Αφηρημένο

Περίπου 500.000 άτομα έχουν διαγνωστεί με καρκίνο της ουροδόχου κύστης στις ΗΠΑ απαιτούν ρουτίνα κυστοσκοπικές παρακολούθησης για την παρακολούθηση των υποτροπών ή εξέλιξης της νόσου, με αποτέλεσμα πάνω από $ 2 δισεκατομμύρια σε ετήσιες δαπάνες. Προσδιορισμός των νέων διαγνωστικών και την παρακολούθηση των στρατηγικών είναι σαφώς απαραίτητη, και δείκτες που σχετίζονται με αλλαγές μεθυλίωσης του DNA υπόσχονται πολλά λόγω της σταθερότητάς τους, αντικειμενική μέτρηση και τις γνωστές ενώσεις με την ασθένεια και με τα κλινικά χαρακτηριστικά της. Για την ταυτοποίηση νέων επιγενετικών δεικτών του επιθετικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης, χρησιμοποιήσαμε ένα υψηλής απόδοσης μεθυλίωσης του DNA χάντρα-συστοιχίας σε δύο διακριτές με βάση τον πληθυσμό σειρά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης περιστατικό (n = 73 και n = 264, αντίστοιχα). Στη συνέχεια επικυρώνονται τη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης αυτών των υποψήφιων τόπων με το βαθμό του όγκου σε ένα τρίτο του πληθυσμού (n = 245) με όξινο θειώδες Pyrosequencing των υποψήφιων τόπων. Array αναλύσεις βασίζονται εντοπίστηκαν 5 τόπους για περαιτέρω επιβεβαίωση με όξινο θειώδες Pyrosequencing. Εντοπίσαμε και επιβεβαίωσε ότι η αυξημένη μεθυλίωση υποστηρικτής του

HOXB2

είναι σημαντικά και ανεξάρτητα σχετίζονται με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης και της μεθυλίωσης του

HOXB2

,

KRT13

και

FRZB

μαζί προβλέψει σημαντικά υψηλής ποιότητας μη-διεισδυτική νόσο. Η μεθυλίωση των γονιδίων αυτών μπορεί να είναι χρήσιμα ως κλινικά δείκτες της ασθένειας και μπορούν να δείξουν γονίδια και μονοπάτια άξια συμπληρωματική εξέταση ως νέων στόχων για την θεραπευτική αγωγή

Παράθεση:. Marsit CJ, Houseman ΕΑ, Christensen π.Χ., Gagne L , Wrensch MR, Nelson HH, et al. (2010) Προσδιορισμός των Methylated γονιδίων που σχετίζονται με επιθετικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10.1371 /journal.pone.0012334

Επιμέλεια: Μιχαήλ Freitag, το Πανεπιστήμιο του Όρεγκον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 17, 2010? Αποδεκτές: 29 Ιουλίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 23 Αυγούστου, 2010

Copyright: © 2010 Marsit et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Flight Attendant Ιατρικό Ινστιτούτο Ερευνών [YCSA 052.341 σε CJM]? και το National Institutes of Health [R01CA121147, K07CA102327 και P42ES007373]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2009, εκτιμάται ότι περίπου 71.000 καρκίνους της ουροδόχου κύστης διαγνώστηκαν και μεγαλύτερη από 14.000 θάνατοι αποδόθηκαν σε αυτή την ασθένεια [1]. Η συντριπτική πλειονότητα των θανάτων να εμφανιστεί σε ασθενείς με υψηλό στάδιο περιστατικό, υψηλής ποιότητας, επιθετικοί όγκοι που διηθούν τα μυϊκή στρώματα της κύστης. Χαμηλού βαθμού, μη διεισδυτικής νόσου, από την άλλη πλευρά, μπορεί να αντιμετωπιστεί με επιτυχία, αν και αυτή η επιτυχία έρχεται σε μεγάλη οικονομική επιβάρυνση για το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης. Περίπου 500.000 ασθενείς χρειάζονται παρακολούθηση στις ΗΠΑ με αποτέλεσμα εκτιμώμενη διάγνωση στο θάνατο κόστος ανά ασθενή που κυμαίνονται από $ 96.000 έως $ 187.000, οδηγώντας έτσι σε 2,2 δις $ σε ετήσιες δαπάνες, καθιστώντας τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης η ακριβότερη όλων των καρκίνων [2], [3]. Έτσι, οικονομικά αποδοτική προγνωστικό στρατηγικές για την αξιολόγηση του συμβάντος και υποτροπιάζουσα ασθένεια θα είναι σημαντικής κλινικής χρησιμότητας.

Επιγενετική έλεγχο της έκφρασης του DNA είναι γνωστό να οδηγεί στην εμβρυϊκή ανάπτυξη διαφοροποίηση. Σε ένα παράλληλο τρόπο, σε συνεννόηση με τα γενετικά συμβάντα (μετάλλαξη, διαγραφή και ενίσχυση γονιδίου) πιστεύεται ότι επιγενετικές μεταβολές μπορεί να επισπευθεί σημαντικά παθολογικά χαρακτηριστικά των κακοήθων εκφυλισμού [4]. καρκίνος της ουροδόχου κύστης, με αποκλίνουσες κλινική (και παθολογική) φαινοτύπων του, παρουσιάζει ένα μοντέλο όγκου που μπορεί να προκύψουν από αδρανοποίηση τόπων που ελέγχουν ανεξάρτητα την τάση για εισβολή και, ως εκ τούτου, υπαγορεύουν στάδιο και βαθμό, και ότι αυτή η αδρανοποίηση μπορεί να προκύψει μέσω ποικιλίας επιγενετικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης microRNA μεταβολές [5], μετατροπές στη χρωματίνη [6], [7], και αλλαγές στο DNA μεθυλίωση [8]. Σε αυτή την περίπτωση, υπάρχουν δυνατότητες για τη χρήση των επιγενετικών αλλαγών και ιδιαίτερα DNA CpG μεθυλίωσης ως βιοδείκτες για καρκίνους της ουροδόχου κύστης, καθώς και, ενδεχομένως, για μία ποικιλία άλλων ανθρώπινων καρκίνων [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. προσεγγίσεις μικροσυστοιχιών που βασίζεται, επίσης, προσπάθησαν να προσδιορίσουν νέα γονίδια που συνδέονται με την διεισδυτική νόσο, αλλά με περιορισμένα μεγέθη δειγμάτων, λόγω της στρατηγικής της συστοιχίας που χρησιμοποιείται [15]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις προσεγγίσεις array επιτρέπουν τώρα για την εφαρμογή αυτών των τεχνολογιών με τον πληθυσμό με βάση επιδημιολογικές μελέτες του καρκίνου που χρησιμοποιούν μεγάλο αριθμό δειγμάτων [16], [17], [18]. Υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα για να χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση βασισμένη στον πληθυσμό, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης του μεροληψία, μεγαλύτερη δυνατότητα γενίκευσης των αποτελεσμάτων, καθώς και πρόσβαση σε δείγματα που εκτείνονται σε όλα τα στάδια και τους βαθμούς του όγκου. Ως εκ τούτου, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτό το array-based προσέγγιση για τον εντοπισμό κλινικά και βιολογικά ενημερωτικό μοτίβα και τα νέα γονίδια στόχοι του DNA CpG μεθυλίωσης σε μια σειρά βασισμένη στον πληθυσμό της ουροδόχου κύστης καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο.

Αποτελέσματα

προσδιορισμός των υποψήφιων τόπων

Σας χρησιμοποιηθεί μια προσέγγιση 2-βήμα για τον προσδιορισμό και την επικύρωση των τόπων που σχετίζονται με την ανάπτυξη διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα S1). Στο στάδιο 1, δύο ανεξάρτητες σειρές των όγκων (Πίνακας 1) αναλύθηκαν με συστοιχία μεθυλίωσης του DNA για τον εντοπισμό πιθανών υποψήφιων τόπων που έχουν διαφορική μεθυλίωση, και στο στάδιο 2, οι υποψήφιοι επιβεβαιώθηκαν σε μια πρόσθετη σειρά των όγκων δεν προφίλ στη συστοιχία.

σε γενικές γραμμές, υπήρξε μια γενική αύξηση στη μεθυλίωση σε επεμβατικές όγκους (Εικόνα 1Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η προσέγγιση έχει χρησιμότητα για την οριοθέτηση της αποτελεσματικής βιοδεικτών. Γενικευμένα γραμμικά μοντέλα συγκρίνοντας τα επίπεδα μεθυλίωσης του διηθητικού έναντι μη επεμβατικές όγκους σε κάθε τόπο επιβεβαίωσε αυτή την οπτική εντύπωση. Στη σειρά 1, 445 CpG θέσεις είχαν σημαντικά αυξημένη μεθυλίωση σε διηθητικά σε σύγκριση με μη-επεμβατικές όγκους (

Q

& lt? 0,05), ενώ μόνο 68 θέσεις είχε μειωθεί σημαντικά μεθυλίωσης. Ομοίως, σε σειρά 2, 606 τόποι είχαν σημαντικά αυξημένη μεθυλίωση και μόνο 41 είχαν μειωθεί σημαντικά μεθυλίωσης (Πίνακας S1). Μοντελοποίηση κάθε σειρά, ανεξάρτητα, με αναδρομικά κατανεμήθηκε μοντέλα μίγμα απέδωσε τέσσερα προφίλ μεθυλίωσης (Σχήμα 1Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σημαντικά πιο επιθετικοί όγκοι ήταν σε μεθυλίωση κατηγορία 4 (Ρ & lt? 0,00001, μετάθεση chi-square)

(Α) Scatterplot μέσες τιμές μεθυλίωσης βήτα σε μη επεμβατικές όγκους της ουροδόχου κύστης (χ-άξονας) και μέσο όρο. τιμές βήτα μεθυλίωση σε επεμβατικές όγκους (γ-άξονας) σε σειρά 1 (n = 73) και σειρά 2 (n = 264) δείγματα. (Β) Αναδρομικές μοντέλα μίγμα διχοτόμηση κάθε σειράς να οδηγήσει σε 4 κατηγορίες χωρίζονται από κόκκινες κάθετες γραμμές, με το πλάτος των κατηγοριών που αντιστοιχούν στον αριθμό των δειγμάτων σε κάθε τάξη. Loci αντιπροσωπεύονται ως σειρές με τη μέση μεθυλίωση για την κατηγορία που απεικονίζεται. Πάνω από κάθε κατηγορία είναι η επικράτηση επιθετικοί όγκοι (n επεμβατική /σύνολο n) μέσα στην τάξη. προφίλ μεθυλίωσης διακρίνει σημαντικά όγκων της ουροδόχου κύστης από μη νοσούντα επιθηλίου της ουροδόχου κύστης (Ρ & lt? 0,00001)

Η

Για να προσδιορίσετε το loci πιο σθεναρά συνδέονται με διεισδυτικής νόσου, χρησιμοποιήσαμε 3 ξεχωριστές, ευρέως εφαρμοσμένες στατιστικές προσεγγίσεις για τον εντοπισμό εκείνων. γονιδιακούς τόπους (από καθεμία από τις τρεις στατιστικές προσεγγίσεις και σε όλη την σειρά 2), που επικαλύπτονται σε διαφοροποίηση επεμβατικές και μη-διεισδυτική νόσο. Πέντε τόποι (

FRZB

_E186,

HOXB2

_P99,

KRT13

_P676,

RIPK1

_P868,

STAT5A

_P704) βρέθηκαν να συνδέονται με διεισδυτικής νόσου στις τρεις στατιστικές προσεγγίσεις.

για τέσσερις από αυτούς τους τόπους (

FRZB

,

STAT5A

,

KRT13

, και

HOXB2

), θειώδους δοκιμασίες Pyrosequencing ήταν σε θέση να σχεδιαστούν, και χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν τα ευρήματα σειρά σε ένα υποσύνολο των όγκων της ουροδόχου κύστης που εξετάστηκαν στη συστοιχία. Μια δοκιμασία Pyrosequencing για

RIPK1

δεν θα μπορούσε να σχεδιαστεί με επιτυχία. Για όλες τις θέσεις CpG που εξετάστηκαν, καθώς και τη μέση κατά μήκος χώρων για

FRZB

,

KRT13

, και

HOXB2

, παρατηρήσαμε σημαντικά μεγαλύτερη μεθυλίωση σε επεμβατικές σε σύγκριση με μη επεμβατικές όγκους, σύμφωνα με τα αποτελέσματα array (Σχήμα S2A, S2C, S2D). Για

STAT5A

, επιβεβαιώσαμε τη σημαντικά μεγαλύτερη έκταση της μεθυλίωσης στο συγκεκριμένο χώρο CpG μετριέται από τον πίνακα, αλλά δεν τήρησε αυτή τη συσχέτιση στις γειτονικές περιοχές CpG (Σχήμα S2B), και έτσι αυτή τόπους δεν ήταν περαιτέρω διερευνώνται.

Θεραπεία της κυτταρικής σειράς καρκίνου της ουροδόχου κύστης με μεθυλίωση αναστολέα οδηγεί σε Re-έκφραση HOXB2

Pyrosequencing πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η κατάσταση μεθυλίωσης του

HOXB2

,

FRZB

, και

KRT13

στην ουροδόχο κύστη καρκινικές κυτταρικές σειρές ΗΤΒ-9 και UM-UC3. ΗΤΒ-9 είχε HOXB2 μεθυλίωση έκταση 68,9, παρόμοιο με αυτό που είχε παρατηρηθεί μεταξύ των δειγμάτων πρωτογενούς όγκου της ουροδόχου κύστης, και έτσι επιλέχθηκε για περαιτέρω εξέταση. Θεραπεία της ΗΤΒ-9 κυττάρων με 1 ή 2 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης οδήγησε σε μια αύξηση μεγαλύτερη από 100 φορές έκφραση του HOXB2 σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2).

Ποσοτική RT ανάλυση -PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση γονιδίου του

HOXB2

σε ανθρώπινες κυτταρικές καρκινώματος ουροδόχου κύστεως γραμμή ΗΤΒ-9, μετά από αγωγή 5 ημερών με 1 ή 2 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης ή ψευδο θεραπεία . Ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση φορές αλλαγή στην έκφραση σε σύγκριση με εικονικές θεραπεία για 4 ή 6 πειράματα επανάληψη, και οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν τα τυπικά σφάλματα.

Η

HOXB2 μεθυλίωση ανεξάρτητα σχετίζεται με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Pyrosequencing των περιοχών προαγωγού του

FRZB

,

KRT13

, και

HOXB2

πραγματοποιήθηκε σε μια ανεξάρτητη σειρά ασθενών όγκου 263 κύστη δεν εξετάζονται με σειρά, καθώς και σε 4 δείγματα μη-νοσούντα όγκου που λαμβάνεται από την NDRI. Η έκταση της μεθυλίωσης στα pyrosequenced περιοχές σε μη-νοσούντα επιθήλιο της ουροδόχου κύστης, μη επεμβατικές όγκους σε διηθητικό όγκων απεικονίζεται στην Εικόνα 3, και αποκαλύπτει σημαντικές διαφορές στη μεθυλίωση σε όλες τις 3 κατηγορίες για κάθε ένα από τα γονίδια (

HOXB2

P & lt? 0,00001,

KRT13

P & lt? 0,05,

FRZB

P & lt? 0,003, Kruskal Wallis Test). Η μεθυλίωση του

HOXB2

και

KRT13

είναι το καθένα σημαντικά μεγαλύτερη στην επεμβατική σε σύγκριση με μη-επεμβατικές όγκους (προστατεύεται Wilcoxon rank ποσά τεστ, Ρ & lt? 0,00001 και η P & lt? 0,02, αντίστοιχα). TP53 ανοσοϊστοχημική (IHC) ένταση χρώσης έχει προηγουμένως συνδέονται με μια πιο επιθετική νόσο [19], [20], και θα περιλαμβάνονται αυτήν τη μεταβλητή όταν πραγματοποιήσαμε λογιστικής παλινδρόμησης πρόβλεψη της διεισδυτικής νόσου, για κάθε μία από τις θέσεις χωριστά, διχοτομηθεί το βαθμό μεθυλίωσης σε το μεσαίο, και τον έλεγχο για άλλους πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες. Σε μοντέλα που ελέγχονται ως προς την ηλικία, το φύλο, και TP53 ανοσοϊστοχημική χρώση ένταση του όγκου, μόνο

HOXB2

μεθυλίωση υποστηρικτής αποδειχθεί μια ανεξάρτητη συσχέτιση με επεμβατικές όγκους (Πίνακας 2). Όγκους με

HOXB2

μεθυλίωση είχε OR 7,7 (95% CI 3.3, 18.2) για να είναι μια επεμβατική όγκου. Αυτό το αποτέλεσμα που πραγματοποιήθηκε σε ένα πρότυπο έλεγχο και για τις 3 θέσεις, καθώς και ΤΡ53 IHC ένταση χρώσης και την ηλικία του ασθενούς και το φύλο, όπου

HOXB2

μεθυλίωση συσχετίστηκε με 8.6 φορές αυξημένο κίνδυνο του να είναι μια επεμβατική όγκου (95% CI 3,4, 21,7).

Η μέση (γεμάτος κύκλος) και τα διαστήματα εμπιστοσύνης% της έκτασης της μεθυλίωσης των περιοχών προαγωγού του (Α 95),

FRZB

, (Β)

KRT13

, και (γ)

HOXB2

απεικονίζονται (άξονας γ) σύγκρισης μη-νοσούντα επιθήλιο της ουροδόχου κύστης, μη επεμβατική όγκων και επεμβατικές όγκους (χ-άξονας). Οι διαφορές ως προς την έκταση της μεθυλίωσης σε αυτές τις ομάδες είναι σημαντικά διαφορετική (τεστ Kruskal-Wallis), για

HOXB2

(P & lt? 0,00001) και

KRT13

(P & lt? 0,04), και

FRZB

(P & lt? 0.003). Συγκρίσεις ειδικά των μη επεμβατική σε σύγκριση με διεισδυτικής νόσου αποκάλυψε επίσης σημαντικές διαφορές για

HOXB2

* P & lt? 0,00001 και

KRT13

** P & lt?. 0.02

Η

η μεθυλίωση του HOXB2, FRZB και KRT13 συνδέονται με επιθετική μη επεμβατική καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Όπως μας ενδιαφέρει τον καθορισμό του τρόπου μεθυλίωσης συμβάλλει στην πρόοδο και την επιθετικότητα των όγκων, εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης έκταση και ο βαθμός του όγκου μέσα οι μη επεμβατικές όγκους. Το σχήμα 4 δείχνει ότι υπάρχει πολύ μεγαλύτερο βαθμό της μεθυλίωσης του

HOXB2

(P & lt? 0.01),

KRT13

(P & lt? 0,01) και

KRT13

(P = 0.0001) σε υψηλής ποιότητας (3) σε σύγκριση με χαμηλής ποιότητας (1,2) μη επεμβατική όγκων. Για τον έλεγχο για πιθανούς συγχυτικούς, πραγματοποιήσαμε πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ του γονιδίου υποκινητή μεθυλίωση έκταση και το βαθμό του όγκου. Αρχικά, διαμορφώθηκε ένας τον υποκινητή του γονιδίου ξεχωριστά, και παρατηρούνται σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των

FRZB

(OR 2.9, 95% CI 1,1, 7,9), και

KRT13

(OR 3.3, 95% CI 1,1, 10.1), αλλά μόνο οριακά στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του

HOXB2

μεθυλίωση και υψηλής ποιότητας όγκου (OR 2.6, 95% CI 0,9, 6,9, Πίνακας S2). Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα πρόσθετα αποτελέσματα της μεθυλίωσης αυτών των 3 τόπων με την μοντελοποίηση της συσχέτισης μεταξύ μεθυλίωση των τριών τόπων σε σύγκριση με κανένα, 1, ή 2 μεθυλιωμένα και υψηλής ποιότητας μη-διεισδυτικής νόσου (Πίνακας 3). Ελεγχόμενη για την ηλικία, το φύλο, και TP53 IHC ένταση χρώσης, η μεθυλίωση όλων των 3 loci συσχετίστηκε με σημαντική 7,4 φορές αυξημένο κίνδυνο να είναι ένας όγκος υψηλής ποιότητας (95% CI 2,5, 22,1).

Η μέση ( γεμάτος κύκλος) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης για την έκταση της μεθυλίωσης των περιοχών προαγωγού του (Α)

FRZB

, (Β)

KRT13

, και (γ)

HOXB2

απεικονίζονται (άξονας γ) σύγκριση χαμηλή (1,2) σε υψηλά (3+) βαθμός όγκους (χ-άξονας). P-τιμές που προκύπτουν από τα ποσά που Wilcoxon Rank αποδεικνύουν ότι αυτές οι διαφορές είναι σημαντικές για

HOXB2

(P & lt? 0.01),

KRT13

(P & lt? 0,01) και

FRZB

( Ρ = 0.0001).

Η

Συζήτηση

σε σύγκριση με το γονίδιο έκφρασης δεικτών βασίζεται, τα πρότυπα μεθυλίωσης DNA είναι πιο σταθερά και μπορούν να ανιχνευθούν με τη χρήση διαφόρων προσεγγίσεων που απαιτούν σχετικά μικρά ποσά υλικά ασθενή. Επιπλέον, αυτοί οι δείκτες μπορούν να ταυτοποιηθούν και να ποσοτικοποιηθούν αντικειμενικά, παρέχοντας πιθανή βελτίωση στην αξιοπιστία σε ιστολογικές υποκειμενική διαγνώσεις όπως τάξεων όγκου ή σε σύγκριση με ανοσοϊστοχημική χρώση μοτίβα που βασίζονται στην ατομική ερμηνεία της έντασης και την τοποθεσία της χρώσης. Για παράδειγμα, οι δείκτες προσδιορίζονται και ανεξάρτητα επικυρωθεί σε αυτή τη μελέτη αναμονή υπόσχεση ως βιοδείκτες χρήσιμα σε έλεγχο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και παρακολούθησης για υποτροπή και την εξέλιξη και θα μπορούσε να εφαρμοστεί και ελέγχθηκαν για την κλινική χρησιμότητα σε εύκολο να συλλέγουν τα ιζήματα ούρων [9], [10 ], [11], [13], [21]. Επιπλέον, η ανακάλυψη των γονιδίων και μονοπατιών επιγενετικώς μεταβάλλεται σε όγκους της ουροδόχου κύστης προτείνουν νέους στόχους για θεραπευτική παρέμβαση, ειδικά κατά την εξέταση του φτωχή πρόγνωση σχετίζεται με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ταυτοποίηση σημαντικές και χρήσιμες δείκτες που βασίζονται μεθυλίωσης του DNA δεν είναι χωρίς πρόκληση, ιδίως καθώς υπάρχει συχνά υψηλός βαθμός συσχέτισης μεταξύ αυτών των μεταβολών [22]. Ως εκ τούτου, κατάλληλες στατιστικές προσεγγίσεις πρέπει να χρησιμοποιηθούν για να εξετάσουν αυτές τις αλλαγές και να εντοπιστούν οι αλλαγές με τη μεγαλύτερη κλινική χρησιμότητα. Πιστεύουμε ότι η προσέγγισή μας 2 στάδιο προβλέπει την πιο ισχυρή και γενικεύσιμων ταυτοποίηση των μεθυλίωσης του DNA αλλαγές που πρέπει να εξεταστούν περαιτέρω προοπτικές μελέτες. Χρησιμοποιώντας πολλές διαφορετικές στατιστικές προσεγγίσεις, η στρατηγική μας επιλογή για πληροφοριακούς δείκτες μας επέτρεψε να εντοπίσει ένα διαχειρίσιμο αριθμό των δυνητικά χρήσιμων και ισχυρή βιοδεικτών για εργαστηριακή επικύρωση καθώς και την αντιγραφή σε ανεξάρτητα δείγματα. Το πιο σημαντικό, η επικύρωση μας αυτών των δεικτών σε μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών παρέχει πειστικές αποδείξεις της πιθανής χρησιμότητας τους και η βιολογική σημασία.

Προηγούμενες μελέτες που εξετάζουν πάνελ των υποψηφίων γονιδίων έχουν εντοπίσει συγκεκριμένα γονίδια και τα πάνελ των τόπων που είναι προγνωστικά τόσο η παρουσία του όγκου όταν εξετάζονται σε ιζήματα ούρα [23] και της εξέλιξης από μη επεμβατικές να διεισδυτική νόσο [15], [24], [25], [26], όταν εξετάζονται εντός του ιστού του όγκου. Συγκεκριμένα γονίδια, όπως

RASSF1A

,

RaRb

,

BAMBI

και το

SFRP

οικογένειας έχουν συσχετιστεί με υψηλότερο βαθμό και τον καρκίνο ανώτερο στάδιο της ουροδόχου κύστης [8 ], [27], [28]. Η στρατηγική μας δεν εντόπισε αυτών των ειδικών γονιδίων, και η διαφορά αυτή μπορεί να οφείλεται σε έναν αριθμό διαφορών μεταξύ προσέγγισής μας και αυτών που προηγουμένως χρησιμοποιηθεί. Έχουμε κάνει χρήση ενός δείγματος υπόθεσης σειρά βασισμένη στον πληθυσμό, ενώ πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει το νοσοκομείο με βάση σειρά ευκολία, και ως εκ τούτου μπορεί να είχε κάποια μεροληψία εισήχθη στα δείγματα που εξετάστηκαν. Η πλατφόρμα συστοιχία χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή είναι περιορισμένη σε ότι εξετάζει μόνο ένα υποσύνολο του συνόλου των γονιδίων και μόνο 1 ή 2 ειδικές θέσεις CpG για αυτά τα γονίδια, και έτσι μπορεί να χάσει τα ειδικά γονίδια loci περιγράφηκε προηγουμένως. Τέλος, αναλυτική προσέγγιση μας, καθώς βασίζεται στον προσδιορισμό του πάνελ γονιδίων μπορεί να αναγνωρίσει διαφορετικούς τόπους από αυτές που χρησιμοποιούνται στις υποψήφιες αναλύσεις, αλλά υπερμεθυλίωση αυτών που περιγράφονται προηγουμένως υποψηφίων, μπορεί, στην πραγματικότητα, ότι σχετίζεται ισχυρά με τα πρότυπα μεθυλίωσης που ταυτοποιούνται εδώ . Περαιτέρω μελέτη που συνδυάζει προηγουμένως εντοπιστεί θέσεις με τη δική μας νέους στόχους σε μια προοπτική μόδας είναι απαραίτητη για να καθοριστεί πιο οριστικά αυτές τις θέσεις με τη μεγαλύτερη κλινική χρησιμότητα.

Οι βιολογικές βάσεις της μη επεμβατικής ακόμα υποτροπιάζουσα νόσο έναντι της διεισδυτικής νόσου παραμένουν σε να διευκρινιστεί πλήρως [29]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι υπάρχουν μεγάλες διαφορές στην μεθυλίωση μεταξύ επεμβατικές και μη επεμβατικές όγκους, με επιθετικοί όγκοι που παρουσιάζουν μια γενική αύξηση στη μεθυλίωση σε σύγκριση με μη-επεμβατικές όγκους. Όπως μεθυλίωσης του DNA σε κάθε ένα CpG είναι ένα δυαδικό μέτρο (είτε η κυτοσίνη είναι μεθυλιωμένη ή όχι), η διαφορά ως προς το βαθμό της μεθυλίωσης μπορεί να αντανακλούν δυνητικά μεγαλύτερη ομοιογένεια κατά την επιλογή των επιγενετικώς τροποποιημένων κυττάρων στην ανάπτυξη της διεισδυτικής νόσου, αποτέλεσμα συνεπές με προηγούμενη εργασία μας εξετάζοντας μόνο μια περιορισμένη ομάδα υποκινητές γονιδίων σε ένα ενιαίο σειρά όγκων της ουροδόχου κύστης [14]. Αυτή μεγαλύτερος βαθμός μεθυλίωσης μπορεί να οδηγεί τα χαρακτηριστικά της επεμβατικής φαινοτύπου, ή εναλλακτικά μπορεί να είναι συνέπεια του επιλεκτικές πιέσεις που σχετίζονται με αυτό φαινότυπο. Παρά το γεγονός ότι η προσέγγισή μας στην εξέταση περιστατικό της νόσου δεν μπορεί να διακρίνει πλήρως τις δυνατότητες αυτές, παρέχει ενδεικτικά στοιχεία για την επείγουσα ανάγκη για περαιτέρω εξέταση του εν λόγω επιγενετικών φαινομένου.

Ταυτοποίηση των συγκεκριμένων γονιδίων των οποίων μοτίβο μεθυλίωσης του DNA συνδέεται με φαινοτύπους όγκο, συμπεριλαμβανομένων των στάδιο και βαθμό φωτίζει επίσης τις ιδιαίτερα σημαντικές βιολογικές διεργασίες και τα μονοπάτια που απαιτούνται για την γένεση αυτών των ιστολογικά καθορισμένες καταστάσεις ιστού. Η

FRZB

γονίδιο (επίσης γνωστό ως

SFRP3

) είναι ένα μέλος της εκκρινόμενης κατσαρωμένα οικογένεια υποδοχέων διαλυτών πρωτεϊνών που δεσμεύεται με και ανταγωνίζεται τον υποδοχέα WNT. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι η υπερμεθυλίωση

SFRP

γονιδίων είναι ισχυρά και σχετίζεται σημαντικά με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, επιβεβαιώνοντας τη σημασία αυτής της οδού σε αυτό το φαινότυπο [8], [12]. Από τις

SFRP

γονίδια, μόνο

SFRP1

, (εκτός από

FRZB

) είναι διαμορφωμένο στη συστοιχία, και σε μια διαφορετική θέση CpG από ό, τι οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε μας και προηγούμενες εκθέσεις της μεθυλίωσης του [8], [30]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί αυτή τόπους δεν προσδιορίζονται στην προσέγγιση ελέγχου μας. Πρόσθετες, πιο γονιδίωμά πυκνή διερεύνηση μονοπάτι Wnt είναι δικαιολογημένη, καθώς αυτό μπορεί να προτείνει μια νέα διαδρομή για θεραπευτική παρέμβαση για την ασθένεια αυτή.

HOXB2

είναι ένα μέλος της οικογένειας ομοιοκυτίου των μεταγραφικών παραγόντων , και κωδικοποιείται στο χρωμόσωμα 17 ως τμήμα μιας συστάδας γονιδίων με άλλα μέλη της οικογένειας ΗΟΧ. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρούμε ότι η μη νοσούντων επιθηλίου της ουροδόχου κύστης επιδεικνύει ένα παρόμοιο βαθμό μεθυλίωσης σε

HOXB2

και

KRT13

ως μη διεισδυτικής νόσου, ενώ σε

FRZB

μη -diseased ιστός έχει ένα σημαντικά χαμηλότερο βαθμό μεθυλίωσης από οποιονδήποτε από τους τύπους όγκου 2. Παρατηρούμε επίσης, στην κυτταρική καρκινώματος κύστης σειρά ανθρώπινου ΗΤΒ-9, το οποίο παρουσιάζει ένα βαθμό μεθυλίωσης παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε επεμβατικές όγκους, ότι η αγωγή με τον αναστολέα μεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του

HOXB2

, υποδηλώνοντας ότι η μεθυλίωση του γονιδίου αυτού μπορεί να είναι λειτουργικά οδηγούν στην αδρανοποίηση του γονιδίου αυτού. Τα αποτελέσματα στο

HOXB2

συνάδουν με τη βιβλιογραφία η οποία έχει περιγραφεί μία δισθενή δομή περιοχής της χρωματίνης των γονιδίων ομοιοακολουθίας, όπου αμφότερα τα πολυδύναμα και τελικά διαφοροποιημένα έκθεμα ιστού σήματα τόσο δραστική και κατασταλτικών χρωματίνης εντός της ίδιας περιοχής [31 ], [32], και έτσι ένα ενδιάμεσο βαθμό της μεθυλίωσης του DNA. Διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης εμφανίζονται στοχεύονται για υπερμεθυλίωση της περιοχής αυτής, ένα φαινόμενο που αναφέρθηκαν προηγουμένως σε όλη την ομάδα Polycomb ελεγχόμενη γονιδίων σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα [33]. Μια τέτοια απόκλιση μεταβολή ενός κλειδιού αναπτυξιακού γονιδίου μπορεί να είναι κρίσιμη για τον καθορισμό των φαινοτύπων αυτών των όγκων και να εξηγήσει την συμπεριφορά και το αποτέλεσμα από αυτές τις ανόμοιες μορφές της ασθένειας αυτής.

KRT13

κωδικοποιεί κυτοκερατίνη-13 η οποία έχει αποδειχθεί ότι έχει ειδική έκφραση σε τραχηλικού πλακώδους όγκους και σε βλεννώδες αδενοκαρκινώματα του τραχήλου της μήτρας τύπου [34]? με τις γνώσεις μας, επιγενετικές μεταβολές σε αυτό το γονίδιο δεν έχουν αναφερθεί. Επιγενετική μεταβολή αυτού του γονιδίου μπορεί να επηρεάσει πρότυπο έκφρασης του, και τέτοιες αλλαγές μπορεί να είναι σημάδια μιας πιο de-διαφοροποιημένο φαινότυπο, που θεωρείται χαρακτηριστικό των επιθετικών, υψηλής ποιότητας όγκους.

Εμείς αποδειχθεί σε μία ανεξάρτητη σειρά επιβεβαίωση των όγκων που η έκταση της μεθυλίωσης του

HOXB2

και

FRZB

σχετίζεται με το βαθμό του όγκου, ανεξάρτητα μεταξύ τους και από την ανοσοϊστοχημική χρώση ΤΡ53 πρωτεΐνη. χρώση TP53 έχει προηγουμένως εξεταστεί και έχει touted ως ένα χρήσιμο προγνωστικό δείκτη σε αυτή τη νόσο [35], [36], [37], αν και υπάρχουν αντικρουόμενες δεδομένα σχετικά με τη χρησιμότητά του [36], [38], [39], [40]. Μια πρόσφατη μετα-ανάλυση εξετάζει τη χρησιμότητά του δείχνει ότι δεν υπάρχουν επαρκείς ενδείξεις που να υποδηλώνουν τη χρήση αυτού του δείκτη κλινικά [20], καθώς μπορεί να παρέχουν καμία προσθήκη προγνωστικές πληροφορίες, εκτός από μια ισχυρή σχέση με την επεμβατική φαινότυπο της νόσου [41], [ ,,,0],42]. Δεν μπορούμε ακόμα να υποδηλώνουν ότι οι δείκτες που ανακαλύφθηκε χρησιμοποιώντας την προσέγγισή μας κρατήσει πια κλινική χρησιμότητα από παθολογική ταξινόμηση και σταδιοποίηση των όγκων, αλλά πιστεύουμε ότι τα στοιχεία μας υποδηλώνουν συγκεκριμένες κυτταρικές οδούς που διαταράσσεται σε αυτή την ασθένεια. Έτσι, αυτές οι οδοί θα μπορούσε να διερευνηθεί εντατικά ως νέα στόχους για θεραπευτικές στρατηγικές. Επιπλέον, προτείνουμε ότι οι μελλοντικές εργασίες, εξετάζοντας τη χρησιμότητα αυτών των δεικτών σε μια προοπτική μόδας είναι απαραίτητη, δεδομένου ότι μπορεί να είναι χρήσιμο για τον καθορισμό ποια μπορεί να εξελιχθεί όγκους. Πράγματι, αυτοί οι δείκτες θα μπορούσαν επίσης να συμβάλουν στην κλινική προσπάθειες για να ακολουθήσουν οι ασθενείς με λιγότερο επεμβατικές μεθόδους, για να καθορίσει εάν ο όγκος τους έχει υποτροπιάσει ή προοδεύσει, απαιτώντας έτσι πιο επιθετική θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης και Δείγμα Διαπίστωση

Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη με την προϋπόθεση έγγραφη συγκατάθεση υπό την έγκριση των θεσμικών συμβούλια αναθεώρηση του Dartmouth Medical School και το Πανεπιστήμιο Μπράουν. Αξιοποιήσαμε δύο, ανεξάρτητο, μη-συνεχόμενες βασισμένη στον πληθυσμό σειρά περιπτώσεων καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η πρώτη, που αποτελείται από όγκους από 344 άτομα συμμετείχαν σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων του καρκίνου περιστατικό της ουροδόχου κύστης στο New Hampshire, διαγνώστηκαν μεταξύ Ιουλίου 1994 και Ιουνίου 1998 [43], και η δεύτερη αποτελείται από όγκους από 264 άτομα διαγνώστηκαν μεταξύ 1η Ιανουαρίου 2002 έως 30 τον Ιούλιο του, 2004 [44]. Αν και ξεχωριστή στο χρόνο και το πεδίο εφαρμογής, οι δύο αυτές μελέτες χρησιμοποιήθηκαν ταυτόσημες διαδικασίες πρόσληψης και το προσωπικό της μελέτης, καθώς και ταυτόσημη πρωτόκολλα για τη διαπίστωση των υλικών παθολογίας για τη μοριακή εξετάσεις. Ουροδόχου κύστης όγκων και από τις δύο σειρές εξετάστηκαν από τον παθολογοανατόμο μελέτη (A.R.S.) και ταξινομούνται σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας κατευθυντήριες γραμμές του 1973 και του 2004 για τους όγκους της ουροδόχου κύστης. Ο παθολόγος μελέτη εντόπισε το κατάλληλο τετράγωνο από το οποίο ελήφθησαν τα δείγματα όγκων που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις αναλύσεις, καθώς και το ποσοστό των κακοήθων κυττάρων σε κάθε δείγμα υπολογίστηκε. Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για την εξέταση περιείχε & gt? Δείγμα όγκου 75%. Καρκίνωμα in-situ αποκλείσθηκε από την ανάλυση λόγω του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος. Ο πίνακας 1 περιγράφει τα χαρακτηριστικά των υποκειμένων περιλαμβάνονται στην τελική ανάλυση. Επιπλέον, τέσσερις μη νοσούντων δείγματα επιθηλίου της ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από την Εθνική Νοσημάτων Έρευνας Interchange (NDRI) όλα από δείγματα αυτοψίας των ατόμων που δεν έχουν τη διάγνωση του καρκίνου.

DNA Εξαγωγή και Ανάλυση μεθυλίωσης

τμήματα του όγκου με το μεγαλύτερο ποσοστό του κακοήθους ιστού επιλέχθηκαν από τον παθολογοανατόμο μελέτη για χρήση σε μοριακές αναλύσεις μας. DNA εκχυλίστηκε και όξινο θειώδες νάτριο τροποποιημένα ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες όπως περιγράφονται στο Marsit, et al. [18]. Ένα σύνολο 82 όγκων από την πρώτη σειρά και όλα τα 264 όγκους από τη δεύτερη σειρά ήταν κατατομής για την κατάσταση μεθυλίωσης στο 1505 CpG θέσεις χρησιμοποιώντας τις συστοιχίες μεθυλίωσης χάντρα Illumina GoldenGate®. συστοιχίες χάντρα έτρεξαν στο UCSF Ινστιτούτο Ανθρώπινης Γενετικής, Γονιδιωματικής πυρήνα Διευκόλυνσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και, όπως περιγράφεται στο Bibikova, et al. [45].

Η στατιστική ανάλυση

συναρμολογούνται δεδομένων με το λογισμικό BeadStudio μεθυλίωση από τον κατασκευαστή array (Illumina, San Diego, CA) και την αξιολόγηση της ποιότητας που πραγματοποιούνται, όπως στην Christensen et al. [16] με αποτέλεσμα επτά δείγματα (9%), όπου & gt? 75% των τόπων είχε τιμή ρ & gt ανίχνευση? 1 * 10

-5, να πέσει από την ανάλυση. Μια παρόμοια ελέγχου ποιότητας για CpG θέσεις εξαλειφθεί εκείνους τόπους με τιμή p & gt μεσαίο ανίχνευσης? 0,05 (n = 8, 0,5%)

Οι επόμενες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο πακέτο R.. Για ανίχνευση /οπτικοποίηση, ιεραρχική ομαδοποίηση χρησιμοποιώντας το μετρικό στο Μανχάταν και το μέσο σύνδεσης εκτελέστηκε. Για τόπος με αναλύσεις τόπο, ενώσεις σε μεμονωμένες θέσεις CpG δοκιμάστηκαν με ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο (GLM). Σύμφωνα με την υπόθεση ότι οι μέσες τιμές βήτα ακολουθούν μια κατανομή Βήτα [46], ένα μοντέλο οιονεί διωνυμική (link logit, διωνυμική διακύμανσης, και η παράμετρος κλίμακας μη-μονάδα) χρησιμοποιήθηκε? σημειώστε ότι η λειτουργία σύνδεσμο logit επιβάλλει την κατάλληλη πίεση στη μέση μέση βήτα. Για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με τη σάρωση του 1413 αυτοσωματικό CpG θέσεις, Ρ-τιμές για τις ενώσεις μεταξύ των μέσων βήτα και διεισδυτικής νόσου που χρησιμοποιούνται ψευδή αποκοπή διόρθωση ανακάλυψη και τιμές Q υπολογίζεται από το

qvalue

συσκευασία R. Ένα FDR q -τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική για την εξέταση αυτή

Τυχαία δάση

[47] (https://www.math.usu.edu/~adele/forests/), χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ταξινομητές των χωροκατακτητικών στάδιο (έναντι μη επεμβατική) από CpG μέσες τιμές βήτα. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε R χρησιμοποιώντας το

randomForest

πακέτο (έκδοση 4,5 με 18) από Liaw και Wiener. Σε κάθε κόμβο του δέντρου, ένα τυχαίο δείγμα του

m

από το σύνολο του

Μ

μεταβλητών επιλέχθηκε και η καλύτερη διάσπαση βρίσκεται μεταξύ των

m μεταβλητές

. Η προεπιλεγμένη τιμή για

m

στο πακέτο Τυχαία Δάσος R είναι. Στην ανάλυση αυτή εξετάσαμε μια σειρά από

m

από μισό έως δύο φορές και χρησιμοποιήθηκε

m

που έδωσε το χαμηλότερο σφάλμα πρόβλεψης? σε αυτή την περίπτωση το ποσοστό σφάλματος

m

= 38. Η OOB είναι το ποσοστό του χρόνου πρόβλεψης RF είναι εσφαλμένη. Μια δοκιμή για την συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης (προγνωστικοί παράγοντες) και τον τύπο του δείγματος έγινε με τη σύγκριση της OOB που λαμβάνονται σχετικά με τα δεδομένα που με τη μηδενική κατανομή των σφαλμάτων OOB λαμβάνεται με μετάθεση ετικέτες τύπο δείγματος και να λειτουργήσει η διαδικασία RF 100 φορές. Χρησιμοποιήσαμε επίσης τη δεύτερη σειρά 264 όγκων ως ένα σύνολο επικύρωσης, τον υπολογισμό του ποσοστού σφάλματος καθώς κάθε δένδρο κατασκευάζεται, για να ληφθεί ένα εκτιμώμενο ποσοστό σφάλματος ανεξάρτητη από την πρώτη σειρά. Τέλος, χρησιμοποιούνται οι μεταβλητές βαθμολογίες σημασία, ποσοστιαία αλλαγή σε μέσο τετραγωνικό σφάλμα (MSE), για τον εντοπισμό τόπων που είχε τη μεγαλύτερη επιρροή για την ταξινόμηση, επιλέγοντας εκείνα των οποίων η loci ποσοστιαία αλλαγή σε MSE ήταν μεγαλύτερη από 5%.

Για συμπέρασμα, δεδομένα συνενώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μίγμα [48] με ένα μίγμα από διανομές βήτα [49], και ο αριθμός των τάξεων προσδιορίστηκε με Bayesian κριτήριο πληροφοριών (BIC) [50], [51]. Το μοντέλο μείγμα ταιριάζει με αναδρομικά στεγανοποίηση των δεδομένων χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μίγμα 2-class, με μια παραλλαγή της BIC χρησιμοποιούνται ως κριτήριο για το διαχωρισμό, όπως περιγράφεται στο [46]. των μελών Class ελήφθη από το μοντέλο μείγμα χρησιμοποιώντας μια εμπειρική διαδικασία Bayes, και την επακόλουθη ενώσεις με διηθητικό στάδιο ελέγχθηκαν μέσω της δοκιμής μετάθεσης με 10.000 παραλλαγές κάθε χρησιμοποιώντας το πρότυπο chi-square καλοσύνη-of-fit test. Η έξοδος των μοντέλων μείγμα περιλαμβάνει μια κατηγορία ειδικά για τη διανομή β

F

jk

για κάθε θέση

ι

και κατηγορία

k

. Αυτές οι κατανομές συνεπάγεται μια καμπύλη λειτουργίας δέκτη (ROC) για τη διάκριση των δύο κατηγοριών

k

και

l

από τη σχέση ή, ανάλογα με το ποια καμπύλη βρίσκεται πάνω από τη γραμμή ταυτότητας. Σε κάθε περίπτωση, η περιοχή-κάτω-the-ROC (AUC), υπολογίζεται ως, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί η επίδραση του τόπου

ι

σχετικά με τη διάκριση μεταξύ των τάξεων

k

και

l

. Μια παρόμοια διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διακρίνει την κατηγορία

k

από τους άλλους: χρησιμοποιούμε ένα κανονικό προσέγγιση

G

JK

για τη διανομή των συνδυασμένων τάξεις εκτός από

k

, και υπολογίζουν. Στη συνέχεια κατετάγη κάθε τόπο ι από υπολογιζόμενη AUC

jk της, και επιλεγμένα άτομα με AUC & gt?. 0.90

Για την αναγνώριση τόπων για τα επόμενα επικύρωση ως προάγγελοι των χωροκατακτητικών εναντίον μη διεισδυτικής νόσου, υπολογίσαμε την τομή των τόπων που ήταν πιο σημαντικές (Q & lt? 0,05) στην ανάλυση τόπο ανά τόπο, η κορυφή τόποι κατάταξη από την ανάλυση RF (% μεταβολή στο MSE & gt? 6%), και οι τόποι έχουν AUC & gt? 0,75 για τη διάκριση την τάξη ενδιαφέροντος σε σύγκριση με τους άλλους σε κάθε σειρά όγκου, και στη συνέχεια προσδιόρισε τους τόπους επικάλυψη και στις δύο σειρές.

Bisulfite Pyrosequencing

η ποσοτικοποίηση των εκατό μεθυλίωση της κυτοσίνης διεξήχθη από Pyrosequencing όξινο θειώδες-μετατροπή του DNA με τη χρήση του PyroMark σύστημα Pyrosequencing MD (Qiagen, Valencia, CA).