Αφηρημένο

Ιστορικό

E

sophageal πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα (ESCC) είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη στην Κίνα και άλλες ασιατικές χώρες, ως σημαντική αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο. ESCC εμφανίζει συγκρότημα χρωμοσωμικές ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών διαρθρωτικών και αριθμητικές εκτροπές. Χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όπως επαναλαμβανόμενες ενισχύσεις και ομόζυγη διαγραφές, συμβάλλουν άμεσα στην ογκογένεση μέσω μεταβολής της έκφρασης των βασικών ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Μεθοδολογία /Αρχή Ευρήματα

T

o κατανοήσουν το ρόλο των γενετικών αλλοιώσεων σε ESCC παθογένεια και τον εντοπισμό κρίσιμων στόχων ενίσχυσης /διαγραφή, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σειράς 1-Mb γονιδίωμα-ευρεία συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (aCGH) για 10 που χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές σειρές ESCC. Επαναλαμβανόμενες χρωμοσωμικές κέρδη συχνά ανιχνεύονται στο 3q26-27, 5p15-14, 8p12, 8p22-24, 11q13, 13q21-31, 18p11 και 20q11-13, με συχνές απώλειες διαπίστωσε επίσης για 8p23-22, 11q22, 14q32 και 18q11-23 . Κέρδος 11q13.3-13.4 ήταν η συχνότερη αλλοίωση ESCC. Μέσα σε αυτή την περιοχή,

CCND1

ογκογονίδιο ταυτίστηκε με το υψηλό επίπεδο της ενίσχυσης και η υπερέκφραση σε ESCC, ενώ

ήταν επίσης εντυπωσιακά υπερεκφράζεται SHANK2

FGF19

και. Επιπλέον, ένα υψηλής αντιστοιχίας (91,5%) της ενίσχυσης του γονιδίου και της πρωτεΐνης υπερέκφραση του

CCND1

παρατηρήθηκε σε πρωτογενείς όγκους ESCC.

CCND1

ενίσχυση /υπερέκφραση επίσης συσχετίστηκε σημαντικά με τον λεμφαδένα μετάσταση ESCC.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η γονιδιωματική κέρδος 11q13 είναι ο κύριος μηχανισμός που συμβάλλει στην ενίσχυση. Μυθιστόρημα ογκογονίδια που εντοπίζονται στο 11q13 αμπλικόνιο συμπεριλαμβανομένων των

FGF19

και

SHANK2

μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ESCC ογκογένεση

Παράθεση:. Ying J, Shan L, Li J, Zhong L , Xue L, Zhao H, et al. (2012) Genome-Wide Έλεγχος για γενετικές αλλοιώσεις σε καρκίνο του οισοφάγου από aCGH Προσδιορίζει 11q13 Ενίσχυση ογκογονίδια συνδεδεμένες με Κομβικό μετάσταση. PLoS ONE 7 (6): e39797. doi: 10.1371 /journal.pone.0039797

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 6η Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 30η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2012 |

Copyright: © 2012 Ying et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (# 30801344, # 30928012) και του Πεκίνου Nova Πρόγραμμα (Νο 2009A70). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του οισοφάγου είναι μία από τις πιο επιθετικές κακοήθειες προέρχεται από το γαστρεντερικό σωλήνα, και κατατάσσεται ως η έκτη κύρια αιτία των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο στον κόσμο [1]. συχνότητα εμφάνισης του ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των διαφόρων περιοχών σε όλο τον κόσμο, με την Κίνα ως περιοχή υψηλού κινδύνου. Σε ορισμένες περιοχές της βόρειας και κεντρικής Κίνας, συχνότητα εμφάνισης της υπερβαίνει τα 100 περιπτώσεις /ανά 100.000 ανά έτος [2]. Ιστολογικά, καρκίνο του οισοφάγου ταξινομείται ως αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου και οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC). Οι περισσότερες από τις περιπτώσεις που αναφέρθηκαν στις ΗΠΑ είναι οισοφάγου αδενοκαρκινώματα, ωστόσο, στην Κίνα και σε άλλες ασιατικές χώρες, ESCC είναι το κυρίαρχο είδος που αντιπροσωπεύει περίπου το 90% όλων των περιπτώσεων. Παρά τις προόδους στην πολυτροπική θεραπείες, ESCC παραμένει ένα σοβαρό πρόβλημα του καρκίνου περίθαλψης σε πολλές χώρες με πολύ χαμηλά ποσοστά επιβίωσης 5 ετών (& lt? 30%) [3]. Έτσι, έχει μεγάλη κλινική αξία να ψάξουν για ευαίσθητη και ειδική βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση της παρούσας κακοήθειας, καθώς και νέων θεραπευτικών στόχων.

γενωμικών ενισχύσεων και διαγραφές συμβάλλουν στην ανθρώπινη ογκογένεση με μεταβολή της έκφρασης τα επίπεδα των κρίσιμων ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠΕ). Παρά την υψηλή επικράτηση της, ESCC δεν έχει μελετηθεί τόσο έντονα όσο αδενοκαρκίνωμα ομόλογό του. Προσπάθειες έχουν τεθεί για τον εντοπισμό ακαθάριστο αριθμού αντιγράφων μεταβολές των δύο κυτταρικές σειρές ESCC και όγκων, συμπεριλαμβανομένων καρυότυπο, φθορισμός

in situ

υβριδισμός (FISH), συμβατικό υβριδισμό συγκριτική γονιδιώματος (CGH) και απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) αναλύσεις . Σύμφωνα με τα διαθέσιμα στοιχεία που δημοσίευσε σήμερα, οι πιο συχνά σε πράξεις χρωμοσωμικές ενισχύσεις σε ESCC 3ο τρίμηνο, 4Q, 5ρ, 8ρ, 7q, 9Q, 10q21, 11q13-q22, 18p11.3, 20q και 22qtel [4] – [12]. Ενισχύσεις που φιλοξενούν ογκογονίδια, π.χ. 11q13 (

CCND1

,

EMS1

), 3q26 (

EIF5A2

), 21q22 (

ETS2

), 8q24

(MYC)

, έχουν παρατηρηθεί σταθερά σε περισσότερες από μία μελέτες [4] – [12]. Χρωμοσωμικές απώλειες περιοδικά περιλαμβάνουν 3ρ, 5q, 9p, 13q, 18q και 21q, στο οποίο στοχεύουν τα γονίδια, όπως

FHIT

,

APC

,

RB1 ​​

και

CDKN2A

βρίσκονται [4] – [12]. Τα τελευταία χρόνια, υψηλής ανάλυσης array-CGH βάση (aCGH) έχει εφαρμοστεί για τον εντοπισμό ογκογονίδια στόχο και ΕΠΠΕ μέσω του καθορισμού επαναλαμβανόμενων κερδών και ζημιών σε διάφορους καρκίνους. Μέχρι πρόσφατα, δύο μελέτες που έχουν διεξαχθεί ανάλυση aCGH στην πρωτογενή δείγματα ESCC, αποκαλύπτοντας επαναλαμβανόμενες, ενισχύσεις υψηλού επιπέδου στο 3q27.1, 7p11, 8q21.11, 8q24.21, 11q13.3, 11q22, 12q15-q21.1, 18q11.2 και 19q13.11-q13.12, και ομόζυγη διαγραφές σε 4q34.3-q35.1 και 9p21.3 [13]? [14]. Ωστόσο, σε σύγκριση με το «καθαρό» κυτταρικές σειρές ESCC, στοιχειώδη δείγματα ESCC περιέχουν πολλά φυσιολογικά κύτταρα που ενδέχεται να επηρεάσουν aCGH αποτελέσματα με διαφορετικούς τρόπους. Παρά το γεγονός ότι αρκετές ολοκληρωμένη ολόκληρη μελέτες γονιδιώματος σε κυτταρικές σειρές ESCC έχει αναφερθεί, οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται προέρχονται κυρίως από την ιαπωνική ESCC (ΤΕ σειρά) και της Νότιας Αφρικής ESCC ασθενείς, αντίστοιχα [15] – [17]. Χαρακτηριστικών των πολλαπλών κυτταρικών σειρών ESCC προέρχονταν από διαφορετικές περιοχές υψηλού κινδύνου σε χώρες της Ασίας μέσω aCGH δεν θα επιτρέψει μόνο την αναγνώριση των επαναλαμβανόμενων χρωμοσωμικών αλλαγών στις ασιατικές ESCC, αλλά και να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για μελλοντικές μελέτες που χρησιμοποιούν αυτές τις κυτταρικές σειρές, όπως τα μοντέλα ESCC.

Σε αυτή τη μελέτη, προφίλ 10 που χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές σειρές ESCC προέρχονται από ηπειρωτικής Κίνας (EC1, ΕΚ18 και EC109), το Χονγκ Κονγκ, Κινέζικα (HKESC1, HKESC2, HKESC3 και SLMT1) και Ιαπωνικά (KYSE70, KYSE410 και KYSE520) των ασθενών για ολόκληρου του γονιδιώματος μεταβολές αριθμό αντιγράφων του DNA με τη χρήση ανάλυσης aCGH. Μεταξύ εντοπίστηκαν αλλαγές, ενίσχυση της 11q13 είναι η πιο συχνή αύξηση που παρατηρείται, υπόθαλψη

FGF19

,

SHANK2

και

CCND1

. Έχουμε περαιτέρω βρεθεί ότι

CCND1

έκφρασης συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε πρωτογενείς όγκους ESCC, και ενίσχυση DNA συμβάλλει στην υπερέκφραση της, η οποία συσχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα πρωτογενών όγκων ESCC.

Αποτελέσματα

Γονιδιωματική προφίλ των ESCC γραμμές κυττάρων από 1-Mb aCGH

Δέκα κυτταρικές σειρές ESCC αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 1-Mb aCGH (Sanger 3040-BAC /PAC κλώνος array). αναλογίες ένταση του σήματος για κάθε BAC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και εμφανίζεται ως οικόπεδα log2 χρησιμοποιώντας SeeGH λογισμικού [18]. Το σχήμα 1 δείχνει την αντιπροσωπευτική SeeGH karyograms μιας κυτταρικής σειράς ESCC (ΕΚ18) αναλύεται, καταδεικνύοντας την ταυτοποίηση των διαφόρων κερδών και ζημιών. Άλλες SeeGH karyograms των κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν ESCC φαίνεται στο Σχήμα S1. Σχήμα 2 συνοψίζει τα περιοδικά μεταβληθεί περιοχές (με αναλογίες log2 περισσότερο από 1 ή λιγότερο από -1). Σε γενικές γραμμές, χρωμοσωμικές κέρδη πιο συχνά ανιχνεύονται από τις απώλειες. Οι πιο συχνές μεταβολές περιλαμβάνουν αύξηση του 11q13 (70%) και πλήρη απώλεια της 18q11-23 (50%). Άλλα κέρδη που συμβαίνουν σε τρεις ή περισσότερες κυτταρικές σειρές είναι 3q26-27 (40%), 5p15-14 (50%), 8p12 (30%), 8p22-24 (30%), 13q21-31 (30%), 18p11 ( 30%) και 20q11-13 (40%). Άλλες απώλειες που συμβαίνουν σε τρεις ή περισσότερες κυτταρικές σειρές είναι 8p23-22 (40%), 11q22 (30%) και 14q32 (30%) (Εικ. 2).

Κανονικοποιημένη αναλογίες ένταση σήματος log2 απεικονίσθηκαν χρησιμοποιώντας SeeGH λογισμικό. Ένας λόγος σήματος log2 από το 0 αντιπροσωπεύει ισοδύναμου αριθμού αντιγράφου μεταξύ του δείγματος και της αναφοράς DNA (λεπτομέρειες στο Υλικά και Μέθοδοι). Cytoband πρότυπο για κάθε χρωμόσωμα δείχνεται στο αριστερό. Οι κάθετες γραμμές δηλώνουν αναλογίες σήματος log2 -2-2 με αριθμό αντιγράφων αυξάνεται στα δεξιά και μειώνεται στο αριστερό. Κάθε σκούρο μπλε κουκίδα αντιπροσωπεύει έναν απλό κλώνο BAC.

Η

Οι ανωμαλίες με συχνότητα ≥20% σε 10 κυτταρικές σειρές ESCC φαίνονται. * Οι Περιφέρειες με ανωμαλίες σε κυτταρικές σειρές ≥50% εμφανίζονται με έντονους χαρακτήρες.

Η

Ενίσχυση και υπερέκφραση του 11q13 γονίδια σε ESCC Γραμμές κυττάρων

Μεταξύ των περιοχών που προσδιορίζονται με επαναλαμβανόμενες αλλαγές, ενίσχυση της 11q13 0,3 έως 13,4 είναι η πιο συχνή κέρδος σε ESCC (Εικ. 3Α), ιδιαίτερα σε εκείνες τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από Κινέζους ασθενείς (6/7 κυτταρικές σειρές, 85%). Αρκετά γονίδια με τους πιθανούς ογκογόνο λειτουργίες έχουν εντοπιστεί σε αυτό τον τόπο, συμπεριλαμβανομένων των

CCND1

και

CTTN

. Έτσι, 11q13 ερευνήθηκε περαιτέρω για την επιβεβαίωση των κερδών και ταυτοποίηση των ενισχυμένων γονιδίων, με duplex γονιδιωματικό DNA PCR σε 10 κυτταρικές γραμμές ESCC.

CCND1

αντιστοιχίζεται στο κέντρο της 11q13 amplicon, και την ενίσχυση υψηλού επιπέδου

CCND1

επιβεβαιώθηκε σε 6/10 κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Β, C), ενώ

CTTN

εμφάνισε το δεύτερο υψηλότερο επίπεδο της ενίσχυσης (σε 5/10 κυτταρικές σειρές).

, aCGH προφίλ των έξι κυτταρικών σειρών ESCC στο

CCND1

τόπο. Κανονικοποιημένες αναλογίες σήματος log2 χαράχθηκαν. Ενισχύσεις ορίστηκαν ως εντάσεις σήματος log2 ≥1. Οριζόντιες γραμμές δηλώνουν αναλογίες σήματος log2 -1 έως 3 με τον αριθμό αντιγράφων αύξηση προς τα πάνω. Κάθε μαύρο /πολύχρωμο κουκίδα αντιπροσωπεύει έναν απλό κλώνο BAC. Τα ονόματα των συνδεδεμένων κλώνων BAC εμφανίζονται επίσης. Αντίγραφο χάρτης του πυρήνα 11q13 αμπλικόνιο φαίνεται στο κάτω μέρος.

Β

, Ημι-ποσοτική duplex γονιδιωματικής ανάλυσης DNA PCR του

CCND1

σε 10 κυτταρικές σειρές ESCC και 3 φυσιολογικά δείγματα PBMC. αναλογίες ένταση του σήματος του

CCND1

/

GAPDH

φαίνονται.

C

, Περίληψη αριθμού αντιγράφων γονιδίου αλλαγές αρκετών γονιδίων εντός του 11q13 αμπλικόνιο. Οι αριθμοί που εμφανίζονται στον πίνακα αποτελούν πτυχώσεις του αριθμού αντιγράφων του ESCC κυτταρικών σειρών σε σχέση με τις μέσες τιμές των τριών δειγμάτων PBMC. PBMC, περιφερειακά μονοπύρηνα κυττάρων αίματος.

Η

Πολλά γονίδια γύρω από

CCND1

στο 11q13 περαιτέρω εξετάστηκαν από ημι-ποσοτική RT-PCR σε κυτταρικές σειρές ESCC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

FGF19

και

SHANK2

επίσης αξιοσημείωτα υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές ESCC, ενώ μόνο ασθενώς ή όχι εκφράζεται σε φυσιολογικό οισοφάγο ή αθανατοποιημένα φυσιολογικά κύτταρα (Εικ. 4), αν και χωρίς προφανή ενίσχυση του

SHANK2

ανιχνεύθηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

FGF3

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και

4

ήταν ουσιαστικά δεν εκφράζεται σε κάθε κυτταρική σειρά ESCC ή κανονική οισοφάγο. Η υπερέκφραση του

CCND1

και

CTTN

παρατηρήθηκε επίσης στις περισσότερες κυτταρικές σειρές ESCC σε σύγκριση με την κανονική οισοφάγο, παρόλο που γενικά εκφράζεται σε φυσιολογικό οισοφάγο και αθανατοποιημένα κύτταρα (Εικ. 4). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά επιβεβαίωσαν ότι 11q13 είναι η πιο συχνή ενίσχυση στην ESCC και οριοθετείται πολλά γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

CCND1

,

CTTN

,

FGF19

και

SHANK2,

ως πιθανές κρίσιμες ογκογονίδια που επηρεάζονται.

το καθεστώς ενίσχυσης των 11q13 περιοχής από aCGH και

CCND1 από

multiplex DNA PCR παρατίθενται στο κάτω μέρος. +, Ενισχυμένο? -, Δεν ενισχύεται. 23x, 25x, 30x: κύκλοι RT-PCR. Όλα τα άλλα γονίδια εξετάστηκαν με RT-PCR με 30 κύκλους, με το

GAPDH

μόνο για 23 κύκλους.

Η

CCND1 υπερέκφραση στην Πρωτοβάθμια ESCC και της κλινικοπαθολογοανατομικές Συλλόγου

έκφραση της πρωτεΐνης CCND1 ερευνήθηκε περαιτέρω με ανοσοϊστοχημεία σε ESCC μικροσυστοιχίες ιστού (TMA) από 171 πρωτοβάθμια ESCC και δίπλα χειρουργική ιστολογική περιθώριο φυσιολογικό οισοφαγικό ιστούς. Θήκες με & gt? 10% των καρκινικών κυττάρων να παρουσιάζουν θετική πυρηνική χρώση βαθμολογήθηκαν για CCND1 υπερέκφραση. Ενενήντα τέσσερα από τα 171 περιπτώσεις (55%) έδειξαν CCND1 υπερέκφραση, συμπεριλαμβανομένων 42 περιπτώσεις της κατηγορίας 1+, 35 περιπτώσεις βαθμού 2+ και 17 περιπτώσεις της κατηγορίας 3+ (Εικ. 5Α). Αντίθετα, μόνο διάσπαρτα θετικά κύτταρα βρέθηκαν σε βασικά κύτταρα του φυσιολογικού οισοφάγου επιθήλια.

.

Μια

,

Top πάνελ

, ανοσοϊστοχημική χρώση για το

CCND1

.

Αριστερά

, διάσπαρτα θετικότητα του

CCND1

, ιδιαίτερα στη βασική στιβάδα, παρατηρείται σε φυσιολογικό οισοφαγικό επιθήλιο (αρχική μεγέθυνση, χ 200).

Μέση

, μια περίπτωση ESCC είναι αρνητική για

CCND1

έκφρασης (αρχική μεγέθυνση, × 200).

Δεξιά

, διάχυτη και ισχυρή πυρηνική χρώση για

CCND1

σε αυτή την περίπτωση ESCC (αρχική μεγέθυνση, × 200).

Κάτω πάνελ

, ανάλυση FISH. Πράσινο σήματα αναφέρονται σε ανιχνευτή της CHR 11 κεντρομερίδιο αναφορά ενώ τα κόκκινα σήματα ανιχνευτή στόχος για

CCND1

.

Αριστερά

, μη ενισχυμένοι σε φυσιολογικό οισοφαγικό επιθήλιο,

Μέση

, ένα μη ενισχυμένο περίπτωση ESCC.

Δεξιά

, ένα ενισχυμένο περίπτωση ESCC.

Β

. Αποτελέσματα

CCND1

επίπεδα ενίσχυσης και έκφρασης σε 94 παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτοβάθμια ESCC.

Η

Στη συνέχεια δοκιμάστηκε το συσχετισμό μεταξύ CCND1 υπερέκφραση και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, όπως το μέγεθος του όγκου, το βαθμό, των λεμφαδένων μετάσταση, και την ηλικία του ασθενούς. CCND1 υπερέκφραση ήταν σημαντικά σχετίζεται με μετάσταση στους λεμφαδένες (

σ

= 0,006) (Πίνακας 1), αλλά όχι με Pt, τάξη, ή την ηλικία του ασθενούς (

σ

& gt? 0,05, αντίστοιχα). Στις περιπτώσεις με CCND1 υπερέκφραση, δεν υπήρχε καμία σημαντική διαφορά όσον αφορά την μετάσταση στους λεμφαδένες, μεταξύ των ομάδων υψηλής έκφρασης CCND1 (Βαθμός 2+ και 3+) και η ομάδα χαμηλής έκφρασης (Βαθμός 1+) (

p

= 0,37).

η

CCND1 υπερέκφραση που προέρχεται από την Gene ενίσχυση, αλλά δεν είναι ενεργοποιημένος β-κατενίνης Σηματοδοσίας

Για να επιβεβαιώσετε την ενίσχυση του γονιδίου του

CCND1

στην πρωτοβάθμια ESCC και να διερευνήσει η ένωση με την υπερέκφραση του, εφαρμόσαμε φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH) ανάλυση με τις εμπορικές

CCND1

καθετήρα μαζί με CEP 11 ανιχνευτή σε 94 περιπτώσεις.

CCND1

ενισχύθηκε σε 50 περιπτώσεις (53,2%) και μη ενισχυμένο σε 44 περιπτώσεις (46,8%) (Εικ. 5Β). Επιπλέον, ενίσχυση γονιδίου με FISH και υπερέκφρασης της πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία για

CCND1

έδειξε 91,5% (

κ

= 0,69) συμφωνία.

ανοσοϊστοχημικά, πυρηνική χρώση για β-κατενίνης ήταν θετική μόνο σε 4/94 περιπτώσεις (4,3%). Όλα τα β-κατενίνης θετικές περιπτώσεις ήταν αρνητικές για CCND1 με ανοσοϊστοχημεία.

Συζήτηση

ESCC είναι η έκτη πιο θανατηφόρου καρκίνου σε όλο τον κόσμο και ευθύνεται για το 90% των περιπτώσεων όλων των καρκίνων του οισοφάγου στην Κίνα [19]. Παρά το γεγονός ότι η συχνότητα εμφάνισης της ESCC είναι χαμηλή στις δυτικές χώρες, αυτός ο όγκος είναι κοινή στην Ασία, ιδιαίτερα σε ορισμένες περιοχές στην Κίνα όπως επαρχίας Χενάν και πόλη Σαντού [20]? [21]. Όπως και άλλες μορφές καρκίνου, περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες συμβάλλουν στην παθογένεση ESCC. Καπνό, το αλκοόλ, ζεστό ρόφημα /τροφίμων, διαιτητική ανεπάρκεια και αχαλασία έχουν θεωρηθεί ως σημαντικοί παράγοντες περιβαλλοντικού κινδύνου για ESCC, όπως αποκαλύπτεται από επιδημιολογικές μελέτες [21]? [22]. Εν τω μεταξύ, κυτταρογενετικής και μοριακής γενετικής ανάλυσης απέδειξαν πολλαπλές γενετικές ανωμαλίες στο ESCC, συμπεριλαμβανομένων των χρωμοσωμικών ζημιών και κερδών. Διαλεύκανση αυτών των εκτροπών θα οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της παθογένεσης ESCC, και περαιτέρω ανάπτυξη θεραπευτικών και βιοδείκτες για την πρόβλεψη των μεταστάσεων και την πρόγνωση. Σε αυτή τη μελέτη, θα πραγματοποιηθεί μια ολοκληρωμένη έρευνα της γονιδιωματικής ανωμαλίες στο ESCC με υψηλή ανάλυση array-CGH βάση, να οριοθετηθούν τις ελάχιστες χρωμοσωμικές περιοχές της ενισχύσεις και τις διαγραφές. Τα αποτελέσματα παρέχουν λεπτομερείς εικόνες των πολλαπλών γενετικών βλαβών στην ESCC γονιδιώματα, αλλά και να δώσει συμβουλές για την περαιτέρω προσδιορισμό των κρίσιμων ογκογονίδια και ΕΠΠΕ σε αυτή την κακοήθεια

Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα [4] -. [14], επαναλαμβανόμενο κέρδη συμπεριλαμβανομένων 11q13 (

CCND1

,

EMS1

), 3q26 (

EIF5A2

), 21q22 (

ETS2

) και 8q24

(MYC)

, και οι ζημίες συμπεριλαμβανομένων 3ρ, 5q, 9p, 13q, 18q και 21q με γονίδια-στόχους, όπως

FHIT

,

APC

,

RB1 ​​

και

CDKN2A

, εντοπίστηκαν σε κυτταρικές σειρές ESCC σε αυτή τη μελέτη. Μεταξύ αμπλικονίων ανιχνεύονται, 11q13.3-13.4 είναι η πιο συχνά ενισχύεται χρωμοσωμική περιοχή. Δύο γονίδια,

CCND1

και

CTTN

βρίσκεται στην περιοχή αυτή, ταυτοποιήθηκαν με ενισχύσεις υψηλού επιπέδου σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές ESCC. Ενώ διερευνάται σε επίπεδο mRNA, βρήκαμε αρκετά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

CCND1 CTTN, FGF19

και

SHANK2

, ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές ESCC. Πρόσφατα, Sawey et al ανέφεραν ότι

CCND1

και

FGF19

ήταν δύο οδήγηση ογκογονίδια στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [23]. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στο

CCND1

. Η μελέτη μας επιβεβαίωσε συχνές ενίσχυσης (53,2%) και συγκλίνουσες πρωτεΐνη υπερ-έκφραση (51,1%) του

CCND1

στην πρωτοβάθμια ESCC. Επιπλέον, μια θετική συσχέτιση μεταξύ του

παρατηρήθηκε CCND1

ενίσχυση /υπερέκφραση και λεμφαδένα μετάσταση στο ESCC, υποδεικνύοντας ότι

CCND1

μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για ESCC, σύμφωνα με άλλες μελέτες ([ ,,,0],24] – [27] Εκτός από την ενίσχυση, CCND1 υπερέκφραση μπορεί να κινείται από μεταγραφική ρύθμιση, όπως του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt βήτα-κατενίνη είναι ένα βασικό μέλος του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt, το οποίο έχει προταθεί εμπλέκονται σε οισοφαγικό έναρξη του καρκίνου.. και την εξέλιξη [28]. σε αυτή τη μελέτη, μόνο 4,3% (4 στα 94) των περιπτώσεων ESCC ταυτοποιήθηκαν με βήτα-κατενίνης πυρηνική έκφραση. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η γονιδιωματική κέρδος του 11q13 σε ESCC είναι ο κύριος μηχανισμός με αποτέλεσμα

CCND1

ενίσχυση και υπερέκφραση. Αυτός ο μηχανισμός έχει επίσης αναφερθεί σε άλλους τύπους όγκων όπως το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα [29], οι όγκοι της υπόφυσης [30], και του καρκίνου του μαστού [31].

CTTN αποτελεί ακτίνη πρωτεΐνη που συνδέεται σκαλωσιές, δεσμεύει και ενεργοποιεί ακτίνη πρωτεΐνη που σχετίζεται με σύμπλεγμα (ARP2 /3) και έτσι ρυθμίζει τις διακλαδισμένες δίκτυα ακτίνης στο σχηματισμό της δυναμικής σχετικών δομών του φλοιού ακτίνης.

CCND1

και

CTTN

συχνά συν-ενισχύεται σε καρκίνους [32] – [34]. Προηγουμένως,

CTTN

έχει αναγνωριστεί ως

καλόπιστους

ογκογονίδιο που βρίσκεται στο 11q13 που εμπλέκονται στην καρκινογένεση ESCC, συμβάλλει στην μετάσταση διαφόρων caners συμπεριλαμβανομένων ESCC, του μαστού, ηπατοκυτταρικό, και το κεφάλι και το λαιμό πλακώδες καρκινώματα κυττάρων [32] – [34]. FGF19, ένας αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών, μαζί με CCND1, αναφέρθηκε πρόσφατα σε μια σημαντική ογκογονιδίου οδηγού σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [23]. Η συμμετοχή των FGF19 και άλλα νέα ογκογονίδια που προσδιορίζονται στην ESCC παθογένεια και οι σχετικοί μηχανισμοί μόριο πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Μεταξύ άλλων συχνές χρωμοσωμικές κέρδη, 3q26-27 είναι ένα μυθιστόρημα αμπλικόνιο ανιχνεύτηκε σε ESCC. Γνωστά ογκογονίδια που κατοικούν σε αυτήν την περιοχή περιλαμβάνουν

EVI1

,

EIF5A2

και

PIK3CA

, τα οποία έχουν αναφερθεί να παρουσιάζουν δυναμικό ογκογόνο λειτουργίες. Επιπλέον,

TRIO

και

CTNND2

σε 5p,

MYC

στο 8q22,

KLF5

και

POU4F1

σε 13q και

NKX2.2

σε 20p Εξετάστηκαν επίσης να παίξει ογκογόνο ρόλους σε άλλους όγκους [35]? [36] και μπορεί να συμβάλει στη ESCC καρκινογένεση. Περιφέρειες διαγραφές υψηλού επιπέδου που περιέχουν γνωστά ή υποψήφιο ΕΠΠΕ ανιχνεύθηκαν επίσης, συμπεριλαμβανομένων 18q11-23 περιέχει

SMAD2, Smad4

και

DCC

(EC1, EC109, HKESC3, SLMT1 και KYSE70), 8ρ22 που περιέχει

DLC1

(EC1, KYSE70, 410 και 520) και μια περιοχή για 14q32 που περιέχει

DLK1

και

MEG3

(EC1, EC109 και KYSE70). Άλλες διαγραφές υψηλού επιπέδου που περιέχει υποψήφια ΕΠΠΕ περιλαμβάνουν 4q21.23-21.3 (

MAPK10

,

PTPN13

και

ARGAP24

), 7p21.2 (

DGKB

), 7q35 (

CNTNAP2

), 8q11 (

CEBPD

), 10p11 (

PARD3

), 13q31.1 (

SPRY2

) και 16q22 -23 (

ATBF1

). Οι περισσότερες από αυτές τις διαγραμμένες περιοχές του ESCC έχουν επίσης αναφερθεί σε έναν ή περισσότερους άλλους τύπους καρκίνου [37]? [38]. Είναι σημαντικό ότι, η γενετική /επιγενετικές διαταραχές ή να τροποποιηθούν τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων υποψηφίων TSG που αναφέρθηκαν παραπάνω, συμπεριλαμβανομένων των

SMAD2

,

Smad4

,

DCC

,

DLC1

και

PARD3,

έχουν αναφερθεί σε όγκους ESCC και κυτταρικές σειρές, υποδεικνύοντας ότι η μελέτη aCGH χρήση πολλαπλών καρκινικών κυτταρικών σειρών θα μπορούσε να διευκολύνει τον εντοπισμό των κρίσιμων γονιδίων του καρκίνου σε ανθρώπινους όγκους. [39] – [42].

Εν κατακλείδι, πολλαπλές ελάχιστη περιοχές διαγραφές και αμπλικονίων ανιχνεύθηκαν σε 10 χρησιμοποιείται συνήθως ESCC κυτταρικές σειρές σε αυτή τη μελέτη, καθώς και αρκετές νέες ογκογονίδια βρίσκεται στην πιο συχνά ενισχυμένης περιοχής 11q13, συμπεριλαμβανομένων των

FGF19

,

SHANK2

και

CCND1

, έχουν εντοπιστεί. Αυτή η μελέτη παρέχει κρίσιμα στοιχεία για την περαιτέρω ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των κρίσιμων ογκογονιδίων και ΕΠΠΕ εμπλέκονται στην παθογένεια ESCC.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

Δέκα κυτταρικές σειρές ESCC (EC1, ΕΚ18, EC109, HKESC1, HKESC2, HKESC3 και SLMT1 είναι από την κινεζική ασθενείς, ενώ KYSE70, KYSE410 και KYSE520 είναι από Ιάπωνες ασθενείς) και τρεις απαθανάτισε φυσιολογικό οισοφαγικό επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (Het-1A, NE1 και NE3) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη [ ,,,0],43]. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT), καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

δείγματα όγκου

Ένα σύνολο 171 (FFPE) Κινέζικα δείγματα ESCC φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (2007-2008) και των παρακείμενων χειρουργική περιθώριο ιστολογικά φυσιολογικό οισοφαγικό ιστούς ελήφθησαν, μετά από γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις και Θεσμικών παραλαβή των ασθενών Review Board (IRB) έγκριση από το Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα. Όλοι οι ασθενείς είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία (δηλαδή, χωρίς χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία), με χειρουργικά αφαιρέσιμες πρωτογενείς όγκους. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 58 έτη (εύρος 33-78), και αναλογία ανδρών-γυναικών ήταν 4.2: 1 (138: 33). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) -stained τμήματα επανεξετάστηκαν για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και τον προσδιορισμό των περιοχών του όγκου. το στάδιο του όγκου (PT) και ο βαθμός ορίστηκαν σύμφωνα με την τρέχουσα ταξινόμηση WHO των όγκων.

array CGH ανάλυση

χρωμοσωμικές Υψηλού μοριακού βάρους DNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen (Qiagen , Hilgen, Germany). Η καθαρότητα και το μοριακό βάρος του DNA εξετάσθηκαν επί πηκτωμάτων αγαρόζης. 1-Mb ανάλυση συστοιχιών σε ολόκληρο το γονιδίωμα με 3040 BAC /PAC κλώνοι που παρέχονται από Sanger Institute, UK (https://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/) [44]. Οι λεπτομέρειες κλώνοι που απαριθμούνται στο Ensembl (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html)

Array-CGH πραγματοποιήθηκε με ελαφρές τροποποιήσεις [43] – [45].. Εν συντομία, δείγμα DNA (600 ng) σημάνθηκε με Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia), ενώ το DNA των φυσιολογικών μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) από υγιείς κινέζικα δότες με Cy3-dCTP χρησιμοποιώντας την CGH Genomic Labeling System Array BioPrime αναφοράς (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια απομακρύνθηκαν με τη χρήση μονάδας καθαρισμού που παρέχεται στο σύστημα επισήμανσης. Σημασμένα δείγματα και φυσιολογικό DNA (50 μΐ το καθένα) αναμίχθηκαν και καταβυθίζεται με αιθανόλη μαζί με 67.5 μΙ ανθρώπινης Cot-1 DNA (Invitrogen). Στη συνέχεια, το μικτό DNA επαναιωρήθηκαν σε 30 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος υβριδοποίησης, μετουσιωμένη και προϋβριδοποιήθηκαν σε ένα θάλαμο υγρασίας μέσα σε ένα κλίβανο υβριδισμού στους 5 rpm για 2 ώρες στους 37 ° C. Το μίγμα προ-υβριδισμού παρασκευάστηκε ως εξής: 80 μΐ DNA σπέρματος ρέγγας κατακρημνίστηκαν (10 mg /ml, Sigma) και 67,5 μΙ ανθρώπινης Cot-1 DNA (Invitrogen), επαναιωρήθηκαν σε 120 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος υβριδοποίησης και μετουσιώνεται για 10 λεπτά σε 72 ° C. Μετά τον προϋβριδισμό, το προϋβριδοποιήθηκαν ανιχνευτής προστέθηκε πάνω στην πλάκα, και επωάζονται στους 5 rpm για 48 ώρες στους 37 ° C. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές, ξηραίνεται στον αέρα και αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C.

υβριδοποιημένες φέτες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Αχοη 4000B (Αχοη Instruments Inc, Union City, CA) και αναλύθηκαν με τη GenePixPro 4,0 εικόνα λογισμικό ανάλυσης όπου οι κηλίδες ορίστηκαν και διάμεση εντάσεις φθορισμού υπολογίστηκαν. Οι φόντο αφαιρούνται εντάσεις φθορισμού εισήχθησαν σε ένα ειδικά σχεδιασμένο Microsoft Excel πρότυπο υπολογιστικό φύλλο. Ένα συγκεκριμένο σημείο αποκλείστηκε αν οι διπλές κηλίδες έχουν μια διαφορά & gt? 10%. Οι μέσες τιμές των διπλών κηλίδων παρουσιάστηκαν σε γραφική έξοδο με τη μορφή του μέσου log2 αναλογία (Cy5 /Cy3) κατά απόσταση κατά μήκος κάθε χρωμόσωμα (Mb). Χρωμόσωμα αντίγραφο αλλαγές αριθμός βαθμολογήθηκαν ως ημίζυγος απώλεια εάν ο λόγος log2 ήταν κυμαινόμενη από -0,2 -0,7 να, και ομόζυγη διαγραφή αν & gt? -0,7, Ή γονιδιωματική κέρδος για αναλογία log2 από 0,2 έως 0,5, και ενίσχυση αν & gt? 0,5. μεταβολές αριθμό αντιγράφων δει τα φυλετικά χρωμοσώματα αποκλείστηκαν στην ανάλυση.

Multiplex Γονιδιωματική PCR

Multiplex PCR επιτρέπεται μια ημι-ποσοτική αξιολόγηση της ενίσχυσης του DNA /απώλεια.

GAPDH

γονίδιο επιλέχθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Εμείς ενισχύεται

CCND1

και τον εσωτερικό έλεγχο ταυτόχρονα. Για

CCND1

, ένα ζεύγος εκκινητών (εμπρός: 5′-tgctgcgaagtggaaaccat και να αντιστραφεί: 5′-caacaagttgcagggaagtc) δημιουργείται ένα προϊόν PCR 227 bp. Για

GAPDH

, ένα ζεύγος εκκινητών (εμπρός: 5′-gcctcactccttttgcagac και να αντιστραφεί: 5′-gatgaccttgcccacagcct) δημιουργείται ένα προϊόν PCR 157 bp. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε έναν τελικό όγκο 20 μΐ που περιέχει 200 ​​mM τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίου, 2,5 mM ΜαΟΙ

2, 50 ng DNA, 0,5 mM κάθε ολιγονουκλεοτίδιο και 0,5 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 30 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, 72 ° C για 30 s και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και απεικονίστηκαν. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν τουλάχιστον δύο φορές σε ανεξάρτητα πειράματα.

ημι-ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

Ολικό RNA εκχυλίστηκαν από σφαιρίδια κυττάρου χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRI (Κέντρο Molecular Research, Cincinnati, ΟΗ). Η αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR) διεξήχθη όπως περιγράφεται [43], με τη χρήση

GAPDH

ως έλεγχος. Οι εκκινητές για όλα τα γονίδια θα πρέπει να παρέχονται κατόπιν αιτήσεως. Το πρόγραμμα PCR χρησιμοποιείται μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους αντίδρασης (94 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s) (ή 23, 25 κύκλοι για CCND1), με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά.

ESCC Tissue Microarray (TMA)

σε κάθε περίπτωση, τόσο του όγκου και των φυσιολογικών ιστών επαναλήφθηκαν με διάμετρο 1 mm σε ένα γυάλινο πλακίδιο. Πριν από την απόκτηση του δείγματος, HE-βάφονται FFPE διαφάνεια των κάθε περίπτωση παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο και είχαν κύκλο οι θέσεις συνήθως χαρακτηριστική μορφολογία των ESCC και γύρω φυσιολογικούς ιστούς. Τα δείγματα ελήφθησαν από τις θέσεις κυκλωμένα στο μπλοκ παραφίνης χρησιμοποιώντας τον ιστό Beecher Instruments arrayer (Silver Springs, MD). Για κάθε μπλοκ, δύο 1 πυρήνες mm αποκόπηκαν από τα κυκλωμένα περιοχές στο μπλοκ δότη και μαζεύτηκαν στον αποδέκτη μπλοκ για να εξασφαλιστεί η εκπροσώπηση των δειγμάτων, και να αποφύγει πληροφορίες που λείπουν οφείλεται σε απώλεια των πυρήνων ιστού. Ένα σύνολο 171 ESCC δείγματα, 54 δείγματα του αντίστοιχου κανονικού βλεννογόνου μαζεύτηκαν σε δύο μπλοκ παραλήπτη. Τομές ιστού microarray (4 μm) κόπηκαν 24 ώρες πριν από την ανοσοϊστοχημεία.

Automated Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με μια Ventana Benchmark XT Autostainer (Ventana, Tuscon, USA), χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντι- κουνελιού ανθρώπινο CCND1 /κυκλίνης D1 (κλώνος SP4) και αντι-ανθρώπινη β-κατενίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (κλώνος β-κατενίνης-1) από ϋΑΚΟ (Glostrup, Δανία) με κιτ Ventana Ultraview (Ventana, Tucson, USA). Τα πλακίδια επωάστηκαν για 24 λεπτά στους 37 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα. Διαμινοβενζιδίνη ή 3-αμινο-9-αιθυλκαρβαζόλη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνα και ολισθαίνει βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη πριν από την τοποθέτηση. Και οι δύο χρωμογόνα χρησιμοποιούνται για την τακτική πλήρη τμήματα πριν από τη δοκιμή ΤΜΑ έδωσε συγκλίνοντα αποτελέσματα όσον αφορά τις δύο επιφάνειες και εντάσεις ανοσοχρώση. Οι αρνητικοί έλεγχοι δημιουργήθηκαν από παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος και αντικατάσταση με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS).

Τα επίπεδα έκφρασης CCND1 και β-κατενίνης προσδιορίστηκαν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία τεσσάρων επιπέδων σύστημα βαθμολόγησης, με βάση το θετικό κλάσμα πυρηνική χρώση των κυττάρων όγκου (βαθμός 0 = 0-10%? βαθμού 1+ = 11-25%? βαθμός 2+ = 26-50%? βαθμός 3+ = 51-100%). Ένα σκορ 0 θεωρήθηκε αρνητική, ενώ ένα σκορ 1+, 2+ ή 3+ θεωρήθηκε θετική. Για το β-κατενίνης, χρώση στο κυτταρόπλασμα μπορεί να ήταν παρόντες, αλλά δεν είχε συμπεριληφθεί στον προσδιορισμό της θετικότητας.

φθορισμού in situ υβριδισμός (FISH)

Για την ανάλυση FISH του

CCND1

ενίσχυση γονιδίου, χρησιμοποιήθηκαν δύο απευθείας σημασμένων ανιχνευτών, Vysis

CCND1

/CEP11 FISH Probe Kit συμπεριλαμβανομένων LSI

CCND1

(11q13) SpectrumOrange ενάντια

CCND1

(11q13) και CEP11 SpectrumGreen (Vysis /Abbott, IL, USA) ενάντια στο κεντρομερές του χρωμοσώματος 11. ανάλυση FISH έγινε σύμφωνα με το «LSI Locus ανιχνευτές ειδικούς Identifier DNA» από Vysis. Η

CCND1

γονίδιο του χρωμοσώματος 11 αναλογία κεντρομερίδιο προς μετρήθηκε σε τουλάχιστον 60 πυρήνες από κύτταρα όγκου και λήφθηκε ένας μέσος όρος. Παρατηρώντας περισσότερα από δύο αντίγραφα του

CCND1

για κάθε χρωμόσωμα 11 θεωρήθηκε ότι είναι ένα θετικό σημάδι για

CCND1

γονίδιο ενίσχυσης.

Στατιστική Ανάλυση

Στατιστικές ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS έκδοση 12.0. Η συσχέτιση μεταξύ των ψαριών και τα αποτελέσματα IHC και τις μεταβλητές κλινικο-παθολογικές εκτελούνται χρησιμοποιώντας το χ

2-τεστ. Για όλες τις δοκιμές, ένα

σ

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

Ολόκληρο προφίλ γονιδίωμα των 10 κυτταρικών σειρών ESCC από 1 Mb aCGH. Κανονικοποιημένες αναλογίες ένταση του σήματος log2 χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας SeeGH λογισμικού. Ένας λόγος σήματος log2 από το 0 αντιπροσωπεύει ισοδύναμου αριθμού αντιγράφου μεταξύ του δείγματος και της αναφοράς DNA (λεπτομέρειες στο Υλικά και Μέθοδοι). Cytoband πρότυπο για κάθε χρωμόσωμα είναι προς τα αριστερά για κάθε οικόπεδο. Οι κάθετες γραμμές υποδηλώνουν λόγους σήματος log2 από -2 έως +2 με αριθμό αντιγράφων αυξάνεται προς τα δεξιά και μειώνεται προς τα αριστερά. Κάθε μαύρη κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα μονό κλώνο BAC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0039797.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Tzer Jing Seng για το βοήθεια του πίνακα-CGH, ​​Profs Gopesh Srivastava και ο Γιώργος Τσάο (Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ) για κάποιο φυσιολογικό οισοφαγικό επιθηλιακών κυτταρικών σειρών ESCC και, και DSMZ (γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών & amp? καλλιέργειες κυττάρων). για κυτταρικές σειρές KYSE (Shimada et al, του καρκίνου 69: 277-284, 1992)

.