Αφηρημένο

όγκου micromilieu συχνά δείχνει έντονη οξέωση αναγκάζοντας τα κύτταρα να προσαρμοστούν φαινότυπο τους προς την αυξημένη ογκογένεση προκαλείται από την αλλοιωμένη κυτταρική σηματοδότηση και την μεταγραφική ρύθμιση. Στους μηχανισμούς παρουσιάζει τη μελέτη και τις πιθανές συνέπειες της λογομαχία μεταξύ των εξω- και ενδοκυτταρικού pH (pH

e, pH

i) και μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη-κινασών (ERK1 /2, p38) αναλύθηκε. Τα δεδομένα ελήφθησαν κυρίως στην ΑΤ1 κύτταρα καρκινώματος προστάτη R-3327, αλλά η αρχή σημασία επιβεβαιώθηκε σε 5 άλλους τύπους κυττάρων. Εξωκυτταρική οξέωση οδηγεί σε ταχεία και παρατεταμένη μείωση του ρΗ

i παράλληλα με φωσφορυλίωση ρ38 σε όλους τους τύπους κυττάρων και σε /2 φωσφορυλίωση ERK1 σε 3 από 6 τύπους κυττάρων. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της p38 προκλήθηκε από μόνη ενδοκυτταρική lactacidosis σε φυσιολογικό pH

e. Αναστολή της /2 φωσφορυλίωση ERK1 κατά τη διάρκεια της οξέωσης οδήγησε στο νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. λήφθηκε καμία απόδειξη για την εμπλοκή των κινασών c-Src, PKC, PKA, PI3K ή EGFR, ούτε οι μεταβολές του όγκου των κυττάρων στην ενεργοποίηση ΜΑΡΚ οξέωση που προκαλείται. Ωστόσο, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι οξέωση αυξάνει το σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), πιθανώς προέρχεται από μιτοχόνδρια, τα οποία στη συνέχεια ενεργοποιούν φωσφορυλίωση ΜΑΡΚ. Απομάκρυνσης των ROS εμπόδισε ΜΑΡΚ φωσφορυλίωση οξέωση που προκαλείται, ενώ προσθήκη H

2O

2 είναι ενισχυμένη. Τέλος, οξέωση αυξημένη φωσφορυλίωση του CREB παράγοντα μεταγραφής μέσω ρ38, οδηγώντας σε αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα ενός CRE-ρεπόρτερ ακόμη και 24 ώρες μετά την ενεργοποίηση τα κύτταρα πίσω σε ένα κανονικό περιβαλλοντική περιβάλλον. Έτσι, ένα όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου μπορεί να προκαλέσει μια μεγαλύτερης διάρκειας p38-CREB-medited αλλαγή στο μεταγραφικό πρόγραμμα, το οποίο μπορεί να διατηρήσει το αλλαγμένο φαινότυπο, ακόμη και όταν τα κύτταρα αφήνουν το περιβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Riemann Α, Β Schneider , Ihling Α, Nowak M, Sauvant C, νεύρων O, et al. (2011) όξινο περιβάλλον οδηγεί σε ROS-Induced ΜΑΡΚ σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10.1371 /journal.pone.0022445

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: δεύτερης Απρίλη 2011? Αποδεκτές: 21 του Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Riemann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Deutsche Krebshilfe (επιχορηγήσεις 106774/106906), το BMBF (Pronet-Τ3 Ta-04) και το πρόγραμμα Wilhelm-Roux της Ιατρικής Σχολής, Universität Halle-Wittenberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Δύο μικροπεριβάλλοντα μπορεί να διακριθεί σε σχέση με συμπαγείς όγκους: (i) το περιβάλλον ιστός στον οποίο τα κύτταρα του όγκου να διαμένουν (παθολογική περιβάλλοντος ιστού) και (ii) το τοπικό περιβάλλον που δημιουργείται από τα κύτταρα του όγκου (μικροπεριβάλλον του όγκου) , ότι μπορεί να δημιουργήσει μια παθολογική περιβάλλοντος ιστού για γειτονικά κύτταρα. Η παθολογική περιβάλλον ιστός υποστηρίζει την προώθηση του όγκου και το μικροπεριβάλλον του όγκου υποστηρίζει την εξέλιξη του όγκου [1] – [4]. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου χαρακτηρίζεται από έλλειψη οξυγόνου (υποξία), ως συνέπεια της δομικές και λειτουργικές ανωμαλίες του αγγειακού δικτύου [5], που οδηγεί σε ανεπαρκή διαπότιση του συμπαγούς όγκου [5], [6]. Προκειμένου να διατηρηθεί τα κύτταρα του όγκου της ζήτησης ενέργειας εναλλαγή μεταβολισμό τους να γλυκόλυση, με αποτέλεσμα την αυξημένη κατανάλωση γλυκόζης και προφέρεται παραγωγή γαλακτικού οξέος. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να εμφανιστούν ακόμη και σε όγκους όταν η παροχή οξυγόνου είναι επαρκής – γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg. Πρόσφατα, τα στοιχεία παρουσιάστηκαν αποδεικνύουν ότι η έκφραση ισομορφή συρραφής του πυροσταφυλική κινάση είναι απαραίτητη για την αλλαγμένη μεταβολισμό η οποία παρέχει ένα εκλεκτικό πλεονέκτημα για κύτταρα όγκου [7]. Μαζί αυτά τα χαρακτηριστικά σχηματίζουν ένα πολύπλοκο δίκτυο και να δημιουργήσει ένα μεταβολικό μικροπεριβάλλον, που αποτελείται από υποξία, χαμηλή γλυκόζη, οι υψηλές συγκεντρώσεις γαλακτικού και εξωκυτταρικό οξέωση. τιμές ρΗ στις συμπαγείς όγκους είναι στην περιοχή από 6,5 έως 6,8 [6]. Αυτό το όξινο περιβάλλον είναι η εισαγωγή για την προώθηση και την εξέλιξη του όγκου.

Είναι γνωστό ότι οι μεταβολικές επιπτώσεις μικροπεριβάλλον συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, η αποτελεσματικότητα της θεραπείας με ακτινοβολία, η φωτοδυναμική θεραπεία και χημειοθεραπευτικά βλάπτεται από το περιβάλλον του όγκου [8], [9]. Η ανάπτυξη και τα χαρακτηριστικά της μετανάστευσης, καθώς και την ευαισθησία της απόπτωσης μπορεί να επηρεαστεί, πάρα πολύ. Έτσι, ο φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων – και ως εκ τούτου του ίδιου του όγκου – εξαρτάται, εκτός από την γενετική προσδιορισμό, επί της μεταβολικής μικροπεριβάλλον. Ο «σπόρος και το έδαφος» -hypothesis ακόμα και αξιώνει ότι μετά την απόκτηση όλων των απαραίτητων καρκινικών γενετικές αλλοιώσεις μόνο ο σχηματισμός της μικροπεριβάλλον του όγκου επιτρέπει στα κύτταρα του όγκου να αυξάνεται [10].

Για μια λεπτομερή μηχανιστική κατανόηση, είναι σημαντικό να αποδομήσουν αυτό το μικροπεριβάλλον και να καθορίσει τα αποτελέσματα των διαφόρων παραμέτρων ξεχωριστά προκειμένου να αξιολογήσει τη συμβολή τους. Λαμβάνοντας υπόψη ότι υπάρχει άφθονη βιβλιογραφία σχετικά με την υποξία, η σημασία της μεταβολικής οξέωσης είναι λιγότερο ερευνηθεί. Πρόσφατα δείξαμε ότι η μεταβολική οξέωση per se ενισχύει χημειοαντίσταση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη υπό ορθοξικές και normoglycemic συνθήκες [9], [11], υποδεικνύοντας ότι οξέωση αποτελεί σημαντικό καθοριστικό παράγοντα μικροπεριβάλλον για φαινότυπο όγκου αλλοιώσεις. Αυτό οξέωση που προκαλείται από διέγερση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης που εξαρτάται χημειοαντίσταση εξαρτάται από κινάσες ΜΑΡ, ωστόσο δεν είναι σαφές πώς συμβαίνει η ενεργοποίηση αυτών των κινασών από ένα εξωκυτταρικό ρΗ μείωση [9]. Μπορεί να εξαρτάται από την ενδοκυτταρική αλλαγές του pH-ομοιόσταση και τη ρύθμιση της ως απάντηση στην εξωκυττάρια οξέωση. Επιπλέον, υπάρχουν αρκετές υποψήφιες μονοπατιών σηματοδότησης που θα μπορούσαν να συνδέσουν ρΗ αλλαγές στο ΜΑΡΚ ενεργοποίηση, π.χ. οι κινάσες ΡΚΑ, ΡΚΒ, PKC, c-Src ή EGFR [12]. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει (i) το pH-ομοιόσταση των κυττάρων του όγκου κατά τη διάρκεια μεταβολική οξέωση του μικροπεριβάλλον, (ii) οι μηχανισμοί των ERK1 /2 και p38 φωσφορυλίωση υπό αυτές τις συνθήκες και (iii) την πιθανή σχέση μεταξύ αυτές οι δύο διαδικασίες, καθώς και οι συνέπειες του επηρεάζουν αυτές τις οδούς.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Η υπογραμμή ΑΤ1 του R-3327 αρουραίου Dunning καρκίνωμα του προστάτη χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) στους 37 ° C κάτω από

2 ατμόσφαιρα και υπο καλλιεργούνται δύο φορές την εβδομάδα σε υγροποιημένη 5% CO. LS513 κύτταρα (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA? CRL-2134) αναπτύχθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες όπως ΑΤ1 κύτταρα. OK κύτταρα (φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από νεφρική εγγύτατο σωληνάριο του νεφρού opossum) [13] και τα κύτταρα NCI-H358 (ανθρώπινο καρκίνωμα βρογχοκυψελιδικού? American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA? CRL-5807) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% FCS, τα κύτταρα MDCK-C7 (φυσιολογική νεφρική αγωγός συλλογής επιθήλιο κύτταρα του σκύλου) [14] σε μέσο ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS και τα κύτταρα CHO (αθανατοποιημένα κύτταρα ωοθηκών του κινεζικού χάμστερ) [15] σε Ham F-12 μέσο συμπληρωμένο με 10% FCS. Για όλα τα πειράματα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία Petri (Western Blot) ή καλυπτρίδες (μέτρηση του pH

i) και μεταφέρθηκε σε μέσο χωρίς επιπλέον συμπλήρωμα FCS για 24 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου εκτέθηκαν σε διττανθρακικό HEPES ρυθμισμένο διάλυμα Ringer ρυθμισμένο σε ρΗ 7,4. Η ενδοκυτταρική οξέωση προκλήθηκε αντικατάσταση 40 mM NaCl με 40 mM γαλακτικού οξέος και αναγωγή του χλωριούχου με εντελώς αντικαθιστώντας NaCl με το γλυκονικό νάτριο (7,4 mM υπολειμματικό χλωρίδιο). Εξωκυττάριο οξέωση (pH 6,6) εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας διττανθρακικό-MES (μορφολινοαιθανοσουλφονικό οξύ) ρυθμιστικό διάλυμα Ringer ρύθμιση του pH στο 6,6. Το ρυθμιστικό ικανότητα (β) είναι 5.9 mmol /lxΔpH για την διττανθρακικό-HEPES ρυθμισμένο διάλυμα Ringer σε ρΗ 7,4 και 3,9 mmol /lxΔpH για την διττανθρακικό-MES ρυθμισμένο διάλυμα Ringer.

Πειραματικό

ρύθμισης

Μετά την εξάντληση του ορού για 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα από τα προαναφερθέντα ρυθμιστικά (1 ml) για έως και 3 ώρες. Όλοι οι αναστολείς ή ενεργοποιητές που χρησιμοποιούνται προστέθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου επώασης.

κυτοσολίου ρΗ

κυτοσολίου ρΗ απλών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την ευαίσθητη στο ρΗ BCECF χρωστική (2 ‘, 7’-δις- ( 2-καρβοξυαιθυλο) -5- (και-6) -καρβοξυφλουορεσκεϊνη, ακετοξυμεθυλ εστέρα, Invitrogen, Paisley, UK) όπως περιγράφεται προηγουμένως [16], [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα Ringer που περιέχει 5 μΜ ΒΟΕΟΡ-ΑΜ για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν 2 φορές με διάλυμα επιπότισης για να απομακρυνθεί η περίσσεια της βαφής και μεταφέρθηκε στο στάδιο ενός ανεστραμμένου Axiovert 100 TV μικροσκόπιο (Zeiss, Oberkochen, Germany). Τα μήκη κύματος διέγερσης ήταν 450 nm /490 nm, εκπεμπόμενο φως μετρήθηκε μέσω ενός ζωνοπερατού φίλτρου (515-565 nm). Ο ρυθμός συλλογής δεδομένων ήταν ένας λόγος έντασης φθορισμού κάθε 10 s. Μετά την αφαίρεση του υποβάθρου, υπολογίστηκαν φθορισμού αναλογίες ένταση. βαθμονόμηση ρΗ διεξήχθη μετά από κάθε πείραμα με νιγερικίνη (Sigma, St. Louis, USA) τεχνική [18], [19] χρησιμοποιώντας ένα βαθμονόμησης δύο σημείων (ρΗ 6,8 και 7,5). Τα διαλύματα βαθμονόμησης περιείχαν 132 mM KCl και 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM ΜαΟΙ

2, 10 mM HEPES και 10 μΜ νιγερισίνη.

όγκος κυττάρων

Η επίδραση της οξέωσης σχετικά με τον όγκο των κυττάρων προσδιορίστηκε ηλεκτρονικά με ένα μετρητή κυττάρων Casy (Innovatis, Reutlingen, Γερμανία). Ως εκ τούτου, τα κύτταρα επωάστηκαν όπως αναφέρθηκε παραπάνω, ανεξάρτητο από θρυψινοποίηση και τον όγκο των κυττάρων και η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από 10 λεπτά ή 3 h στις αντίστοιχες λύσεις Ringer.

κηλίδος Western

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Τα κύτταρα λύθηκαν (0.1% Triton Χ-100 σε PBS, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, 37 mg /l ορθοβαναδικό νάτριο ή 150 mM NaCl, 10 mM Tris ρΗ 7.4, 1% Nonidet Ρ-40, 0.1% SDS, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% Triton Χ-100, 1 mM EDTA, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, 184 mg /l ορθοβαναδικό νάτριο), κυτταρικής πρωτεΐνης καθορίζεται από την BCA-Methode (BC Δοκιμασία Αντιδραστήρια από Uptima), διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης . Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα ειδικά για ERK1 /2, p38, ΜΚΚ3 /6? φωσφο-ERK1 /2, φωσφο-ρ38, φωσφο-ΜΚΚ3 /6, CREB και φωσφο-CREB (1:1000, Cell σηματοδότηση). Το δεσμευμένο πρωτογενές αντίσωμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο και το σύστημα ECL (Pierce /Thermo Fisher Scientific) με τον Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Biorad, Μόναχο, Γερμανία). Ποσοτική ανάλυση έγινε με Ποσότητα Ένα λογισμικό (Biorad).

CRE-SEAP γονίδιο αναφοράς δοκιμασία

Μετενεργοποίησης εκτιμήθηκε από το σύστημα προσδιορισμού γονιδίου Mercury ™ Διαδρομή προφίλ δημοσιογράφος από την Clontech Inc. χρησιμοποιώντας εκκριτική αλκαλική φωσφατάση (SEAP) υπό τον έλεγχο του ορίζεται στοιχείων απόκρισης cis-ρυθμιστικών (CRE) ως ρεπόρτερ, ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], [21]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια pCRE-SEAP κατασκευάσματα ή κενούς φορείς. SEAP-δραστηριότητα στα μέσα ενημέρωσης προσδιορίστηκε με το Σύστημα AttoPhos® από Promega (Mannheim, Γερμανία) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο επιμόλυνσης (β-γαλακτοσιδάση).

απελευθέρωση LDH

LDH δραστηριότητα σε μέσα μαζικής ενημέρωσης και σε προϊόντα λύσης κυττάρου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τυποποιημένο πρωτόκολλο [22] προσαρμοστεί σε χαμηλότερα κλίμακα (200 μΙ) σε ένα πολλαπλών φρεατίων αναγνώστη (άπειρη, Tecan, Βερολίνο).

Caspase-3-δραστικότητα

Cells πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα PBS (4 ° C) και επωάστηκαν με 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης (10 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% Triton Χ-100, ρΗ 7,5) για 10 λεπτά επί πάγου, συλλέχθηκαν, και φυγοκεντρήθηκε στις 16,000§ για 10 λεπτά στους 4 ° C. 60 μΙ του υπερκειμένου επωάστηκε με 65 μΐ ​​ρυθμιστικού αντίδρασης (20 mM PIPES, 4 mM EDTA, 0.2% CHAPS, 10 mM DTT, ρΗ 7.4) που περιέχει 42 μΜ DEVD-AFC (τελική συγκέντρωση) στους 37 ° C, και ο φθορισμός του το διασπασμένο προϊόν, 7-αμινο-4-τριφθορομεθυλοκουμαρίνη (AFC), μετρήθηκε στα 400 nm διέγερση και 505 nm μήκος κύματος εκπομπής χρησιμοποιώντας πολλές εκβαθύνσεις μετρητή (άπειρη, Tecan, Βερολίνο). Διασπασμένου AFC ποσοτικά με μια καμπύλη βαθμονόμησης με τη χρήση γνωστών συγκεντρώσεων AFC. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (Interchim, Montluçon, France) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο.

Προσδιορισμός εξωκυτταρικής pH, γλυκόζη και γαλακτικό

ρΗ μετρήθηκε με ένα αναλυτή αερίων αίματος (ABL5, Radiometer, Κοπεγχάγη, Δανία). Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της γλυκόζης, η γλυκόζη (HK) κιτ δοκιμασίας από την Sigma (G3293) χρησιμοποιήθηκε (δείγμα 2 ή 5 μΙ, αντίστοιχα, συν 200 kit μΐ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το γαλακτικό προσδιορίσθηκε με τη χρήση γαλακτικού αντιδραστήριο (τριάδα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (δείγμα 10 μΙ συν 100 kit μΙ). Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον εις τριπλούν.

σχηματισμό ROS

σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) εκτιμήθηκε με τη φθορίζουσα χρωστική DCFDA-ΑΜ (Molecular Probes, Leiden, Ολλανδία) που αντιδρά με αύξηση του φθορισμού με την παρουσία H

2O

2 μόλις ο δεσμός εστέρα έχει διασπαστεί από την κυτταρική εστεράσες. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και επωάστηκαν για 30 λεπτά με βαφή μετά τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές. Στη συνέχεια, ο φθορισμός (διέγερση 485 nm? Εκπομπή 535 nm) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή με πολλές εκβαθύνσεις (άπειρη, Tecan, Βερολίνο, Γερμανία). Επιπλέον κενό αξιών χωρίς κύτταρα και τις τιμές του τυφλού χωρίς χρωστική προσδιορίστηκαν και αφαιρείται. Η αύξηση του φθορισμού πάνω από το κενό αξίας εκφράζονται ανά mg πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε ως ένα μέτρο για το σχηματισμό ROS.

Προσδιορισμός της μιτοχονδριακής δραστηριότητας

Για να εκτιμηθεί μιτοχονδριακή δραστηριότητα, προσδιορίσαμε τη συσσώρευση της ροδαμίνης 123 μετά από έκθεση σε ρΗ 7,4 ή ρΗ 6,6. Μετά την έκθεση 3 ώρες τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά με 0.1 μΜ ροδαμίνη 123 σε διάλυμα HEPES-Ringer, καθώς και με την παρουσία 20 μΜ CCCP ή 2 μΜ νιγερισίνη [23], [24]. Στο τέλος τα κύτταρα λύθηκαν με 0.1% Triton Χ-100 και την κυτταρική φθορισμός προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή με πολλές εκβαθύνσεις (άπειρη, Tecan, Βερολίνο). Μιτοχονδριακή πρόσληψη της ροδαμίνης 123 εμποδίζεται με την παρουσία CCCP επειδή Ψ

m καταρρέει. Αντίθετα, μιτοχονδριακή πρόσληψη ροδαμίνη 123 είναι μέγιστη σε παρουσία νιγερικίνη, η οποία καταρρέει το βαθμιαίο ρΗ κατά μήκος της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Κατά συνέπεια το σύνολο της ενέργειας από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων μετατρέπεται σε Ψ

m. Έτσι, η πρόσληψη της ροδαμίνης 123 σε παρουσία νιγερισίνη μείον πρόσληψης της ροδαμίνης 123 σε παρουσία CCCP αντιπροσωπεύει ένα ακατέργαστο εκτίμηση της μιτοχονδριακής δραστικότητας και εξαλείφει τυχόν μη ειδικά αποτελέσματα. Η πρόσληψη της ροδαμίνης 123 ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει γνωστές συγκεντρώσεις της ροδαμίνης 123.

Υλικά