 ± 860 ± 110.12Pack έτη

Α26 ± 2432 ± 250.01Size (cm)

Α3.9 ± 1.94.3 ± 2.10.14SexWomen4526Men158690.33Smoking statusNever7315Former3217Current98630.002HistologyAdeno

b7748Squamous

b10739Others1980.12Differentiation

cWell2517Moderately9537Poorly2918Undifferentiated720.31Pathologic stageI11858II5319III3017IV210.66RecurrenceNo11059Yes93360.20Table 1. κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά (Ν = 298)

aMean ± τυπική deviationbAdeno, αδενοκαρκίνωμα.? Τα πλακώδη, πλακώδες δεδομένων cDifferentiation καρκίνωμα λείπει σε 68 περιπτώσεις CSV Λήψη CSV

Για να αναλυθεί η σχέση του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, Ki-67 έκφραση αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση (Σχήμα 5D). Ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 βρέθηκε να είναι σημαντικά διαφορετικό ανάλογα με την κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

(

P

= 0,02? Σχήμα 5Ε): ο δείκτης πολλαπλασιασμού μέση Ki-67 ήταν 29% και 22% σε όγκους με και χωρίς

HS3ST2

υπερμεθυλίωση, αντίστοιχα. Η σχέση μεταξύ του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67 και

HS3ST2

υπερμεθυλίωση ήταν επίσης παρόμοια σε αδενοκαρκίνωμα (

P

= 0.04) και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (

P

= 0,009).

επιβίωση ανάλυση

επιβίωσης χωρίς υποτροπή (RFS) και τη συνολική επιβίωση σε σύγκριση ανάλογα με την κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

όλη στάδιο του όγκου. Για να αναλυθεί η επίδραση του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση στην πρόγνωση των ασθενών, είμαστε στρωματοποιημένη δεδομένων από το στάδιο του όγκου, διότι το στάδιο του όγκου συνδέεται σημαντικά με την επιβίωση των ασθενών με NSCLC.

HS3ST2

υπερμεθυλίωση δεν συσχετίστηκε με RFS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η επίδραση του

HS3ST2

υπερμεθυλίωση στη συνολική επιβίωση έδειξε ένα διαφορετικό μοτίβο ανάλογα με τη συμμετοχή των λεμφαδένων σε 248 σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs. Για 193 αρνητικούς λεμφαδένες σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs, το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών ήταν 59% και 71% σε ασθενείς με και χωρίς

HS3ST2

υπερμεθυλίωση, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Και, αυτή η διαφορά ήταν σημαντικά διαφορετική (

P

= 0.04). Ωστόσο, η συνολική επιβίωση δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών με και χωρίς υπερμεθυλίωση του

HS3ST2

σε 55 θετικούς λεμφαδένες περιπτώσεις. (

P

= 0,69? Εικόνα 6Β)

Γενικά επιβίωση σε σύγκριση ανάλογα με την κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

σε 193 αρνητικούς λεμφαδένες σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs (Α) και σε 55 θετικούς λεμφαδένες σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs (Β).

HS3ST2

υπερμεθυλίωση σε μια ομάδα που δεν έχουν συμμετοχή των λεμφαδένων έδειξαν μια σημαντική αρνητική επίδραση στη συνολική επιβίωση (

P

= 0.04).

Η

COX- αναλογικών κινδύνων ανάλυση

Στρωματοποιημένη αναλογικών κινδύνων κατά Cox ανάλυση (Πίνακας 2) για 248 σταδίου Ι-ΙΙ NSCLCs έγιναν για τον έλεγχο για πιθανούς συγχυτικούς επιδράσεις των μεταβλητών, όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, επικουρική θεραπεία, υποτροπή, και διαφοροποίησης, καθώς και για τον υπολογισμό του δείκτη κινδύνου (HR). Οι ασθενείς με

HS3ST2

υπερμεθυλίωση σε 193 αρνητικούς λεμφαδένες NSCLCs είχε ένα 2,12 φορές (95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI] = 1,25 – 3,58?

P

= 0,005) μεγαλύτερο κίνδυνο αποτυχίας σε σύγκριση με εκείνους χωρίς να

HS3ST2

υπερμεθυλίωση. Ωστόσο, η συνολική επιβίωση σε ασθενείς με τη συμμετοχή των λεμφαδένων δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό ανάλογα με την κατάσταση μεθυλίωσης του

HS3ST2

(HR = 0,84, 95% CI = 0,34 – 3,82?

P

= 0.69).

η

HS3ST2

υπερμεθυλίωση

HR

α

95% CI

α

P

-τιμή

(Α) και θετικούς λεμφαδένες casesNo1.00 (Ν = 55) Yes0.840.34-3.820.69 (Β) αρνητικούς λεμφαδένες casesNo1.00 (Ν = 193) Yes2.121.25-3.580.005Table 2.