Αφηρημένο

Enhancer της Zeste ομόλογο 2 (ΕΖΗ2), η ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση της Polycomb Κατασταλτικά συγκρότημα 2 καταλυτικό ιστόνης Η3 λυσίνη 27 τρι-μεθυλίωσης (H3K27me3), είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ανθρώπινους καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε το ογκοκατασταλτικό Διαγράφεται καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1) ως στόχο της καταστολής από ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3. DLC1 είναι ένα ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνης για τις πρωτεΐνες της οικογένειας Rho. Η απενεργοποίηση του DLC1 οδηγεί σε υπερ-ενεργοποιημένα Rho /ROCK σηματοδότηση και εμπλέκεται σε ακτίνη κυτταροσκελετό αναδιοργάνωση για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου. Με χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης, αποδείξαμε ότι H3K27me3 ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη στην περιοχή υποκινητή DLC1 ενός DLC1-μη εκφράζοντα κυτταρική γραμμή ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, MHCC97L. Εξάντληση των ΕΖΗ2 σε MHCC97L από shRNA μειωμένο επίπεδο H3K27me3 σε DLC1 υποκινητή και προκαλείται από το γονίδιο DLC1 επανέκφραση. Αντίθετα, παροδική υπερέκφραση της GFP-ΕΖΗ2 στο DLC1-κύτταρα που εκφράζουν Huh7 μειωμένο επίπεδο DLC1 mRNA με ταυτόχρονη εμπλουτισμό ΕΖΗ2 με υποκινητή DLC1. Μια αντίστροφη σχέση μεταξύ ΕΖΗ2 και έκφραση DLC1 παρατηρήθηκε στο ήπαρ, πνεύμονα, μαστού, προστάτη, και τους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών. Θεραπεία του καρκίνου κυττάρων με το ΕΖΗ2 μικρό μοριακό αναστολέα, 3-Deazaneplanocin Α (DZNep), αποκαταστάθηκε έκφραση DLC1 σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, που δείχνει ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 επιγενετική ρύθμιση της DLC1 ήταν ένας κοινός μηχανισμός σε ανθρώπινους καρκίνους. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι η θεραπεία DZNep ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση HCC μέσω διαταράσσοντας ακτίνης δικτύου κυτταροσκελετού, γεγονός που υποδηλώνει το θεραπευτικό δυναμικό των DZNep στη στόχευση μετάσταση καρκίνου. Στο σύνολό τους, η μελέτη μας έχει ρίξει μηχανιστική εικόνα ΕΖΗ2-H3K27me3 επιγενετική καταστολή DLC1 και υποστήριξε τη σημαντική προ-μεταστατικό ρόλο της ΕΖΗ2 μέσω καταστολής του όγκου και των μεταστάσεων καταστολείς

Παράθεση:. Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-F, Wong CM, Ng IO-L (2013) ΕΖΗ2 Μεσολαβεί H3K27me3 εμπλέκεται στην Επιγενετική καταστολή των διαγραμμένων στον καρκίνο του ήπατος 1 σε ανθρώπινους καρκίνους. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10.1371 /journal.pone.0068226

Συντάκτης: William B. Coleman, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας Σχολή Ιατρικής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 του Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 28 Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου του 2013

Copyright: © 2013 Au et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ SeedFunding Προγράμματος βασικής Έρευνας (200811159061 και 201011159045 έως CMW), το Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας του Συμβουλίου Γενικών Ταμείου Έρευνας (HKU 782411M να CMW) και το Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας του Συμβουλίου Συνεργατική Ταμείου Έρευνας (HKU 1 /06C και HKU 7 /CRG /09 έως IN). IN είναι Loke Yew Καθηγητής Παθολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι ο συν-συγγραφέας Chun-Ming Wong είναι μια Συντακτική Επιτροπή PLoS ONE μέλους και αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει ανταγωνιστικά οικονομικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Απελευθέρωση των ανάντη επιγενετικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών προωθεί επιγενετικές αλλαγές και συνέβαλε στην παρεκκλίνουσα αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκίνους του ανθρώπου [1]. Enhancer του Zeste ομολόγου 2 (ΕΖΗ2), η καταλυτική υπομονάδα του Polycomb Κατασταλτικά Complex 2 (PRC2), είναι ένα από τα πιο συχνά πάνω ρυθμισμένα επιγενετικό ρυθμιστές σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους [2-5]. ΕΖΗ2 είναι μια μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών που καταλύει ειδικά της ιστόνης H3 λυσίνη 27 tri-μεθυλίωσης (H3K27me3), το οποίο με τη σειρά του δρα ως κατασταλτικό τροποποίηση των ιστονών για τον έλεγχο επιγενετικώς μεταγραφής γονιδίων [6,7]. Up-ρύθμιση του ΕΖΗ2 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κακοήθη εξέλιξη και εμπλέκονται στον καρκίνο μετάσταση [2]. λειτουργίες ΕΖΗ2 ως ογκογονίδιο σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους, κυρίως μέσω επιγενετική αποσιώπηση γονιδίων όγκου και μετάσταση καταστολέα, συμπεριλαμβανομένων E-cadherin [8], RUNX3 [9], SLIT2 [10], DAB2IP [11], και KLF2 [12]. Πρόσφατα, έχουμε επίσης αναφερθεί ότι ΕΖΗ2 αδρανοποιεί επιγενετικώς εκφράσεις πολλαπλών microRNAs όγκου και μετάσταση καταστολέα (miRNAs), όπως miR-125b και miR-139 στο ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), ως εκ τούτου προάγει HCC ογκογενετικότητας και μετάσταση [13]. Ο εντοπισμός νέων στόχων που έχουν σιγήσει από ΕΖΗ2 θα αποκαλύψει καλύτερα τις μοριακές ρόλους των ΕΖΗ2 στη μετάσταση του καρκίνου η οποία θα είναι επωφελής για την ανάπτυξη των χημειοθεραπειών που στοχεύουν ΕΖΗ2.

DLC1 αναγνωρίστηκε ως

καλόπιστους

ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε περιοδικά διαγράφονται χρωμοσωμική περιοχή στο χρωμόσωμα 8ρ21 στο HCC [14]. DLC1 είναι ένα Rho ΟΤΡάσης-πρωτεΐνης ενεργοποίησης (RhoGAP) εντοπίζεται στις εστιακές συμφύσεις [15,16], και είναι ειδικό για τον έλεγχο της δραστηριότητας του RhoA, Β, C και CDC42 [17,18]. Η δραστηριότητα RhoGAP της DLC1 ρυθμίζει αρνητικά αυτές τις πρωτεΐνες Rho με την τόνωση της εγγενούς GTP υδρολυτική δράση τους, έτσι τους μετατρέπει από την ενεργή GTP-δεσμευμένη κατάσταση στην ανενεργή κατάσταση ΑΕΠ-δεσμεύεται. Ο καταρράκτης σηματοδότησης Rho επιτρέπει κατάλληλο έλεγχο πολλών βιολογικών διεργασιών όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός [19] και την κίνηση των κυττάρων [20] σε φυσιολογικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης κακοήθειας, η DLC1 /Rho μονοπατιού έχει ιδιαίτερη σημασία λόγω της ρύθμισης του σχετικά με την κυτταροσκελετού της ακτίνης που σχετίζονται με την μετάσταση του καρκίνου. Έχουμε δείξει ότι η απώλεια του DLC1 σε HCC ενεργοποιημένα RhoA, το οποίο στη συνέχεια ενεργοποιείται καθοδικός τελεστής Rho κινάσης (ROCK) να αναδιαμορφώσει το δίκτυο κυτταροσκελετού της ακτίνης για την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [21,22]. Άλλες διαφορετικές όγκου κατασταλτικής ρόλους DLC1 περιλαμβάνουν μεσολάβηση της κασπάσης-3-εξαρτώμενη απόπτωση σε μοντέλο HCC [23], η αναστολή του VEGF-εξαρτώμενων από αγγειογένεση στο μοντέλο καρκίνου του προστάτη [24], και η καταστολή της ικανότητας κλωνισμού σε διάφορους τύπους καρκίνων [25]. Κάτω ρύθμιση των DLC1 συνήθως εμφανίζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων κακοηθειών [26] και η απώλεια της έκφρασης κλασικά συνδέεται με χρωμοσωμικές διαγραφή ή προαγωγέα DNA υπερμεθυλίωση (Yuan et al 1998? Ng et al 2000? Wong et al 2003? Kim et al 2003). Στην παρούσα μελέτη, παρείχε την πρώτη απόδειξη ότι DLC1 είναι ένας νέος στόχος της καταστολής από ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3. Δείξαμε περαιτέρω αδρανοποίηση των ΕΖΗ2 από 3-Deazaneplanocin Α (DZNep) αυτή την εκ νέου εξέφρασε DLC1 και εντυπωσιακά καταργηθεί κυτταροσκελετού αναδιοργάνωση και ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα. Συλλογικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η επιγενετική αποσιώπηση των DLC1 εμπλέκεται στην προ-μεταστατική λειτουργία του ΕΖΗ2 σε ανθρώπινους καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

SMMC-7721 κυτταρική γραμμή (Shanghai Institute of Cell Biology) και Huh 7 κυτταρική γραμμή (Japanese Cancer Research Τράπεζα) διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) -υψηλής γλυκόζη. κυτταρική σειρά MHCC97L (δώρο από τον καθηγητή Z.Y. Τανγκ του Πανεπιστημίου Fudan, Σαγκάη) [27] και την κυτταρική γραμμή ΜΙΧΑ (Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογίας Κυττάρου) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ-υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με πυροσταφυλικό νάτριο. κυτταρική σειρά HeLa (American Type Culture Collection) διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ-χαμηλής γλυκόζης. CNE2 (American Type Culture Collection) και HCT116 (δώρο από τον καθηγητή Β Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Βαλτιμόρη, MD) [28] κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute 1640. Όλα μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη.

τροποποίηση όξινου θειώδους και μεθυλίωση ανάλυση

τροποποίηση όξινου θειώδους γονιδιακού DNA που εξάγεται από κυτταρικές γραμμές πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DNA ΕΖ Μεθυλίωση-Direct Kit (ZYMO Research, Orange, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση του DLC1 προαγωγού μετά όξινου θειώδους τροποποίηση είναι: 5′-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3′ (αντίστροφο) για BS-1 περιοχή? και 5’-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3’ (αντίστροφο) για την περιοχή BS-2. PCR προϊόν κλωνοποιήθηκε εντός ΤΟΡΟ ΤΑ φορέα κλωνοποίησης (Invitrogen, Carlsbad, CA) και την αλληλουχία των μεμονωμένων κλώνων διεξήχθη με αλληλούχηση Sanger.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας EZ ChIP kit (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [13]. ChIP βαθμού αντίσωμα έναντι H3K9me3 (ab8898? Abcam, Cambridge, MA, USA), H3K27me3 (07-449? Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) και ΕΖΗ2 (# 3147? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμασία. IgG Κουνελιού (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) ή IgG ποντικού (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας στην δοκιμασία. Αστάρια εκτείνονται -394nt να -325nt ανάντη της θέσης έναρξης της μεταγραφής DLC1 χρησιμοποιήθηκαν: 5′-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3’ (αντίστροφο). Ποσοτικοποίηση της περιοχής αντίσωμα δεσμεύεται έγινε από qPCR εκτελούνται με ΑΒΙ Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

In vitro

θεραπεία επιγενετικές ναρκωτικά

DZNep (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ, USA) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). 5-Αζα-dC (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε 50% οξικό οξύ. TSA (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε αιθανόλη. Ο διαλύτης των χημικών ουσιών χρησιμοποιήθηκε ως εικονικές στην αντίστοιχη θεραπεία. Για τη θεραπεία DZNep, DZNep (1 μΜ ή 10 μΜ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για 48 ή 72 ώρες. Για 5-Αζα-dC θεραπεία, 5-Αζα-dC (10 μΜ) αναπληρώνονται καθημερινά για 72 ώρες. Για τη θεραπεία TSA, TSA (0.25 μg /mL) προστέθηκε μόνο στα κύτταρα σε τις τελευταίες 24 ώρες του πειράματος.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

πριν από την κυτταρική δοκιμασία μετανάστευσης, 2×10

5 κύτταρα MHCC97L υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ DZNep για 48 ώρες. Mock και DZNep επεξεργασμένα κύτταρα (1×10

5) κύτταρα σπάρθηκαν στο άνω θάλαμο του μεγέθους 8 μm-πόρων Transwell ένθετο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Το κάτω θάλαμος περιείχε ρυθμισμένο μέσο που συλλέγεται από μη επεξεργασμένα κύτταρα MHCC97L να προσελκύσει την κυτταρική μετανάστευση για 18 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τρεις ανεξάρτητες απόψεις της μεμβράνης Transwell φωτογραφήθηκαν και τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων μετρήθηκε.

ανοσοφθορισμού (IF) μικροσκοπία και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM)

Πριν από την IF απεικόνισης, 2×10

5 κύτταρα MHCC97L υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ DZNep για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, mock και DZNep-κατεργασμένα κύτταρα (1×10

5) κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε μέσο καλλιέργειας DZNep-δωρεάν για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton-X-100. Εστιακή συμφύσεις χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-παξιλλίνη (05-417? Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). F-ακτίνη οπτικοποιήθηκε με χρώση με FITC-συζευγμένο φαλλοϊδίνη (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Αν οι εικόνες είχαν δει και κατέλαβε τη χρήση ενός Leica φθορισμού Q550CW μικροσκόπιο (Leica, Wetzler, Γερμανία). Για SEM, mock και DZNep επεξεργασμένα κύτταρα καθηλώθηκαν με 1% τετροξείδιο οσμίου και 2,5% γλουταραλδεΰδης, ακολουθούμενη από σταδιακή αφυδάτωση αιθανόλης. Μετά το στάδιο του κρίσιμου σημείου ξηρό, πλάκες τοποθετημένα σε άργυρο πάστα. Εικόνες σαρώθηκαν και κατέλαβε κάτω × 2.000 μεγέθυνσης χρησιμοποιώντας ένα Hitachi S-4800 FEG ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης.

Η στατιστική ανάλυση

Μη παραμετρικά δεδομένα και συνεχή παραμετρικά δεδομένα αναλύθηκαν με Mann Whiteny U δοκιμής και

t

τεστ, αντίστοιχα με τη χρήση του GraphPad Prism έκδοσης 5.00 (GraphPad Software, San Diego California USA). Δοκιμές θεωρήθηκαν σημαντικά όταν το

P

αξία ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

επίπεδο H3K27me3 διαφορικά εμπλουτίζεται με υποκινητή DLC1 στο απαθανάτισε κανονική ηπατοκυττάρων και κυτταρικές σειρές HCC

Για να κατανοήσουμε το ρόλο των επιγενετικών απορρύθμισης και DLC1 αδρανοποίηση στο HCC, ξεκινήσαμε με την ανάλυση κατάσταση μεθυλίωσης DLC1 υποκινητή από διθειούχο αλληλουχίας στην απαθανάτισε κανονική ηπατοκυττάρων κυτταρική σειρά ΜΙΧΑ και δύο κυτταρικές σειρές HCC SMMC-7721 και MHCC97L. υποστηρικτής DLC1 ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένη σε ΜΙΧΑ, ετερογενώς και μερικώς μεθυλιωμένη σε MHCC97L, και εντελώς μεθυλιωμένη σε SMMC-7721 (Σχήμα 1Α). Η κατάσταση μεθυλίωσης του DLC1 στην ΜΙΧΑ και SMMC-7721 συσχετίζονται καλά με DLC1 μεταγραφικό επίπεδο. Αλλά σε MHCC97L, εκ των οποίων ο υποκινητής DLC1 μόνο μερικώς μεθυλιωμένη, η πλήρης αποσιώπηση του DLC1 πρότεινε ότι άλλες επιγενετικό κανονισμοί μπορούν να εμπλέκονται (Σχήμα 1Β). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι παρεκκλίνουσα ιστονών μεθυλίωση μπορεί να συμβάλει στην DLC1 αποσιώπηση στην MHCC97L. Χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία διεξήχθη για να εκτιμήσει τον εμπλουτισμό της μεταγραφικής κατασταλτικών τροποποιήσεις των ιστονών, H3K9me3 και H3K27me3, για τον υποκινητή DLC1 (Σχήμα 1C). Δείξαμε ότι H3K9me3 και H3K27me3 δεν ήταν ανιχνεύσιμες σε ΜΙΧΑ και αυτό ήταν σύμφωνο με την μεταγραφικά ενεργή κατάσταση του γονιδίου DLC1 σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Σε αντίθεση, ο εμπλουτισμός και των δύο μεταγραφικές κατασταλτικά H3K27me3 και H3K9me3 ανιχνεύθηκε σε υποκινητή DLC1 της SMMC-7721 και τα κύτταρα MHCC97L. Είναι ενδιαφέρον ότι, H3K27me3 ήταν πιο άφθονα εμπλουτίζεται σε MHCC97L, σε σύγκριση με SMMC-7721. Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι, εκτός από τη μερική μεθυλίωση του DNA, H3K27me3 έλαβε επίσης μέρος στην επιγενετική αποσιώπηση να αδρανοποιηθεί πλήρως μεταγραφικά το γονίδιο DLC1 σε MHCC97L.

Ανάδοχος μεθυλίωσης του DNA και την τροποποίηση των ιστονών του DLC1 σε κυτταρικές σειρές HCC.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει το νησί CpG που βρίσκονται σε DLC1 τόπο. DNA κατάσταση μεθυλίωσης των 45 CpG δινουκλεοτιδίων (BS-1 περιοχή περιλαμβάνονται 35 CpG dinulceotides και περιοχή BS-2 περιλαμβάνονται 10 CpG δινουκλεοτίδια) αποτέλεσαν αντικείμενο ανάλυσης θειώδους αλληλουχίας. ΜΙΧΑ έδειξε πλήρη unmethylation, MHCC97L έδειξε μερική μεθυλίωση και SMMC-7721 έδειξε πλήρη μεθυλίωση. Ανοικτός κύκλος αντιπροσωπεύει μη μεθυλιωμένα δινουκλεοτίδια CpG και κλειστό κύκλο αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα μονό κλώνο που αλληλουχήθηκαν. (Β) RT-PCR (άνω πάνελ) και qRT-PCR (κάτω πλαίσιο) δείχνει έκφραση mRNA ανιχνεύσιμη DLC1 σε ΜΙΧΑ, αλλά όχι σε MHCC97L και SMMC-7721 κύτταρα. (C) χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία σε συνδυασμό με qPCR ανάλυση (qChIP) αποκάλυψε την σχετική εμπλουτισμό των H3K9me3 και H3K27me3 στην περιοχή του υποκινητή DLC1 στο ΜΙΧΑ, MHCC97L και SMMC-7721 κύτταρα. Fold εμπλουτισμού της δοκιμασίας τσιπ υπολογίζεται σε συνάρτηση με τον έλεγχο IgG μετά κανονικοποιούνται με το DNA των εισροών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Καταστολή της ΕΖΗ2 που προκαλείται επανέκφραση DLC1 σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές

Να παρέχει περισσότερες αποδείξεις ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 ρυθμίζει άμεσα DLC1, ερευνήσαμε εάν η έκφραση DLC1 θα μπορούσε να αποκατασταθεί με την νοκ ντάουν της ΕΖΗ2. κυτταρικές σειρές HCC που εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο-μη στόχους (NTC) ή ΕΖΗ2 στόχευση shRNA (shEZH2) ιδρύθηκαν στην προηγούμενη μελέτη μας [13]. Μετά σταθερή knockdown του ΕΖΗ2, DLC1 ήταν μεταγραφικά προκλήθηκε σε MHCC97L (Σχήμα 2Α). Απώλεια H3K27me3 στον υποκινητή DLC1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα MHCC97L shEZH2 (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 συμβάλλει στην καταστολή της DLC1 σε MHCC97L. Σε DLC1-κύτταρα που εκφράζουν Huh7, παροδική υπερέκφραση της GFP-ΕΖΗ2 μεταγραφικά καταπιεσμένη DLC1 και ταυτόχρονη εμπλουτισμό της ΕΖΗ2 ανιχνεύθηκε στον υποκινητή DLC1 (Σχήμα 2C και D Συμπληρωματική Εικόνα S1). Σύμφωνα με το μοντέλο νοκ ντάουν ΕΖΗ2, δείξαμε περαιτέρω ότι η θεραπεία 3-Deazaneplanocin Α (DZNep), ένας αναστολέας μικρό μόριο ΕΖΗ2 [29,30], μείωσε σημαντικά το επίπεδο ΕΖΗ2 πρωτεΐνη και το επίπεδο H3K27me3 και προκαλείται από DLC1 επανέκφραση σε MHCC97L κύτταρα (Σχήμα 2Ε). Το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση αποσιώπηση DLC1 επιγενετικές δεν περιορίζεται σε HCC. Re-έκφραση του DLC1 κατά την κατεργασία DZNep παρατηρήθηκε επίσης σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των ρινοφαρυγγικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος CNE2, ορθοκολικό κυτταρική γραμμή καρκινώματος HCT116 και του τραχήλου της μήτρας κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος HeLa (Εικόνα 2F). Τα παραπάνω ευρήματα έδειξαν ότι η επιγενετική αποσιώπηση των DLC1 από ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 είναι ένας κοινός μηχανισμός είναι κοινή για διαφορετικά ανθρώπινων καρκίνων.

ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 συμμετείχε στην επιγενετική καταστολή DLC1 σε HCC και πολλαπλές άλλων ανθρώπινων καρκίνων.

(Α) DLC1 ήταν μεταγραφικά που προκαλείται κατά την σταθερή νοκ ντάουν της ΕΖΗ2 στα κύτταρα MHCC97L. (Β) Ανάλυση qChIP επιβεβαίωσε την εξάντληση του εμπλουτισμού H3K27me3 με υποκινητή DLC1 κατά ΕΖΗ2 νοκ ντάουν στα κύτταρα MHCC97L. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C) DLC1 ήταν μεταγραφικά κατασταλεί σε κύτταρα Huh7 μετά από παροδική υπερέκφραση της GFP-ΕΖΗ2. ανάλυση (D) qChIP αποκάλυψε μια ταυτόχρονη εμπλουτισμό των ΕΖΗ2 σε θέση υποστηρικτής DLC1 είναι κατά GFP-ΕΖΗ2 υπερέκφραση σε κύτταρα Huh7. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) ΕΖΗ2 και έκφραση H3K27me3 μειώθηκε κατά την αγωγή 1μΜ DZNep για 48 ώρες σε κύτταρα MHCC97L (αριστερό πάνελ). DMSO χρησιμοποιήθηκε ως εικονικές θεραπεία. Pan Η3 και α-τουμπουλίνης ήταν φόρτωση έλεγχο του ανοσοστυπώματος. θεραπεία DZNep επάγεται μεταγραφικά έκφραση DLC1 σε MHCC97L όπως υποδεικνύεται από ανάλυση qPCR (δεξί πάνελ). (F) Διάφορα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της ρινοφαρυγγικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος CNE2, το ορθοκολικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος HCT116 και της αυχενικής κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος HeLa εξετάστηκαν για DLC1 επανέκφραση κατά την κατεργασία DZNep. Η θεραπεία των κυττάρων με 10μΜ DZNep επανενεργοποιηθεί έκφραση DLC1.

P

-τιμές που λαμβάνονται από το

t-test

.

Η

Τα επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 και DLC1 αντιστρόφως συσχετίζονται σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου

Για την παροχή κλινική σημασία του

in vitro

παρατηρήσεις μας, εξετάσαμε την έκφραση του mRNA DLC1 σε 25 ζεύγη πρωτογενή δείγματα HCC και συσχετίζεται το επίπεδο έκφρασης με προηγούμενα δεδομένα μας έκφραση ΕΖΗ2 mRNA [31]. Σε αυτή την ομάδα των δειγμάτων, ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ενώ DLC1 ήταν σημαντικά μειωτικά στους ογκογόνους ιστούς από τα μη ογκογόνους ιστούς (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και DLC1 παρατηρήθηκε σε ένα υποσύνολο δειγμάτων HCC, στην οποία υποκινητή DLC1 δεν σίγησε με μεθυλίωση του DNA [17] (Εικόνα 3Β). Έχουμε επεκταθεί επίσης την ανάλυσή μας σε άλλες ανθρώπινων καρκίνων με την ανάκτηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών του πνεύμονα [32], του μαστού [33], του προστάτη [34] και [35] καρκίνους των ωοθηκών από Oncomine (www.oncomine.org) (Σχήμα 3C ). Συνεπής με τα ευρήματα από την ανθρώπινη HCC, η ταυτόχρονη DLC1 ρύθμιση προς τα κάτω και ΕΖΗ2 πάνω ρύθμιση δεν παρατηρήθηκε σε αυτές τις κακοήθειες, γεγονός που υποδηλώνει τις συνέπειες της ΕΖΗ2 up-ρύθμιση για τη φίμωση της έκφρασης DLC1 σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους.

αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της ΕΖΗ2 και εκφράσεις DLC1 σε ανθρώπινους καρκίνους.

(Α) Είκοσι πέντε ζεύγη δειγμάτων HCC εξετάστηκαν για έκφραση ΕΖΗ2 και DLC1 mRNA με qPCR. ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε HCC νεοπλασματικής (Τ) σε ιστούς από μη οιδηματώδης (ΝΤ) ιστούς (αριστερό πάνελ). Στο ίδιο δείγμα ομάδα, DLC1 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται HCC σε σύγκριση με ιστούς NT (δεξί πάνελ).

P

τιμές από Wilcoxon συμφωνημένα τεστ ζεύγους. Παρατηρήθηκε (Β) Ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ ΕΖΗ2 και έκφραση DLC1 σε μια υποομάδα δειγμάτων HCC χωρίς μεθυλίωση DLC1 υποκινητή. επίπεδο έκφρασης των ΕΖΗ2 και DLC1 σε ζεύγη-HCC δείγματα εκπροσωπήθηκε από ΔΔCt (Τ

(HPRT Ct-γονίδιο της Ct ενδιαφέροντος) ΝΤ

(HPRT Ct – Γονίδιο της Ct ενδιαφέροντος)). ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, USA). (Γ) ΕΖΗ2 αναρρύθμιση (αριστερό πάνελ) και ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω DLC1 (δεξί πάνελ) παρατηρήθηκε με συνέπεια στους ογκογόνους ιστούς διαφόρων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων [32], του μαστού [33], του προστάτη [34] και των ωοθηκών [35] καρκίνους. δεδομένα έκφρασης και

P

τιμές των DLC1 και ΕΖΗ2 σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου λήφθηκε από Oncomine βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών. Πλωτή ράβδοι φαίνονται να απεικονίσουν την ελάχιστη, μέση και μέγιστη μονάδες κανονικοποιημένη έκφραση σε μη-νεοπλασματικής (ΝΤ) και οιδηματώδης (Τ) ιστούς.

Η

DLC1 είναι συνεργικά σιγήσει H3K27me3 μόνο όταν το DNA υποστηρικτής του είναι μερικώς μεθυλιωμένα

από πολλαπλά επιγενετικές κατασταλτικά μηχανήματα συνδέονται στενά με τη δημιουργία ενός λιγότερο ανεκτικό περιβάλλον χρωματίνης για την καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου [36,37], επιδιώξαμε να αποδείξει την συνδυαστική επίδραση των διαφορετικών επιγενετικών μηχανημάτων για τον έλεγχο της έκφρασης DLC1. MHCC97L και SMMC-7721 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με DZNep μαζί με 5-Αζα-2’δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC) και τριχοστατίνη Α (TSA), οι οποίες είναι καλά χαρακτηρισμένες αναστολείς μεθυλίωσης του DNA και ακετυλίωση ιστονών, αντίστοιχα. Ενώ επεξεργασία των DZNep, 5-Αζα-DC και TSA αυξημένα ατομικά DLC1 έκφραση, συνδυασμένη θεραπεία τριών φαρμάκων συνεργικά αποκατασταθεί έκφραση DLC1 σε MHCC97L κύτταρα (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, η συν-θεραπεία σε SMMC-7721 κύτταρα δεν έδειξαν περαιτέρω αύξηση στην έκφραση DLC1 σε σύγκριση με 5-Αζα-dC μόνο του (Σχήμα 4Β), υπονοώντας ότι μεθυλίωση του DNA ήταν ένα κυρίαρχο επιγενετικές μηχανισμός για φίμωση DLC1 σε αυτή την κυτταρική γραμμή.

έκφραση DLC1 είχε συνεργικά αποκαταστάθηκε μετά DZNep, 5-Aza-dC και θεραπείας TSA σε MHCC97L αλλά όχι SMMC-7721 κύτταρα.

(Α) Συνδυαστική επιγενετικές φαρμακευτική αγωγή σε κύτταρα MHCC97L με 10 μΜ 5-Αζα-dC, 0,25 μg /mL TSA και 10μΜ DZNep προκάλεσε την πιο ισχυρή DLC1 επανέκφραση από κάθε μονή ή διπλή επιγενετική θεραπεία φαρμάκων. DZNep και θεραπεία 5-Αζα-dC διεξήχθησαν για 72 ώρες. TSA ήταν είτε προστίθεται σε κύτταρα μόνο του ή με άλλα φάρμακα κατά τη διάρκεια των τελευταίων 24 ωρών της θεραπείας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Προσθήκη DZNep σε SMMC-7721 κύτταρα δεν προκάλεσε περαιτέρω DLC1 επανέκφραση σε σύγκριση με 5-Αζα-DC και TSA διπλή επεξεργασία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

DZNep θεραπεία διαταράσσει κυτταροσκελετού της ακτίνης για την αναστολή HCC μετανάστευση των κυττάρων

DLC1 /Rho /οδός ROCK είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση σωστή αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού και κυτταρική κινητικότητα. ευρήματα διαδικασία μας υποδηλώνουν ότι ΕΖΗ2 εμπλέκεται στην καταστολή DLC1, εμείς, ως εκ τούτου δοκιμαστεί περαιτέρω εάν η θεραπεία DZNep θα μπορούσε να καταστείλει

in vitro

HCC μετανάστευσης. θεραπεία DZNep στο 1 μΜ για 48 ώρες, η οποία έδειξε ελάχιστη κυτταροτοξική επίδραση (Συμπληρωματική Εικόνα S2), ανέστειλαν αποτελεσματικά την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα MHCC97L όπως καταδεικνύεται με τη δοκιμασία μετανάστευσης Transwell (Σχήμα 5Α). κύτταρα κατεργασμένα DZNep επίσης έδειξαν κατάργηση του δικτύου κυτταροσκελετού ακτίνης κατάλληλη όταν εξετάζεται με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Σχήμα 5Β) και χρώση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 5C). Αυτές οι κυτταρικές μορφολογικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από τη θεραπεία με DZNep πολύ έμοιαζε με εκείνες του DLC1 που προκαλείται κυτταρική κυτταροσκελετού κατάρρευση και συρρίκνωση κυττάρων [21], πράγμα που σημαίνει ότι DZNep μπορεί να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων μέσω παρεμβολής DLC1 /ROCK μονοπάτι και προκάλεσε σημαντική αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης.

Η θεραπεία της DZNep ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων HCC μέσω διακοπής της ακτίνης του κυτταροσκελετού.

(Α) θεραπεία DZNep καταργηθεί αποτελεσματικά MHCC97L κυττάρων μεταναστευτικών ικανότητα. Πριν από την δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ DZNep για 48 ώρες. Mock και DZNep επεξεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια υπόκειται σε δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων με τη χρήση συσκευής Transwell. Αντιπροσωπευτικές εικόνες τριών ανεξάρτητων πειραμάτων έδειξαν.

P

-τιμές που λαμβάνονται από το

t-test

. θεραπεία (Β) DZNep κατέστειλε τον σχηματισμό των filopodia (κόκκινα βέλη) και ελασματοπόδια (μπλε βέλη) όπως απεικονίζεται με μικροσκοπία σάρωσης ηλεκτρονίων. Εικόνες (2000x μεγέθυνση) συνελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα FEG Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης Hitachi S-4800. θεραπείας (C) DZNep απομειωθεί κυτταροσκελετού της ακτίνης και προκάλεσε συρρίκνωση κυττάρων σε κύτταρα MHCC97L. ίνα στρες βάφτηκε με ΡΙΤΟ-συζευγμένο φαλλοϊδίνη και εστιακές συμφύσεις χρωματίστηκαν με αντι-παξιλλίνη αντίσωμα. Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Mock-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν οργανωμένες δέσμες ινών στρες και καλά επισυνάπτεται παξιλλίνη. DZNep-επεξεργασμένα κύτταρα συρρικνώθηκαν και έχασε σωστή δίκτυο κυτταροσκελετού της ακτίνης. Εικόνες (100 χ μεγέθυνση) συνελήφθησαν από την Leica Q550CW μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Wetzler, Γερμανία).

Η

Συζήτηση

Ένα σημαντικό προ-μεταστατικό ρόλο της ΕΖΗ2 στον καρκίνο είναι μέσω επιγενετικών σίγηση του όγκου και της μετάστασης γονίδια καταστολής [8-12]. H3K27me3 είναι το καλύτερα χαρακτηρισμένο ΕΖΗ2 μεσολάβηση τροποποίηση ιστόνης στο επιγενετικές σύστημα των θηλαστικών. Στην παρούσα μελέτη, θα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 εμπλέκεται στην επιγενετική καταστολή της DLC1 κατά την ανάπτυξη HCC. Είναι ενδιαφέρον ότι, από διάφορα δημοσιευμένα στοιχεία του γονιδιώματος σε επίπεδο της ομάδας Polycomb χαρτογράφηση του γονιδίου-στόχου (PCG) σε κύτταρα ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών (HES), έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι DLC1 είναι υποψήφια PCG-ρυθμίζονται γονιδίου σε πρώιμο στάδιο ανάπτυξης (Συμπληρωματική Εικόνα S3). Σε κύτταρα HES, ο υποκινητής DLC1 καταλαμβάνεται από SUZ12, η ​​οποία συνδέεται με ΕΖΗ2 για να σχηματίσει το PRC2 στη μεσολάβηση H3K27me3 και καταστολή της μεταγραφής [38]. Επιπλέον, ο προαγωγός DLC1 χαρακτηρίζεται επίσης με H3K27me3 [39] και H3K4me3 [40], οι οποίες αποτελούν τη δισθενή χρωματίνη υπογραφή των στόχων PCG [41]. Αυτή η δισθενής υπογραφή της χρωματίνης, που περιλαμβάνει την H3K27me3-αποσιώπησης και H3K4me3 ενεργοποίησης τροποποιήσεις των ιστονών, επιτρέπει γονίδια των αναπτυξιακών σημασίας και τα γονίδια που απαιτούνται για τη συντήρηση βλαστική ικανότητα να ισορροπεί σε ένα έτοιμο προς μεταγράψει κατάσταση μέχρι διαφοροποίησης [41,42]. DLC1 είναι απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη [43] και, ενδεχομένως, έχει ένα ρόλο στην προδιαγραφή γενεαλογία [44]. DLC1 knockout ποντίκια είναι τα εμβρυϊκά θανατηφόρα [43]. Ωστόσο, DLC1 είναι πανταχού μεταγράφεται σε ενήλικες ιστούς [14], υποδηλώνοντας ότι PCG φίμωση αποτέλεσμα έχει αντικατασταθεί κατά διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα. Κατά την ογκογένεση, είναι πιθανό ότι DLC1 επανακτά εμβρυϊκά PCG της σήμανσης ως αποτέλεσμα της ΕΖΗ2 πάνω ρύθμιση. Στο μοριακό επίπεδο, αποδείξαμε ότι DLC1 συν-ρυθμίζονται από ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3, μεθυλίωση DNA και απακετυλίωση ιστόνης σε κύτταρα HCC. Ωστόσο, η από κοινού ρύθμιση μεταξύ των τριών επιγενετικών μηχανισμών DLC1 παρατηρήθηκε μόνο όταν υποστηρικτής του μερικώς μεθυλιωμένη (όπως στα κύτταρα MHCC97L). Μόλις υποκινητή DLC1 ήταν πυκνά μεθυλιώθηκε (όπως σε SMMC-7721 κύτταρα), H3K27me3 απουσίαζε και μεθυλίωσης του DNA ήταν το κλειδί κατασταλτική μηχανισμός με μέτρια συμμετοχή απακετυλίωση ιστόνης. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να αντανακλά την στιχομυθία του ΕΖΗ2 αποσιώπησης και μεθυλίωσης του DNA σε ένα προγενέστερο στάδιο της επιγενετικής καταστολή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων πριν από την ενδεχόμενη αντικατάσταση των H3K27me3 αποσιώπηση από το σταθερό μηχανήματα μεθυλίωσης του DNA [45,46]. Πράγματι, τα ευρήματά μας ότι DLC1 είναι ένα PCG-ρυθμίζεται στόχο και μετέπειτα επιγενετικές σίγηση του κατά τη διάρκεια της εξέλιξης κακοήθειας είναι επίσης σύμφωνη με την προτεινόμενη πρόσφατα μοντέλο για PCG σήμανση των γονιδίων στα κύτταρα ES έχουν προδιάθεση για

de novo

καρκίνο συγκεκριμένες μεθυλίωσης του DNA [45,46].

Φαρμακολογική στόχευση της απελευθερωμένης επιγενετικών πρωτεϊνών αναδύεται ως μια ελκυστική προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου [47,48]. DZNep έχει αποδειχθεί για την εξάλειψη της ογκογενή κύτταρα HCC σε γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν με HCC [49], διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [29] και στοχοθέτηση των ανθρώπινων οξεία μυελογενή λευχαιμία σε ποντικούς μοντέλο όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με panobinostat [50]. Ωστόσο, η επίδραση μετάσταση κατασταλτική του DZNep δεν έχει αξιολογηθεί ποτέ. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι DZNep αναστέλλουν την έκφραση ΕΖΗ2 και μπορεί περαιτέρω να λειτουργήσει ως ισχυρός αναστολέας μετάστασης μέσω διατάραξη της ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού. Μια λεπτομερής φαρμακολογικό χαρακτηρισμό της DZNep για να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου HCC και εξέλιξης in vivo εξακολουθεί να δικαιολογείται να διερευνήσει τις θεραπευτικές δυνατότητες των DZNep ως θεραπευτική αγωγή του καρκίνου.

Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι EHZ2 προωθεί HCC μετάσταση εν μέρει μέσω της επιγενετικής καταστολής πολλαπλών miRNAs σηματοδότησης στόχευση Rho /ROCK [13]. Για παράδειγμα, miR-139 που στοχεύει Rock2 [22] ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο HCC από ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27me3 [13]. Σε αυτή τη μελέτη, επιπλέον απέδειξε ότι DLC1, το κλειδί ανάντη ρυθμιστή της οδού Rho /ROCK, επίσης σιγήσει ΕΖΗ2. Συνολικά, τα ευρήματά μας διαλευκάνουν μια σφιχτή και πολυεπίπεδο ρύθμιση της σηματοδότησης DLC1 /Rho /ROCK από ΕΖΗ2, η οποία μπορεί να στηρίξει μια κρίσιμη επιγενετικές οδηγείται εκδήλωση για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Παροδική υπερέκφραση της GFP-ΕΖΗ2, όπως επιβεβαιώνεται από ανοσοαποτύπωση (αριστερά panal) και qPCR (δεξιά panal), αύξησε τα επίπεδα ΕΖΗ2 και H3K27me3 στα κύτταρα Huh-7. Αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα (# 3147, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) ανιχνεύεται τόσο την ενδογενή και την πρωτεΐνη σύντηξης GFP-ΕΖΗ2 στο ανοσοστύπωμα. Πρωτεΐνης και RNA συλλέχθηκαν έξι ημέρες μετά την επιμόλυνση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. κύτταρα

MHCC97L σε επεξεργασία με 1 μΜ DZNep για 48 ώρες εξετάστηκαν για τη βιωσιμότητά τους με trypan blue χρώση πριν τον προσδιορισμό κυτταρικής μετανάστευσης. Mock και DZNep επεξεργασμένα κύτταρα ήταν εξίσου βιώσιμο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Δημοσίως διαθέσιμες τσιπ αλληλουχίας και το chip-on-chip δεδομένων αναλύθηκε για να παρέχει ενδείξεις της κατάστασης DLC1 χρωματίνης σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. locus DLC1 βρέθηκε να χαρακτηρίζεται από H3K27me3 (Zhao et al., 2007) και H3K4me3 (Pan et al., 2007) σε ανεξάρτητες μελέτες. Επιπλέον, ο υποστηρικτής DLC1 βρέθηκε επίσης να δεσμεύονται από SUZ12, η ​​οποία είναι μια βασική συνιστώσα των Polycomb Κατασταλτικά Complex 2.

doi (Lee et al., 2006): 10.1371 /journal.pone.0068226.s003

(ΔΕΘ)