Abstract

Παρά τις προόδους στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία της πολυτροπικότητας για καρκίνους, οι περισσότεροι των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα έχουν τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό κατά τη στιγμή της διάγνωσης, γεγονός που υποδηλώνει την εξαιρετικά προοδευτική χαρακτηριστικό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Η διεισδυτικότητα των μηχανισμών υποτακτικός και μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για την ανίχνευση της έκφρασης του CXCL16-CXCR6 σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Αποδείχθηκε ότι είναι παρόμοια με το CXCL12 και CXCR4, CXCL16 και CXCR6 επίσης συνεκφράζονται σε ανθρώπινα πρωτογενή πνεύμονα καρκινικούς ιστούς. Μετά την επιβεβαίωση της λειτουργικής ύπαρξη CXCL16 και CXCR6 πρωτεΐνη στο Α549, 95δ και Η292 κύτταρα από ELSA και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, έχουμε ακόμη διερευνηθεί η σημασία του άξονα CXCL16-CXCR6 στις βιολογικές λειτουργίες του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών

in vitro

. Διαπιστώθηκε ότι CXCL16 δεν είχε αποτελέσματα επί της PCNA (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έκφραση του Α549, 95d και Η292 κύτταρα. Ωστόσο, τόσο εξωγενή CXCL16 και CM (ρυθμισμένο μέσο από Α549, 95d ή Η292) βελτίωσε σημαντικά την

in vitro

βιωσιμότητα και εισβολή των καρκινικών κυτταρικών γραμμών τρία πνεύμονα. Το εξουδετερωτικό αντίσωμα προς CXCL16 ή προς τα κάτω ρύθμιση των CXCR6 ήταν ικανή να αναστείλει την αυξημένη βιωσιμότητα και διεισδυτικότητα του Α549, 95d και Η292 κύτταρα διεγερμένα από CM CXCL16 ή. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι άξονα CXCL16-CXCR6 εμπλέκεται στη ρύθμιση της βιωσιμότητας και της εισβολής και όχι έκφραση PCNA κυττάρων του πνεύμονα Caner, το οποίο ανοίγει την πόρτα για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών της εξέλιξης του πνεύμονα όγκου και των μεταστάσεων

Αιτιολογική αναφορά.: Hu W, Liu Υ, Zhou W, Si L, Ren L (2014) CXCL16 και CXCR6 συνεκφράζονται στα Ανθρώπινα Καρκίνο του πνεύμονα

In Vivo

και μεσολαβούν την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων

In Vitro

. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10.1371 /journal.pone.0099056

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 11 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας 81270753 (σε W.-ΗΖ), Wuhan Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου 2013060602010249 (σε W.-DH), Ίδρυμα Επιστήμης Φυσικής Επιστήμης και Τεχνολογίας του Υπουργείου επαρχία Hubei 2010CDB05502 (σε W.-DH ) και Προσωπικού σχέδιο Κατάρτισης του συστήματος Υγείας του Πεκίνου 2013-3-021 (σε W.-HZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μια κοινή κακοήθη όγκο που κατατάσσεται ως η κύρια αιτία θανάτου κακοήθειας που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του πνεύμονα έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια σε ορισμένες μεγάλες πόλεις της Κίνας [1]. Παρά τις προόδους στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία της πολυτροπικότητας για καρκίνους, το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τους περισσότερους ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι λιγότερο από 20%. Οι μηχανισμοί υπογραμμίζοντας εισβολής και της μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα έχουν προσελκύσει πολλή προσοχή από το θώρακα ογκολόγους για δεκαετίες χρόνια. Μερικές υποθέσεις και τα μόρια έχουν προταθεί, αλλά μια εις βάθος κατανόηση των περίπλοκων επεμβατική και μεταστατικό διεργασίες των καρκινικών κυττάρων παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα.

Από την ανακάλυψη του πρώτου χημειοκινών το 1987, περισσότερα από 50 είδη οι χημειοκίνες και 20 είδη υποδοχέων χημειοκίνης έχουν κλωνοποιηθεί και ταυτοποιηθεί. Η ενεργοποίηση της οδού σήματος χημειοκίνης /υποδοχέα έχει επιβεβαιωθεί ότι μεσολαβεί μια σειρά φυσιολογικών και παθολογικών εκδηλώσεων, ιδίως την πρόσληψη των λεμφοκυττάρων, καθώς και την ανάπτυξη του όγκου και τη μεταστατική εξάπλωση, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα για τη διαλεύκανση του μεταστατικού διαδικασία των κακοήθων κυττάρων από το Immunology προοπτικές [2], [3], [4], [5], [6].

Μεταξύ των διαφόρων χημειοκινών και υποδοχέων χημειοκίνης, CXCL16-CXCR6 είναι ένα μοναδικό ζεύγος υποδοχέα χημειοκίνης /χημειοκίνης. CXCL16, επίσης γνωστή ως SR-PSOX, ανήκει στην οικογένεια CXC χημειοκίνη και υπάρχει τόσο σε μια διαμεμβρανική και διαλυτή μορφή [7], [8], [9]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ CXCL16 και «μοναδικού υποδοχέα της, CXCR6 (ονομάζεται επίσης Bonzo, STRL33 και TYMSTR) εμπλέκεται σε πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες, όπως η επιλεκτική διακίνησης υποσύνολα λεμφοκυττάρων, κυτταρική προσκόλληση, κυτταρική επιβίωση, μυϊκή αναγέννηση, την ανάπτυξη του εγκεφάλου, χρόνιας φλεγμονής και αντι- ανοσία όγκου [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Συγκεκριμένα, πρόσφατες μελέτες έχουν επαληθεύσει την υπερ-έκφραση του CXCL16 ή /και CXCR6 σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων και CXCL16 θα μπορούσε να τονώσει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση, εισβολή και ενεργοποίηση ΑΚΤ οδού των καρκινικών κυττάρων σηματοδότησης μέσω του «υποδοχέα του CXCR6

in vitro

[15], [16], [17], [18]. προηγούμενη μελέτη μας επιβεβαίωσε επίσης την υπερβολική έκφραση της πρωτεΐνης σε CXCR6 ανθρώπινη φυσική κύτταρα καρκίνου του προστάτη και την ενεργοποίηση του CXCL16-CXCR6 μονοπάτι θα μπορούσε να προωθήσει την μετανάστευση και την εισβολή των PC3 και LNCaP κυττάρων

in vitro

[19]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CXCL16-CXCR6 μπορεί να είναι ένα νέο ζεύγη συνδέτη /υποδοχέα χημοκίνης εμπλέκεται στην ογκογένεση και τη μετάσταση. Μερικές ομάδες έχουν αρχίσει να δίνουν προσοχή στο ρόλο των CXCL16-CXCR6 στον όγκο, όμως, η σχέση μεταξύ CXCL16-CXCR6 και ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ακόμα ασαφείς και αξίζει περαιτέρω έρευνες.

Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση της CXCL16 και CXCR6 σε ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, Α549, Η292 και 95d, προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) και κυτταρομετρία ροής διεξήχθησαν για να εξεταστεί η λειτουργική έκφραση του CXCL16 και CXCR6 σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Για την περαιτέρω διαλεύκανση του ρόλου του άξονα CXCL16-CXCR6 στον καρκίνο του πνεύμονα, παρατηρήσαμε επίσης τη δράση του CXCL16 επί PCNA (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έκφραση και επεμβατική ικανότητα των Α549, Η292 και 95d κύτταρα. Οι επιδράσεις του γονιδίου CXCR6 ρύθμιση προς τα κάτω από την τεχνολογία μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) επί της βιωσιμότητας και διηθητικότητα των κυττάρων Α549 επίσης προσδιορίστηκε με ΜΤΤ και δοκιμασία εισβολής. Μέσα από την εξερεύνηση της αλλαγής της βιολογικής συμπεριφοράς των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από τον άξονα CXCL16-CXCR6, ελπίζουμε να παρέχει γνώσεις σε καλύτερη

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο κατανόηση της εξέλιξης αυτής της επιθετικής κακοήθους όγκου. Συλλογή ιστού

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τους συμμετέχοντες στη μελέτη είχαν εγκριθεί από το Zhongnan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Wuhan Επιτροπής Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής, και οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση τους.

Ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα (33 περιπτώσεις) και φυσιολογικά (5 περιπτώσεις) σε ιστούς ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκτομή πνευμονικού λοβού ή πνευμονεκτομή για καρκίνο ή μη καρκινικά νοσήματα του πνεύμονα σε Zhongnan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Wuhan από το 2003 έως το 2006. Η ταυτοποίηση των τύπων όγκου έγινε με δύο επαγγελματικές παθολόγους . 33 καρκίνους του πνεύμονα, 13 περιπτώσεις ήταν αδενοκαρκινώματα (AC), 12 περιπτώσεις ήταν πλακώδη καρκινώματα (SC), 7 περιπτώσεις ήταν αδενοχοληδωτό καρκινώματα (ASC) και 1 περίπτωση ήταν βρογχοκυψελιδικό καρκίνωμα (BC). Τα στάδια των όγκων εκτιμήθηκε σύμφωνα με την έβδομη έκδοση του νέου συστήματος σταδιοποίησης TNM προτείνεται από τη Διεθνή Ένωση για τη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα (IASLC) το 2009. Στα 33 δείγματα, 3, 1, 9, 8, 10 και 2 περιπτώσεις ήταν ΙΑ, ΙΒ, ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ και ΙΙΙΒ, αντίστοιχα.

Cell Culture

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549, Η292 και 95δ κύτταρα ελήφθησαν από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας επιστήμη (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1640 που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA), 10 mM HEPES, 1 mM νάτριο πυροσταφυλικό οξύ, 4,5 g /L γλυκόζη, 100 UI /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν και διαβιβάσθηκαν για τρεις φορές, στη συνέχεια αφήνονται να αναπτυχθούν έως συρροής για τα ακόλουθα πειράματα.

Ανοσοϊστοχημεία

Η μέθοδος για ανοσοϊστοχημεία βασίστηκε στην προηγούμενη διαδικασία μας [19]. Εν συντομία, οι ιστοί ρουτίνας σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη και 0,3% Η

2O

2 σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης στα τμήματα. Μετά από επεξεργασία με πρωτεΐνη ορού αποκλεισμού να εμποδίσει μη ειδικής δέσμευσης, οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR4 (25 μg /ml), ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR6 (25 μg /ml), αντι- ποντικού ανθρώπινο CXCL12 (20 μg /ml) και κατσίκα αντι-ανθρώπινο CXCL16 (20 μg /ml) αντισώματα (από την Κ & amp? D Systems, Abingdon, UK), αντίστοιχα. Ένα κιτ αντιδραστήριο ανίχνευσης στρεπταβιδίνης /βιοτίνης (Maixin Βίο., Fuzhou, Κίνα) με 3, 30-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του σήματος και Harris αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε ως αντι-κηλίδας. Mouse ή αίγα ισότυπου IgG (10 μg /ml) (Dingguo Bio Co. Ltd, Shanghai, China) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και τα ανθρώπινα πρώτου τριμήνου λαχνών ιστούς (5 δείγματα) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος (13, 19). Η βαθμολόγηση έγινε τυφλά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τηλεπαθολογία χωρίς τη γνώση των σχετικών κλινικών πληροφοριών (π.χ., βαθμός του όγκου, το μέγεθος του όγκου ή την κλινική έκβαση). Η ένταση ανοσοχρώση παρατηρήθηκε και βαθμολογήθηκε ως καθόλου χρώση (βαθμολογία = 0), ανοιχτό κίτρινο (βαθμολογία = 1), ανοιχτό καφέ (βαθμολογία = 2) ή καφέ (βαθμολογία = 3). Το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε ως & lt? 5% (βαθμολογία = 0), 5-25% (βαθμολογία = 1), 26-50% (βαθμολογία = 2), 51-75% (βαθμολογία = 3) ή & gt? 75% (βαθμολογία = 4). Συνδυάζοντας την ανοσοχρώση βαθμολογία ένταση και το ποσοστό των θετικών κυττάρων, που έχουν ταξινομηθεί το σκορ ως εξής: & lt? 2, αρνητική έκφραση? 2-3, ασθενής έκφραση? 4-5, μέτρια έκφραση και 6-7 ως ισχυρή έκφραση [19].

Η ανοσοκυτταροχημεία

Μετά 70-80% συρροή των κυττάρων, Α549, Η292 ή 95d τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,25 % θρυψίνη (Bio Basic Inco., ΒΒΙ, Ontario, Canada) που περιέχει 0.1% ΕϋΤΑ και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5cells /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων προ-τοποθετούνται με καλυπτρίδες. Μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες, οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν σε PBS και κατέστησαν διαπερατά για 15 λεπτά σε 0,03% Triton X-100-PBS, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,3% Η

2O

2 για να απενεργοποιηθεί η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης. Η ακόλουθη διαδικασία ήταν όπως περιγράφεται παραπάνω στη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και ανθρώπινα πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα τροφοβλάστης χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως θετικός έλεγχος [13], [19]. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με Image-ProPlus 6,0 λογισμικό και η μέση πυκνότητα έκφραση του CXCL16 και CXCR6 σε τρεις κυτταρικές γραμμές καταγράφηκε. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Παρασκευή Κυττάρων Καλλιεργημένα ρυθμισμένου μέσου

Το απομονωμένο Α549, 95d και Η292 σπάρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας (6 ml /φιάλη) σε πυκνότητα 1 × 10

6 /ml, αντίστοιχα, και καλλιεργήθηκαν συνεχώς για 48 ώρες. Τα υπερκείμενα, δηλαδή ρυθμισμένο μέσο (CM), συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 g, στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C. Τα υπερκείμενα από μέσο καλλιέργειας χωρίς κύτταρα συλλέχθηκαν επίσης ως έλεγχος.

Δοκιμασία ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές (ELISA)

Χωνευμένου Α549, Η292 και 95d τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (500 μλ /φρεάτιο) σε πυκνότητα 5 χ 10

5 /ml, αντίστοιχα. Τα υπερκείμενα των κυτταρικών καλλιεργειών συλλέχθηκαν στις 24, 36, 48, 60, 72, 96 και 100 ώρες καλλιέργειας. Κάθε συλλέγονται υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους -80 ° C για την ανάλυση ELISA. Η ποσότητα του CXCL16 σε κάθε υπερκείμενο μετρήθηκε με την ανθρώπινη CXCL16 κιτ ELISA (Shanghai Westang Bio-Tech Co Ltd, Σαγκάη, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κιτ δοκιμασίας CXCL16 επέδειξε ευαισθησία 40 pg /ml και ένα συντελεστή ενδο-δοκιμασίας διακύμανσης μικρότερη από 12%. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Detection Κυτταρομετρία Ροής για έκφραση CXCR6

Η έκφραση μεμβράνης του CXCR6 πρωτεΐνης σε Α549, Η292 και 95d κύτταρα ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής συμφώνως προς την προηγούμενη μέθοδο και CXCR4 μας χρησιμοποιήθηκε επίσης ως έλεγχος την ίδια στιγμή [20]. Εν συντομία, για την προστασία δυνατή την εντόπιση της μεμβράνης του υποδοχέα χημειοκίνης στο μεγαλύτερο βαθμό, τα κύτταρα, κατά 70-80% συρροή των κυττάρων, υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,25% θρυψίνη μόνο για 30-50 s, τότε βγαίνει από τη θέση απαλά και πλένονται με PBS [ ,,,0],20]. Μετά από αποκλεισμό με 10% FBS, τα ανακτηθέντα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο ΡΕ ποντικού (φυκοερυθρίνη) -CXCR6 μονοκλωνικό αντίσωμα (1:10? R &? D Systems, Inc), αντι-ανθρώπινο-ΡΕ CY5-CXCR4 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ( 1:05? eBioscience), ποντικού ΡΕ-ισότυπος IgG2b (R &? D Systems, Inc) ή ποντικού ΡΕ-CY5-IgG2a ισοτύπου (eBioscience), στη συνιστώμενη χρήση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με 1 ml PBS με φυγοκέντρηση στα 2000 χ g για 5 λεπτά και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία FACS Calibur ροής (FC500, Beckman Coulter-, USA) και λογισμικό CellQuest. Τα κύτταρα από 1 × 10

5 μετρήθηκαν και το ποσοστό των θετικών κυττάρων καταγράφηκε. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

PCNA Ανίχνευση με Κυτταρομετρία Ροής

Το απομονωμένο Α549, Η292 και 95d κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κυττάρου /φρεάτιο. Στο 70-80% συρροή των κυττάρων, οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα στερήθηκαν για 12 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ανθρώπινο ανασυνδυασμένο CXCL16 (100 ng /mL) (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) ή ένα συνδυασμό των CXCL16 με αντίσωμα εξουδετέρωσης CXCL16 (100 ng /mL) (R &? D Systems, Inc.) για ανθήρα 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη και συλλέγονται για την ακόλουθη PCNA (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) εξέταση. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 70% αιθανόλη και 0,1% Triton Χ-100, το καθένα για 20 λεπτά, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο ΡΕ-ΡΟΝΑ μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:05? EBioscience) ή ποντικού ΡΕ-IgG

ισοτύπου 2a (eBioscience) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι [21]. Η ακόλουθη διαδικασία εξέτασης ήταν όπως περιγράφεται παραπάνω στη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής ανίχνευσης για έκφραση CXCR6. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

CXCR6 σιωπή σε Α549 κύτταρα

Τα απομονωμένα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 /ml. Στο 70-80% συρροή, αυτά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με phU6 /GFP /Neo πλασμίδιο που περιέχει μικρή φουρκέτα RNA μόρια (shRNA) στοχεύουν ενάντια CXCR6, με τη χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Οι αλληλουχίες για τρία ολιγονουκλεοτίδια shRNA ήταν: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC ΑΑΤ TCC ΑΑΟ ACT Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-AAG TCT ΤΟΟ ΑΑΤ TGT CCT CAG-3′ (Anti-νόημα )? (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-ΑΤΑ GCA GAC ΑΑΤ CAT GGT GAG-3′ (Anti-έννοια)? (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC ΤΟΟ ΟΤΟ ΑΤΑ Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (Anti-νόημα) (GENECHEM, Σαγκάη, Κίνα). Οι ομάδες χωρίστηκαν σε phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6-shRNA), μη στόχευση siRNA ολιγονουκλεοτίδια αρνητικό μάρτυρα (phU6 /GFP /Neo, shRNA ελέγχου) και κενά ελέγχου (χωρίς οποιαδήποτε θεραπευτική αγωγή). Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν με καλλιέργεια G418 σε συγκέντρωση 800 μg /ml. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και η αποτελεσματικότητα σίγηση προσδιορίστηκε με κηλίδα western.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Το ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο, Sigma Chemicals] δοκιμασία εφαρμόστηκε για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του CXCL16-CXCR6 στη βιωσιμότητα των κυττάρων

in vitro

[21]. Τα πειράματα χωρίστηκαν σε δύο στάδια: πρώτον, τα απομονωμένα Α549 κύτταρα από κενό-ελέγχου, shRNA ελέγχου και CXCR6-shRNA (2819-1) ομάδες σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων με επίπεδο πυθμένα μικροπλακίδια με πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες, αντίστοιχα. Δεύτερον, μετά πέθαναν με 1640 χωρίς FCS για 12 ώρες, τα κύτταρα από κενό-ελέγχου, shRNA ελέγχου ή CXCR6-shRNA (2819 με 1) ομάδες υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο ελέγχου (1640) ή CXCL16 σε συγκέντρωση 100 ng /mL για 48 ώρες.

αντιδραστήριο ΜΤΤ (20 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο των 96 φρεατίων και επωάζονται στους 37 ° C για 4 ώρες. Το μέσο αποχύθηκε και 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε διαλυτοποίηση των αντιδραστικών κρυστάλλων. Η απορροφητικότητα μετρήθηκε σε μήκος κύματος 570 nm σε έναν αυτόματο αναγνώστη μικροπλάκας. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές [21].

ECM εισβολή Δοκιμασία

Η επεμβατική ικανότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα εκτιμήθηκε αντικειμενικά από

in vitro

δοκιμασία εισβολής με βάση την προηγούμενη μέθοδο μας [19], [20]. Εν συντομία, τα ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας (μέγεθος πόρων 8 μm, 6,5 mm διαμέτρου? Corning, Corning, ΝΥ, USA) επικαλύφθηκαν με 10 μΙ καθαρό εξωκυττάρια μήτρα (ECM) γέλης (Sigma, St. Louis, ΜΟ 63103, American) τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 24 φρεατίων. Τα πειράματα χωρίζονται στις ακόλουθες δύο μέρη: πρώτον, το απομονωμένο Α549, Η292 ή 95d κύτταρα (1 χ 10

5/200 μΐ ελεύθερου ορού 1640) τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CM, CXCL16 ( 100 ng /ml) και ένας συνδυασμός CM ή CXCL16 με αντίσωμα CXCL16 εξουδετέρωση (100 ng /mL). Δεύτερον, τα κύτταρα Α549, από το τυφλό-ελέγχου, phU6 /GFP /Neo και phU6 /GFP /Neo-CXCR6 ομάδα, σπάρθηκαν στο άνω θάλαμο σε πυκνότητα (1 × 10

5/200 μΙ ελεύθερο ορού δωρεάν 1640), στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CXCL16 (100 ng /ml) ή CM. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 800 μλ 1640 παρέχεται με 10% FBS. Μετά επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, τα ένθετα απομακρύνονται και πλένονται σε PBS. Στη συνέχεια, οι μη εισβάλλοντες κύτταρα μαζί με ECM γέλη απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια του φίλτρου με σκούπισμα με ένα μπουμπούκι βαμβάκι. Τα ένθετα σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Το αποτέλεσμα παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Tokyo, Japan) και τα κύτταρα μετανάστευσαν προς την κατώτερη επιφάνεια μετρήθηκαν. Για να εξαλειφθεί η ατομική μεταβλητότητα, τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές και η επεμβατική δείκτης υπολογίστηκε ως η αναλογία των κυττάρων μετανάστευσαν της ομάδας πειράματος με εκείνη του δικό του έλεγχο. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν, και επαναλαμβάνεται τρεις φορές.

Στατιστικά

Τα πειράματα

in vitro

παρουσιάστηκαν στη μέση ± SE. Τα δεδομένα της έκφρασης PCNA,

in vitro

βιωσιμότητα και την εισβολή δοκιμασία αξιολογήθηκαν με την post hoc του Dunnett

t

τεστ και τεστ Dunnett Τ3, κατά περίπτωση. Οι διαφορές έγιναν αποδεκτές ως σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Πρωτεΐνη Έκφραση των CXCL16-CXCR6 στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα

in vivo

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη έκφραση του CXCL16 και CXCR6 σε ανθρώπινο Caner πνεύμονα (33 δείγματα) και φυσιολογικούς ιστούς (5 δείγματα). Τα αποτελέσματα στο Σχ. 1 απέδειξε σαφώς την συνέκφραση των CXCR6 και CXCL16 πρωτεΐνη σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Ειδικά καφέ χρώματος χρώση για CXCR6 και CXCL16 στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη θα μπορούσε να παρατηρηθεί σαφώς στα πρωτογενή κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, αλλά ο θετικός ρυθμός έκφραση και χρώση ένταση του CXCR6 ήταν ισχυρότερη από εκείνη του CXCL16. Αν και μέτρια έως ισχυρή, καφέ χρώματος χρώση για CXCL16 και CXCR6 παρατηρήθηκε επίσης σε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, αλλά η θετική έκφραση κυρίως περιορίζονται στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και φλεγμονώδη κύτταρα. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη για μη ειδική χρώση με το αντίσωμα ελέγχου.

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη έκφραση του CXCL16-CXCR6 και CXCL12-CXCR4 σε ανθρώπινα πρωτογενή ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτό τα πειράματα ήταν ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR4 (25 μg /ml), ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR6 (25 μg /ml), αντι-ανθρώπινου CXCL12 ποντικού (20 μg /ml) και κατσίκα αντι-ανθρώπινο CXCL16 (20 /ml) αντισωμάτων μg. Απεδείχθη στο Σχ. 1 ότι ένα συγκεκριμένο καφέ χρώματος χρώση για CXCL16-CXCR6 και CXCL12-CXCR4 στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη της ανθρώπινης διαφορετικές παθολογικές μορφές του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. Μέτρια προς ισχυρή, καφέ χρώματος χρώση για CXCL16 και CXCR6 παρατηρήθηκε επίσης σε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, αλλά η θετική έκφραση κυρίως περιορίζονται στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και φλεγμονώδη κύτταρα. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη για μη ειδική χρώση με το αντίσωμα ελέγχου. Οι εικόνες ήταν ο εκπρόσωπος των πειραμάτων. AC: αδενοκαρκινώματα? SC: πλακώδες καρκίνωμα? BC: βρογχοκυψελιδικό καρκίνωμα? Con: φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων? Villi: ανθρώπινη πρώτο τρίμηνο λάχνης ιστούς, ως ένας θετικός έλεγχος. Μεγέθυνσης, × 200.

Η

Επίσης, αναλύσαμε επίσης τη σύνδεση του προτύπου έκφρασης CXCL16-CXCR6 με διαφορετικές παθολογικές μορφές του καρκίνου του πνεύμονα. Απεδείχθη στο Σχ. 2 ότι τα ανιχνεύθηκαν 33 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, για την έκφραση της πρωτεΐνης CXCR6, μόνο 3 περιπτώσεις SC ήταν ασθενές θετικό και οι άλλοι ήταν όλα μέτρια έως ισχυρή θετική, ενώ για CXCL16, η ένταση χρώσης ήταν αρνητική (10), ασθενές (8), μέτρια (8) και ισχυρή (7). Από τις 10 CXCL16-αρνητικά δείγματα, 7 περιπτώσεις ανήκουν σε AC, 2 περιπτώσεις ανήκουν σε SC και 1 περίπτωση ήταν ASC. Από τις 7 CXCL16-ισχυρή δείγματα, 5 περιπτώσεις ήταν SC και 2 περιπτώσεις ήταν ASC. Το υπόλοιπο 16 αδύναμο έως μέτρια δείγματα ήταν AC (6), SC (5) ASC (4) και BC (1), αντίστοιχα (Σχ. 2).

Σύμφωνα με το σκορ ένταση ανοσοχρώσης και του ποσοστού των θετικών κυττάρων, τα αποτελέσματα της ανάλυσης της ανοσοχημείας ταξινομήθηκαν ως ακολούθως: & lt? 2, αρνητική έκφραση? 2-3, ασθενής έκφραση? 4-5, μέτρια έκφραση, και 6-7 ως ισχυρή έκφραση. AC: αδενοκαρκινώματα? SC: πλακώδες καρκίνωμα? ASC: αδενοχοληδωτό καρκινώματα? Π.Χ:. Βρογχοκυψελιδικό καρκίνωμα

Η

Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε επίσης CXCL12-CXCR4 ως θετικό έλεγχο και σύγκριση του προτύπου έκφρασης μεταξύ CXCL16-CXCR6 και CXCL12-CXCR4. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1,2 και Πίνακας 1 η πλειονότητα των δειγμάτων που εκφράζονται CXCR4 (30/33) και CXCL12 (28/33) πρωτεΐνη, παρά από ένα ελαφρύ διαφορά στην ένταση έκφρασης. Επιπλέον, σε 33 δείγματα ανιχνεύθηκαν, υπήρχαν 30 περιπτώσεις που συν-εκφράζεται CXCR6 και CXCR4 πρωτεΐνη, και 19 περιπτώσεις που συν-εκφράζεται CXCL16 και CXCL12 πρωτεΐνη.

Η

Πρωτεΐνη Έκφραση των CXCL16-CXCR6 σε ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές γραμμές

Μετά την επιβεβαίωση της συνέκφραση CXCL16-CXCR6 πρωτεΐνης σε ανθρώπινη φυσική κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση του CXCL16-CXCR6 σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών Α549, Η292 και 95d με ανοσοκυτταροχημεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, θετική καφέ χρώματος χρώση για τόσο CXCL16 και CXCR6 μπορούσε να παρατηρηθεί σαφώς στο κυτταρόπλασμα και cytomembrane του Α549, Η292 και 95δ κύτταρα, αντίστοιχα. Αν και υπήρχαν διαφορές της έντασης έκφρασης σε Α549, 95d και Η292 κύτταρα, η χρώση για τον συνδέτη ήταν όλα σχετικά ασθενέστερη από ό, τι είναι υποδοχέα σε τρεις τύπους κυττάρων. Επιπλέον, το πρότυπο έκφρασης του CXCL16-CXCR6 ήταν παρόμοια με εκείνη του CXCL12-CXCR4, της ειδικής χρώσης για μπορούσαν επίσης να παρατηρηθεί τόσο CXCR4 και CXCL12 σε τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα παρά τη διαφορά της έντασης έκφραση σε διαφορετικά κύτταρα.

η ανοσοκυτταροχημεία διεξήχθη για την ανίχνευση της πρωτεΐνης έκφρασης του CXCL16-CXCR6 και CXCL12-CXCR4 σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτό τα πειράματα ήταν ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR4 (25 μg /ml), ποντικού αντι-ανθρώπου CXCR6 (25 μg /ml), αντι-ανθρώπινου CXCL12 ποντικού (20 μg /ml) και κατσίκα αντι-ανθρώπινο CXCL16 (20 /ml) αντισωμάτων μg. Θετικές καφέ χρώματος χρώση για αμφότερα CXCL16 και CXCR6 παρατηρήθηκε σαφώς στο κυτταρόπλασμα και cytomembrane του Α549, Η292 και 95d κύτταρα, αντίστοιχα. Επιπλέον, CXCL12 και CXCR4 επίσης συν-εκφράζεται στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα τρία. Δεν χρώση υποβάθρου παρατηρήθηκε στον έλεγχο ισότυπο. A: Οι εικόνες ήταν αντιπροσωπευτικές από τα πειράματα? Β: Η σχετική ένταση έκφρασης των CXCL16-CXCR6 και CXCL12-CXCR4 στο Α549, Η292 και 95δ κύτταρα. Tro: ανθρώπινα πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα τροφοβλάστης ως θετικός έλεγχος. Η μεγέθυνση, χ 200.

Η

Στη συνέχεια, ένας προσδιορισμός ELISA εκτελέστηκε για να εξετάσει την απελευθέρωση του διαλυτού CXCL16 σε καλλιεργημένα Α549, Η292 και 95d κύτταρα

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, τρία είδη κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα όλες εκκρίνονται CXCL16 αυθόρμητα σχεδόν σε ένα σταθερό ρυθμό, αλλά υπήρχε μια μικρή διαφορά στη συγκέντρωση του CXCL16 στο μέσο καλλιέργειας. Η ποσότητα του CXCL16 που παράγεται από τα κύτταρα Η292 ήταν η υψηλότερη μεταξύ των τριών τύπων κυττάρων. Η συγκέντρωση του CXCL16 στην 24 ώρες το καλλιεργημένο μέσο Η292 ήδη φτάσει σε 1391,9 ± 13,43 ng /ml και η συσσωρευμένη συγκέντρωση CXCL16 ήταν 2633.2 ± 9.84 και 2566,9 ± 3,1 ng /ml μετά από καλλιέργεια για 96 και 120 ώρες, αντίστοιχα. Αν και η παραγωγή των CXCL16 από κύτταρα Α549 ήταν σχετικά μικρότερη από εκείνη των δύο Η292 και 95d κύτταρα, η παραγωγή του CXCL16 ήταν ακόμη σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και η ποσότητα του CXCL16 ήταν 977,45 ± 12,85 ng /ml μετά από καλλιέργεια επί 120 ώρες. Για 95d κύτταρα, η συγκέντρωση του CXCL16 συσχετίζεται επίσης θετικά με το χρόνο καλλιέργειας και ο 120 h παραγωγή CXCL16 ήταν 1165,2 ± 12,00 ng /ml.

Χωνευμένου Α549, Η292 και 95d τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (500 μl /φρεάτιο) σε πυκνότητα 5 χ 10

5 /ml, αντίστοιχα. Τα υπερκείμενα των κυτταρικών καλλιεργειών συλλέχθηκαν στις 24, 36, 48, 60, 72, 96 και 100 ώρες καλλιέργειας. Μία δοκιμασία ELISA πραγματοποιήθηκε για να εξετάσει την απελευθέρωση του διαλυτού CXCL16 σε καλλιεργημένα Α549, Η292 και 95d κύτταρα

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, τρία είδη κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα όλες εκκρίνονται CXCL16 αυθόρμητα σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, παρά τις μια διαφορά στη συγκέντρωση του CXCL16 στο μέσο καλλιέργειας. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι ράβδοι σφάλματος απεικονίζουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η έκφραση μεμβράνης του CXCR6 σε Α549, Η292 και 95d κύτταρα. Αν και η αναλογία της έκφρασης CXCR6 με Η292 κυττάρων ήταν μικρότερη από εκείνη των δύο Α549 (52.4 ± 5.79%) και 95d κυττάρων (56,03 ± 11,42%), το μέσο ποσοστό ήταν ακόμη 34.87 ± 6.17 (Εικ. 5). Επιπλέον, εντοπίστηκε επίσης την έκφραση μεμβράνης του CXCR4 στο Α549, Η292 και 95δ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Διαπιστώθηκε ότι το ποσοστό των CXCR4-θετικών κυττάρων σε Α549, Η292 και 95d ήταν 25,56 ± 6,44, 46,00 ± 6,52 και 28,57 ± 1,43, αντίστοιχα. Έτσι, μεμβράνη CXCR6 και CXCR4 έχουν συνεκφράζονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα τρία παρά από μια μικρή διαφορά στη θετική αναλογία έκφρασης.

Η κυτταρομετρία ροής (FCM) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης της μεμβράνης CXCR6 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα . Τα κύτταρα του 1 × 10

5 μετρήθηκαν και η αναλογία αραίωσης (φυκοερυθρίνη) -CXCR6 μονοκλωνικό αντίσωμα και το μονοκλωνικό αντίσωμα PE-CY5-CXCR4 ήταν 1:10 και 1:05, αντίστοιχα. Το ιστόγραμμα κατέδειξε το μέσο ποσοστό έκφραση CXCR6 και CXCR4 σε Α549, Η292 και 95d κύτταρα, αντίστοιχα. Οι εικόνες FCM ήταν αντιπροσωπευτικές των πειραμάτων. Το ποσοστό των κυττάρων CXCR6 θετικών μεμβράνης σε Α549, Η292 και 95d ήταν 52,4 ± 5,80, 56,03 ± 11,42 και 34,8 ± 6,17, αντίστοιχα. Επιπλέον, η έκφραση μεμβράνη του CXCR4 παρατηρήθηκε επίσης σε Α549, Η292 και 95d κύτταρα ταυτόχρονα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και οι εικόνες ήταν αντιπροσωπευτικά των πειραμάτων. Οι μπάρες σφάλματος απεικονίζουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Επιδράσεις της CXCL16 για PCNA Έκφραση του καρκίνου του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων

in vitro

Η

Μετά τον προσδιορισμό της λειτουργικής ύπαρξη CXCL16 και CXCR6 στο Α549, 95δ και Η292, παρατηρήσαμε περαιτέρω την επίδραση των CXCL16 διέγερσης για PCNA έκφραση αυτών των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στο επίπεδο PCNA σε διάφορες πειραματικές ομάδες (Ρ & gt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο). Τα αποτελέσματα ήταν εξαιρετικά συνεπής σε τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και του άξονα CXCL16-CXCR6 δεν έδειξαν επίδραση στις PCNA έκφραση του Α549, 95d ή H292.

Μετά την νηστεία επί 12 (100 ng /mL) ή συνδυασμός των CXCL16 με αντίσωμα εξουδετέρωσης CXCL16 (100 ng /mL) για 48 ώρες ανθήρα. Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα της διέγερσης CXCL16 επί PCNA (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έκφραση ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στο επίπεδο PCNA σε διάφορες πειραματικές ομάδες (Ρ & gt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των πειραμάτων και τα αποτελέσματα ήταν επαναλήψιμα και συνεπής σε καρκινικές κυτταρικές σειρές τρία πνεύμονα. Οι μπάρες σφάλματος απεικονίζουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

CXCR6 ήταν κάτω-ρυθμίζονται από siRNA Τεχνολογίας

Η αποτελεσματικότητα της RNA παρεμβολής κατά CXCR6 επικυρώθηκε από κηλίδα western. Ήταν φαίνεται στο Σχ. 7 ότι CXCR6 πρωτεΐνη ουσιαστικά εκφράζεται σε κύτταρα Α549 (τράπεζα ελέγχου, χωρίς καμία επεξεργασία) και η τεχνολογία παρεμβολής RNA ανέστειλε αποτελεσματικά την έκφραση CXCR6 σε κύτταρα Α549. Η αποτελεσματικότητα αποσιώπησης του CXCR6 shRNA- (2819 – 1) ήταν η καλύτερη, έτσι σε όλα τα επόμενα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε αυτό το siRNA για να φιμώσουν την έκφραση CXCR6 mRNA.

Για να φιμώσουν την έκφραση του γονιδίου CXCR6, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα Α549 με phU6 /GFP /Neo πλασμίδιο που περιέχει μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) μόρια που στοχεύουν ενάντια CXCR6, με τη χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Οι αλληλουχίες για τρία ολιγονουκλεοτίδια shRNA ήταν: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC ΑΑΤ TCC ΑΑΟ ACT Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-AAG TCT ΤΟΟ ΑΑΤ TGT CCT CAG-3′ (Anti-νόημα )? (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-ΑΤΑ GCA GAC ΑΑΤ CAT GGT GAG-3′ (Anti-έννοια)? (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC ΤΟΟ ΟΤΟ ΑΤΑ Τ-3 ‘(με νόημα) και 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (Anti-νόημα). Αποτελεσματικότητα της RNA παρεμβολής κατά CXCR6 επικυρώθηκε από κηλίδα western. Ήταν φαίνεται στο Σχ. 7 ότι CXCR6 πρωτεΐνη ουσιαστικά εκφράζεται σε κύτταρα Α549 (τράπεζα ελέγχου, χωρίς καμία επεξεργασία) και η τεχνολογία παρεμβολής RNA ανέστειλε αποτελεσματικά την έκφραση CXCR6 σε κύτταρα Α549. Διαδρομή 1: Κενό ελέγχου? Διαδρομή 2: RNA-ελέγχου? Διαδρομή 3: CXCR6 shRNA- (2821-1)? Διαδρομή 4: CXCR6 shRNA- (2820-2)? Διαδρομή 5:. CXCR6 shRNA- (2819 – 1)

Η

Επιπτώσεις του CXCL16-CXCR6 στο Α549 κυττάρων Βιωσιμότητας

in vitro

Η

Αποτελέσματα δοκιμασίας ΜΤΤ στο Σχ. 8 έδειξε ότι δεν υπήρχε διαφορά του

in vitro

βιωσιμότητα μεταξύ του τυφλού ελέγχου και shRNA ελέγχου. Ωστόσο, σε σύγκριση με το τυφλό-ελέγχου, η βιωσιμότητα των Α549 κυττάρων από την CXCR6-shRNA (2819-1) ομάδες μειώθηκε σημαντικά με την παράταση του χρόνου καλλιέργειας (σε σύγκριση με τον μάρτυρα, Ρ & lt? 0,01 στους 72, 96 και 120 ώρες) . Επιπλέον, ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CXCL16 ήταν σε θέση να αυξήσει το

in vitro

βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 από το τυφλό-ελέγχου και shRNA ελέγχου (σε σύγκριση με τον μάρτυρα, Ρ & lt? 0,01), ενώ δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του Α549 κύτταρα από την CXCR6 ρυθμισμένα προς τα κάτω ομάδα (σε σύγκριση με τον έλεγχο, Ρ & gt? 0,05).

Η δοκιμασία ΜΤΤ εφαρμόστηκε για να αξιολογήσει τις επιδράσεις της CXCL16-CXCR6 στη βιωσιμότητα των κυττάρων

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ.