Αφηρημένο

Ένα ευρέως αποδεκτό πρότυπο στον τομέα της βιολογίας του καρκίνου είναι ότι οι συμπαγείς όγκοι είναι uni-προγονική που προέρχεται από ένα και μόνο ιδρυτή και τους απογόνους του . Ωστόσο, τα δεδομένα έχουν σταθερά προέρχονται που δείχνουν νωρίς όγκων σε ποντίκια και ανθρώπους μπορεί να έχει ένα πολυ-προγονική προέλευση στην οποία ένα κινηθεί γενάρχη διευκολύνει την μεταμόρφωση των γειτονικών συν-γεννητόρων. Έχουμε αναπτύξει ένα νέο μοντέλο ποντικιού που επιτρέπει τον προσδιορισμό της κλωνικής αρχιτεκτονική των εντερικών όγκων

in vivo

και

ex vivo

, έχουν επικυρωθεί αυτό το μοντέλο, και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για να αξιολογηθεί η κλωνική αρχιτεκτονική των αδενωμάτων , εντός του βλεννογόνου καρκινώματα, και επεμβατική αδενοκαρκινώματα του εντέρου. Το ποσοστό των πολλαπλών προγονική όγκοι δεν άλλαξε σημαντικά καθώς οι όγκοι εξελίχθηκαν από αδενώματα με χαμηλού βαθμού δυσπλασία [40/65 (62%)], για να αδενώματα με υψηλού βαθμού δυσπλασία [21/37 (57%)], για την εντός του βλεννογόνου καρκινώματα [10/23 (43%)], σε επεμβατικές αδενοκαρκινώματα [13/19 (68%)], υποδεικνύοντας ότι ο κλώνος που προκύπτει από την γενάρχη συνεχίζει να συνυπάρχουν με κλώνους που προκύπτουν από συν-γεννητόρων. Επιπλέον, τα νεοπλασματικά κύτταρα από διαφορετικές κλώνους εντός ενός πολυ-προγονικό αδενοκαρκίνωμα μάλιστα έχουν παρατηρηθεί να εισβάλουν ταυτόχρονα στο υποκείμενο μυϊκό σύστημα [2/15 (13%)]. Έτσι, εντός του όγκου ετερογένεια που προκύπτουν νωρίς το σχηματισμό όγκων παραμένει καθ ‘όλη την ογκογένεση

Παράθεση:. Zahm CD, Szulczewski JM, Leystra ΑΑ, Paul Olson TJ, Clipson L, Albrecht DM, et al. (2016) Καρκίνοι Σύνθετη Εντερική συχνά διατηρούν ένα Multi-Προγονική Αρχιτεκτονική. PLoS ONE 11 (2): e0150170. doi: 10.1371 /journal.pone.0150170

Επιμέλεια: Kwong-Kwok Wong, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 6 Οκτωβρίου, 2015? Αποδεκτές: 10 του Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 26 Φλεβάρη 2016

Copyright: © 2016 Zahm et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (https://www.cancer.gov/) των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (R01 CA123438 να RBH? P30 CA014520 στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin Carbone Κέντρο Καρκίνου? P30 DK058404, προκλινικά μοντέλα Digestive Diseases πυρήνα, Ασθένειες Vanderbilt Πεπτικό Κέντρο Ερευνών? Ρ50 CA095013, Μεταγραφική Παθολογίας και Imaging Core, Vanderbilt GI SPORE? K08 CA84146 να ΑΤΤ? Τ32 CA009135 να CDZ και AAL? και Τ32 CA090217 να TJPO) και τα κεφάλαια εκκίνησης από το Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison Τμήμα Γαστρεντερολογίας και ηπατολογίας, Τμήμα Ιατρικής, και Σχολή Ιατρικής και Δημόσιας Υγείας στο RBH

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Η ετερογένεια των όγκων έχει αναγνωριστεί εδώ και δεκαετίες. Νεοπλασματικών κυττάρων εντός ενός όγκου ποικίλει σε διάφορες διακριτές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένων των κρατικών διαφοροποίησης, ρυθμό πολλαπλασιασμού, μεταστατικό δυναμικό και θεραπευτική ανταπόκριση. Ιστορικά, προτάθηκαν δύο μοντέλα για να εξηγήσουν εντός του όγκου ετερογένεια. Η κλωνική μοντέλο εξέλιξη ισχυρίζεται ότι διαφορετικούς υποκλώνους προκύψουν από ένα ενιαίο προγονικών ως συνέπεια των μοριακών αλλαγών που ακολουθείται από επιλογή για ανόμοια μικροπεριβάλλοντα εντός ενός όγκου [1]. Αντίθετα, το μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων ισχυρίζεται ότι ένας μικρός πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από ένα και μόνο προγονικά είναι υπεύθυνος για τη συντήρηση του όγκου αλλά οι απόγονοι μπορούν να διαφοροποιηθούν με διάφορους διαφορετικούς τρόπους [1]. Και στα δύο μοντέλα, δύο βασικές υποθέσεις είναι ότι οι όγκοι είναι uni-προγονική, που προέρχεται από ένα μόνο ιδρυτή, και ότι ένας υποκλώνος θα συσσωρεύονται τελικά μεταλλάξεις που οδηγούν μετάσταση σε άλλα όργανα.

Τα δεδομένα έχουν σταθερά που προκύπτουν για το ένα τρίτο μοντέλο εντός του όγκου ετερογένεια: συμπαγείς όγκους μπορεί να έχει ένα πολυ-προγονική αρχιτεκτονική [2]. Έχουμε αποδείξει ότι η κληρονομική και καρκινογόνο επαγόμενη εντερική όγκων στο εργαστήριο ποντίκι μπορεί να προέρχονται από πολλαπλές ιδρυτές [3, 4]. Τα ευρήματά μας συνάδουν με εκείνες του άλλου εργαστηρίου καταδεικνύουν ότι κληρονομική και σποραδικές όγκους παχέος εντέρου στον άνθρωπο μπορεί να είναι πολυ-προγονική στην αρχιτεκτονική [5, 6]. Έτσι, σε αντίθεση με μια ευρέως αποδεκτό πρότυπο στον τομέα της βιολογίας του καρκίνου, συμπαγείς όγκους μπορεί να έχει ένα πολυ-προγονική προέλευση και, κατά συνέπεια, να είναι ετερογενής, ακόμη και δεδομένου ότι μόλις αρχίζουν να διαμορφώνουν.

Οι αρχικές μελέτες με πειραματόζωα κυρίως στηρίχθηκε στις χίμαιρες συσσωμάτωσης. Τέτοιοι ποντικοί δημιουργήθηκαν με σύντηξη μαζί πρώιμα έμβρυα. Τυπικά, ένα έμβρυα μεταφέρονται το δείκτη γενεαλογία Rosa 26 που εκφράζει β-γαλακτοσιδάση, έτσι ώστε τα κύτταρα από αυτό το έμβρυο λεκέ μπλε παρουσία 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-β-D-γαλακτοπυρανοσίδη, ενώ τα κύτταρα από την άλλη έμβρυο παραμένουν λευκά. Όγκους που είναι heterotypic, που αποτελείται από μπλε και άσπρο νεοπλασματικά κύτταρα, έχουν ένα πολυ-προγονική καταγωγή. Η χρήση των χίμαιρες συσσωμάτωσης απέδωσε νέες γνώσεις για τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης. Δυστυχώς, αυτό το ισχυρό πειραματικό εργαλείο έχει κάποιους σημαντικούς περιορισμούς. Η παραγωγή χιμαιρών συσσωμάτωσης είναι πολύ χρονοβόρα και δαπανηρή, έτσι ώστε ο αριθμός των ζώων που αναλύθηκαν είναι συχνά χαμηλή. Η κλωνική αρχιτεκτονική οποιουδήποτε όγκου μπορεί να προσδιοριστεί μόνο μετά από μια μακρά διαδικασία χρώσης που περιλαμβάνει δύο στάδια στερέωσης και μια ολονύκτια επώαση στους 37 ° C. Η χρώση είναι συχνά ατελής αφού το υπόστρωμα πρέπει να διαχυθεί μέσα στον όγκο? κατά συνέπεια, δεν μπορούν να βαθμολογηθούν όλες οι όγκοι. Επιπλέον, οι σκληρές συνθήκες απαγορεύουν κάθε μεταγενέστερη μοριακή ανάλυση.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει ένα νέο μοντέλο ποντικού που επιτρέπει η κλωνική αρχιτεκτονική των εντερικών όγκων που θα καθοριστεί

in vivo

και

ex vivo

, επικυρωμένη αυτό το μοντέλο, και στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί η κλωνική αρχιτεκτονική των εντερικών καρκίνων. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι αδενώματα έχουν ένα πολυ-προγονική προέλευση και ότι αυτή η πρώιμη ποικιλομορφία παραμένει ως όγκοι μετάβαση από καλοήθη σε κακοήθη κατάσταση.

Μέθοδοι

στελέχη Ποντίκι και την παραγωγή του ψηφιδωτού ποντίκια

οι μελέτες σε πειραματόζωα διεξήχθησαν υπό πρωτόκολλα εγκεκριμένα από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Ουισκόνσιν, σύμφωνα με τις πολιτικές που καθορίζονται από το Γραφείο του Εργαστηρίου καλή μεταχείριση των ζώων στα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. C57BL /6J (Β6), FVB /NJ (FVB), ​​B6.Apc

Min /J ποντίκια που ήταν ετερόζυγο για το

Min

αλληλόμορφο του

Αδενωματώδεις γονίδιο πολυποδίαση coli

(

Αρο

Min /+), και B6.129 (CG) -gt (ROSA) 26Sor

ΤΜ4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo /J ποντίκια που είχαν ημίζυγα για το mT /mg ρεπόρτερ ελήφθησαν από το The Jackson Laboratory. FVB /N-Tg

(Fabp1-CRE) 1Jig ποντίκια ημίζυγα για το διαγονίδιο Fabp1-Cre στο οποίο ο υποκινητής από την πρωτεΐνη δέσμευσης λιπαρού αρουραίου οξύ είναι συντηγμένο με το γονίδιο που κωδικοποιεί Cre ανασυνδυάση, καταλήγοντας σε μωσαϊκό έκφραση της Cre πριν η ολοκλήρωση της εντερικής μορφογένεση, ελήφθησαν από το Repository του National Cancer Institute στο Frederick Mouse. Τα αποθέματα αυτών των στελεχών διατηρήθηκαν από αδελφικών σταυρούς και διασταυρώσεως με Β6 ή FVB ποντίκια που εισήχθησαν κάθε πέμπτη γενιά. Απόγονοι γονότυπος χρησιμοποιώντας DNA που απομονώθηκε από το κλιπ toe για PCR, όπως περιγράφεται από τους προμηθευτές των ζώων.

Ένα ποντίκι που φέρει το

Min

αλληλόμορφο του

Αρο

εντοπίστηκε στο εργαστήριο του Dr. William F. Dove στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin εξής μεταλλαξιγένεση με αιθυλονιτροζουρία [7, 8]. Ο ιδρυτής και των απογόνων του παρουσιάζονται με χλωμό πόδια λόγω της απώλειας αίματος από όγκους στο έντερο [7]. Όγκου πολλαπλότητα, την ανάπτυξη και την εξέλιξη στο

Αρο

Min /+ ποντίκια εξαρτώνται από το γενετικό υπόβαθρο. Β6

Αρο

Min /+ ποντίκια αναπτύσσουν κατά μέσο όρο 100 εντερική όγκους και συνήθως πεθαίνουν από 150 ημέρες από την ηλικία [7]. Οι όγκους που ξεκίνησαν μετά την απώλεια της δραστικότητας ΑΡΟ σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα σύντομα μετά τη γέννηση και είναι σχεδόν πάντοτε καλοήθη αδενώματα [9-13]. Αντίθετα, (SWRxB6) F1

Αρο

Min /+ υβρίδια αναπτύξουν λίγες όγκους και συνήθως ζουν ένα χρόνο ή περισσότερο [14]. Οι όγκοι σε αυτούς τους ποντικούς είναι συχνά επεμβατικές καρκίνοι που περιστασιακά μετάσταση σε τοπικούς λεμφαδένες, προφανώς λόγω της αυξημένης διάρκειας ζωής [14].

πειραματικά ποντίκια δημιουργήθηκαν με πρώτη διέλευση Β6

mT /mG

θηλυκά να Β6

Αρο

Min /+ αρσενικά να παράγουν Β6

Αρο

Min /+?

MT /mG

ποντίκια που στη συνέχεια πέρασε στην FVB

Fabp1-Cre

ποντίκια για να παράγουν (FVBxB6) F1

Αρο

Min /+?

Fabp1-Cre

?

MT /mG

υβρίδια. Πειραματικό υβρίδια F1 αφέθηκαν να ηλικία έως 150 ημέρες ή έως ότου ετοιμοθάνατα να εκτιμηθεί η κλωνική αρχιτεκτονική των όγκων σε διαφορετικά στάδια.

φθορισμού ενδοσκόπηση

φθορισμού ενδοσκόπηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο σύστημα Karl Storz Coloview ως περιγράφηκε προηγουμένως [15, 16]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και τους δόθηκε η κλύσμα θερμού PBS να διώξει οποιαδήποτε κοπράνων. Το ενδοσκόπιο εισήχθη περίπου τεσσάρων εκατοστών και στη συνέχεια αποσύρθηκε αργά χρησιμοποιώντας ένα Optotronics δίοδος-αντλείται σύνολο λέιζερ στερεάς κατάστασης σε 437nm σε ισχύ τα 100mW ως πηγή φωτός. Βίντεο συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια όλης της διαδικασίας και στατικές εικόνες συλλήφθηκαν κάθε όγκου. Τα ποντίκια αφέθηκαν να ξυπνήσει μετά την επέμβαση.

Βίντεο και φωτογραφίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το πακέτο των Φίτζι του ImageJ να απεικονίσει φυσιολογικό και δυσπλαστικών κρυπτών που εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη.

Απεικόνιση ολόκληρων αναρτήσεις

Τα εντερικά κομμάτια απομακρύνθηκαν ανέπαφα κατά τη νεκροψία, ανοίχτηκε κατά μήκος, ξεπλύθηκε με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 4 ώρες και φυλάχθηκε στους 4 ° C σε 70% αιθανόλη. Το μικρό έντερο, τυφλό έντερο, και του παχέος εντέρου στερεώθηκαν σε 0.4% αγαρόζη σε PBS και απεικονίζεται να συλλάβει ερυθρό φθορισμό (mT? TdTomato) και πράσινο φθορισμό (MG? EGFP) χρησιμοποιώντας είτε ένα μικροσκόπιο Zeiss σε 12.5x και ή Nikon μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 20x (βλ S1 αρχείου για περισσότερες λεπτομέρειες).

Ολόκληρο-mount εικόνες που χρησιμοποιούνται για τη στατιστική ανάλυση ελήφθησαν στο μικροσκόπιο Zeiss και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το πακέτο επεξεργασίας εικόνας Φίτζι του ImageJ [17]. Μια μακροεντολή χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η συνοχή μεταξύ των εικόνων. Εν συντομία, η μακροοικονομική έψαξε έναν κατάλογο για αρχεία εικόνας Zeiss (ZVI) και να μετατραπεί σε Ανοίξτε Μικροσκοπία Περιβάλλοντος (ΟΜΕ) ετικέτα μορφή αρχείου εικόνας (TIFF) με τη χρήση των τόπων Bio-Μορφές Εισαγωγέας /Εξαγωγέας για τη διατήρηση meta δεδομένα [18]. Στη συνέχεια ολοκλήρωσε το ακόλουθο σύνολο των λειτουργιών με τις ρυθμίσεις βάσει της οποίας πρωτεΐνης απεικονίζεται (tdTomato ή EGFP): αφαιρείται φόντο, ενισχυμένη τοπική αντίθεση (CLAHE), που autothreshold, και μετατρέπεται σε δυαδικό. Μόλις στο δυαδικό, οι περιοχές της εικόνας που δεν περιέχουν ιστό γέμισαν με κίτρινο. Το αποτέλεσμα ήταν μια δυαδική εικόνα στην οποία λευκό αντιπροσωπεύει ιστό που εκφράζει tdTomato και μαύρο αντιπροσωπεύει ιστό που εκφράζει EGFP (S1 Σχήμα).

μέγεθος Patch ανάλυση

Για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ μωσαϊκισμού και κλωνική αρχιτεκτονική, κόκκινο και πράσινο μπαλώματα του εντερικού επιθηλίου σε πειραματικά ποντίκια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χάρτες απόσταση όπως περιγράφηκε προηγουμένως για χίμαιρες συσσωμάτωσης [3, 4]. Εν συντομία, επίπεδη δυαδικές εικόνες του κάθε εντερικού τμήματος μετατράπηκαν σε χάρτη απόσταση εικόνες, που δείχνουν για κάθε θέση η Ευκλείδεια απόσταση από το πλησιέστερο αντίθετο χρώμα, χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού EBImage [19]. Η μέση ελάχιστη απόσταση από τα απέναντι μέτρα χρώμα το ψηφιδωτό μέγεθος του εμπλάστρου, η οποία σε σύγκριση με τα μεγέθη μπάλωμα από χίμαιρες συσσωμάτωσης (S2 σχήμα).

3D ανακατασκευή των όγκων

Μερικές αδενώματα από ποντίκια υποβάλλονται σε ευθανασία σε 150 ημέρες ηλικία αποκόπηκαν και οπτικά αφαιρεθεί χρησιμοποιώντας 2,2-θειοδιαιθανόλη (TDE) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εκκαθαριστεί αδενωμάτων ήταν τοποθετημένα

en bloc

σε 97% έγινε TDE και πολυφωτονικών διέγερση απεικόνισης σε ένα σύστημα Prairie Τεχνολογίες Ultima IV Imaging στα τόπους.

στοίβες Εικόνα από το Ultima IV ήταν ραμμένες μαζί χρησιμοποιώντας το προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του Grid /Συλλογή ραφές plug-in για το ImageJ που διανέμεται ως μέρος του έργου Φίτζι [21]. Ιστορικό αφαίρεση πραγματοποιήθηκε σε δύο κανάλια, χρησιμοποιώντας τη λειτουργία φόντο ImageJ αφαιρούμε με ένα κυλιόμενο ακτίνα μπάλα 40 pixels. Όταν δείχνουν μόνο EGFP, ένα όριο χρησιμοποιήθηκε για την εξάλειψη αυτοφθορισμό ιστό. Το όριο αυτό ισχύει εξίσου για όλους τους τομείς όλων των εικόνων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοικοδόμηση. Εικόνες στη συνέχεια άνοιξαν χρησιμοποιώντας το ImageJ προβολή 3D plug-in (Εμφάνιση ως: Όγκος, Χρώμα: Κανένα? Όριο: 0, Αναδόμηση παράγοντα: 1) για να δημιουργήσει υψηλής ποιότητας 3D απεικονίσεις του συνόλου δεδομένων ΟΜΕ

Ανοσοϊστοχημεία

Όλα αποκοπεί όγκοι είτε ενσωματωμένα σε FSC 22 (Surgipath) και flash κατεψυγμένα ή τοποθετούνται σε φορμόλη, επεξεργασία και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Μπλοκ εν σειρά τομές και παρατάσσονται ως δύο 5μm τμήματα ανά διαφάνεια. Κάθε δέκατο slide χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Για πληρέστερη ανάλυση, τα πλακίδια ενδιαφέροντος βάφτηκαν με ανοσοϊστοχημεία για CTNNB1 (1: 200 Καθαρισμένο Mouse Anti-β-κατενίνης αντίσωμα, BD Transduction Laboratories) χρησιμοποιώντας το HistoMouse Max Kit (Invitrogen) ή με ανοσοφθορισμό για την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) ή κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (tdTomato) (πρωτοβάθμιας 1: 1000 Χρώματα Living EGFP μονοκλωνικό αντίσωμα, Clontech, και τις δευτεροβάθμιες 1: 1000 αντι-ποντικού κατσίκας Alexa Fluor 488, Invitrogen? και /ή της πρωτοβάθμιας 1: 200 αντι-tdTomato, Rockland και τις δευτεροβάθμιες 1: 1000 κατσίκας αντι-κουνελιού Alexa Fluor 568, Invitrogen) και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) εφαρμόζοντας παρατείνει Χρυσό με DAPI μέσα στερέωσης (Molecular Probes). Σημειώστε ότι χρώση για EGFP και tdTomato ήταν αναγκαία επειδή στερέωση αποσβένει το φθορίζον σήμα

ανοσοφθορισμού

Οι ιστολογικές τομές χρωματίζονται με ανοσοφθορισμό απεικονίστηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα ολόκληρο-mount απεικόνισης.? η μόνη αλλαγή ήταν η χρήση του 4x, 5x, 10x ή 20x στόχο φακούς. Μετα-επεξεργασία των εικόνων δεν ήταν απαραίτητη. Οι ιστολογικές τομές χρωματίζονται με ανοσοϊστοχημεία ή αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) απεικονίστηκαν με τον ίδιο τρόπο με μία πηγή φωτός αλογόνου και χωρίς φίλτρα χρώματος

Pathology

εκτιμήθηκε Η παθολογία της κάθε βλάβης. από δύο παθολόγους πίνακας-επικυρωμένο (KAM και MKW) εξετάζοντας H & amp? Ε βάφονται διαφάνειες. Όγκοι ταξινομούνται είτε ως αδένωμα με χαμηλού βαθμού δυσπλασία, αδένωμα με υψηλού βαθμού δυσπλασία, καρκίνωμα εντός του βλεννογόνου, ή διηθητικό αδενοκαρκίνωμα. Τα ιστολογικά κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση των βλαβών ορίζονται ως εξής: παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε σε ανθρώπινο σωληνοειδές αδενώματα, αλλοιώσεις με χαμηλού βαθμού δυσπλασία παρουσίασαν υπερχρωματικούς, επίμηκες πυρήνες με διαστρωμάτωση των πυρήνων στα μισά του δρόμου προς την αυλική όψη με scatted μίτωση. Σε υψηλού βαθμού δυσπλασία, οι υπερχρωματικό πυρήνες είναι μεγαλύτερα, στρογγυλεμένες και συχνά περιέχει εμφανή πυρηνίσκος, παρουσιάζουν την πυρηνική διαστρωμάτωση στην επιφάνεια του αυλού, καταδεικνύουν περίπλοκη αρχιτεκτονική με back-to-back ή ηθμοειδή αδένες, και περιέχουν άφθονη μιτωτικής στοιχεία (μερικές φορές άτυπα) με περιοχές κυτταρικής νέκρωσης. Σε όγκους που παρουσιάζουν εντός του βλεννογόνου καρκινώματος, οι πυρηνικές και κυτταρολογικά χαρακτηριστικά είναι όμοια με εκείνη που παρατηρείται με υψηλού βαθμού δυσπλασία, ωστόσο αυτές οι αλλοιώσεις αποδεικνύουν επίσης νεοπλασματική εισβολή των κυττάρων πέρα ​​από την βασική μεμβράνη μέσα στο υμένα ή μυϊκό βλεννογόνο και μπορεί να σχετίζεται με μια δεσμοπλαστικού αντίδραση. Για βλάβες που πρέπει να ταξινομηθεί ως επεμβατική αδενοκαρκινώματα, τα νεοπλασματικά κύτταρα να εισβάλουν πέρα ​​από το μυϊκό βλεννογόνο σε τουλάχιστον υποβλεννογόνιο. Η ιστολογία των διηθητικών όγκων μπορεί να ποικίλουν έτσι ώστε οι όγκοι μπορεί να αποτελείται από νεοπλασματικά κύτταρα με καλοσχηματισμένα αδένων ή φύλλα των κυττάρων χωρίς σχηματισμό αδένα, ωστόσο σε όλες τις περιπτώσεις υπάρχει μια σχετική απόκριση δεσμοπλαστικού.

Αλληλούχηση

Αρο

η

τομές παραφίνης ήταν προετοιμασμένοι για τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής (LCM) των περιοχών ενδιαφέροντος με χρώση για EGFP χρησιμοποιώντας το HistoMouse Max Kit (Invitrogen) (πρωτοβάθμιας 1: 1000 Living Colors EGFP μονοκλωνικό αντίσωμα, Clontech). Δίπλα τομές στη συνέχεια κόβεται σε πλάκες μεμβράνης και χρωματίστηκαν με κυανό του μεθυλενίου. Περιοχές ενδιαφέροντος αφαιρέθηκαν μέσω LCM με τη βοήθεια των Μεταγραφική Πρωτοβουλίες Έρευνας στην Παθολογία (TRIP) Lab, του Πανεπιστημίου του Wisconsin-Madison. Εναλλακτικά, εάν τα επιθέματα είναι αρκετά μεγάλα, ιστός ξύνεται με το χέρι από μη χρωσμένα πλακίδια που περιέχουν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από το απομονωμένο ιστό χρησιμοποιώντας το Maxwell 16 αυτοματοποιημένο σύστημα καθαρισμού με Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Kit καθαρισμός ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν δύο περιοχές του εξωνίου 15 (κωδικόνια 747-953 και 1285-1513? S1 Πίνακα) του ποντικιού

Αρο

γονιδίου, δεδομένου ότι οι περισσότερες μεταλλάξεις συμβαίνουν σε αυτές τις δύο περιοχές [8, 22]. PCR διεξήχθη για 35 κύκλους. Κάθε κύκλος αποτελείτο από 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 55 ° C, και 1 λεπτό στους 72 ° C. Όλες οι διαδικασίες ενισχύσεως περιλαμβάνονται ελεύθερο DNA ελέγχους που αποτελείται από το κοκτέιλ ενίσχυσης και ύδατος άνευ νουκλεάσης (Promega) στην θέση του προτύπου DNA. PCR εναρκτήρες στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για προσδιορισμό της αλληλουχίας. Μετάλλαξη ανακάλυψη και ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το 6.0.1 (Norman Drinkwater, McArdle Εργαστήριο για την Έρευνα του Καρκίνου, Τμήμα Ογκολογίας, Σχολή Ιατρικής και Δημόσιας Υγείας του Πανεπιστημίου του Wisconsin-Madison) και μετάλλαξη Surveyor (Softgenetics) προγράμματα mSeq.

Αποτελέσματα

Για να μελετηθεί η κλωνική αρχιτεκτονική των εντερικών όγκων, δημιουργήσαμε ποντίκια που φέρουν τρεις γενετικά στοιχεία. Τα πρώτα δύο διαγονίδια που είναι αναγκαίο να δημιουργηθεί ένα πρότυπο μωσαϊκισμού στο έντερο. Ένα διαγονίδιο αποτελείται από την πρωτεΐνη δέσμευσης 1 προαγωγέα συγχωνευμένο με το γονίδιο που κωδικοποιεί Cre ανασυνδυάση λιπαρού οξέος αρουραίου και η άλλη έχει το

mT /mG

ανταποκριτή. Σε κύτταρα που δεν εκφράζουν Cre, κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (tdTomato) παρήχθη αποκλειστικά από τον δημοσιογράφο, ακόμη και κατά τη διάρκεια του εντέρου ογκογένεσης? σε κύτταρα που εκφράζουν Cre που αρχίζει την ημέρα Ε13.5 (πριν από την ολοκλήρωση της εντερικής μορφογένεσης και πριν από το σχηματισμό όγκων Min), πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) παρήχθη αποκλειστικά ως το γονίδιο που κωδικοποιεί την tdTomato διαγράφηκε εξής ανασυνδυασμού. Έτσι, αυτά τα δύο στοιχεία δημιούργησαν ένα διαφοροποιημένο πρότυπο των κυττάρων που εκφράζουν κόκκινο ή πράσινο φθορίζουσες πρωτεΐνες στο απομακρυσμένο λεπτό έντερο, τυφλό έντερο και το κόλον (S3 Εικ). Αυτό το μοτίβο ήταν σταθερή σε όλα τα χρονικά σημεία που αξιολογήθηκαν (S5 σχήμα). Το τρίτο στοιχείο ήταν ένα μόνο αντίγραφο του

Min

αλληλόμορφο του

αδενωματώδη πολυποδίαση coli

(

Αρο

) γονίδιο [8]. Αυτή η μετάλλαξη προδιάθεση τα ποντίκια στην αυθόρμητη ανάπτυξη των όγκων σε όλη του λεπτού εντέρου και του παχέος εντέρου. Δεδομένου ότι η κατάσταση ρεπόρτερ καθορίζεται πριν από τη μορφοποίηση και όγκους έκφραση Cre είναι σταθερή κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, όγκους που αποτελείται από ένα μείγμα από κόκκινο και πράσινο νεοπλασματικά κύτταρα έχουν ένα πολυ-προγονική αρχιτεκτονική.

Για να χαρακτηρίσουμε την εντερική ογκογένεση σε αυτό το μοντέλο, μια ομάδα των 20 ποντικών παράχθηκε και ευθανασία σε 150 ημέρες από την ηλικία. Η συχνότητα εμφάνισης των εντερικών όγκων ήταν 100% με μέσο όρο πολλαπλότητα 11 ± 5. Μια χαμηλή φορτίο όγκου αναμενόταν λόγω της ομοιογενούς F1 γενετικό υπόβαθρο και ήταν ιδιαίτερα επιθυμητή καθώς περιόρισε τη δυνατότητα δύο ανεξάρτητα ξεκίνησε όγκους συγχωνευόμενου ως συνέπεια της εγγύτητας [23]. Όλες οι όγκοι από αυτή την ομάδα ποντικών που αναλύθηκαν ήταν αδενώματα με χαμηλού βαθμού δυσπλασία.

Πολλά από τα αδενώματα σε αυτά τα ποντίκια είχαν μια πολυ-προγονική αρχιτεκτονική. Η σύνθεση των όγκων του παχέος εντέρου ήταν εμφανής

in vivo από

ενδοσκόπηση φθορισμού (Σχήμα 1Α) και

ex vivo

με μικροσκόπιο φθορισμού (Σχήμα 1Β). Από τους 63 όγκους στο απομακρυσμένο λεπτό έντερο και στο κόλον, 32 (51%) επιβεβαιώθηκαν να αποτελείται από κόκκινο και πράσινο νεοπλασματικά κύτταρα με ιστολογία (Πίνακας 1 και το Σχήμα 1 C-1 F). Χαρακτηριστικά του μετασχηματισμού από το φυσιολογικό βλεννογόνο σε νεοπλασία /δυσπλασία ήταν η απώλεια της αρχιτεκτονικής κρύπτη, η εξάντληση των επιφανειακών βλεννίνη, και την αύξηση της μίτωσης, καθώς σχετίζεται πυρηνικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων συνωστισμό, διαστρωμάτωση, επιμήκυνση και υπερχρωμασία. Επιπλέον, οι δυσπλαστικές κόκκινα και πράσινα κύτταρα είχαν αυξημένο επίπεδο CTNNB1 (β-κατενίνης) και συχνά αυτή η πρωτεΐνη εντοπίστηκε στον πυρήνα επιβεβαιώνοντας ότι τα κύτταρα σε αμφότερες τις καταγωγές ήταν νεοπλασματικών (Σχήμα 1 C-1 F). Τέλος, κόκκινο και πράσινο νεοπλασματικών κλώνοι συχνά γίνεται μοναδική μεταλλάξεις στο

Αρο

(Πίνακας 2 και Εικ S4), υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι αυτές οι κλώνοι που προέρχονται από διαφορετικούς ιδρυτές. Έτσι, αυτό το καινοτόμο μοντέλο ποντικού είναι αρκετά κατάλληλο για τη μελέτη της κλωνική αρχιτεκτονική των εντερικών όγκων. Επιπλέον, ένα σημαντικό πλεονέκτημα αυτού του μοντέλου είναι ότι η οπτικοποίηση των διαφορετικών καταγωγών δεν παρεμποδίζει μοριακές αναλύσεις συμπεριλαμβανομένων ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση αλληλουχίας DNA.

Η κλωνική αρχιτεκτονική όγκων του παχέος εντέρου είναι ορατό

in vivo

χρησιμοποιώντας φθορισμό ενδοσκόπηση. Το εντερικό επιθήλιο είναι ένα μονό στρώμα κυττάρων που αντικαθίσταται κάθε τρεις έως πέντε ημέρες. Τα νέα κύτταρα που παράγονται από βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται κοντά στη βάση του κάθε κρύπτη. Στο μοντέλο μας, κρύπτες είναι ομοτυπική κόκκινο ή πράσινο ομοτυπική με το τελευταίο να είναι ιδιαίτερα εμφανής κατά τη διάρκεια της ενδοσκόπησης φθορισμού, καθώς κάθε κρύπτη εμφανίζεται ως μια διακριτή πράσινο κύκλο (Α). Οι όγκοι μπορεί να αποτελείται από μόνο το κόκκινο κρυπτών (αριστερό πάνελ), ένα μίγμα από κόκκινο και πράσινο κρύπτες (μεσαίο πλαίσιο), ή μόνο πράσινο κρύπτες (δεξί πάνελ). Οι όγκοι που περιγράφονται στο λευκό. Η υψηλή μεταβλητότητα σε κλωνική αρχιτεκτονική είναι επίσης εμφανής στο σύνολό βάσεις (Β). Όγκοι ήταν ομοτυπική κόκκινο (αριστερό πάνελ), ετεροτυπική (μεσαία τρία πάνελ), ή ομοτυπικών πράσινο (δεξί πάνελ). Το μείγμα του κόκκινου και του πράσινου κρύπτες ποικίλλει μεταξύ των πολλαπλών προγονική όγκους, ενώ ορισμένα από αυτά αποτελούνται κυρίως από είτε κόκκινο ή πράσινο κρύπτες κρύπτες, ενώ άλλες είναι περίπου ίσος αριθμός και των δύο τύπων. Η ιστολογική εξέταση είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό της αρχιτεκτονικής, όπως οι όγκοι μπορεί να εμφανιστεί heterotypic με νεοπλασματική κρύπτες ενός χρώματος αναμιχθεί με την κανονική κρύπτες του άλλου χρώματος. Η κλωνική αρχιτεκτονική των όγκων βαθμολογείται από ιστολογικές τομές. Τα νεοπλασματικά κύτταρα κατέστησαν ορατά ακόλουθη Η &? Ε χρώση (C) με υψηλά επίπεδα CTNNB1 (β-κατενίνης) έκφραση στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (D, καφέ κηλίδα). Όπως εμφανίζεται σε ένα κοντινό τμήμα του ίδιου του όγκου χρωματίστηκαν με ανοσοφθορισμό, νεοπλασματικά κύτταρα σε ένα ενιαίο όγκου συχνά προέκυψε τόσο από τα κόκκινα και πράσινα κυτταρικών γραμμών (Ε-Ρ). Τα πάνελ Β φωτογραφίες που παρουσιάζονται στην ίδια μεγέθυνση? μέγεθος bar = 1 mm. Πάνελ C και Ε εμφανίζονται στην ίδια μεγέθυνση? μέγεθος bar = 500 μm. Πίνακας Α παρουσιάζει μια διεύρυνση 4x σε ένα παρακείμενο τμήμα του περιγράφονται χώρο στον πίνακα Γ του πίνακα F παρουσιάζει μια διεύρυνση 4x της περιοχής που περιγράφεται στον Πίνακα Ε

Η

Η

Το ποσοστό των πολυ-προγονική όγκων σε μωσαϊκά ήταν παρόμοιο με το ποσοστό που παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες με χίμαιρες συσσωμάτωσης (S2 Εικ? 40-52% σε μωσαϊκά έναντι 22-47% σε χίμαιρες συσσωμάτωσης). Αυτό το εύρημα πιθανότατα αντανακλά το γεγονός ότι το συνονθύλευμα του κόκκινου και του πράσινου κύτταρα στο περιφερικό λεπτό έντερο και του παχέος εντέρου του ψηφιδωτού ποντίκια μας ήταν συγκρίσιμο με το συνονθύλευμα των μπλε και λευκών κυττάρων που παρατηρούνται σε χίμαιρες συσσωμάτωσης σε προηγούμενες μελέτες (S2 σχήμα). Όλα τα 165 όγκους στο εγγύς λεπτό έντερο ήταν ομοτυπική κόκκινο (Πίνακας 1), όπως δεσμευτικές το λιπαρό οξύ αρουραίου πρωτεΐνη 1 υποκινητής δύσκολα εκφράζεται σε αυτή την περιοχή της εντερικής οδού (S3 Εικ). Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι η έκφραση του φθορίζουσες πρωτεΐνες από τον ανταποκριτή είναι σταθερή κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Επειδή ογκογένεση δεν οδηγεί σε ενεργοποίηση της CRE ή μεταλλάξεις στο ρεπόρτερ, ετεροτυπικές όγκοι είναι δυνατόν να προσδιοριστεί να έχει ένα πολυ-προγονική καταγωγή. Αυτή η προσέγγιση μπορεί γενικά να εφαρμοστεί για να μελετηθεί η κλωνική αρχιτεκτονική των όγκων σε άλλους ιστούς, που απαιτεί μόνο τη χρήση ενός διαφορετικού διαγονιδίου που εκφράζει Cre ανασυνδυάση.

Η πολυ-προγονική αρχιτεκτονική των όγκων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω μέσω απεικόνισης. Συνολικά πέντε πολλαπλών προγονική αδενώματα απομονώθηκαν, αιωρήθηκε σε TDE ως το μέσο στερέωσης για τη μείωση σκέδασης από λιπίδια, και απεικονίζεται με ένα μικροσκόπιο πολυφωτονικών. Για κάθε αδένωμα, τα συλλεγέντα εικόνες ραμμένες μαζί για να δημιουργήσουν ένα τρισδιάστατο ανασυγκρότησης. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ορισμένοι όγκοι μπορεί να είναι πιο πολύπλοκη από ό, τι απλά biclonal? ο αριθμός των διακριτών χρωματιστές περιοχές κυμαινόταν από δύο έως τέσσερα (S2 πίνακα). Σε μία κυρίως κόκκινο αδένωμα, τρεις ξεχωριστές περιοχές πρασίνου θα μπορούσε να θεωρηθεί, υποδεικνύοντας ότι αυτή η όγκου θα μπορούσε να προέρχεται από τέσσερις ιδρυτές αν κάθε κλώνος προήλθε από ένα μοναδικό αρχικό συμβάν (Σχήμα 2). Ωστόσο, η προετοιμασία για την απεικόνιση μας εμπόδισε από το να είναι σε θέση να εκτελέσει τις μελέτες αλληλουχίας που θα μας επιτρέψει να καθορίσει εάν οι ξεχωριστές πράσινες κηλίδες είχαν διαφορετικά προφίλ μετάλλαξη, η οποία θα παρέχει περαιτέρω στοιχεία για την καταγωγή τους.

Η έκφραση της φθορίζουσες πρωτεΐνες διευκολύνει τη χρήση απεικόνισης πολυφωτονική διέγερση για την ανακατασκευή του όγκου σε τρεις διαστάσεις Ανακατασκευές επιτρέπουν την εξερεύνηση της δομής κάτω από την επιφάνεια των όγκων (Α, επιφάνεια? Β, πλαϊνή όψη) χωρίς στρεβλώσεις και αντικείμενα που συμβαίνουν όταν απεικόνισης πολλαπλών ιστολογικές τομές. Τέσσερις διαφορετικές χρωματιστές περιοχές ήταν εμφανής σε έναν όγκο. Τρεις διακριτές περιοχές πρασίνου ήταν εμφανής όταν το κόκκινο αφαιρέθηκε (C). Αυτές οι περιοχές πρασίνου διαχωρίζονται από τουλάχιστον 100 microns, το οποίο είναι ισοδύναμο με τη διάμετρο από 1 έως 2 κρύπτες.

Η

Η πολυ-προγονική αρχιτεκτονική παραμένει ως όγκοι εξελίσσονται από καλοήθεις έως κακοήθεις καταστάσεις. Μια δεύτερη ομάδα των ποντικών που παράγεται και αφήνεται να ηλικία μέχρι ετοιμοθάνατα. Η μέση ηλικία θανάτου ήταν 494 ± 93 ημέρες. Η συχνότητα εμφάνισης των εντερικών όγκων ήταν 100% με μέσο όρο πολλαπλότητα 15 ± 5, η οποία ήταν ελαφρώς υψηλότερη από αυτή που παρατηρήθηκε σε ποντικούς σε ευθανασία σε 150 ημέρες από την ηλικία (ρ = 0,04? Wilcoxon Rank Sum, δύο όψεων). Στα ετοιμοθάνατα ποντίκια, το 16% των όγκων στο περιφερικό μικρό έντερο και το κόλον ήταν εντός του βλεννογόνου καρκινώματα και 13% ήταν αδενοκαρκινώματα επεμβατική (Πίνακας 3). Παρόμοια με αυτό που παρατηρήθηκε σε ανθρώπινο ορθοκολικό βλάβες, εντός του βλεννογόνου καρκινώματα εμφανίζουν νεοπλαστικό εισβολή κυττάρου εντός είτε στον ίδιο υμένα ή μυϊκό βλεννογόνο και μπορεί να σχετίζεται με μια δεσμοπλαστικού απόκριση (Σχήμα 3). Σημειώστε ότι μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι μακρόβια ποντίκια Min αναπτύξουν προχωρημένη νόσο, ακόμη κι αν οι όγκοι εμφάνισαν μικρή γενετική αστάθεια [14]. Για μια βλάβη να θεωρηθεί μια επεμβατική αδενοκαρκίνωμα έπρεπε να είναι εισβολή των νεοπλασματικών κυττάρων πέρα ​​από το μυϊκό βλεννογόνο τουλάχιστον μέσα στο υποβλεννογόνο εκεί. Τα νεοπλασματικά κύτταρα συχνά ήταν σε στήλες στην εμφάνιση με εξέχοντα πυρήνια, είχε μια αρχιτεκτονική ηθμοειδή με την πλάτη με πλάτη αδένες χωρίς να παρεμβαίνει στρώμα, κοκκώδες ηωσινοφιλική πυρηνορρηκτικών συντρίμμια παρόν εντός του αυλού του αδένα, αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα και συνδέεται με μια δεσμοπλαστικού απόκριση. Ένα πολυ-προγονική αρχιτεκτονική παρατηρήθηκε στο 62% των αδενωμάτων με χαμηλού βαθμού δυσπλασία, το 57% των αδενωμάτων με υψηλού βαθμού δυσπλασία, το 43% των εντός του βλεννογόνου καρκινώματα, και το 68% των χωροκατακτητικών αδενοκαρκινώματα (Πίνακας 3).

Στα ποντίκια που είχαν τη δυνατότητα με την ηλικία μέχρι ετοιμοθάνατο, ορισμένοι όγκοι ήταν αδενώματα με υψηλού βαθμού δυσπλασία (Α και Β), ενώ άλλα ήταν εντός του βλεννογόνου καρκινώματα (CF). Τα νεοπλασματικά κύτταρα εντοπίζονται Η &? Ε τομές (Α, C και D) ήταν ένα μίγμα και των δύο κόκκινα και πράσινα κύτταρα (Β, Ε και F). Πάνελ Α και Β εμφανίζονται στην ίδια μεγέθυνση? μέγεθος bar = 1 mm. Πάνελ C και Ε είναι ίδια μεγέθυνση? μέγεθος bar = 1 mm. Πίνακες D και F είναι 4x διευρύνσεις της ζώνης που περιγράφεται στο Γ

Η

Τα κακοήθη κύτταρα εισβάλλουν στην χιτώνας και τα μυϊκού propria μπορεί ακόμη και να προέρχονται από διαφορετικούς ιδρυτές. Συνολικά 15 επεμβατική αδενοκαρκινώματα από 10 ποντίκια αναλύθηκαν. Ταυτόχρονη εισβολή του κόκκινου και του πράσινου νεοπλασματικών κυττάρων παρατηρήθηκε στο 13%. Αυτή η παρατήρηση δείχνει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κλώνων μπορεί να διαρκέσει ακόμα και οι όγκοι αρχίζουν να εισβάλουν από την υποβλεννογόνιο στο propria muscularis.

Συζήτηση

Έχουμε δημιουργήσει ένα νέο μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου, που εκτελούνται μελέτες επικύρωσης να συγκρίνουν τα ευρήματά μας με προηγούμενες πειραματικά μοντέλα, και στη συνέχεια χρησιμοποιείται το μοντέλο για να μελετηθεί η κλωνική αρχιτεκτονική των κακοήθων καρκίνων στο έντερο. Τα ευρήματα όχι μόνο δείχνουν ότι οι καρκίνοι αποτελούνται από κύτταρα που προέρχονται από πολλαπλούς ιδρυτές αλλά ότι τα κύτταρα από διακριτά προέλευση μπορεί ταυτόχρονα να εισβάλουν στον κολονικό μυϊκό τοίχωμα. Η ανακάλυψη αυτή είναι αντίθετη με την έννοια ότι όλοι οι συμπαγείς όγκοι είναι uni-προγονική και ότι ένα ενιαίο υποκλώνος αποκτά τελικά ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα μέσω επιγενετικές αλλαγές ή μεταλλάξεις και, κατά συνέπεια, μετάσταση από τον πρωτογενή όγκο σε απομακρυσμένες περιοχές.

Το μοντέλο μας ήταν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας διάφορες διαφορετικές προσεγγίσεις. επιλέγεται Το διαγονίδιο Fabp1-Cre έγινε επειδή εκφράζεται σταθερά στο απομακρυσμένο λεπτό έντερο, τυφλό έντερο, και του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης [24, 25] και πριν από ογκογένεση συμβαίνει στο ποντίκι Min. Συνεπής με αυτό τον ισχυρισμό, οι κρύπτες εντός της κανονικής έντερο ήταν είτε εξ ολοκλήρου κόκκινο απουσία έκφρασης Cre ή εξ ολοκλήρου πράσινου στην παρουσία της έκφρασης Cre. Επιπλέον, το μοτίβο των μωσαϊκισμού είναι παρόμοια σε ποντικούς σε ευθανασία σε 150 ημέρες από την ηλικία και εκείνων που σκοτώθηκαν όταν ετοιμοθάνατα, υποδεικνύοντας ότι η κατάσταση που διαπιστώθηκε νωρίς κατά την εμβρυογένεση είναι σταθερό σε ενήλικα ποντίκια (S5 Σχ, S6 Σχ, και S3 Πίνακα). Αν Cre ήταν αυθόρμητα ενεργοποιούνται σε διαφορετικά κύτταρα, το έντερο θα στραφούν σταδιακά περισσότερο πράσινο, όπως τα ποντίκια ηλικίας, επειδή το πράσινο κύτταρα δεν μπορούν να μετατραπεί ξανά σε κόκκινο. Και στις δύο ομάδες ποντικών, το εγγύς ήμισυ της εντερικής οδού ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου το κόκκινο, ενώ το περιφερικό μισό ήταν ένα μίγμα του κόκκινου και του πράσινου με το κόλον να αποτελείται από πράσινα κύτταρα 37,6% στα ποντίκια υποβάλλονται σε ευθανασία στο 150 ημέρες και 38,1% πράσινα κύτταρα σε ποντίκια υποβάλλονται σε ευθανασία όταν ετοιμοθάνατα (ρ = 0,46, t-test). Όλα τα 165 όγκους που σχηματίζονται στο εγγύς ήμισυ του λεπτού εντέρου και 24 της 63 όγκων στο κόλον και άπω ήμισυ του λεπτού εντέρου ήταν ομοτυπική κόκκινο (Πίνακας 1). Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι Fabp1-Cre διαγονίδιο δεν ενεργοποιούνται ανωμάλως ως συνέπεια της νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Άλλοι όγκοι στο απομακρυσμένο ήμισυ του εντερικού σωλήνα ήταν ομοτυπική πράσινο ή ετερότυπη. Το ποσοστό των heterotypic, ή φανερά πολλαπλών προγονική, οι όγκοι ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν χίμαιρες συσσωμάτωσης (S2 Εικ). Το μοτίβο του κόκκινου και του πράσινου νεοπλασματικών κλώνους εντός ενός όγκου μεταβάλλεται δραματικά με το κόκκινο και το πράσινο είναι εξαιρετικά αναμιχθεί σε μερικούς όγκους (Σχήμα 1Β). Τέτοια πολύπλοκα μίγματα θα ήταν δύσκολο να εξηγηθεί από την απροσδιόριστη έκφραση του διαγονιδίου Fabp1-Cre εντός ενιαίου κλώνο.