Αφηρημένο

Πυρηνική παράγοντας που επάγει την απόπτωση 1 (NAIF1), στο παρελθόν ήταν αναφερθεί ότι προκαλούν απόπτωση. Επιπλέον, η έκφραση του NAIF1 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο το γονίδιο NAIF1 επάγει την απόπτωση δεν είναι πλήρως κατανοητός. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NAIF1 ήταν ελάχιστα εκφρασμένη σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Τα δεδομένα μας δείχνει επίσης ότι NAIF1 εντοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων όπως ανιχνεύεται με παρακολούθηση του πράσινου φθορισμού της πρωτεΐνης σύντηξης NAIF1-GFP χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού συνεστιακή. Στη συνέχεια, μια συγκριτική πρωτεομική προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει την διαφορική έκφραση των πρωτεϊνών μεταξύ κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ45 /NAIF1 (-) και ΜΚΝ45 /NAIF1 (+). Βρήκαμε πέντε πρωτεΐνες (πρωτεασώματος 26S υπομονάδα 2, πρωτεασώματος 26S υπομονάδα 13, NADH αφυδρογονάσης Fe-S πρωτεΐνη 1, τσαπερονίνη περιέχουν TCP1 υπομονάδα 3 και θειορεδοξίνης αναγωγάση 1) που ήταν επάνω ρυθμισμένη και τρεις πρωτεΐνες (ριβονουκλεάση αναστολέα 1, 14-3- 3 πρωτεΐνη έψιλον ισομορφή και πρωτεΐνη δέσμευσης απολιποπρωτεΐνη AI) που ρυθμίζεται προς τα κάτω στα κύτταρα ΜΚΝ45 υπερεκφράζουν NAIF1. Ανακαλύψαμε επίσης ότι NAIF1 θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 /S, μεταβάλλοντας την έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου cyclinD1, cdc2 και ρ21. Τα διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών που προσδιορίζονται εδώ που σχετίζονται με διάφορες κυτταρικές προγράμματα που αφορούν κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και ρύθμιση της μεταγωγής σήματος και δείχνουν ότι NAIF1 μπορεί να είναι ένας καταστολέας όγκων σε καρκίνο του στομάχου. Η έρευνα μας παρέχει ενδείξεις που αποσαφηνίζει το ρόλο του πώς λειτουργεί NAIF1 στο γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Yang Μ, Zhong J, Zhao Μ, Wang J, Gu Υ, Yuan Χ, et al. (2014) Η υπερέκφραση της πυρηνικής επαγωγής απόπτωσης Factor 1 τροποποιηθεί η πρωτεομικής Προφίλ του ανθρώπινου γαστρικού Cancer Cell ΜΚΝ45 και Induced κύκλου κυττάρου σε G1 /S φάσης. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu », Ιταλία

Ελήφθη: 27 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 23, Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Key πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2007CB914700). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες του κόσμου προκαλώντας περίπου 8% και 10% της ετήσιας περιπτώσεων καρκίνου και θανάτων, αντίστοιχα. Σύμφωνα με την παγκόσμια έκθεση της επιδημίας από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, σχεδόν ένα εκατομμύριο γαστρικό περιπτώσεις καρκίνου και 738.000 θάνατοι υπολογίζεται ότι συνέβη το 2008 [1], [2]. Πολλές προσπάθειες έχουν ληφθεί σε κλινικές? Εν τούτοις, η θνησιμότητα των ασθενών με καρκίνο του στομάχου είναι ακόμη τόσο υψηλή όσο το 70% [2]. Ένας λόγος για αυτή την υψηλή θνησιμότητα είναι ότι οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο συχνά δεν διαγιγνώσκεται μέχρι το προχωρημένο στάδιο, το οποίο είναι πάρα πολύ αργά για να παρέχει αποτελεσματική θεραπεία. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια προφανής ανάγκη εξεύρεσης νέων βιο-δείκτες και αποτελεσματικές στρατηγικές για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Πρωτεομική έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλούς τομείς της έρευνας, συμπεριλαμβανομένης της έρευνας για τον καρκίνο. Κοινό δείγματα σε πρωτεομική ανάλυση για την έρευνα του καρκίνου περιλαμβάνουν καρκινικές κυτταρικές σειρές με διαφορετικό υπόβαθρο ή διαφορετικές θεραπείες ιστών και αίματος από ασθενείς με καρκίνο, καθώς επίσης και [3] – [6]. Αυτά πρωτεομική αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να ερευνήσει την προέλευση και την ανάπτυξη του καρκίνου ή να ψάξουν για διαγνωστικούς βιοδείκτες. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται μέσω μεθόδων πρωτεομική οφείλονται όχι μόνο σε άμεση ρύθμιση των μεταγραφικό επίπεδο, αλλά αντανακλούν επίσης μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών [3], [7]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να αναλύσουμε τόσο την έκφραση και ρύθμιση της πρωτεΐνης με πρωτεομική ανάλυση. Παρά πολλά αναδυόμενες τεχνικές, 2-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας έχει παραμείνει το πιο χρησιμοποιούνται μέθοδο για πρωτεομική ανάλυση.

Ο πυρηνικός παράγοντας που επάγει την απόπτωση ανθρώπινου γονιδίου που κωδικοποιεί 1 (NAIF1) βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9q34.11 . NAIF1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με ένα

Μγβ

-όπως πεδίο στο Ν-τερματική περιοχή του [8], [9]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του NAIF1 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και ΜΚΝ45 επάγει απόπτωση [8], [10]. . Επιπλέον, Luo

κ.ά.

βρήκαν ότι NAIF1 σημαντικά εκφράζεται σε φυσιολογικό γαστρικό ιστό, ενώ η έκφραση του ρυθμίζεται προς τα κάτω ή έχασε στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς (

P & lt?

0.001). Επιπλέον, η έκφραση NAIF1 ήταν υψηλότερη σε καλά διαφοροποιημένο (

P

= 0.004) από ότι στην μετρίου ή ανεπαρκώς διαφοροποιημένο γαστρικό καρκίνο [10]. Ωστόσο, ο ρόλος του NAIF1 στη ρύθμιση της κυτταρικής προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης είναι άγνωστος.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πρωτεομική τεχνολογία που βασίζεται σε 2-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με MALDI-TOF φασματομετρία μάζας για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που σχετίζονται με το βιολογικές λειτουργίες του NAIF1. Τα προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, ΜΚΝ45 με ή χωρίς NAIF1 υπερέκφραση αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας 24 cm ρΗ 3-10 NL σειρά ακινητοποιημένη διαβάθμιση ρΗ (IPG) λωρίδες. Για την επικύρωση αυτά τα δεδομένα, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του RNA από όλα τα διαφορετικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών και τρεις πρωτεΐνες περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NAIF1 προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 φάση /S με τη ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των cyclinD1, cdc2 και της πρωτεΐνης p21. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας μπορεί να οδηγήσει σε μια καλύτερη κατανόηση του πώς λειτουργεί NAIF1 στην επαγωγή της απόπτωσης και μπορεί επίσης να ρίξει φως σχετικά με τη διάγνωση και τη θεραπεία των γαστρικών καρκίνων στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ45, BGC823, AGS και SGC7901 ελήφθησαν από το καρκινικό κύτταρο και Τράπεζα της κινεζικής Academic Ιατρικών Επιστημών και καλλιεργούνται σε ελάχιστο βασικό υγρό μέσο Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. διαμόλυνση DNA εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης X-tremeGENE ΗΡ DNA (Roche, Ελβετία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πλασμίδια έκφρασης

Τα πλασμίδια έκφρασης pEGFP-Ν1-NAIF1, η οποία εκφράζει μια NAIF1-GFP πρωτεΐνη σύντηξης, και ρΕΟΡΡ-Ν1, η οποία εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Qing Luo [10].

κυτταρικού κύκλου διανομής ανάλυση

εκθετικά αυξανόμενη κύτταρα επιμολύνθηκαν με το φορέα pEGFP-N1 ή το πλασμίδιο ρΕΟΡΡ-Ν1-NAIF1. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 ° C για 1 ώρα. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης (0.05 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), 0,2 mg /ml ΚΝάσης, και 0.1% Triton Χ-100) στους 4 ° C για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για GFP και ΡΙ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή κυττάρων BD LSR II (BD, San Jose, CA, USA). ΡΙ φθορισμός μετρήθηκε μεταξύ του πληθυσμού θετικών κυττάρων GFP και οι κατανομές των κύκλων κυττάρου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit LT3.2. Τρία ξεχωριστά δείγματα παρασκευάστηκαν και όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η ποσοτικοποίηση της απόπτωσης

Ο ποσοτικός προσδιορισμός της απόπτωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ΡΕ αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD). Εν συντομία, BGC823 ή ΜΚΝ45 κύτταρα επιμολύνθηκαν με το φορέα pEGFP-N1 ή το πλασμίδιο ρΕΟΡΡ-Ν1-NAIF1. Μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS δύο φορές και στη συνέχεια επανα-εναιωρήθηκε με ρυθμιστικό σύνδεσης (10 mM Hepes /NaOH (ρΗ 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM ΟαΟ

2) . Τα επαναιωρημένα κύτταρα επωάστηκαν με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένη με Annexin V (AV) και 7-αμινο-ακτινομυκίνη (7-AAD), και στη συνέχεια μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τον αναλυτή κυττάρων BD LSR II. Τέσσερις διακριτές κυτταρικών πληθυσμών θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε ένα dot-οικοπέδου: βιώσιμων κυττάρων (AV

– /7-AAD

-), αποπτωτικά κύτταρα πρώιμης φάσης (AV

+ /7-AAD

– ), την όψιμη φάση της αποπτωτικών κυττάρων (AV

+ /7-AAD

+), και νεκρωτικές κύτταρα (AV

– /7-AAD

+). Ένα ελάχιστο των 10.000 GFP θετικά κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα και τα δεδομένα αναφέρονται ως το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (AV

+ /7-AAD

– και AV

+ /7-AAD

+ ) μεταξύ των συνολικών κυττάρων. Τρεις ανεξάρτητες παρασκευάσματα δείγμα έγιναν και όλες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

Ομοεστιακή σάρωσης

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη για 15 min. σε θερμοκρασία δωματίου. Προκειμένου να ενισχυθεί η διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης, τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,5% Triton Χ-100, που ακολουθείται από επώαση με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) για τη χρώση των πυρήνων. Κυτταρική κατανομή του NAIF1 αναλύθηκε με παρακολούθηση του πράσινου φθορισμού της πρωτεΐνης σύντηξης NAIF1-GFP χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Leica Microsystems Heidelberg GmbH.

παρασκεύασμα πρωτεΐνης για 2-DE

Για κάθε δείγμα, 5 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 2% CHAPS, 20 mM DL-διθειοθρεϊτόλη (DTT), 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), 30 mM φθοριούχο νάτριο, και 0,25 mg /ml RNaseA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C για 30 λεπτά. στα 12.000 rpm. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα και συμπυκνώθηκε με 0,1 Μ NH

4COOH. Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης προστέθηκε σε τελικό όγκο 800 μΐ, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία Bradford (Tiangen, Beijing, Κίνα).

Δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση

διδιάστατη ηλεκτροφόρηση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [5]. Εν συντομία, 1 mg πρωτεϊνών αραιώθηκε σε 450 μΙ με ρυθμιστικό διάλυμα επανενυδάτωσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 2% CHAPS, και 20 mM DTT). IPG λωρίδες (IPG, 24 cm, ρΗ 3-10, NL, GE Limit.) Επανυδατώθηκαν με τις επανυδατώνεται δειγμάτων για 18 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ισοηλεκτρική εστίαση με Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) διαδοχικά για 1 ώρα στα 100 V, 1 ώρα στα 250 V, 1 ώρα στους 500 V, 1 ώρα σε 1000 V, 1 ώρα σε 3000 V, 1 h στους 5000 V, 2 ώρες σε 8000 V, και 6 ώρες σε 8000 V για να πάρει συνολικά 80 KVH. Μετά την ισοηλεκτρική εστίαση, IPG λωρίδες εξισορροπηθεί με ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης I (6 Μ ουρία, 150 mM Tris-HCl (ρΗ 8.8), 30% γλυκερόλη, 2% SDS, 1% DTT) επί 15 λεπτά. που ακολουθείται από μια δεύτερη επώαση με ένα άλλο ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης II (6 Μ ουρία, 150 mM Tris-HCl (ρΗ 8.8), 30% γλυκερόλη, 2% SDS, 2,5% ιωδοακεταμίδιο) για 15 λεπτά. Η δεύτερη διάσταση της SDS-PAGE διεξήχθη με 12,5% SDS-PAGE χρησιμοποιώντας τα Ettan DALT ΕΞΙ συστημάτων κάθετης (GE).

χρώση Gel και την εικόνα ανάλυσης

Το SDS-PAGE πηκτές σταθεροποιήθηκαν κατά τον καθορισμό ρυθμιστικού (10% CH

3COOH, 40% C

2Η

5OH, και 50% αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O) για 30 λεπτά. Οι πηκτές μετά πλύθηκαν σε αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O για 10 λεπτά. 3 φορές και χρωματίστηκαν με Coomassie blue G-250.

Τα πηκτώματα σαρώθηκαν με ένα σαρωτή εικόνας χρησιμοποιώντας λογισμικό MagicScan την αξιολόγηση των μορφών σημείο. λογισμικό ImageMaster πλατίνα (έκδοση 5.0) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των εικόνων πήγματος. Οι κηλίδες που παρατηρήθηκαν τόσο στο πήκτωμα ελέγχου και NAIF1 γέλη αναλύθηκαν και η ένταση κάθε κηλίδας ποσοτικοποιήθηκε με τον υπολογισμό του όγκου σημείο μετά την ομαλοποίηση της εικόνας γέλη. Ποσοτική ανάλυση των εικόνων γέλης (τρεις επαναλήψεις /δείγμα) ελήφθησαν και κηλίδες με στατιστικά σημαντικά διαφορές (t-test, *

P

& lt? 0,05). Αποκόπηκαν και πέψη για ταυτοποίηση

Protein ταυτοποιήσεις

διαφορικά εκφρασμένη πρωτεΐνη σημεία εξήχθησαν και de-βάφονται σε 50 mM ΝΗ

4HCO

3 /ακετονιτρίλιο (50/50) και ξηραίνονται με φυγοκέντρηση κενού. Τα τεμάχια της πηκτής στη συνέχεια υπέστησαν πέψη με 10 ng /ml θρυψίνη (Promega, WI, USA) σε 50 mM ΝΗ

4HCO

3 ρυθμιστικό σε 37 ° C όλη τη νύκτα. Το υγρό θρυψίνη μεταφέρθηκε σε έναν καθαρό σωλήνα, αραιώνεται με 100 μΙ 60% ακετονιτρίλιο /0.1% τριφθοροοξικό οξύ, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπερήχους για 15 λεπτά, τρεις φορές. Όλη η απέκτησε υγρό συλλέχθηκε και στέγνωσε εν κενώ και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C. Τα εκλουσθέντα πεπτίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Bruker UltraFlex MALDI-TOF /TOF εξοπλισμένο με την πηγή SCOUT από BGI-Πεκίνο. Τα αποτελέσματα φάσμα μάζας ήταν σε αντίθεση εναντίον ακολουθιών θηλαστικών από τη (μη απολύονται) βάση δεδομένων NCBInr για το πεπτίδιο αναγνώρισης δακτυλικών αποτυπωμάτων μάζα.

Απομόνωση RNA, RT και σε πραγματικό χρόνο Q PCR

Το συνολικό RNA ήταν εξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA με ολίγο (dT)

18 εκκινητές και Μ-ΜυΙ_ν αντίστροφης μεταγραφάσης (TAKARA).

Για αντίστροφη μεταγραφική PCR, εκκινητές για NAIF1 και β-ακτίνη ήταν ως εξής: NAIF1 αίσθηση, 5′- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ‘, και αντι-νόημα, 5′-CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3′? β-ακτίνη νόημα, 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ‘, και αντι-νόημα, 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Όλες οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας NCBI έκρηξη και αγοράστηκαν από Sangon, Πεκίνο.

ποσοτική PCR εκτελέστηκε με το SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japan) με ένα σύστημα αντίδρασης 20 μΙ που έχει συσταθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. έκφραση του γονιδίου-στόχου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κατάλληλα σε πραγματικό χρόνο qPCR εκκινητές (Πίνακας 1). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Το πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη σε έναν ανακυκλωτή ABI7300 (ΑΒΙ, MA, USA) με τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση για 30 s στους 95 ° C, ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης για 5 s στους 95 ° C, και επέκταση για 31 s στους 60 ° C. Ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη στο τέλος για να επικυρώσει την ειδικότητα του αναμενόμενου προϊόντος PCR. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τις δύο πρότυπες μεθόδους καμπύλη. Τρία ανεξάρτητα δείγματα προετοιμάστηκαν για κάθε κατάσταση και κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν.

Η

Western Blotting

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, 2 χ 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν με μέσο ροής, σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους 500

g

, και πλύθηκαν 3 φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1,5% ΝΡ-40, 0.1% SDS, και 50 μg /ml PMSF, με προσφάτως προστιθέμενη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 15 λεπτά. και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη χρήση Bradford μεθόδους. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% BSA σε TBST για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από επώαση με πρωτογενές αντίσωμα λύσεις σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (β-ακτίνη, 1:5000, Sigma? NAIF1, 1:1000, Santa Cruz? 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz? TCP1-γ, 1:1000, Abcam? TXNRD1, 1:1000, Abcam? CyclinD1, 1:1000, CST? cdc2, 1:500, CST? και p21, 1 :500, CST). Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές με TBST, που ακολουθείται από επώαση με τα κατάλληλα δευτερογενή αντισώματα για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL χημειοφωταύγειας. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική σύγκριση. Μια σχετική τιμή των

P & lt?.

0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

επιυολυσυένα NAIF1 εντοπίζεται στον πυρήνα

Τόσο η αντίστροφη μεταγραφική κηλίδωση πειράματα PCR και δυτική έδειξαν ότι NAIF1 ήταν ελάχιστα εκφρασμένη σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, ΜΚΝ45, BGC823, AGS, και SGC7901? ενώ NAIF1 ανιχνεύθηκε εύκολα όταν επιμολύνθηκε στα κύτταρα (Σχήμα. 1Α και Β). Εμείς επιμολυσμένα μια κατασκευή σύντηξης NAIF1-GFP σε ΜΚΝ45 και BGC823 κυττάρων και έναν φορέα GFP χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ομοεστιακό μικροσκόπιο έδειξαν ότι όταν τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με το κατασκεύασμα pEGFP-Ν1-NAIF1, πράσινος φθορισμός ανιχνεύθηκε μόνο στους πυρήνες? αντιθέτως, το πράσινο σήμα flurescent ανιχνεύθηκε σε ολόκληρο το κύτταρο όταν επιμολύνθηκαν με το φορέα GFP (Σχήμα. 1 C). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε άλλες κυτταρικές γραμμές όπως BGC823 (Σχήμα S1). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν που επιμολύνονται NAIF1 πρωτεΐνη εντοπίζεται στον πυρήνα.

(Α) Αντιστροφή της μεταγραφής PCR δείχνει NAIF1 δεν εκφράζεται σε επίπεδο RNA στα κύτταρα που δοκιμάστηκαν. Το πλασμίδιο που περιέχει το γονίδιο NAIF1 χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για το θετικό μάρτυρα και DDH

2O χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για αρνητικό έλεγχο. (Β) κηλίδωση Western έδειξε ότι NAIF1 δεν εκφράζεται στο επίπεδο της πρωτεΐνης στα τέσσερα δοκιμάστηκαν γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. κύτταρα ΜΚΝ45 υπερεκφράζουν πρωτεΐνη σύντηξης NAIF1-GFP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η επιμολυσμένα μπάντα NAIF1 ανιχνεύθηκε μεταξύ της πρωτεΐνης παράγοντες σήμανσης μοριακού βάρους 55 και 75 kD? ενώ δεν ανιχνεύτηκαν ζώνες μεταξύ 40 και 55 kD, η οποία είναι η προβλεπόμενη θέση της πρωτεΐνης NAIF1. (Γ) υποκυτταρική κατανομή του NAIF1. κύτταρα ΜΚΝ45 διαμολύνθηκαν είτε με το κατασκεύασμα σύντηξης NAIF1-GFP ή στον φορέα GFP. Τα άνω τρία εικόνες αντιπροσωπεύουν η πρωτεΐνη σύντηξης NAIF1-GFP διανέμεται μόνο στους πυρήνες, ενώ κάτω από τις εικόνες αντιπροσωπεύουν GFP διανέμεται σε όλο το κύτταρο.

Η

επάγεται NAIF1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 /S φάσης

το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των γαστρικών καρκινικών κυττάρων υπό την επίδραση της NAIF1 διερευνήθηκε στη συνέχεια. GFP-θετικά κύτταρα αναλύθηκαν για να εξασφαλιστεί η σωστή πληθυσμός χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα S2). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι NAIF1 προκάλεσε μία σημαντική αλλαγή στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου: παρατηρήθηκε μια αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού στην φάση Ο0 /Ο1 και μείωση στη φάση S σε κύτταρα που υπερεκφράζουν NAIF1 σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον άδειο τον φορέα, τόσο μετά την επιμόλυνση 24 ώρες και 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα. 2Α, κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, το 54% περίπου του BGC823 κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα pEGFP-N1 ήταν στην φάση G0 /G1, και 34% και 12% των κυττάρων ήταν στην φάση S και G2 /M φάση, αντίστοιχα . Από την άλλη πλευρά, σε BGC823 κύτταρα επιμολυσμένα με το pEGFP-Ν1-NAIF1 κατασκεύασμα υπήρξε μια σαφής αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε Ο0 φάση /G1 (74%), καθώς επίσης και μια μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (26%) και G2 /M φάση (0%). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, περίπου το 36% των κυττάρων BGC823 ελέγχου ήταν σε G0 /G1 φάση, και 59% και 5% των κυττάρων είναι σε φάση S και G2 /M φάση αντίστοιχα. Σε BGC823 κύτταρα επιμολυσμένα με το pEGFP-Ν1-NAIF1 κατασκεύασμα, περίπου το 55% των κυττάρων ήταν στην G0 /G1 φάση, και 37% και 8% των κυττάρων ήταν στην φάση S και G2 /M φάση, αντίστοιχα. Σε ΜΚΝ45 κύτταρα, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, περίπου το 56% των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το φορέα pEGFP-N1 ήταν σε G0 /G1 φάση, και 29% και 15% των κυττάρων ήταν στην φάση S και G2 /M φάση, αντίστοιχα. Περίπου 76% των ΜΚΝ45 κύτταρα επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα pEGFP-Ν1-NAIF1 ήταν σε φάση G0 /G1, και τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S και G2 /M φάση μειώθηκαν σε 24% και 0%, αντίστοιχα. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, περίπου 43% των κυττάρων ελέγχου ΜΚΝ45 ήταν σε G0 /G1 φάση, και 43% και 14% των κυττάρων ήταν στην φάση S και G2 /M φάση, αντίστοιχα. Σε ΜΚΝ45 κύτταρα επιμολυσμένα με το pEGFP-Ν1-NAIF1 κατασκεύασμα, περίπου το 56% των κυττάρων ήταν στην G0 /G1 φάση, και 28% και 16% των κυττάρων ήταν στην φάση S και G2 /M φάση, αντίστοιχα (Σχήμα. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η υπερέκφραση του NAIF1 επάγεται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 /S φάσης του γαστρικού καρκίνου κυττάρων BGC823 και ΜΚΝ45.

(Α) και (Β) στήλες δείχνουν τη διαφορετική κατανομή του κυτταρικού κύκλου μεταξύ κύτταρα επιμολυσμένα με NAIF1 και με τον φορέα GFP 24 ώρες ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε BGC823 κύτταρα (Α) και (Β) ΜΚΝ45 κύτταρα. Για να διασφαλιστεί το σωστό πληθυσμό, GFP-θετικά πληθυσμός αναλύθηκε. * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05). (Γ) Western στύπωμα δείχνει την αλλαγή στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου πρωτεϊνών που σχετίζονται με NAIF1 επαγόμενη G1 /S φάσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD (η = 3)? Σημαντική διαφορά από την ομάδα NAIF1 υπερεκφράζουν, t-test του Student, * P & lt?. 0.05

Η

Για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο NAIF1 που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε τις πιθανές ρόλους των cyclinD1, p21 και πρωτεΐνες cdc2 , οι οποίες είναι σημαντικές στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1 /S. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης του cyclinD1 και cdc2 μειώθηκαν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, τόσο σε κύτταρα BGC823 και ΜΚΝ45. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του ρ21 αυξήθηκαν (Εικόνα. 2C).

Συγκριτική πρωτεομική ανάλυση του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΚΝ45, με ή χωρίς επιπλέον έκφραση της πρωτεΐνης NAIF1

Τα πρωτεΐνη προφίλ των ΜΚΝ45 κύτταρα επιμολυσμένα με το pEGFP-Ν1-NAIF1 κατασκευάσματα ως ομάδα που έλαβε ή με το φορέα pEGFP-Ν1, όπως η ομάδα ελέγχου μετρήθηκαν με 2-DE 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Συνολικά, πάνω από 700 κηλίδες επιλύθηκαν, εκ των οποίων 11 ήταν πρωτεϊνών & gt? 1,5 φορές διαφορικά εκφραζόμενα όπως προσδιορίζεται με ανάλυση με ImageMaster έκδοση 5.0. Τα διαφορικά εκφραζόμενο κηλίδες πρωτεΐνης αποκόπηκαν από την πηκτή, και 8 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση /TOF MALDI-TOF. Εκπρόσωπος θεραπεία και ομάδα ελέγχου χάρτες τζελ 2-DE φαίνεται στο σχήμα. 3Α και τα διαφορικά εκφρασμένων κηλίδες πρωτεΐνης σημειώνονται. Οι Megascopic 2-DE εικόνες γέλη του καθενός από τα διαφορικά εκφρασμένων κηλίδες πρωτεΐνης που αντιπροσωπεύεται στην Εικόνα. 3Β και 3C. Πέντε από τις πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα στην ομάδα που λάμβανε συμπεριλαμβανομένων NADH αφυδρογονάσης (ουβικινόνη) Fe-S πρωτεΐνη 1 (NADUSF1), τσαπερονίνη περιέχει TCP1 υπομονάδα 3 (TCP1-γ), θειορεντοξίνη αναγωγάση 1 (TXNRD1), πρωτεοσώματος 26S υπομονάδα 2 ( PSMC2) και πρωτεασώματος 26S υπομονάδας 13 (PSMD13). 3 πρωτεΐνες κάτω ρυθμισμένα, συμπεριλαμβανομένων αναστολέα ριβονουκλεάσης 1 (RNH1), έψιλον ισομορφή πρωτεΐνη 14-3-3 (14-3-3 ε) και Α-Ι πρωτεΐνη απολιποπρωτεΐνης πρόσδεσης (APOAIBP). Πίνακας 2 απεικονίζει συγκεκριμένες πληροφορίες σχετικά με αυτές τις πρωτεΐνες και το επίπεδο της διαφορικής έκφρασης.

(Α) Εκπρόσωπος 2-DE χάρτες των κυττάρων ΜΚΝ45 επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ελέγχου ή NAIF1. (Β) και εικόνες (C) Megascopic και σχετική ένταση όγκος των διαφορικών εκφρασμένων πρωτεϊνών. (Β) αντιπροσωπεύει το up-ρυθμίζονται σημεία της πρωτεΐνης, ενώ (C) αντιπροσωπεύει τα κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες.

Η

Εκκαθάριση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών

Σε πραγματικό χρόνο qPCR και τη δυτική αποτύπωση πραγματοποιήθηκαν για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων 2-DE. τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου qPCR και είναι συνεπείς με τα αποτελέσματα 2-DE, εκτός από μία πρωτεΐνη, 14-3-3ε (Σχήμα. 4Α). επιλεγεί τρεις πρωτεΐνες με βάση τη σημασία τους και τις πιθανές λειτουργίες για περαιτέρω ανάλυση με αποτύπωμα western για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων 2-DE. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του TXNRD1 και TCP1-γ ήταν σημαντικά αυξημένα στην ομάδα NAIF1 σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05), ενώ το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του 14-3-3ε ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα NAIF1 (

P & lt?

0,05) (Εικόνα 4Β.). Συνολικά, τα αποτελέσματα κηλίδας western συνάδουν με αποτέλεσμα η 2-DE.

(Α) Επαλήθευση της 2-DE προκύπτει από πραγματικό χρόνο qPCR. * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05) ** Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.001). (Β) Η επαλήθευση της 2-DE αποτελέσματα κατά Western και την σχετική ένταση όγκου των διαφορικών εκφρασμένων πρωτεϊνών, με τη χρήση β-ακτίνης ως μάρτυρα. * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για να περιγράψει το γονίδιο NAIF1? Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την πρωτεομική προφίλ NAIF1 υπερεκφράζεται. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ανιχνεύσει και να εντοπίσει τις πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση αλλάζει με κύτταρα ΜΚΝ45 υπερεκφράζουν NAIF1. Περαιτέρω, απόδειξη παρέχεται για να εξηγήσει πώς λειτουργεί NAIF1 στην επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης και άλλες δραστηριότητες. Μια στρατηγική 2-DE χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη λόγω της βολικής μεθοδολογία της και υψηλή απόδοση. Συνολικά, εντοπίσαμε και προσδιόρισε 5 πρωτεΐνες που ρυθμίζονται up-και 3 πρωτεΐνες που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα ΜΚΝ45 υπερεκφράζουν NAIF1 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες περιλαμβάνουν μια σειρά φυσιολογικών δραστηριοτήτων, όπως η υποβάθμιση πρωτεΐνη, ο έλεγχος της ομοιόστασης κυττάρων οξειδοαναγωγής, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ρύθμιση κυτταρικού σκελετού, κυτταρική απόκριση στρες, απόπτωση και ρύθμιση του μεταβολισμού. Το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου, BGC823 και ΜΚΝ45 ερευνήθηκε επίσης, και τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του NAIF1 μπορεί να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 /S φάσης μέσω τροποποιήσεως των επιπέδων έκφρασης ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου πρωτεΐνες cyclinD1, cdc2 και p21 .

Τα αποτελέσματα από τη δυτική αποτύπωση και την αναστροφή της μεταγραφής PCR έδειξε ότι NAIF1 ήταν ελάχιστα εκφράζεται σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι ανάλογη με το εύρημα Luo σε ιστούς [10]. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ότι NAIF1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη στα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ45 και BGC823. Δεδομένου ότι γονιδιωματικό DNA υφίσταται κυρίως στον πυρήνα, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι μπορεί να λειτουργούν NAIF1 στον πυρήνα αλληλεπιδρώντας με γονιδιωματικό DNA και νουκλεοπρωτεΐνη, προκειμένου να επηρεάσει την έκφραση των γονιδίων και πρωτεϊνών διεξοδικά. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε πρωτεομική ανάλυση για τη διερεύνηση της πρωτεομική χαρακτηριστικών των κυττάρων ΜΚΝ45 υπερεκφράζουν NAIF1.

Ανώμαλη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου είναι ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων [11]. Μελέτες έχουν δείξει ότι πολλές μικρά μόρια μπορούν να ενεργοποιήσουν τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τα οποία επιτρέπουν στα κύτταρα να επισκευάσει ελαττώματα. Ωστόσο, ανεπιτυχής repairation μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση [12] – [15]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NAIF1 προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 /S. Η μετάβαση από G1 προς S φάση απαιτεί την ενεργοποίηση του συγκροτήματος από κυκλίνη-Cdk4 /6 και κυκλίνη-cdc2 (επίσης γνωστή ως Cdk1). Εν τω μεταξύ, ρ21 αναστέλλει τη δράση cdc2 και μεσολαβεί συναρμολόγηση και την ενεργοποίηση των κυκλίνη-cdk4 /6 στο κυτταρόπλασμα, καθώς και την αναστολή της δραστικότητας τους στον πυρήνα [16]. Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση western αποτύπωση Διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του cyclinD1 και cdc2 μειώθηκαν, ενώ το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ρ21 του αυξήθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν NAIF1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από NAIF1 διαμεσολαβείται από την ρ21 και cyclinD1 οδό. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ο πληθυσμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε περίπου 10% σε κύτταρα που υπερεκφράζουν NAIF1 ως αποτέλεσμα διακοπή του κυτταρικού κύκλου (σχήμα S3).

26S πρωτεασώματος είναι ένας συντηρητικός οργανίδιο σε όλα ευκαρυωτικά κύτταρα και είναι υπεύθυνο για την ενδοκυτταρική αποικοδόμηση πρωτεϊνών [17]. Οι πρωτεΐνες που διασπώνται από 26S πρωτεασώματος εμπλέκονται σε μια σειρά βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, του κυτταρικού κύκλου, και της ανάπτυξης και ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων που με τη σειρά ρυθμίζουν άλλες διαδικασίες [18]. Διαταραχή της ισορροπίας αποικοδόμησης των πρωτεϊνών οδηγεί στην δημιουργία και ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, 26S πρωτεασώματος είναι ένας ελκυστικός στόχος θεραπεία του καρκίνου. Εδώ, βρήκαμε ότι δύο υπομονάδες του 26S πρωτεασώματος, PSMC2 και PSMD13, ήταν και οι δύο πάνω ρυθμισμένα σε ΜΚΝ45 κύτταρα που υπερεκφράζουν NAIF1. PSMC2 και PSMD13 είναι υπομονάδες του πρωτεασώματος 19S, το οποίο είναι το ρυθμιστικό σωματίδιο (RP) του πρωτεασώματος 26S. PSMC2 είναι μια ΑΤΡάση ενώ PSMD13 είναι ένα μη-ΑΤΡάσης. Ορισμένοι ερευνητές πιστεύουν ότι η αναστολή 26S πρωτεασώματος μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση των κυττάρων του καρκινώματος, και οι αναστολείς πρωτεασώματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία του καρκίνου [19] – [21]. Ωστόσο, μια μελέτη από Tan

et al.

Υποδηλώνει ότι ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) -α ενεργοποιεί το σύστημα πρωτεασώματος 26S με up-ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του 26S πρωτεασώματος υπομονάδες [22]. ΤΝΡ-α είναι μία πολύ γνωστή κυτοκίνη η οποία μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε ένα εύρος καρκινικών κυττάρων, και τώρα χρησιμοποιείται στην κλινική ως περιφερειακή θεραπεία του τοπικά προχωρημένου σαρκώματα μαλακού ιστού και μελανώματα μετάσταση για να αποφευχθεί ο ακρωτηριασμός των άκρων [23]. Όπως TNF-α, NAIF1 έχει επίσης την ικανότητα να επάγει απόπτωση, πράγμα που σημαίνει ότι ο πρωτεασώματος 26S μπορεί να εμπλέκονται στη διαδικασία της απόπτωσης που επάγεται από NAIF1.

Τα δεδομένα μας καταδεικνύουν επίσης ότι δύο πρωτεΐνες, TXNRD1 και NDUFS1, είναι up-ρυθμίζεται από NAIF1. TXNRD1 ρυθμίζει την οξειδοαναγωγική κατάσταση των πρωτεϊνών θειόλες σε κύτταρα θηλαστικών, και λειτουργεί σε τόσο την προώθηση και την πρόληψη του καρκίνου σε διάφορα είδη καρκινωμάτων [24] – [27]. Δεν υπήρξαν μελέτες για να διερευνηθεί ο ρόλος του TXNRD1 σε γαστρικό καρκίνο. Κατά τη γνώμη μας, TXNRD1 μπορεί να συμμετέχει στην καταστολή του γαστρικού καρκίνου ή γένεσης της πάνω ρύθμιση TXNRD1 μπορεί να είναι ένας προσαρμοστικός μηχανισμός σε απόκριση σε οξειδωτικό στρες που δημιουργείται από υπερέκφραση του NAIF1. Το γονίδιο κωδικοποιεί μία NDUFS1 75 kDa Fe-S υπομονάδα, η οποία είναι μία από τις επτά μιτοχονδριακού υπομονάδων του συμπλόκου Ι [28]. Συγκρότημα Ι είναι η μεγαλύτερη από τα ένζυμα αναπνευστικής αλυσίδας και ανεπάρκεια σύνθετων Ι είναι η κύρια αιτία μιας σειράς εγγενή μιτοχονδριακών ασθενειών, όπως το σύνδρομο Leigh [29]. Επιπλέον, το 75 kDa υπομονάδα του συμπλόκου Ι είναι ένα υπόστρωμα κασπάσης, η οποία εμπλέκεται στη μιτοχονδριακή μονοπάτι απόπτωσης. διάσπαση κασπάση του NDUFS1 απαιτείται για αρκετές μιτοχονδριακές αλλαγές που σχετίζονται με την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων των επιπέδων ΑΤΡ, παραγωγή ROS, και απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης πλάσματος και ούτω καθεξής [30]. Από NAIF1 επάγει απόπτωση μέσω της μιτοχονδριακής οδού [8], υποθέτουμε ότι η αυξητική ρύθμιση του NDUFS1 συμμετέχει στη διαδικασία απόπτωση που επάγεται από NAIF1.

TCP1-γ έχει ταυτοποιηθεί ως σαπερονίνης σε ευκαρυωτικά κυτοσόλιο. Προηγούμενη έρευνα έχει διαπιστώσει ότι TCP1-γ είναι σημαντική εκφράζεται σε όγκους ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε σύγκριση με τα ζεύγη γειτονικών μη-κακοήθεις ιστούς όγκων [31], [32]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ TCP1-γ και του γαστρικού καρκίνου εξακολουθεί να είναι άγνωστη και χρειάζεται περαιτέρω μελέτη.

Από την άλλη πλευρά, εντοπίστηκαν τρεις πρωτεΐνες, 14-3-3ε, RNH1 και APOAIBP, που ήταν κατάντη ρυθμίζεται σε ΜΚΝ45 κύτταρα που υπερεκφράζουν NAIF1. 14-3-3 είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που αποτελείται από πολυλειτουργικές πρωτεΐνες που δεσμεύονται και διαμορφώνουν τις λειτουργίες ενός ευρέος φάσματος κυτταρικών πρωτεϊνών.