Αφηρημένο

Στα θηλαστικά, η κεντρική γεννήτρια κιρκαδικό ρυθμό αποτελείται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων του ρολογιού, συμπεριλαμβανομένων των

Per1 /2 /3

,

Cry1 /2

,

BMAL1

, και

Ρολόι

. Εικοσιτετράωρου ρυθμού διάσπαση μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο καρκίνου στον άνθρωπο, και η απορρύθμιση των γονιδίων του ρολογιού έχει εμπλακεί σε πολλούς τύπους καρκίνων. Μεταξύ αυτών των γονιδίων,

Per2

αναφέρεται ότι έχει ιδιότητες καταστολής του όγκου, αλλά λίγα είναι γνωστά για τη συσχέτιση μεταξύ των

Per2

και HIF, η οποία είναι ο κύριος στόχος της νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) θεραπεία . Σε αυτή τη μελέτη, η ρυθμική έκφραση του

Per2

γονίδιο δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε καρκίνο του νεφρού κυτταρικές γραμμές, με την εξαίρεση των κυττάρων Caki-2. Σε κύτταρα Caki-2, HIF1α αύξησε το πλάτος του

Per2

ταλάντωση με άμεση σύνδεση προς την θέση HIF-δέσμευσης που βρίσκεται στην

Per2

υποκινητή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HIF1α μπορεί να ενισχύσει το πλάτος του

Per2

κιρκαδικό ρυθμό

Παράθεση:. Okabe T, Kumagai Μ, Nakajima Υ, Shirotake S, Kodaira Κ, Oyama M, et al. (2014) Ο αντίκτυπος της HIF1α στο

Per2

εικοσιτετράωρου ρυθμού στον Καρκίνο Νεφρική Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10.1371 /journal.pone.0109693

Επιμέλεια: Shin Yamazaki, Πανεπιστήμιο του Τέξας Southwestern Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Okabe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Νεφρική καρκίνωμα (RCC) είναι η πιο συχνή κακοήθεια του ενήλικου νεφρού, η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 2% των καρκίνων σε όλο τον κόσμο [1]. Μια σωματική μετάλλαξη του Von Hippel-Lindau (

VHL

) γονίδιο είναι η πιο συχνή γενετική αλλαγή που παρατηρείται σε RCC [2], και οι πρόσφατες προσπάθειες έχουν στόχο το VHL-υποξία διεγέρσιμο παράγοντα (HIF) μεσολάβηση υποξία επαγόμενη γονιδιακή μονοπάτι για θεραπεία RCC [3]. HIFs είναι ετεροδιμερείς παράγοντες μεταγραφής με δύο δομικά συγγενείς υπομονάδες: μία ευαίσθητα στο οξυγόνο υπομονάδα HIFα και συστατικώς εκφράζεται HIFß ή υποδοχέα υδρογονάνθρακα αρύλιο πυρηνικός μεταθέτης (ARNT) υπομονάδα [4]. Σε φυσιολογική οξυγόνωση, τα μόρια HIFα υποβάλλονται σε μία διαδικασία που περιλαμβάνει ρυθμιστική ενζυματική υδροξυλίωση των διατηρημένων προλυλ και ασπαραγινυλίου, οδηγώντας σε ταχεία πρωτεΐνη μεσολάβηση ουβικιτινίωση και πρωτεασώματος αποικοδόμηση VHL [5]. Υποξία ή μεταλλάξεις στο

VHL

γονίδιο αδρανοποιούν αυτό το μονοπάτι. Αυξημένη δραστηριότητα HIFα ρυθμίζει προς τα πάνω γονίδια που εμπλέκονται σε πολλές πτυχές της εξέλιξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολικών προσαρμογής, αποπτωτικά αντίσταση, και την αγγειογένεση [3]. Στο RCC, έντονη όγκου αγγειακών δικτύων μπορεί να αποδοθεί στην ακατάλληλη συσσώρευση HIFα οδηγώντας σε επαγωγή αγγειογόνο γονίδιο. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι ένα από τα πιο ισχυρά προ-αγγειογόνοι παράγοντες, των οποίων η έκφραση μετενεργοποίησε από HIF1α /ARNT μέσω σύνδεσης με το στοιχείο υποξία-απόκρισης (HRE) στο

VEGF

υποκινητή [6] , [7]. Η αυξημένη έκφραση του VEGF συνδέεται επίσης με κακοήθη εξέλιξη και μια κακή έκβαση της θεραπείας [8]. Ως εκ τούτου, καταστέλλοντας την HIF διαμεσολαβούμενη γονιδιακή μονοπάτι μπορεί να είναι μια σημαντική θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του RCC [3].

Πολλές φυσιολογικές, βιοχημικές, και συμπεριφορικές διεργασίες είναι υπό κιρκαδιανού ρύθμιση, η οποία παράγεται από ένα εσωτερικό χρόνος -keeping μηχανισμός αναφέρεται ως το βιολογικό ρολόι σε όλους σχεδόν τους οργανισμούς από βακτηρίδια σε θηλαστικά [9], [10]. Οι κιρκαδικούς ρυθμούς ελέγχονται από γενετικά καθορισμένη δίκτυα ανατροφοδότησης μεταγραφής-μετάφρασης βρόχους που αφορούν γονίδια του ρολογιού, συμπεριλαμβανομένων των

Per1 /3.2

,

Cry 1/2

,

BMAL1

, και

Ρολόι

[11]. Ένα κοινό θέμα υποκείμενη κιρκάδιο ρυθμικότητα είναι ότι οι ταλαντώσεις των μεταγραφών γονιδίων του ρολογιού είναι η συνέπεια της ενδοκυτταρικής μεταγραφικής-μεταφραστική βρόχους ανάδρασης. Για παράδειγμα, στα θηλαστικά, η μεταγραφικών παραγόντων CLOCK και BMAL1 ετεροδιμερή και ενεργοποιούν την έκφραση των τριών

Ανά γονίδια

και δύο

Cry

γονιδίων μέσω σύνδεσης με στοιχεία Ε-box σε υποστηρικτές τους. Τα προϊόντα πρωτεΐνης αυτών των γονιδίων πολυμερίζονται και μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου οι πρωτεΐνες PER και CRY καταστέλλουν την μεταγραφική δραστικότητα του διμερούς CLOCK-BMAL1 [12], [13].

Μεταξύ αυτών των γονιδίων του ρολογιού,

per2

είναι υπεύθυνη για τον καθορισμό της περιόδου ταλάντωσης [14]. Επιπλέον,

Per2

έχει ιδιότητες καταστολής όγκων και συχνά μεταλλάσσεται ή προς τα κάτω σε ανθρώπινους καρκίνους του μαστού [15], [16]. Σε καρκίνο του νεφρού, αλλοιωμένη έκφραση η

Per2

γονίδιο που φέρεται να εμπλέκονται στην εμφάνιση και εξέλιξη της νόσου, αλλά ο μοριακός μηχανισμός που ευθύνεται παραμένει ασαφής [17].

Σε αυτή τη μελέτη, μετρήσαμε τα επίπεδα του

Per2

δραστηριότητα υποκινητή και mRNA σε οκτώ νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη. Η

Per2

δραστηριότητα υποκινητή και το επίπεδο mRNA κυμάνθηκε πάνω από έναν κύκλο περίπου 24 ωρών στα κύτταρα Caki-2, τα οποία περιέχουν BMAL1, CLOCK, και πρωτεΐνες HIF1α. Βρήκαμε επίσης ότι HIF1α αύξησε το πλάτος της ταλάντωσης με απευθείας σύνδεση με την HRE-σαν στοιχείο που βρίσκεται στο

Per2

υποκινητή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HIF1α μπορεί να επηρεάσει το πλάτος

Per2

κιρκαδικούς ρυθμούς σε νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και κυτταρικές καλλιέργειες, τα χημικά, και τα ένζυμα

Ιδρύθηκε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές RCC (Α 704, ACHN, 786-O, Α498, 769-Ρ, και Caki-2) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). RCC4 + φορέα μόνο και RCC4 + VHL ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Αυτές νεφρικών κυττάρων γραμμές διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 μέσο (Kojin Bio, Tokyo, Japan) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Ϋίβ Technologies, Carlsbad, CA, USA), 24 U /mL πενικιλλίνη , και 25 μg /mL στρεπτομυκίνη (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. Χρησιμοποιήσαμε επίσης την ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ3Τ3 και μοντέλα ανθρώπινου οστεοσαρκώματος U2OS κύτταρο της αυτόνομης κιρκαδικό ρολόι [18], [19]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν επίσης από την ATCC, και διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ), συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (24 U /mL), και στρεπτομυκίνη (25 μg /mL). Chrysin αγοράστηκε από την Sigma, και η καθαρότητα της υπερέβαινε το 96%. Ένα απόθεμα διαλύματος chrysin παρασκευάστηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Chrysin διαλύθηκε σε DMSO σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 10, και 100 mM) και προστίθενται κάθε 2 μL έως 2 mL μέσα καλλιέργειας (τελική συγκέντρωση? 1, 10, 100 μΜ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μέσο καλλιέργειας που περιέχει 1, 10, 100 μΜ chrysin ή ίδια συγκέντρωση DMSO ως έλεγχος για 2 ώρες.

πλασμίδιο κατασκευή

Για την κατασκευή φορέων δημοσιογράφος που φέρει το m

Per2

υποκινητή, ο m

Per2

θραύσμα υποκινητή (-279 να +112 bp, όπου 1 υποδεικνύει την υποθετική θέση έναρξης της μεταγραφής) ήταν αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) -amplified από το γονιδίωμα ποντικού /6J C57BL , και κλωνοποιείται στη θέση NheI /XhoI του pGL3 Basic (Promega, Madison, WI, USA). Λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (διακύμανση των) αντικαταστάθηκε με το

Nco

Ι και

Xba

θραύσμα του pSV40-dFLuc, με αποτέλεσμα m

Per2

-dFLuc. Η HRE-μεταλλαγμένο m

Per2

υποκινητή δημιουργήθηκε με αντίστροφη PCR χρησιμοποιώντας ένα ΚΩΔ-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo, Osaka, Japan).

εκθέσεων σε πραγματικό χρόνο του κιρκάδιου ρυθμιζόμενων γονιδίων έκφρασης χρησιμοποιώντας λουσιφεράση βιοφωταύγεια

Όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

4 ανά δίσκο) σε ένα δίσκο 35 mm 2 ημέρες πριν την επιμόλυνση, και το πλασμίδιο ανταποκριτή επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κατάλληλη ποσότητα του πλασμιδίου αναφοράς για κάθε κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε σύμφωνα με διαφορές στην αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ δεξαμεθαζόνη (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) για 2 ώρες, και το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο εν απουσία ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 μΜ D-λουσιφερίνη (Toyobo ). Η βιοφωταύγεια μετρήθηκε στους 37 ° C υπό 5%

2 ατμόσφαιρα CO και ολοκληρωμένα για 1 λεπτό σε διαστήματα 10 λεπτών χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο πιάτο τύπου ΑΒ-2550 Kronos Dio (ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan) [20], [21]. δραστηριότητα βιοφωταύγεια εκφράστηκε ως σχετικές μονάδες φωτός (RLUs). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τέσσερις φορές. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο φωτόμετρο για τουλάχιστον 4 ημέρες, ενώ το μέσο μετρήθηκαν βιοφωταύγειας τους. Τα λαμβανόμενα ακατέργαστα δεδομένα (10 λεπτά κάδοι) έχουν λειανθεί από 10-σημείο κινητός μέσος όρος μέθοδο και αφαίρεση της τάσης αφαιρώντας ένα κινητό μέσο όρο 12 ώρες από τις εξομαλύνονται τα δεδομένα [21].

Ανάλυση κιρκαδικούς ρυθμούς που χρησιμοποιούν βιοφωταύγεια

για να δοκιμαστεί η σημασία του κιρκάδιου ρυθμικότητα και για τον υπολογισμό του κιρκαδιανού παραμέτρους (δηλαδή, περίοδο, το πλάτος, και ακρόφασης), πραγματοποιήσαμε μηχανογραφημένη ανάλυση των δεδομένων στο λογισμικό Cosinor κατεβάσει από το εικοσιτετράωρου ρυθμού Εργαστήριο (Walterboro, SC, ΗΠΑ) λογισμικό αρχική σελίδα (https://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. Κιρκάδιου παράμετροι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δεδομένα από 1-5 ημέρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη.

Automated σύλληψη και ανάλυση εικόνας

ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

4 ανά πηγάδι) για 6- φρεατίων 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση, και το πλασμίδιο έκφρασης μορφομετατράπηκε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ δεξαμεθαζόνη (Nakalai Tesque) για 2 ώρες, και το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο εν απουσία ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.1 μg /mL Hoechst 33342 (Invitrogen) για 1 ώρα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA).

Ποσοτικοποίηση του mRNA με πραγματικού χρόνου RT-PCR

Όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαστήματα 4-h από έξι πλάκες σε κάθε χρονικό σημείο που αρχίζει 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη. Ολικό RNA από τα κύτταρα αυτά εξήχθη χρησιμοποιώντας ISOGEN (Nippon Gene, Τόκιο, Ιαπωνία) και αντίστροφη μεταγραφή.

Per2

και

GAPDH

μεταγραφές ήταν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Η PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Ενός Σταδίου SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Kyoto, Japan) με τις ακόλουθες παραμέτρους θερμικών κύκλων: 94 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 94 ° C για 20 s και 62 ° C για 1 λεπτό. Η

GAPDH

μεταγραφή χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την έκφραση του κάθε μεταγραφή. Κιρκάδιου σημασία ρυθμικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor (κιρκαδιανού ρυθμού Εργαστήριο) [22], [23]. Εκκινητές για κάθε γονίδιο σχεδιάστηκαν με βάση τις διαθέσιμες πληροφορίες από το National Center for Biotechnology Information (NCBI). Οι αλληλουχίες εκκινητή PCR ήταν ως εξής:

Per2

(GenBank αριθμός πρόσβασης Νο, NM_022817? Amplicon, 85 bp.): Με νόημα εναρκτήρας 5′-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 ‘και 5’-αντινοηματικός εκκινητής AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 ‘

GAPDH

(GenBank με κανένα, M33197? αμπλικόνιο, 185 bp.):. αίσθηση εκκινητή 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′ και αντιπληροφοριακό εκκινητή 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 ».

λουσιφεράσης δοκιμασία

Επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς λουσιφεράσης. Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

4 ανά φρεάτιο) επί πλακών 24 φρεατίων που περιέχουν DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (24 U /mL), και στρεπτομυκίνη (25 μg /mL). Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Για κάθε δείγμα, επιμολυσμένα DNA προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και διασπάστηκαν με 100 μι παθητικής ρυθμιστικού λύσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλής λουσιφεράσης Δοκιμασία (Promega) και ένα φωτόμετρο Ascent FS II (Thermo Scientific).

κηλίδωση Western

Όλα τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με 100 ηΜ δεξαμεθαζόνης για θεραπεία 2 h. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο. Μετά από 24-ώρες επώασης, αυτά τα κύτταρα λύθηκαν σε Κυττάρου λυτική-ΜΤ (Sigma). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 15,000 rpm στους 4 ° C για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα αποθηκεύτηκαν ως εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Για στύπωμα Western, 20- μα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 7.5% πολυακρυλαμίδιο δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS-ΡΑΑ) πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) -Tween που περιέχει 5% μη λιπαρό ξηρό γάλα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι HIF1α (αραίωση 1: 500? BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), PER2 (αραίωση, 1:1000? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Cry1 (αραίωση, 1:2000? Santa Cruz Biotechnology), CLOCK (αραίωση, 1:1000? Thermo Scientific), GAPDH (αραίωση, 1:10000? Sigma), και BMAL1 (αραίωση, 1:100? μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού που παράγεται στο εργαστήριο μας). Πραγματοποιήσαμε τέσσερις αναπαράγουν Western blots? ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα εμφανίζεται

δοκιμασία ChIP

πειράματα ChIP πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός εμπορικά διαθέσιμου σετ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Magna-chip? Millipore, Bedford, ΜΑ, USA).. Εν συντομία, κύτταρα Caki-2 απλώθηκαν σε δίσκους διαμέτρου 100-mm (5 × 10

4 κύτταρα ανά δίσκο)? Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση, 1%) επί 10 λεπτά στους 37 ° C για να συνδέσει εγκάρσια πρωτεΐνες στο DNA. Η μη αντιδράσασα φορμαλδεΰδη σβήστηκε με 1 mL 10 × γλυκίνης. Η πλάκα πλύθηκε δύο φορές με παγωμένο PBS, και τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν σε 1 mL PBS με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και ομαδοποιήθηκαν μαζί σε ένα σωλήνα 1,5 mL. Η διασυνδεδεμένη χρωματίνη διατμήθηκε με κατεργασία με υπερήχους 20 φορές επί 1 λεπτό κάθε φορά με 1 λεπτό από ψύξη επί πάγου μεταξύ των παλμών χρησιμοποιώντας μία Branson 2510 υπερήχων καθαριστικό (Branson, Danbury, CT, USA). Ανοσοκαταβύθιση (IP) πραγματοποιήθηκε με 5 μg είτε αντι-HIF1α (αραίωση 1: 500? Novus Biologicals Inc., Littleton, CO, USA) ή αντίσωμα αντι-IgG (Millipore) ως αρνητικός έλεγχος. Πλύσεις και έκλουση του DNA ΠΕ διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο Magna-chip (Millipore). Δέκα τοις εκατό (10%) της αρχικής διασπασμένο DNA χρωματίνη παρομοίως αντίστροφη διασυνδεδεμένη και καθαρίζεται, και το ανακτημένο DNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου. Διεξήχθη PCR με ειδικούς εκκινητές που πλευρίζουν το HRE-όπως αλληλουχία μέσα στην περιοχή υποκινητή του ανθρώπινου

Per2

γονίδιο (-476 να -284 bp, αίσθηση: 5′- ACGCCGGAAGTGGATGAGAC -3 ‘και αντινόημα: 5’ CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT -3 ‘) με τις ακόλουθες παραμέτρους θερμικών κύκλων: 94 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 94 ° C για 20 s, ανόπτηση στους 59 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s.

η στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τέσσερις φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± πρότυπα σφάλματα. Για να αξιολογήσουν τη σημαντικότητα των διαφορών, Φοιτητών

t-test

εκτελέστηκε. Χρησιμοποιήσαμε ένα μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) για συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων συγκέντρωσης φαρμάκου, ακολουθούμενη από την εφαρμογή του τεστ post hoc κατά Tukey. Για όλες τις αναλύσεις, το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο

P

& lt? 0,05. Το λογισμικό Cosinor (εικοσιτετράωρου ρυθμού Εργαστήριο) [22], [23] χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του κιρκαδιανού ρυθμικότητα.

Αποτελέσματα

Κιρκαδικό έκφραση του

Per2

γονιδίου σε καρκίνο του νεφρού κυτταρικές σειρές

Για να εξερευνήσετε την μεταγραφική ταλάντωση του

Per2

, όλες οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με ένα γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης καθοδηγείται από το

Per2

υποστηρικτής, και παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας Kronos Dio (ΑΒ-2550? ATTO). Ένας υποκινητής λουσιφεράση συνδεδεμένη σε κύτταρα Caki-2 εμφανίζεται κιρκαδικούς ρυθμούς μετά από 2 ώρες δεξαμεθαζόνη θεραπεία (Εικ. 1Α, Πίνακας 1), αλλά ρυθμικότητα δεν ανιχνεύθηκε στις άλλες κυτταρικές γραμμές (Εικ. S1). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές και τα αποτελέσματα αυτά ήταν συνεπή. 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη,

Per2

επίπεδα mRNA είχε ένα κιρκαδικό ρυθμό στα Caki-2 κύτταρα (Σχ. 1 Β, Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κιρκαδιανό ρυθμικότητα του

Per2

γονίδιο δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές, με εξαίρεση τα κύτταρα Caki-2.

(Α) Όλα τα νεφρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με το ρεπόρτερ Per2 προαγωγό (2 μg) και το βιοφωταύγειας στη συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο. Σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση της λουσιφεράσης δραστηριότητας του

Per2

υποστηρικτής έδειξαν ότι η δραστηριότητα κυμάνθηκε πάνω από ένα κύκλο περίπου 24 ωρών. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων απεικονίζεται. Αυτές οι καλλιέργειες έδειξαν σημαντική κιρκαδικούς ρυθμούς (Πίνακας 1). (Β) Τα επίπεδα του mRNA της

Per2

προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου για έξι πλάκες σε κάθε χρονικό σημείο. Ολικό RNA εξήχθη κάθε 4 ώρες, ξεκινώντας 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη για έναν κύκλο 24-h, και

Per2

μεταγραφήματα ποσοτικά. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τα τυπικά σφάλματα των μέσων τιμών (

n

= 6). Τα δεδομένα από ένα και μόνο 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor για ρυθμικότητα (Πίνακας 1). (Γ) Η δομή του

Per2

υποκινητή και μια ανάλυση των πιθανών μοτίβων παράγοντα δέσμευσης μεταγραφής σε αυτή την περιοχή. Το 2994-bp περιοχή περιέχει ένα E-box-σαν αλληλουχία (CACGTT) και μία αλληλουχία HRE-σαν (ATGTG), παρόμοια με την συναινετική αλληλουχία HRE (ACGTG) που βρίσκεται ανάντη της θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS). (D) συγκρίσεις Ακολουθία: πάνω γραμμή, ακολουθία ποντίκι? κάτω γραμμή, ανθρώπινη ακολουθία. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του δυναμικού μοτίβων παράγοντα δέσμευσης μεταγραφής για αλληλουχία E-μοιάζει με κουτί και HRE-όπως αλληλουχία είναι 100% συντηρημένα μεταξύ ποντικού και ανθρώπου.

Η

Ανάλυση του

Per2

υποστηρικτής περιοχή

μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ένα E-box-όπως ακολουθία (CACGTT) και κατάντη περιοχή του είναι απαραίτητη για την μεταγραφική ταλάντωση του

Per2

, ένα κρίσιμο συστατικό της μοριακό ρολόι [24]. Εστιάσαμε σε αυτό το E-box-όπως περιοχής και HRE. Τα μοτίβα παράγοντα δέσμευσης μεταγραφής βρίσκεται στην

Per2

προαγωγό σε ποντίκια και ανθρώπους αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό MatInspector (Genomatix, Μόναχο, Γερμανία). Ανάλυση αλληλουχίας του

Per2

περιοχή προαγωγού αποκάλυψε υψηλή ομολογία μεταξύ ποντικών και ανθρώπων. Η ανάλυση της αλληλουχίας αποκάλυψε επίσης ένα E-box-ειδή αλληλουχία (CACGTT) και ένα HRE-ειδή αλληλουχία (ATGTG), παρόμοια με την συναινετική αλληλουχία HRE (ACGTG) [25] που βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS) (Σχ. 1C ). Αυτές οι αλληλουχίες ήταν 100% συντηρημένη μεταξύ ποντικών και ανθρώπων (Σχ. 1D). Μία δοκιμασία παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο (Σχ. 1Α) έδειξε ότι η περιοχή προαγωγού κλωνοποιήσαμε είναι επαρκής για την παραγωγή κιρκαδικού μεταγραφική ταλάντωση σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές.

Η έκφραση των γονιδίων του ρολογιού στη νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές

Για να εξεταστεί η διαφορά μεταξύ άλλες κυτταρικές σειρές Caki-2 και, εξετάσαμε την έκφραση του BMAL1, CLOCK, PER2 και πρωτεΐνες Cry1. Caki-2, 786-O, και Α498 κύτταρα εξέφρασαν BMAL1 πρωτεΐνη. Όλες οι νεφρικές κυτταρικές σειρές καρκίνου εκφράζονται CLOCK και πρωτεΐνη Cry1, αλλά δεν εκφράζουν PER2 πρωτεΐνη (Εικ. 2Α). κηλίδες πλήρους μήκους PER2 και BMAL1, εκτός από ένα θετικό έλεγχο, παρουσιάζονται στο Σχήμα S2, S3.

Όλες οι κυτταρικές σειρές λύθηκαν και συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά το συγχρονισμό με κατεργασία δεξαμεθαζόνης 2 ωρών. Πραγματοποιήσαμε τέσσερις αναπαράγουν Western blots? ένας εκπρόσωπος κηλίδα εμφανίζεται. (Α) κηλίδες Western του νεφρικού καρκίνου εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων (20 μg) με BMAL1, CLOCK, PER2, Cry1 και αντισώματα GAPDH απεικονίζεται. κηλίδες πλήρους μήκους PER2 και BMAL1, εκτός από ένα θετικό έλεγχο, παρουσιάζονται στο Σχήμα S2, 3. (Β) κηλίδες Western του νεφρικού καρκίνου εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων (20 μg) με HIF1α και αντισώματα GAPDH δείχνονται.

η έκφραση της πρωτεΐνης HIFα υπό νορμοξικές συνθήκες στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του νεφρού

Δεδομένου ότι η πρωτεΐνη HIF1α μπορεί να υπερεκφράζεται γενικά σε RCC, εξετάσαμε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης HIF1α. Σε Caki-2 και RCC4 + φορέα μόνο, HIF1α πρωτεΐνη υπερεκφράζεται (Εικ. 2Β). Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα ότι η

Per2

κιρκαδικό ρυθμό δείχθηκε μόνο σε κύτταρα Caki-2, το οποίο περιείχε BMAL1, CLOCK, και πρωτεΐνη HIF1α, είναι πιθανό ότι HIF1α σχετίζεται με το

Per2

κιρκαδικού ρυθμού σε ασθενείς με νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Ο αντίκτυπος των HIF1α στο

Per2

μεταγραφική δραστηριότητα

για να εξετάσει τον αντίκτυπο της HIF1α στο

Per2

μεταγραφική δραστηριότητα, ΝΙΗ3Τ3 και U2OS κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα γονίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης που κινείται από τον

Per2

υποκινητή και συν-επιμολύνθηκαν με το

Hif1α

και

Arnt

φορέα έκφρασης. Συν-επιμόλυνση με HIF1α /ARNT αύξησε το πλάτος της ταλάντωσης και δεν είχε καμία επίδραση στην περίοδο ή ακροφάση ταλάντωσης σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Α-D, Πίνακας 2). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Caki-2 (Σχ. 3Ε, F, Πίνακας 2).

(Α) κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 συν-επιμολύνθηκαν με το

Per2

ρεπόρτερ προαγωγό (400 ng ) και τα πλασμίδια έκφρασης που αναφέρονται (300 ng) για HIF1α /ARNT ή κενό φορέα pcDNA3 (600 ng) ως έλεγχος. Η βιοφωταύγεια συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο. Έλεγχος, επιμολυσμένα με άδειο φορέα pcDNA3 (έλεγχος μη κλωνοποιημένα-φορέα)? + HIF1α /ARNT, επιμολυσμένα με τα πλασμίδια έκφρασης. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες των τεσσάρων επαναληπτικών δειγμάτων που φαίνεται. (Β) έχει αφαιρεθεί η τάση βιοφωταύγεια εμφανίζεται. Περίοδο, το πλάτος, και ακρόφασης των ταλαντώσεων μετρήθηκαν τις ημέρες 2 έως 5 χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor (εικοσιτετράωρου ρυθμού Laboratory). Πλάτος αυξήθηκε σημαντικά (μέση τιμή ± SEM,

n

= 4) σε σύγκριση με τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,01, του Student

t-

δοκιμή). Βλέπε Πίνακα 2. (C) κύτταρα U2OS συν-επιμολύνθηκαν με το

Per2

ρεπόρτερ προαγωγό (400 ng) και τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια έκφρασης (300 ng) για HIF1α /ARNT ή κενό φορέα pcDNA3 (600 ng) ως ένας έλεγχος. Η βιοφωταύγεια συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο. Έλεγχος, επιμολυσμένα με άδειο φορέα pcDNA3 (έλεγχος μη κλωνοποιημένα-φορέα)? + HIF1α /ARNT, επιμολυσμένα με τα πλασμίδια έκφρασης. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες των τεσσάρων επαναληπτικών δειγμάτων που φαίνεται. (D) έχει αφαιρεθεί η τάση βιοφωταύγεια δείχνεται. Περίοδο, το πλάτος, και ακρόφασης των ταλαντώσεων μετρήθηκαν τις ημέρες 2 έως 5 χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor (εικοσιτετράωρου ρυθμού Laboratory). Πλάτος αυξήθηκε σημαντικά (μέση τιμή ± SEM,

n

= 4) σε σύγκριση με τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,01, του Student

t-

δοκιμή). Βλέπε Πίνακα 2. κύτταρα (Ε) Caki-2 συν-επιμολύνθηκαν με τις

Per2

ρεπόρτερ προαγωγό (2 μg) και τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια έκφρασης (1,5 μg) για HIF1α /ARNT ή κενό φορέα pcDNA3 (3 μg ) ως έλεγχο. Η βιοφωταύγεια μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο. Έλεγχος, επιμολυσμένα με άδειο φορέα pcDNA3 (έλεγχος μη κλωνοποιημένα-φορέα)? + HIF1α /ARNT, επιμολυσμένα με τα πλασμίδια έκφρασης. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων απεικονίζεται. (F) έχει αφαιρεθεί η τάση βιοφωταύγεια δείχνεται. Περίοδο, το πλάτος, και ακρόφασης των ταλαντώσεων μετρήθηκαν από τις ημέρες 2 έως 5 χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor (εικοσιτετράωρου ρυθμού Laboratory). Πλάτος αυξήθηκε σημαντικά (μέση τιμή ± SEM,

n

= 4) σε σύγκριση με τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,01, του Student

t

-τεστ). Βλέπε Πίνακα 2.

Η

HIF1α δεν έχει καμία επίδραση στον αριθμό των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3

Για να προσδιορίσετε αν HIF1α ενισχύσει το πλάτος της ταλάντωσης του

Per2

δραστηριότητες υποστηρικτής με την αύξηση του αριθμού των κυττάρων, εκτελέσαμε μέτρηση κυττάρων χρησιμοποιώντας ArrayScan XTI (Thermo Scientific). Συν-επιμόλυνση με HIF1α /ARNT δεν είχε καμία επίδραση στον αριθμό των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 (Εικ. 4). Αυτό δείχνει ότι HIF1α /ARNT αύξησε την βιοφωτισμός του

Per2

δραστηριότητες υποκινητή που δεν επηρεάζουν τον αριθμό των κυττάρων.

ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το Per2 ανταποκριτή προαγωγό (400 ng) και το υποδεικνυόμενο πλασμίδια έκφρασης (300 ng) για HIF1α /ARNT ή κενό φορέα pcDNA3 (600 ng) ως έλεγχος. Οι πλάκες διαβάστηκαν στο ArrayScan XTI (Thermo Scientific) για την καταμέτρηση των κυττάρων ενδείκνυται χρόνο μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη. Οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων δεν επηρεάστηκαν από HIF1α /ARNT σε όλα τα χρονικά σημεία (μέση τιμή ± SEM,

n

= 6, του Student

t

-τεστ).

Η

HIF1α συνδέεται άμεσα με την HRE-όπως ακολουθία μέσα στο

Per2

υποστηρικτής

για να προσδιορίσετε αν HIF1α επηρεάζονται

Per2

μεταγραφή μέσω της HRE-σαν στοιχείο, ένα υποθετικό HIF1α- αλληλουχία πρόσδεσης, εξετάσαμε τις επιδράσεις της HIF1α /ARNT στο

Per2

έκφραση χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία λουσιφεράσης σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. HIF1α /ARNT αυξηθεί

Per2

μεταγραφική δραστηριότητα, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην HRE-μεταλλαγμένο

Per2

υποκινητές (Εικ. 5Α, Β). CoCl

2 θεραπεία επάγει έκφραση HIF1α με σύνδεση προς τον τομέα PAS, με αποτέλεσμα την απόφραξη του HIF1α-pVHL δεσμευτική και ως εκ τούτου HIF1α σταθερότητα [26], [27]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της CoCl

2 επαγόμενη HIF1α υπερέκφραση στο

Per2

μεταγραφική δραστικότητα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CoCl

2. CoCl

2 ρυθμίζεται αυξητικά

Per2

μεταγραφή αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί της HRE-μεταλλαγμένο

Per2

προαγωγό (Εικ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η HRE-όπως ακολουθία στο

Per2

υποστηρικτής έχουμε κλωνοποιημένα ανταποκρίθηκαν στο HIF1α υπερέκφραση. Για να διερευνηθεί κατά πόσο HIF1α συνδέεται άμεσα με την HRE-όπως ακολουθία στο

Per2

υποστηρικτής

in vivo

, μια δοκιμασία ChIP εκτελέστηκε. Cross-linked Caki-2 κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-HIF1α αντίσωμα ή φυσιολογική IgG κουνελιού. Τα προκύπτοντα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με αναλύσεις PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που πλευρίζουν τις αλληλουχίες HRE-όπως (-476 έως -284 bp) του

Per2

υποκινητή. Μια αξιοσημείωτη αύξηση στην ένταση της ζώνης DNA παρατηρήθηκε για το κουνελιού αντι-HIF1α αντίσωμα (Σχ. 5D, λωρίδα 3), αλλά όχι για την κανονική IgG κουνελιού (Σχ. 5D, λωρίδα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HIF1α μπορεί να αυξήσει

Per2

μεταγραφική δραστηριότητα με απευθείας σύνδεση με την HRE στοιχείο που μοιάζει και να ενισχύσει το πλάτος της ταλάντωσης του

Per2

δραστηριότητες υποκινητή.

(Α ) Σχηματική αναπαράσταση του ποντικιού

Per2

υποκινητή. Η ανώτερη περιοχή αντιπροσωπεύει το ποντίκι άγριου τύπου

Per2

προαγωγός και η κάτω περιοχή αντιπροσωπεύει την HRE-μεταλλαγμένο

Per2

υποκινητή. (Β) HIF1α /ARNT ισχυρά που προκαλείται

Per2

δραστηριότητα του υποκινητή. Η

Per2

υποκινητή και το HRE-μεταλλαγμένο

Per2

ρεπόρτερ υποκινητή (60 ng) συν-επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια έκφρασης (+? 50 ng).

Per2

δραστηριότητες υποστηρικτής αυξήθηκαν σημαντικά (μέση τιμή ± SEM,

n

= 4,

σ

& lt? 0,01,

t

test του Student) σε σύγκριση με ο έλεγχος (χωρίς το πλασμίδιο έκφρασης), αλλά η HRE-μεταλλαγμένο

Per2

προαγωγού δεν επηρεάζονται. (C) Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την αγωγή με CoCl

2 (10, 30, 100 μΜ για 6 ώρες), μετρήθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης.

Per2

δραστηριότητες υποκινητή αυξήθηκαν σημαντικά (μέση ± SEM,

n

= 4,

ρ

& lt? 0,05, μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post hoc τεστ Tukey του) συγκέντρωση -dependently σύγκριση με τον έλεγχο, αλλά η HRE-μεταλλαγμένο

Per2

προαγωγού δεν επηρεάζονται. (D) HIF1α αλληλεπιδρά ειδικά με την HRE-όπως ακολουθία μέσα στο

Per2

υποκινητή. Caki-2 κύτταρα διασυνδεδεμένη, λύθηκαν και ανοσοκατακρημνίσθηκαν με αντισώματα αντι-HIF1α αντίσωμα ή κανονική IgG κουνελιού (αρνητικός έλεγχος). Το καταβυθισθέν DNA υποβλήθηκε σε PCR με εκκινητές ειδικούς για την περιοχή στόχο (-476 /-284). Ένα κλάσμα του DNA εισόδου χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. PCR προϊόν παρατηρήθηκε στο αντι-HIF1α πλινθίου (λωρίδα 3) και 10% του DNA εισόδου (λωρίδα 4). Ουσιαστικά μικρότερη ανιχνεύθηκε στο καμία ChIP αντίσωμα (λωρίδα 1) και της κανονικής IgG κουνελιού πλινθίου (λωρίδα 2) λωρίδες.

Η

Η επίδραση της αναστολής HIF1α στο

Per2

κιρκαδικό ρυθμό

Chrysin είναι ένα φυσικό φλαβονοειδές, το οποίο είναι γνωστό ότι αναστέλλει την έκφραση HIF1α με τη μείωση της πρωτεϊνικής σύνθεσης και με τον τρόπο αυτό μειώνεται η σταθερότητα HIFα χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων [28]. Για να εξεταστεί η επίδραση της αναστολής της HIF1α πρωτεΐνης στο

Per2

κιρκάδιου ρυθμού, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις chrysin. Η έκφραση της πρωτεΐνης HIF1α κατεστάλη σημαντικά μετά από 2 ωρών επώαση με 100 μΜ chrysin σε κύτταρα Caki-2 (Σχ. 6Α, Β). Το πλάτος του κιρκαδιανού ρυθμού του

Per2

δραστηριότητα υποκινητή μειώθηκε σημαντικά μετά από 2 ωρών επώαση με 100 μΜ chrysin σε Caki-2 κύτταρα (Σχ. 6C, D, Πίνακας 3). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, HIF1α μπορεί να ενισχύσει τις κιρκαδικούς ρυθμούς του

Per2

στο επίπεδο υποκινητή.

(Α) κύτταρα Caki-2 καλλιεργήθηκαν σε 60-70% συρροή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ως μάρτυρας, ή διαφορετικές συγκεντρώσεις χρυσίνη (1, 10, 100 μΜ) για 2 ώρες. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης HIF1α μετρήθηκαν σε τιμές οπτικής πυκνότητας κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες έλεγχο GAPDH φόρτωση τους, τότε ο μέσος όρος ± SEM, και απεικονίζονται γραφικά (σχετική έκφραση) προς σύγκριση ημιποσοτικά επίπεδα πρωτεΐνης (

n

= 4). έκφραση HIF1α κατεστάλη σημαντικά με 100 ηΜ chrysin σύγκριση με τον έλεγχο επωάστηκαν με DMSO (

ρ

& lt? 0,05, μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή hoc υστέρων κατά Tukey). (C) κύτταρα Caki-2 διαμολύνθηκαν με το

Per2

ρεπόρτερ προαγωγό (2 μg). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΜ chrysin ή DMSO για 2 ώρες. Η βιοφωταύγεια συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων απεικονίζεται. (D) έχει αφαιρεθεί η τάση βιοφωταύγεια δείχνεται. Περίοδο, το πλάτος, και ακρόφασης των ταλαντώσεων μετρήθηκαν τις ημέρες 2 έως 5 χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cosinor (εικοσιτετράωρου ρυθμού Laboratory). Amplitude μειώθηκε σημαντικά (μέση τιμή ± SEM,

n

= 4) σε σύγκριση με τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,05). Βλέπε Πίνακα 3.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, ρυθμική έκφραση του

Per2

γονίδιο παρατηρήθηκε σε κύτταρα Caki-2. Ωστόσο,

Per2

δραστηριότητες υποκινητή και επιπέδων mRNA δεν έχουν κιρκαδικούς ρυθμούς σε οποιεσδήποτε άλλες κυτταρικές σειρές. Μερικές διαφορές ενδέχεται να υπάρχουν μεταξύ άλλων νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών Caki-2 και. Επειδή

Per2

γονιδιακή μεταγραφή ενεργοποιείται από την ετεροδιμεριστεί παράγοντα μεταγραφής BMAL1 /CLOCK με σύνδεση προς την αλληλουχία E-box-όπως [24], εξετάσαμε την έκφραση του BMAL1 και πρωτεΐνης ρολόι σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Caki-2, 786-O, και Α498 κύτταρα εξέφρασαν BMAL1, και όλες οι κυτταρικές γραμμές περιείχαν πρωτεΐνη CLOCK. Επιπλέον, όλες οι νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών που εκφράζονται Cry1 πρωτεΐνη, αλλά δεν εκφράζουν PER2 πρωτεΐνη. Σε κύτταρα Caki-2, εξετάσαμε επίσης την έκφραση των PER2 πρωτεΐνης σε διαστήματα 4-h αρχίζοντας 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δεξαμεθαζόνη. Ωστόσο, δεν πρωτεΐνη PER2 ανιχνεύθηκε σε όλα τα χρονικά σημεία (Εικ. S4).