Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι γενετικές παραλλαγές μπορεί να επηρεάσει αλληλεπίδραση microRNA-στόχου μέσω διαμορφώνουν συγγένεια πρόσδεσης τους, τη δημιουργία ή την καταστροφή των τόπων miRNA-δεσμευτική. SET8, ένα μέλος του συνόλου περιέχει την περιοχή μεθυλοτρανσφεράσης, έχει εμπλακεί σε μια σειρά ποικιλία βιολογικών διεργασιών

Μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας Taqman δοκιμασία, είμαστε ο γονότυπος ενός πολυμορφισμού rs16917496 T & gt?. Γ εντός της miR-502 θέση πρόσδεσης στην 3′-αμετάφραστη περιοχή του

SET8

γονιδίου σε 576 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς. Λειτουργίες του rs16917496 διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης και επικυρώνεται από ανοσοχρώση.

Αποτελέσματα

Log-rank test και Cox παλινδρόμησης έδειξε ότι το CC γονότυπο σχετίστηκε με μεγαλύτερη επιβίωση και μειωμένο κίνδυνο θάνατο για NSCLC [58,0 έναντι 41,0 μήνες,

P

= 0,031? αναλογία κινδύνου = 0,44, 95% εμπιστευτικά διάστημα: 0,26 – 0,74]. Περαιτέρω ανάλυση σταδιακή υποχώρηση πρότεινε rs16917496 ήταν ανεξάρτητα ευνοϊκό παράγοντα για την πρόγνωση και η προστατευτική επίδραση πιο εμφανή σε μη καπνιστές, ασθενείς χωρίς διαβήτη και ασθενείς που έλαβαν χημειοθεραπεία. Μια σημαντική αλληλεπίδραση παρατηρήθηκε μεταξύ rs16917496 και το κάπνισμα σε σχέση με NSCLC επιβίωση (

P

& lt? 0.001). δοκιμασία δραστηριότητας λουσιφεράσης έδειξε ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης για το C αλληλόμορφο σε σύγκριση με το Τ αλληλόμορφο, και το miR-502 είχε μια επίδραση στη διαμόρφωση των

SET8

γονίδιο

in vitro

. Ο γονότυπος CC συσχετίσθηκε με την έκφραση της πρωτεΐνης μειωμένη SET8 βασίζεται σε ανοσοχρώση των 192 δειγμάτων ιστού ΜΜΚΠ (

P

= 0,007). Χαμηλότερα επίπεδα SET8 σχετίστηκαν με μη σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση (55,0 έναντι 43,1 μήνες)

Συμπέρασμα

Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι η rs16917496 T & gt?. C που βρίσκεται στο miR-502 θέση πρόσδεσης συμβάλλει στην NSCLC επιβίωσης, μεταβάλλοντας την έκφραση SET8 μέσω ρύθμισης της αλληλεπίδρασης miRNA-στόχο

Παράθεση:. Xu J, Γιν Ζ, Gao W, Liu L, Yin Υ, Liu P, et al. (2013) γενετική παραλλαγή σε ένα microRNA-502 Minding ιστοσελίδας στο

SET8

γονίδιο προσδίδει κλινική έκβαση της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε ένα κινεζικό πληθυσμό. PLoS ONE 8 (10): e77024. doi: 10.1371 /journal.pone.0077024

Επιμέλεια: Rui Medeiros, IPO, Inst Λιμάνι Ογκολογίας, Πορτογαλία

Ελήφθη: 2 Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 11, Οκτωβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172140, 81272532), η προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (JX10231801) και επαρχία Jiangsu Κλινική προγράμματα επιστήμης και τεχνολογίας (Clinical Research Center, BL2012008). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο, λόγω της υψηλής επίπτωσης της, κακοήθη συμπεριφορά και η έλλειψη σημαντικών εξελίξεων στην στρατηγική θεραπείας. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των περιπτώσεων του καρκίνου του πνεύμονα, με λιγότερο από 15% των ασθενών επιβιώνουν πάνω από 5 έτη [1], [2]. Η ανακάλυψη και η εφαρμογή των ειδικών προγνωστικών βιοδεικτών εκτός από το πρότυπο όγκου, λεμφαδένα, και μετάσταση (TNM) σύστημα σταδιοποίησης μπορεί να βελτιώσει την ιατρική φροντίδα των ασθενών με NSCLC [3]. Παρά τις έντονες προσπάθειες [4], [5], [6], εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη ειδικών βιοδεικτών για την πρόβλεψη του καρκίνου του πνεύμονα πρόγνωση. Ένα ιδανικό βιοδείκτη θα πρέπει να είναι εύκολο να ανιχνευθούν, σταθερή και επαναλήψιμη. Γενετικές παραλλαγές σε ασθενείς με καρκίνο θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικοί δείκτες της κλινικής έκβασης.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία από μικρά (~20-22 nt) μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης του 3 ‘ -untranslated περιοχής (3’UTR) στοχευμένων mRNA [7]. Εκτιμάται ότι περίπου το 30% των ανθρώπινων γονιδίων είναι μεταγραφικής ή μετα-ρυθμίζονται από miRNAs. Ως αποτέλεσμα, οι miRNAs εμπλέκονται σε κρίσιμες βιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης και του πολλαπλασιασμού [8], [9]. Πρόσφατες μελέτες έχουν καταδείξει τα απορυθμισμένη πρότυπα έκφρασης miRNA σε διάφορες μορφές καρκίνου, υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο της miRNAs στην έναρξη, την εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου ανθρώπινου [10], [11]. έχουν προφίλ έκφρασης miRNA και ειδικών miRNAs έχουν δειχθεί να συνδέσει με την επιβίωση μιας ποικιλίας καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [12], [13], [14]. πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) σε προ-miRNA ή ώριμες ακολουθίες miRNA και miRNA-θέσεις σύνδεσης μπορεί να διαμορφώνεται τις αλληλεπιδράσεις miRNA-στόχου μέσω αλλάζοντας την έκφραση των miRNAs, ωρίμανση, καταστροφή ή τη δημιουργία των χώρων miRNA-δέσμευσης, με αποτέλεσμα την απορρύθμιση του γονιδίου-στόχου έκφραση [15], [16], [17]. Αυτό το είδος των πολυμορφισμών έχουν εμπλακεί σε ευαισθησίας στον καρκίνο, την ευαισθησία σε χημειοθεραπεία και πρόγνωση [16], [18], [19], [20]. Μεταξύ αυτών των miRNA-θέση πρόσδεσης SNPs είναι το ένα βρίσκεται μέσα στο χώρο πρόσδεσης miR-502 στην 3’UTR του μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών

SET8

γονίδιο [21].

SET8

(επίσης γνωστό ως PR-SET7 /SETD8 /KMT5A? εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 12q24.31), ένα μέλος της οικογένειας SET μεθυλοτρανσφεράση τομέα περιέχουν κυρίως στόχευση H4K20 για μονομεθύλωσης [22], [23], έχει εμπλακεί σε μια ποικιλία συστοιχία των βιολογικών διεργασιών, όπως μεταγραφική ρύθμιση [24], [25], σχηματισμός ετεροχρωματίνης [26], γονιδιωματική σταθερότητα [27], [28], την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη [28], [29], [30 ], [31], [32]. Πρόσφατα, Shi et al. [33] δείχνουν μια δραστηριότητα για SET8 ως methylatransferase ρ53 και Yang et al. [34] απεκάλυψε μία νέα ρόλο για SET8 σε εισβολή όγκου και μετάσταση. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν έναν πολυμορφισμό rs16917496 Τ & gt? C, η οποία βρίσκεται εντός της θέσης δέσμευσης miR-502 σε

SET8

3’UTR (Σχήμα 1Α), ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης SET8, και συμβάλλει έτσι στον καρκίνο του μαστού και καρκίνο των ωοθηκών ευαισθησία και κλινική έκβαση ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [35], [36], [37].

(Α) Η συμπληρωματικότητα ακολουθία έχει-miR-502 και

SET8

3’UTR είναι που παρουσιάζονται εδώ. (Β) άμεση αλληλούχιση και Σχηματικό διάγραμμα των κατασκευών ρεπόρτερ που περιέχει 1650 bp 3’UTR του

SET8

με rs16917496 Τ ή C αλληλόμορφο. (C) έκφραση λουσιφεράσης κατασκευασμάτων που περιέχουν rs16917496 Τ ή C αλλήλιο σε Α549 και 293Τ κύτταρα. Κάθε διαμόλυνση εκτελέστηκε με pRL-SV40 πλασμιδίων ως κανονικοποιημένη ελέγχους.

πλασμίδια SET8

3’ΙΙΤΡ αναφοράς της λουσιφεράσης συνεπιμολύνθηκαν με χημικά συντίθεται ώριμη HSA-miR-502, με ή χωρίς το miR-502 αναστολείς σε κυτταρικές σειρές Α549 και 293Τ. 3’UTR, 3′-αμετάφραστη περιοχή.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, ο γονότυπος rs16917496 σε ασθενείς με NSCLC να αποδείξει ότι αυτή η SNP είναι μια σημαντική γενετική παραλλαγή για την πρόβλεψη της επιβίωσης. Εμείς επικυρωθεί επίσης ότι το SNP rs16917496 σχετιζόταν με

SET8

έκφραση μέσω επηρεάζουν miR-502 σύνδεση με

SET8

3’ΙΙΤΡ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλοι οι συμμετέχοντες ήταν εθελοντική και θα ολοκληρώσει την ενημερωμένη συγκατάθεση σε γραπτή προτού λάβει μέρος σε αυτή την έρευνα.

Πληθυσμός μελέτης

Όλα τα θέματα που είχαν προσληφθεί από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing (Jiangsu, Κίνα ) μεταξύ Ιανουαρίου 2004 και Σεπτεμβρίου 2012. Όλοι οι ασθενείς που διαγνώστηκαν πρόσφατα, ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε και χωρίς προηγούμενο ιστορικό άλλων μορφών καρκίνου ή προηγούμενη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Όλα τα θέματα που είχαν σχέση εθνοτική πληθυσμού Κινέζων Χαν. Μετά από γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε, ένα δομημένο ερωτηματολόγιο σχετικά με τα δημογραφικά στοιχεία και την ιστορία περιβαλλοντικής έκθεσης, όπως η ηλικία, το φύλο και την κατανάλωση του καπνίσματος, χορηγήθηκε μέσω πρόσωπο με πρόσωπο συνεντεύξεις από εκπαιδευμένους ερευνητές. Κάθε ασθενής δωρεά των 5 ml φλεβικού αίματος για την εκχύλιση γενωμικού DNA. Τα υποκείμενα με χαμηλή συχνότητα (& lt? 1 τσιγάρο ανά ημέρα) και διάρκεια (& lt? 1 έτος) από το κάπνισμα ορίστηκαν ως μη καπνιστές? όλοι οι άλλοι είχαν χαρακτηριστεί ως καπνιστών. Παρακολούθηση πραγματοποιήθηκε κάθε 3 μήνες από τη στιγμή της εγγραφής τους μέχρι το θάνατο ή την τελευταία προγραμματισμένη παρακολούθησης (τελευταία παρακολούθηση, τον Φεβρουάριο του 2013). Έχουμε επιλέξει τις ασθενείς με πλήρη παρακολούθηση-ups και επαρκές δείγμα DNA. Ως αποτέλεσμα, 576 ασθενείς με NSCLC είχαν συμπεριληφθεί και ο γονότυπος στη μελέτη μας. Η maximun χρόνος παρακολούθησης ήταν 102 μήνες (τελευταία παρακολούθηση, τον Φεβρουάριο του 2013) και η διάμεση χρόνος παρακολούθησης ήταν 18,0 μήνες.

Γονοτυπικές

Το γονιδιακό DNA του κάθε θέματος εκχυλίζεται με μια συνήθης μέθοδος [38]. δοκιμασία διάκριση αλληλόμορφων TaqMan επιλέχθηκε για τον προσδιορισμό του γονότυπου χρησιμοποιώντας σύστημα ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primer και ο ανιχνευτής είναι: προς τα εμπρός, TTTATGATGACAAATAATTTTCAAGTT, αντίστροφη, AATGTGAGACACAATGTCTTGATTATA και FAM-TTTATTTCCTTGTTTAAA-MGB, HEX-TTTATTTCCTTATTTAAAT-MGB. Ο προσδιορισμός του γονότυπου περιλάμβανε δύο κενές (νερό) ελέγχους σε κάθε μορφή 384-καλά και περισσότερο από το 10% των δειγμάτων επιλέχθηκαν τυχαία για ανάλυση επανάληψη, δίνοντας το 100% συμφωνία.

Κατασκευή Reporter πλασμιδίων

Από μια σημαντική συσχέτιση αργότερα παρατηρήθηκε για rs16917496 T & gt? C πολυμορφισμός και την επιβίωση NSCLC, κατασκευάσαμε δύο πλασμίδια αναφοράς περιέχουν rs16917496 Τ ή rs16917496 C αλληλόμορφο να καθοριστεί αν αυτός ο πολυμορφισμός είχε καμία επίδραση στη γονιδιακή έκφραση του (Εικόνα 1Β). Το κατασκεύασμα ανταποκριτή αλληλόμορφο Τ ήταν συνθετικά χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το προϊόν και pMIR-ΕΚΘΕΣΗ ™ (Appied Biosystems) διάνυσμα με renilla και λουσιφεράση πυγολαμπίδας γονιδιακές αλληλουχίες αποκόπηκαν με τη χρήση

ΜΙυ

Ι και

Sac

Ι (ΕΕΦ) και στη συνέχεια συνδέθηκε με Τ4 DNA λιγάση (ΡΆΜΦΟΣ). Το αλληλόμορφο C του rs16917496 παραχθεί με τη τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση kit (Takara, Berkeley, CA, USA) με προς τα εμπρός μεταλλαξιογόνο εκκινητή 5′-AAAGAAgAAGGAACTAGGTCAAAAATCTGTCC-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5’μεταλλαξιογόνο-TAGAGCAAAAAGAACTTTTACCTCGGCATC-3’, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή . Όλα τα κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εξακριβώθηκαν κατευθύνοντας αλληλουχίας (Σχήμα 1 Β)

RNA Παρεμβολές, παροδικές επιμολύνσεις και λουσιφεράσης Δοκιμασίες

Το rs16917496 T & gt?. C πολυμορφισμός που βρίσκεται στη θέση σύνδεσης του ΜΙΚ 502 (Σχήμα 1Α). Έτσι, εφαρμόσαμε τη μιμούνται και αναστολέας αυτού του miRNA που συντίθεται από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα) για να δείξει την επίδρασή τους στο γονίδιο αναφοράς pMIR-SET8 in vitro. Τα κύτταρα Α549 και 293Τ διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Carlsbad, CA, USA) και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε επωαστή 37 ° C συμπληρωμένο με 5% CO

2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με το

SET8

3’UTR λουσιφεράσης πλασμίδια (διαφορετικά αλληλόμορφα) και miR-502 mimcs με ή χωρίς miR-502 αναστολείς χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο (Invitrogen). Το πλασμίδιο pRL-SV40 (Promega, Madison, WI, USA) επίσης επιμολυσμένα ως ομαλοποίηση ελέγχου. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης με σύστημα προσδιορισμού Dual-Luciferase Reporter (Promega). Ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν έγιναν για κάθε πλασμίδιο κατασκεύασμα.

Ανοσοϊστοχημεία

Η έκφραση των πρωτεϊνών SET8 στον καρκίνο του πνεύμονα ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Τα πλακίδια παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μία autoimmunostainer Ventana (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) και ένα αντι-SET8 αντίσωμα (Abcam, Cambridge, UK). Ανίχνευση χρησιμοποιηθούν Polymer-HRP, με 3,3-διαμινοβενζιδίνη. Διαφάνειες έγιναν ορατά σε 40 × με ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse.

Οι τομές εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν από δύο παθολόγους που τύφλωσε με τα αποτελέσματα του γονότυπου. Αμφιλεγόμενες περιπτώσεις επαναξιολογούνται από κοινού έως ότου επιτεύχθηκε συναίνεση. Για σύγκριση των αποτελεσμάτων χρώσης, τα δείγματα βαθμολογήθηκαν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία ιστολογική βαθμολογία (H-score). Η ένταση της πυρηνικής ανοσοδραστικότητας των κυττάρων του όγκου (1, κανένας ή αδύναμη? 2, μέτρια? Και 3, έντονη) πολλαπλασιάστηκε με το ποσοστό των θετικών νεοπλασματικών κυττάρων (1-100), λαμβάνοντας έτσι τιμές από 0 έως 300. SET8 έκφραση κατηγοριοποιήθηκε όπως υψηλή (στο ή πάνω από τη μέση τιμή H-score) ή χαμηλή (κάτω από τη μέση τιμή H-score).

Στατιστική Ανάλυση

Hardy-Weinberg ισορροπία αξιολογήθηκε από καλοσύνη, της -ταιριάζει χ

2 τεστ. Συνολική επιβίωση (OS) υπολογίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ της πρώτης θεραπείας και το θάνατο ή την τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία. Συσχέτιση μεταξύ ποσοστού γονότυπο και την επιβίωση εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. Ο μέσος χρόνος επιβίωσης (MST) υπολογίστηκε, και ο μέσος χρόνος παρουσιάζεται όταν δεν μπορεί να υπολογίζεται η διάμεσος χρόνος. Αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλα πραγματοποιήθηκαν για την εκτίμηση των λόγων κινδύνου (HR) και 95% εμπιστευτικά διαστήματα τους (ΠΙ) για το OS. Η

P

αξία για τη δοκιμή ετερογένειας βασίστηκε στη χ

δοκιμή Q 2-based. Η στατιστική ισχύς υπολογίστηκε με τη χρήση του λογισμικού PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η διαφορά στα επίπεδα λουσιφεράσης έκφρασης του γονιδίου αναφοράς. Η κατανομή των βαθμών έκφρασης IHC για κάθε

SET8

γονότυπο συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας ένα χ

2 τεστ. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 18.0 (SPSS Inc.), και

P

& lt? 0,05 σε δύο-side δοκιμή θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

τα χαρακτηριστικά της μελέτης Πληθυσμός

τα δημογραφικά χαρακτηριστικά και κλινικές πληροφορίες των ασθενών και τη σύνδεση με το OS φαίνονται στον πίνακα 1. Η μέση ηλικία κατά την διάγνωση ήταν 60 έτη (εύρος, 29-86), και υπήρχαν 380 άνδρες (66,0%) και 267 καπνιστές (46,4%). Μεταξύ αυτών των ασθενών, 381 (66,2%) ήταν αδενοκαρκινώματα, 166 (28,8%) ήταν καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, και οι άλλοι (29 ασθενείς, 5,0%) ήταν μεγάλων κυττάρων, μη διαφοροποιημένα και μικτών κυττάρων καρκινωμάτων. Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης, 206 ασθενείς πέθαναν από NSCLC. το κάπνισμα, το κλινικό στάδιο και χειρουργική επέμβαση, αλλά όχι σε χημειοθεραπεία ή στοχευμένη κατάσταση θεραπείας, συσχετίστηκε σημαντικά με τον χρόνο επιβίωσης (όλα τα log-rank P & lt? 0.001). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ασθενείς με διαβήτη (MST, 54,9 μήνες) είχαν 42% μειωμένο σημαντικά τον κίνδυνο θανάτου (HR = 0,58, 95% CI: 0,35 – 0,97), σε σύγκριση με άτομα χωρίς διαβήτη (MST, 42,0 μήνες)

Επίδραση του SET8 3’ΙΙΤΡ rs16917496 T & gt? C πολυμορφισμός σε NSCLC επιβίωση

ο γονότυπος συχνότητες των rs16917496 ήταν σε ισορροπία Hardy-Weinberg (

P

= 0.272). Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, το αλληλόμορφο C βρέθηκε να είναι το έλασσον αλληλόμορφο συχνότητα [21], [35], [36], [37]. Δοκιμασία log-rank ανίχνευσε μια σημαντική συσχέτιση της rs16917496 με NSCLC επιβίωση σε διαφορετικά γενετικά μοντέλα (

P

= 0.006, 0.031 και 0.003 για συνεπικρατούν μοντέλο, κυρίαρχο μοντέλο και υποτελούς πρότυπο, αντίστοιχα. Εικόνα 2Α). Οι ασθενείς που φέρουν το rs16917496 CC γονότυπο είχε μια βελτιωμένη OS σε σύγκριση με εκείνους με ΤΤ γονότυπο (58,0 έναντι 41,0 μηνών, HR = 0,44, 95% CI: 0,26 – 0,74). Μονοπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι αυτό το SNP ήταν ένα σημαντικό προγνωστικό δείκτη του NSCLC (κυρίαρχο μοντέλο: HR = 0,74, 95% CI: 0,56 – 0,98? Υπολειπόμενο μοντέλο: HR = 0,47, 95% CI: 0,28 – 0,79) (Πίνακας 1) . Η ένωση παραμένουν σημαντικές μετά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, ο σακχαρώδης διαβήτης, ιστολογία, κλινικό στάδιο, χειρουργική επέμβαση και η κατάσταση επεξεργασίας (κυρίαρχο μοντέλο: HR = 0,70, 95% CI: 0,53 – 0,92). Επιπλέον, μια δύναμη μελέτη του 91,7% (δοκιμή διπλής όψης, α = 0.05) έχει επιτευχθεί για την ανίχνευση ενός HR 0,70 για τους γονότυπους αλληλόμορφο C στο κυρίαρχο μοντέλο.

(Α)

SET

8 rs16917496 γονότυπο και την επιβίωση NSCLC (log-rank

P

= 0,006) σε ένα μοντέλο συνεπικρατούν. (Β) κατά Kaplan-Meier για την επιβίωση του συνδυασμού

SET8

γονότυπους και την κατάσταση καπνίσματος σε NSCLC επιβίωση (log-rank

P

& lt? 0.001). 0, οι ασθενείς με κοινή γονότυπο (ΤΤ) και ποτέ το κάπνισμα? 1, εκείνοι με την παραλλαγή γονότυπους (CT ή CC) και ποτέ το κάπνισμα? 2, τα άτομα με κοινά γονότυπο, αλλά χωρίς το κάπνισμα? 3, εκείνοι με την παραλλαγή γονότυπους και χωρίς το κάπνισμα. (C) χαμηλή έκφραση? (D) υψηλή έκφραση. Τα κύτταρα με ένα καφέ-βάφονται πυρήνας θεωρείται ως θετική. Αρχική μεγέθυνση: × 200. NSCLC, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα.

Η

Για να βρείτε ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες, έχουμε ακόμη έκανε μια πολυπαραγοντική κλιμακωτή ανάλυση παλινδρόμησης Cox με επιλεγμένα δημογραφικά χαρακτηριστικά, τα κλινικά χαρακτηριστικά και το γονότυπο SET8 για NSCLC επιβίωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

SET8

rs16917496 πολυμορφισμό (

P

= 0.014) ήταν παρέμειναν στο τελικό μοντέλο πρόβλεψης μαζί με το κάπνισμα, ο σακχαρώδης διαβήτης και η χειρουργική επέμβαση (

P

= 0.006, 0.018 και & lt?. 0.001, αντίστοιχα) (Πίνακας 2)

Η

διαστρωμάτωση και η αλληλεπίδρασή Ανάλυση

Η σχέση μεταξύ

SET8

rs16917496 πολυμορφισμό και την επιβίωση NSCLC αξιολογήθηκε περαιτέρω με στρωματοποιημένη ανάλυση της κατάστασης κάπνισμα, ο σακχαρώδης διαβήτης, ιστολογία, κλινικό στάδιο, χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και στοχευμένη κατάσταση θεραπεία. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, η προστατευτική επίδραση της παραλλαγής γονότυπων του

SET8

rs16917496 ήταν πιο εμφανή σε μη καπνιστές (προσαρμοσμένη HR = 0,54, 95% CI: 0,35 – 0,83), οι ασθενείς χωρίς διαβήτη (προσαρμοσμένη HR = 0,70 , 95% CI: 0,53 – 0,94), οι ασθενείς που έλαβαν χημειοθεραπεία (προσαρμοσμένη HR = 0,69, 95% CI: 0,51 – 0,92), αλλά όχι στοχευμένη θεραπεία (προσαρμοσμένη HR = 0,52, 95% CI: 0,24 – 1,02). δοκιμή ετερογένειας έδειξε ότι η ετερογένεια σε κάθε δύο στρώματα ήταν σημαντικές για το κάπνισμα (

P

= 0,016). Ως εκ τούτου, η ανάλυση της αλληλεπίδρασης κατάστασης του γονιδίου κάπνισμα διεξήχθη (Πίνακας 4), και υπήρξε μια στατιστικά σημαντική πολλαπλασιαστική αλληλεπίδραση μεταξύ των γονότυπων της rs16917496 και το κάπνισμα σε NSCLC επιβίωση (

P

για πολλαπλασιαστική αλληλεπίδραση & lt? 0.001 ). Σε σύγκριση με τους καπνιστές με rs16917496 ΤΤ γονότυπο, ποτέ καπνιστές με CT γονότυπους CC + είχαν σημαντικά μειωμένο κίνδυνο θανάτου (προσαρμοσμένη HR = 0,50, 95% CI: 0,25 – 0,64). Kaplan-Meier για την επιβίωση του συνδυασμού

Οι SET8

γονότυπους και την κατάσταση καπνίσματος σε NSCLC-ειδική επιβίωση φαίνεται στο Σχήμα 2Β.

Η

Επίδραση του SET8 3’UTR rs16917496T & gt? C πολυμορφισμός στην έκφραση SET8

Η rs16917496 T & gt? C πολυμορφισμός που βρίσκεται στο χώρο πρόσδεσης του miR-502 (Εικόνα 1Α). Όπως είχε προβλεφθεί, χρησιμοποιώντας RNAhybrid [39], miR-502 έχει υψηλότερη ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE) με αλληλόμορφο C (| MFE | = 16.2 kcal /mol) της rs16917496 στο

SET8

από ότι με το Τ αλληλόμορφο (| MFE | = 14.5 kcal /mol). Έτσι, υποθέσαμε το αλληλόμορφο παραλλαγή C μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση του

SET8

προέκυψε από την αυξημένη καταστολή miRNA. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, δύο κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχονται rs16917496 Τ ή αλληλόμορφο C δημιουργήθηκαν για να προσδιοριστεί αν αυτή η SNP θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του γονιδίου (Σχήμα 1 C). Η δραστηριότητα μεταγραφή του γονιδίου αναφοράς με rs16917496 C αλληλόμορφο ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με το Τ αλληλόμορφο, όταν συν-επιμολυσμένα συντεθεί χημικά ώριμη miR-502 στο κελί Α549 (

P

& lt? 0.0001) και κυττάρων 293Τ (

P

= 0,002). Οι αναστολείς miR-502 θα μπορούσε να αντιστρέψει σημαντικά τις δραστηριότητες του γονιδίου αναφοράς με το αλληλόμορφο rs16917496 C (

P

& lt? 0,0001 και για τις δύο Α549 και 293Τ)? Ωστόσο, καμία εμφανής αλλαγή παρατηρήθηκε γονιδίου αναφοράς με Τ αλληλόμορφο που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς του miR-502 (

P

& gt? 0,05 και για τα δύο). Στο σύνολό τους, την ισχυρή επίδραση του miR-502 σε διαμόρφωση

SET8

και στις δύο γραμμές Α549 και κυττάρων 293Τ έδειξε ότι το miR-502 συνδέεται ειδικά με την 3’UTR του

SET8

γονίδιο με rs16917496 C αλληλόμορφο και να καταστείλει την έκφραση του

SET8

γονίδιο

in vitro

η

Σύλλογος της εκδήλωσης SET8 πρωτεΐνη με rs16917496 T & gt?. C Πολυμορφισμός και NSCLC επιβίωση

Μεταξύ των δειγμάτων αίματος 576 NSCLC, 192 είχαν επαρκή ταιριάζουν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Στη συνέχεια διερευνηθεί το καθεστώς έκφραση SET8 στον NSCLC και τη σύνδεση με rs16917496 πολυμορφισμό χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (Εικόνα 2Γ και 2Δ). SET8 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε 50,5% ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Οι ασθενείς με το

SET8

CC γονότυπο είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης SET8 από ό, τι εκείνοι με την CT ή ΤΤ γονότυπο (

P

= 0,007, Πίνακας S1), η οποία επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της λουσιφεράσης δοκιμασίες. Τα αποτελέσματα αυτά υποστήριξαν σχέση γονότυπου-φαινότυπου ότι η rs16917496 CC γονότυπο παραλλαγή εκχωρεί σε χαμηλότερη έκφραση του γονιδίου SET8 σύγκριση με CT ή ΤΤ γονότυπους. Το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με NSCLC με τα επίπεδα έκφρασης χαμηλής και υψηλής SET8 εξετάστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank. Τα άτομα με χαμηλά επίπεδα SET8 εμφανίζεται πλέον OS από εκείνους με υψηλά επίπεδα SET8 (55,0 έναντι 43,1 μήνες), αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,138).

Συζήτηση

τα microRNAs είναι μία νέα κατηγορία των μη-κωδικοποίησης RNA και έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Αναδυόμενες αποδείξεις πρότεινε ότι οι πολυμορφισμοί στο πλαίσιο sites miRNA-δέσμευσης μπορεί να επηρεάσει τη ρύθμιση miRNA να στοχεύσουν γονιδιακή έκφραση και, κατά συνέπεια, να τροποποιήσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου και τα αποτελέσματα. Για παράδειγμα, η παραλλαγή Α αλληλόμορφο του

RAP1A

rs6573 ενισχυθεί η ικανότητα δέσμευσης του miR-196a, οδηγώντας σε αυξημένη miRNA με τη μεσολάβηση

RAP1A

καταστολή, και αυτό το SNP λειτούργησε ως πιθανή προσωπική διαγνωστική δείκτης για οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [40]. Ένας SNP (rs13312986) στη θέση πρόσδεσης miRNA-629 μεταβάλλεται το

NBS1

έκφρασης και συνέβαλαν με τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα [41]. Αλληλόμορφη παραλλαγή του rs3134615 μπορεί να καταστρέψει την ικανότητα του miR-1827 για τη ρύθμιση

MYCL1

έκφρασης και αυτή η παραλλαγή συνδέθηκε με μικρό κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα [42]. Rs7180135 βρίσκεται εντός της θέσης δέσμευσης miR-197 στην 3’UTR του

RAD51

, και το ελάχιστο αλληλόμορφο αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με μια βελτιωμένη ειδική για τον καρκίνο επιβίωση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [43]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε μια SNP στη θέση σύνδεσης miR-502 της SET8

3’ΙΙΤΡ για την προβλεπτική ικανότητα του σχετικά με τα αποτελέσματα NSCLC. Δείξαμε ότι η rs16917496 T & gt? C συσχετίστηκε με NSCLC επιβίωσης σε ένα κινεζικό πληθυσμό. Η παραλλαγή αλληλόμορφο C μπορεί να μειώσει την έκφραση του

SET8

με την ενίσχυση της ικανότητας πρόσδεσης του miR-502 για να στοχεύσετε το site στο 3’UTR του

SET8

. Ο γονότυπος CC συνδέθηκε με την έκφραση της πρωτεΐνης μειωμένη SET8, το οποίο ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες σε καρκίνο του μαστού είχαν το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [35], [37]. Επιπλέον, χαμηλότερα επίπεδα SET8 συσχετίστηκαν με μεγαλύτερη επιβίωση σε NSCLC.

SET8 βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [44]. Η λειτουργία του SET8 είναι πιθανό να είναι πολύ ευρύς και έχει εμπλακεί σε παθολογικές διεργασίες όπως ογκογένεση. Έχει αναφερθεί ότι SET8 απαιτείται για την κανονική εξέλιξη S-φάσης [26], [29], ασχολείται με την μεταγραφική ρύθμιση [24], [25], η αναπαραγωγή και η σταθερότητα [26] γονιδιώματος, [27], [28] και διαμορφώνει τις proapaptotic και του κυτταρικού κύκλου λειτουργίες σύλληψης [30], [31], [33]. SET8 έχει μια καλά καθορισμένη λειτουργία στην οδό ΤΡ53 από monomethylating p53 στη λυσίνη 382 και καταστολή της ενεργοποίησης της μεταγραφής ρ53-διαμεσολαβούμενη των γονιδίων στόχων [33]. Η πιο αξιοσημείωτη λειτουργία του SET8 είναι η διαμόρφωση της δυναμικής χρωματίνη ως ένζυμο ιστόνης τροποποιητικά [45]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι επιγενετικές μεταβολές του κώδικα ιστόνης να συμβάλει στην έναρξη των πολλαπλών κακοήθειες, όπως λεμφώματα, καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και του αδενοκαρκινώματος του παχέος [46], [47]. Αυτές οι επιγενετικές μεταβολές εμφανίζονται σε πρώιμο στάδιο της καρκινογένεσης και συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης [47]. Πρόσφατα, Takawa et al. [44] απεκάλυψε μία συνάρτηση της SET8 για μεθυλίωσης της λυσίνης σε μη ιστόνης πρωτεΐνης PCNA, η οποία λειτουργεί σχετίζονται με ζωτικές κυτταρικές διεργασίες. SET8 έχει βρεθεί ότι προάγουν την καρκινογένεση από την απορύθμιση της έκφρασης PCNA. Εν τω μεταξύ, ένα νέο ρόλο για SET8 σε εισβολή όγκου και μετάσταση ιδρύθηκε από Yang et al. [34]. Απέδειξαν ότι SET8 προωθεί επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και ενισχύει την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του μαστού μέσω λειτουργικής αλληλεξάρτηση με ένα παράγοντα μεταγραφής συστροφή και μέσω της διπλής δράσης χρωματίνης αναδιαμόρφωση. Στο σύνολό τους, SET8 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου.

Η κατάσταση έκφρασης και ο ρόλος λειτουργία του miR-502 στον καρκίνο του πνεύμονα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ωστόσο, miR-502 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τα ζεύγη φυσιολογικά δείγματα ελέγχου. Η έκτοπη έκφραση του miR-502 ανέστειλε αυτοφαγία, κυτταρική ανάπτυξη και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου in vitro. MiR-502 ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματα όγκου ποντικού [48]. Το miR-502 θέση πρόσδεσης SNP rs16917496 στην 3’UTR του

SET8

, εντοπίστηκε για πρώτη φορά από τον Yu et al. [21], έχει αναφερθεί ότι συμβάλλουν στην ευπάθεια του καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών [35], [36], και την κλινική έκβαση των μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [37], [49]. Σύμφωνα με

in silico

ανάλυση με τη χρήση της βάσης δεδομένων RNAhybrid, miR-502 αναμένεται να συνδεθεί έντονα με την περιοχή-στόχο των

SET8

υπόθαλψη αλληλόμορφο C του rs16917496. δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε ότι η δραστικότητα μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς με αλληλόμορφο rs16917496 C μειώθηκε σημαντικά από εκείνη με την T αλληλόμορφο. Η κατιούσα ρύθμιση επίπεδο SET8 θα μπορούσε να οδηγήσει σε έναν αναστολέα σε ογκογένεση και την εξέλιξη. Αυτό ήταν σύμφωνο με την Ένωση προκύπτει ότι το αλληλόμορφο C του rs16917496 σχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση του NSCLC. Περαιτέρω σε βάθος οι λειτουργικές μελέτες απαιτούνται για να αποκαλύψει τον ακριβή μηχανισμό αυτής της παραλλαγής.

Είναι καλά μελετηθεί ότι το κάπνισμα είναι ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του πνεύμονα. Βρήκαμε επίσης ότι είναι μια δυσμενής προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς με NSCLC. Καρκινογόνες ουσίες στα τσιγάρα μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε υπερέκφραση της ρ53 σε πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα [50] και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης SET8 [33]. SET8 ρυθμίζει την έκφραση p53 με μεθυλίωση ρ53 σε λυσίνη 382. Η εξάντληση των SET8 αυξάνει τις προ-αποπτωτικών και το σημείο ελέγχου λειτουργιών ενεργοποίησης της p53 [33]. Εν τω μεταξύ, η rs16917496 C αλληλόμορφο μπορεί να μειώσει την έκφραση του

SET8

με την ενίσχυση της ικανότητας πρόσδεσης του miR-502 με στόχο την 3’UTR του

SET8

. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ rs16917496 και το κάπνισμα. Απαγορεύεται το κάπνισμα σε ασθενείς που φέρουν τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο C του rs16917496 έχουν σημαντικά μεγαλύτερο OS από καπνιστές ή εκείνους με τους γονότυπους ΤΤ. Είναι εύλογο ότι οι γενετικές παραλλαγές στο

SET8

γονίδιο μπορεί να τροποποιήσει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από το κάπνισμα.

Εκτός αυτού, υπήρχαν ακόμα κάποιοι περιορισμοί στη μελέτη αυτή. Πρώτον, μόνο ένα δυναμικό λειτουργικό SNP του

SET8

γονίδιο ερευνήθηκαν, η οποία δεν καλύπτει όλες τις παραλλαγές του

SET8

και περιορίζεται περαιτέρω ανάλυση απλότυπου. Δεύτερον, η μελέτη μας βασίστηκε σε ένα σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος. Παρά το γεγονός ότι παρατηρείται μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ rs16917496 πολυμορφισμό και την επιβίωση NSCLC και ένα αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ αυτού του SNP και την κατάσταση του καπνίσματος. Βιολογικές δοκιμασίες έχουν δείξει ότι rs16917496 είναι η βιολογική λειτουργική. Ως εκ τούτου, υποστήριξε ότι μας διαπίστωση ότι η παραλλαγή rs16917496 CC γονότυπο σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο θανάτου για NSCLC είναι απίθανο να επιτευχθεί κατά τύχη.

Εν ολίγοις, έχουμε επιβεβαιώσει ότι

SET8

3 ‘ UTR rs16917496 T & gt? C πολυμορφισμός μπορεί να προβλέψει την επιβίωση NSCLC των ασθενών σε ένα κινεζικό πληθυσμό. Μια λειτουργική δοκιμασία προταθεί ότι η γενετική παραλλαγή rs16917496 στη θέση σύνδεσης miR-502 θα μπορούσε να τροποποιήσει NSCLC αποτέλεσμα μέσω ρύθμισης της έκφρασης

SET8

. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν ακόμη ότι οι πολυμορφισμοί σε περιοχές miRNA-δέσμευσης μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα και μπορεί να έχουν επίδραση στην κλινική έκβαση των ασθενών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Συσχέτιση rs16917496 γονότυπο και το επίπεδο έκφρασης SET8

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077024.s001

(DOC)