Αφηρημένο

Ιστορικό

επίπεδα μεθυλίωσης του γονιδιακού επαναλήψεων όπως η μακρά διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων (LINE-1) είναι αντιπροσωπευτικές της παγκόσμιας κατάστασης μεθυλίωσης και παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Ο στόχος της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) σε σχέση με αδενωματώδεις και κακοήθη εξέλιξη, η ετερογένεια των ιστών, και ΤΝΜ στάδιο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

DNA συλλέχθηκε με λέιζερ-σύλληψη μικροδιατομής (LCM) από την κανονική, αδένωμα, και καρκινικού ιστού από 25 ασθενείς με TisN0M0 και από 92 πρωτογενείς ασθενείς CRC διαφόρων ΤΝΜ-στάδια. Οι τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

in-situ

νάτριο DNA τροποποίηση όξινου θειώδους (SBM). LINE-1 δείκτη υπομεθυλίωσης (LHI) μετρήθηκε με απόλυτη ποσοτική ανάλυση των μεθυλιώνονται αλληλόμορφα (AQAMA) σε πραγματικό χρόνο PCR? μεγαλύτερο δείκτη έδειξε βελτιωμένη υπομεθυλίωση. LHI σε φυσιολογικά, μεσεγχυματικά καρκίνος, αδένωμα, και CRC ιστός ήταν 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) και 0,53 (SD 0,08), αντίστοιχα. LHI ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε αδένωμα ιστό σε σύγκριση με συνεχόμενο φυσιολογικό επιθήλιο του (

P

= 0,0003) και του καρκίνου μεσεγχυματικών ιστών (

P

& lt? 0,0001). LHI δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ αδενώματος και στις αρχές του καρκινικού ιστού του σταδίου Tis (

P

= 0,20). LHI αυξημένα με την υψηλότερη T-στάδιο (

P

& lt? 0,04), ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε θετικούς λεμφαδένες από CRC ασθενείς με αρνητικούς λεμφαδένες (

P

= 0,03), και ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στην σταδίου IV από ό, τι όλα τα άλλα στάδια της νόσου (

P

& lt? 0,05).

Συμπέρασμα /Σημασία

Με τη χρήση του

in-situ

SBM και LCM κυττάρων επιλογή δείξαμε πρώιμη έναρξη της LINE-1 απομεθυλίωση κατά τη διάρκεια αδενωματώδεις αλλαγή του παχέος επιθηλιακών κυττάρων και απέδειξαν ότι LINE-1 απομεθυλίωση εξέλιξη είναι γραμμική σε σχέση με την εξέλιξη της ΤΝΜ στάδιο

Παράθεση:. Sunami E, de Maat Μ, Vu Α, Turner RR, Hoon DSB (2011) LINE-1 υπομεθυλίωση Κατά Πρωτοβάθμια καρκίνου του παχέος εντέρου εξέλιξη. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10.1371 /journal.pone.0018884

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 12 Οκτώβρη, 2010? Αποδεκτές: 24 του Μαρτίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 14, Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Sunami et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι μελέτες υποστηρίχθηκαν από το Ίδρυμα Weil Οικογένειας (Los Angeles, CA) και η Leslie και η Susan Gonda (Goldschmied) Ίδρυμα (Los Angeles, CA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου το 17-18% του ανθρώπινου γονιδιώματος αποτελείται από καιρό διάσπαρτα στοιχείο νουκλεοτιδίων (LINE-1) επαναλαμβάνεται. Περίπου 500.000 περικοπεί και 3.000 έως 5.000 αλληλουχίες πλήρους μήκους LINE-1 είναι παρούσες σε όλο το γονιδίωμα [1]. Σε φυσιολογικά σωματικά κύτταρα, LINE-1s είναι σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένη, περιορίζει τις δραστηριότητες του retrotransposal στοιχεία και εμποδίζοντας έτσι γενωμική αστάθεια [2], [3]. LINE-1 αλληλουχιών είναι μετρίως πλούσια σε CpG, και οι περισσότεροι μεθυλιωμένα CpGs που βρίσκεται στην περιοχή του 5 ‘και μπορούν να συμπεριφέρονται ως εσωτερικές υποστηρικτές [2]. LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν το γονιδίωμα-ευρεία κατάσταση μεθυλίωσης του DNA, καθώς LINE-1 αλληλουχιών είναι εξαιρετικά επαναλαμβανόμενη, ευρέως διάσπαρτα ανθρώπινα ρετροτρανσποζόνια. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει μια σχέση σημαντικών γονιδιωματικής γεγονότα του παχέος καρκινογένεση να LINE-1 μεθυλίωσης. Για παράδειγμα, 18q απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) (+) ορθοκολικό καρκίνο (CRC) δείχνουν ένα χαμηλότερο μέσο επίπεδο μεθυλίωσης LINE-1 [4]. Μια αντίστροφη σχέση έχει αναφερθεί μεταξύ LINE-1 μεθυλίωση και μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) + /CPG φαινότυπο νησί methylator (CIMP) + /BRAF V600E μετάλλαξη CRC [5], [6]. Έχει πρόσφατα αναφερθεί μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του LINE-1 μεθυλίωση και το συνολικό αριθμό των χρωμοσωμικών ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων τόσο των ζημιών και κερδών σε γαστρεντερικούς στρωματικούς όγκους (GIST) [7]. Όσον αφορά CRC, Bariol et al. αποκάλυψε ότι η παγκόσμια επίπεδο υπομεθυλίωσης του DNA ήταν μεγαλύτερη σε νεοπλασματικές αλλοιώσεις (συμπεριλαμβανομένων των υπερπλαστικών πολυπόδων και αδένωμα) από ό, τι στην κανονική βλεννογόνο [8].

Ένα σημαντικό πρόβλημα στην αξιολόγηση των LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης στο CRC είναι ότι CRC είναι εξαιρετικά ετερογενής και περιέχει διάφορες διηθητικά κύτταρα όπως στρωματικά κύτταρα, λεμφοκύτταρα, και τα αιμοφόρα αγγεία. Το συστατικό στρωματικά και η έκταση της λεμφοκυτταρικής διείσδυσης ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των CRCs. Αυτή η ετερογένεια μπορεί να επηρεάσει την μοριακή ανάλυση, ιδιαίτερα LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης, όπως LINE-1 μεθυλιώνεται στα φυσιολογικά κύτταρα. Για να αποκτήσει ακριβείς ερμηνείες, είναι συνεπώς απαραίτητο να απομονώσουμε συγκεκριμένα καρκινικά κύτταρα από δείγματα ιστών. Πρόωρη στάδιο CRC πρωτογενή ανάλυση όγκου χωρίς ιστοπαθολογία κατευθυνόμενης μικροδιατομής για την αξιολόγηση της θέσης μεθυλίωσης γονιδιωματικού δεν είναι ακριβής. Αυτό είναι ιδιαίτερα ένα προβληματικό ζήτημα κατά την αξιολόγηση CRC εξέλιξη και κατά τη σύγκριση αδενώματος σε καρκινικό ιστό. Στιβαρό και ακριβείς τεχνικές για τέτοιες αναλύσεις δεν υπάρχουν? Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει μια πρακτική προσέγγιση. Αξιοποιήσαμε μικροδιατομής λέιζερ-σύλληψη (LCM) για την συγκομιδή των κυττάρων του ενδιαφέροντος άμεσα χωρίς μόλυνση των μη-καρκινικών κυττάρων. Όξινο θειώδες νάτριο τροποποίηση (SBM) γονιδιωματικού DNA είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για να διακρίνει την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG νησίδων [9]. Οι συμβατικές μέθοδοι SBM οδηγήσει σε 84% έως 96% απώλεια του δείγματος DNA [10]. Αυτή η σημαντική απώλεια της μήτρας DNA απαιτεί υψηλούς όγκους ξεκινώντας δείγμα ιστού. Για να μειωθεί η απώλεια του δείγματος DNA από κύτταρα που συλλέγονται από LCM, έχουμε αναπτύξει μια

in-situ πρωτόκολλο

SBM. DNA τροποποιήθηκε ενώ τα συλληφθέντα κύτταρα εξακολουθούν να συνδέονται στο καπάκι LCM.

Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφερθεί ταυτοποίηση CRC-σχετίζεται εκτροπές επιγενετική όπως περιοχή προαγωγού υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Ένα άλλο χαρακτηριστικό μεταβολή CRC σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA είναι παγκόσμια υπομεθυλίωση [11], [12]. Η εξέλιξη της LINE-1 επίπεδο υπομεθυλίωση κατά την ανάπτυξη του CRC κακοήθειας και την εξέλιξη της νόσου δεν έχει αυστηρά αξιολογηθεί. Καθορισμό της ιστοπαθολογία που σχετίζονται με την έναρξη της απώλειας LINE-1 μεθυλίωση και την τάση των LINE-1 μεθυλίωσης κατά μήκος του άξονα της εξέλιξης στάδιο της νόσου θα μπορούσε να διευκρινίσει περαιτέρω το ρόλο της LINE-1 υπομεθυλίωση στη νόσο του CRC. Σε αυτή τη μελέτη, LCM,

in-situ

SBM, και η απόλυτη ποσοτικοποίηση του μεθυλιωμένων αλληλίων (AQAMA) έχουν χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό για δείγματα από ασθενείς με αδενώματα που περιέχουν

in situ

επεμβατική αδενοκαρκίνωμα (TIS) και οι ασθενείς με πιο προηγμένες CRC. Αυτό επέτρεψε την επιτυχή ακριβή ανάλυση των επιπέδων υπομεθυλίωσης LINE-1 κατά τη διάρκεια της πρωτοβάθμιας εξέλιξης του όγκου μεταξύ των προοδευτικών Τ-στάδια, κόμβος θετικά έναντι κόμβο αρνητική νόσο, και μακρινό μεταστατικό έναντι των τοπικών και τοποπεριοχική νόσου.

Αποτελέσματα

AQAMA γραμμικότητα για LINE-1 επίπεδο μεθυλίωσης

αξιολόγηση

Κατ ‘αρχάς, θα αξιολογείται η ακρίβεια των AQAMA στην αξιολόγηση διάφορα επίπεδα LINE-1 μεθυλίωσης. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα της AQAMA είναι ότι η ποσοτική μέτρηση της μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων αλληλίων διεξάγεται σε μία μόνο αντίδραση PCR, παρέχοντας εξαιρετικό έλεγχο σε σύγκριση με δύο ξεχωριστές αντιδράσεις PCR για μεθυλιωμένο και μη-μεθυλιωμένου ανάλυση αλληλόμορφο. Η ποσοτικοποίηση είναι απόλυτη με πρότυπες καμπύλες για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων. Για αρνητικό έλεγχο, η αντίδραση δοκιμασίας περιείχε καθολικής μη μεθυλιωμένο DNA ελέγχου που συντέθηκε όπως περιγράφεται σε ένα προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη [13]. Για ένα θετικό μάρτυρα, χρησιμοποιήσαμε την καθολική DNA μεθυλιωμένο ελέγχου που εξάγεται από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος από έναν υγιή δότη και υποβάλλεται σε επεξεργασία με

SSSI μεθυλτρανσφεράση.

Για τη μελέτη αυτή, παρασκευάσαμε βαθμιδωτή μίγματα των μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων πρότυπο cDNA και μετρήθηκε τους ως δείγματα με άγνωστο επίπεδο μεθυλίωσης. Η γραμμικότητα της δοκιμασίας AQAMA για LINE-1 επίπεδο μεθυλίωσης (Σχήμα 1) αξιολογήθηκε με συντελεστή Pearson της γραμμικότητας: 0.99 (

P

& lt? 0.001), η οποία έδειξε υψηλή ακρίβεια στη διάκριση LINE-1 διαφορές επιπέδου μεθυλίωσης.

Οικόπεδο μετριέται (κουτιά) και αναμένεται (x) τιμές που δείχνουν την ακρίβεια του προσδιορισμού AQAMA LINE-1.

η

Βελτιστοποίηση

ρυθμίσεις

SBM in-situ

LCM διεξήχθη για να μαζέψουν τα κύτταρα ενδιαφέροντος (Σχήμα 2α) να αποκτήσουν ακριβή αναπαράσταση των κυττάρων σε ερώτηση για την επιτυχή μέτρηση AQAMA. Τρεις διαφορετικές περιοχές του δείγματος ιστού από 10

4, 10

5 και 10

με 6 μm

2 συλλέγονται από 4 μm πάχους παραφίνη-ενσωματωμένες αρχειακό ιστού (τύρφη) ελέγχθηκαν. Μέσα από την ανάλυση, διαπιστώσαμε ότι 2 × 10

5 μm

2 από 4 μm πάχους αποτελέσματα τύρφη σε περίπου 10

5 αριθμούς αντίγραφο LINE-1 DNA. Αυτό παρείχε σημαντική αναπαραγώγιμα επίπεδα του προσδιορισμού μεθυλίωσης DNA LINE-1. Μετά LCM,

in-situ

SBM βελτιστοποιήθηκε κατά παρόμοιο τρόπο όπως έγινε στις προηγούμενες μελέτες επί slide SBM χρησιμοποιώντας ειδική ενίσχυση γονιδιωματική αλληλουχία [14]. Οι τιμές μετατροπής τροποποιημένου DNA από

in-situ

SBM ήταν 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% και 94,4 ± 2,1% σε ρύθμιση επώασης των 60 ° C για 2, 4 και 8 ώρες, αντίστοιχα (Σχήμα 2β). Οι τιμές μετατροπής αυξάνεται με την αύξηση της διάρκειας της επώασης, σύμφωνα με την οποία μετά από 8 ώρες έφθασε περίπου 95%. Η απόδοση του συνολικού DNA (τροποποιημένα και μη τροποποιημένα DNA) δεν μειώνεται με την αύξηση του χρόνου επώασης μέχρι 8 ώρες (Εικόνα 2c). Από τα αποτελέσματα αυτά, μια ρύθμιση επώασης 60 ° C για 8 ώρες επιλέχθηκε ως βέλτιστη για

in-situ

SBM.

Α δείχνει συγκεκριμένες pick-up των κυττάρων-στόχων από LCM. Β και Γ δείχνουν τα αποτελέσματα για το ποσοστό μετατροπής του DNA (%) και για το περιεχόμενο του DNA (× 10

4 αριθμούς αντίγραφο), αντίστοιχα, σε 8 διαφορετικά δείγματα σε 3 διαφορετικές περιόδους επώασης.

Η

LINE-

επιλέχθηκαν 1 επίπεδα υπομεθυλίωση κατά τη διάρκεια της CRC εξέλιξη

Είκοσι πέντε ασθενείς με βλάβες TisN0M0 με την παρουσία της κανονικής, αδένωμα (χαμηλό ή ενδιάμεσο βαθμού) και της καρκινικά κύτταρα στο ίδιο τμήμα του ιστού. Χρησιμοποιώντας LCM, τέσσερα διαφορετικά δείγματα ιστών (κανονικό βλεννογόνο, αδένωμα, του καρκίνου και του καρκίνου μεσεγχυματικό ιστό) συλλέχθηκαν από κάθε ασθενή.

In-situ

SBM και δοκιμασία AQAMA LINE-1 πραγματοποιήθηκαν σε κάθε δείγμα. Το επίπεδο των LINE-1 υπομεθυλίωσης (LHI) υπολογίστηκε ως Q

unmeth /(Q

unmeth + Q

μεθ), όπου Q

unmeth και Q

μεθ είναι οι απόλυτοι αριθμοί αντίγραφο μη μεθυλιωμένων και μεθυλιωμένων LINE-1, αντίστοιχα. Σε κανονική βλεννογόνο δίπλα αλλοιώσεις όγκου και μεσέγχυμα καρκίνος, ο μέσος όρος ήταν 0.382 LHI και 0.366, αντίστοιχα. Δεν υπήρχε διαφορά της LHI μεταξύ μεσεγχύματος καρκίνου και φυσιολογικού βλεννογόνου πλησίον του όγκου. LHI ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στην συνορεύουσα αδενώματος και καρκίνου του ιστού από πρώιμο στάδιο από ό, τι στην κανονική βλεννογόνο (μέση LHI = 0.49, 0.52, και 0.38, αντίστοιχα) (Σχήμα 3). Από τα αποτελέσματα αυτά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι LINE-1 υπομεθυλίωση εμφανίζεται στο αρχικό στάδιο της CRC ογκογένεσης. Επιπλέον, αυτά τα πειράματα απέδειξαν την αναγκαιότητα της χρήσης λεπτομερείς διαδικασίες για τη συλλογή του DNA κατά την ανάλυση LINE-1 επίπεδα μεθυλίωσης, όπως η απομόνωση των κυττάρων-στόχων, με LCM. Με βάση αυτό, LCM χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή δειγμάτων DNA για όλα τα πειράματα στις μελέτες μας.

Η

LINE-1 υπομεθυλίωση και ιστών ετερογένεια

Κατά την ανάλυση των LHI της κανονικής, μεσεγχυματικά καρκίνος, αδένωμα, και CRC ιστός, ήταν 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) και 0,53 (SD 0,08), αντίστοιχα. Για να ελέγξετε εάν υπάρχει ετερογένεια των LINE-1 υπομεθυλίωση μέσα σε έναν όγκο, επιλέχθηκαν 20 T3N0 όγκους για ανάλυση. Δείγμα DNA συλλέχθηκε από την επιφάνεια του αυλού και το βαθύτερο invasional θέση του κάθε όγκου. LHI των δύο αυτών τόπων συγκρίθηκαν (Σχήμα 4). Η μέση LHI ήταν 0,58 στην επιφάνεια και 0.54 στο βαθύτερο τόπους. LHIs ήταν παρόμοιες στην επιφάνεια και στο βαθύτερο τόπους και όγκου ετερογένεια των LINE-1 υπομεθυλίωσης δεν παρατηρήθηκε.

Οι μετρούμενες τιμές LHI στο T3N0 CRC όγκους σύγκριση κύτταρα που λαμβάνονται από την περιοχή του όγκου επιφάνειας του αυλού στο βάθος του όγκου εισβολή περιοχή.

η

LINE-1 υπομεθυλίωσης και CRC στάδιο

για να εκτιμηθεί η μεταβολή του LINE-1 επίπεδα υπομεθυλίωση σύμφωνα με την εξέλιξη του όγκου, η συσχέτιση μεταξύ των σταδίων Dukes και LHI αναλύθηκε. Dukes Α (n = 38), Dukes Β (n = 18), και Dukes Ο (n = 29) επιλέχθηκαν δείγματα (Σχήμα 5c). Η μέση LHI σε Dukes Α, Β, και C ήταν 0.533, 0.607, και 0.621, αντίστοιχα. Dukes Β και Γ όγκων έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι LHI όγκους δούκες Α. Η σχέση μεταξύ LINE-1 μεθυλίωση και Τ-σταδίου (Τ1 (n = 24), Τ2 (n = 21), Τ3 (n = 21), και Τ4 (n = 26)), καθώς και Ν-στάδιο (N0 ( n = 57) και Ν1 (n = 35)) αναλύθηκαν. αξιολογήθηκαν Η αύξηση του LHI σύμφωνα με εισβολή όγκου (Σχήμα 5α) και η διαφορά των LHIs μεταξύ λεμφαδένα θετικών και αρνητικών περιπτώσεων (Σχήμα 5β). Η μέση LHI του Τ1, Τ2, Τ3, Τ4 και ήταν 0,50, 0,58, 0,60, και 0,65, αντίστοιχα. LHI ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (

P

= 0,03) για τις περιπτώσεις με θετικούς λεμφαδένες (LHI = 0,64) από ό, τι αρνητικό λεμφαδένες (LHI = 0,54). Η πρόβλεψη των κομβικών κατάσταση θα ήταν η πιο κλινικά σημαντική και ως εκ τούτου μια καμπύλη λειτουργίας δέκτη (ROC) αναλύθηκε για τη διάκριση αν κόμβος μετάσταση θετικό μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης του πρωτεύοντος CRC μέσω LHI (Σχήμα 6). T-στάδιο εξέλιξης συσχετίζεται σημαντικά με την αύξηση της LHI (

P

= 0,01). Αναλύσαμε επίσης περιπτώσεις με μακρινό εξάπλωση της νόσου (Dukes D, n = 6), και αυτές οι περιπτώσεις έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη LHI σε σύγκριση με Dukes C CRCs (

P

= 0,05) μόνο και σε όλα τα άλλα στάδια Δούκα (

P

& lt? 0,0001). Ένα ROC παραστάθηκε γραφικά για να δείξει την ακρίβεια για την πρόβλεψη των κομβικών εμπλοκή LHI (Σχήμα 6). Αυτό έδειξε ότι η προγνωστική αξία είχε ευαισθησία 0.77 με ειδικότητα 0.62. Υπήρξε σημαντικά χαμηλότερη LHI για δεξιάς έναντι της αριστερής πλευράς του παχέος εντέρου (

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ LHI για την κατάσταση διαφοροποίησης ή το φύλο.

Α, Β και Γ διαφορές εμφανίζονται μεταξύ στάδιο Δούκα, T-στάδιο και Ν-φάση, αντίστοιχα.

Η

Ο x-άξονας αντιπροσωπεύει 1-ειδικότητα και την ευαισθησία y-άξονα. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε έως 0,69. P = 0.003.

Η

Οι αναλύσεις έδειξαν θετική γραμμική σχέση μεταξύ της εξέλιξης των LINE-1 υπομεθυλίωσης και CRC στάδιο εξέλιξης.

Συζήτηση

Η μεταβολή της μεθυλίωσης του DNA μοτίβα έχει μελετηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου [15]. Η υπερμεθυλίωση ειδικές περιοχές υποκινητή του γονιδίου που σχετίζεται με καρκίνο και η παγκόσμια υπομεθυλίωσης του DNA κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου έχει τώρα εμφανίζεται ως σημαντική ιδιότητα των καρκίνων [16], [17]. Υπομεθυλίωση των επαναληπτικών DNA LINE-1 το οποίο σχηματίζει το 20% του γονιδιώματος έχει προταθεί ως υποκατάστατο για την παγκόσμια υπομεθυλίωσης του DNA [5], [18], [19], [20]. Yang et al. έδειξε ότι το γονιδίωμα-ευρεία μεθυλίωση μπορεί να εκτιμηθεί με την αξιολόγηση [21]. Alu επαναλήψεις είναι Σίνες, πιο σύνθετη και ποικιλόμορφη από τις γραμμές. Αξιόπιστες δοκιμασίες μεθυλίωσης για να μελετήσει Alu δεν είναι καλά τεκμηριωμένες. Μια ακριβής αντιπροσωπευτική δοκιμασία για παγκόσμιο φαινόμενο μεθυλίωσης δεν υπάρχει? Ωστόσο, LINE-1 μπορεί να χρησιμεύσει επίσης και ως υποκατάστατο.

LINE-1 υπομεθυλίωσης δεν είναι ειδικό για καρκινικά κύτταρα, και περίπου το ένα τρίτο των LINE-1 είναι μη μεθυλιωμένο σε φυσιολογικό βλεννογόνο και τον καρκίνο μεσεγχυματικά κύτταρα [22], [23]. Η πιθανή μόλυνση του DNA δείγματος που αποτελείται από καρκίνο, μαζί με μεσεγχυματικά κύτταρα, όπως ινοβλάστες ή λεμφοκύτταρα, μπορεί ως εκ τούτου να προκαλέσει ανακριβή αποτελέσματα. Για το λόγο αυτό, ιδιαίτερα όσον αφορά LINE-1 ανάλυση μεθυλίωσης, ακριβή απομόνωση των κυττάρων-στόχων είναι εξαιρετικά σημαντική. Για να ελαχιστοποιηθεί η μόλυνση και να λάβει τα κύτταρα του μόνο ενδιαφέρον, μπορούμε με επιτυχία ολοκληρωμένα LCM στην LINE-1 μεθυλίωση αναλύει σε αυτή τη μελέτη. Εκτιμήσαμε

in-situ

SBM σε συνδυασμό με LCM ως μια προσέγγιση για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας δοκιμασία μεθυλίωσης του DNA, η οποία επιτρέπει την αξιολόγηση των κυττάρων από συγκεκριμένες ιστοπαθολογικά καθορισμένες περιοχές-στόχους του πολύ πρώιμο στάδιο πρωτογενούς ανάπτυξης CRC. Μια πρόσφατη μελέτη προσέφερε κάποιες ενδείξεις ότι τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα αν χρησιμοποιείται macrodissection ή LCM [24]. Ωστόσο, αυτό εξαρτάται από την ευαισθησία του προσδιορισμού υψηλά. Η έννοια της LCM, ωστόσο, είναι state-of-the-art και την ανώτερη macrodissection όταν είναι επιθυμητή η μικρή στοχευμένη δείγματος εισόδου ιστών για ανάλυση DNA. Κατ ‘αρχάς, όταν πρώιμα στάδια μικρές αλλοιώσεις πρέπει να αξιολογούνται και μόνο μικρές περιοχές των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων είναι διαθέσιμα για ανάλυση, η μικροσκοπία καθοδηγούμενη κυττάρων pick-up παρέχει ακρίβεια και έλεγχο του δείγματος DNA εισόδου. Δεύτερον, LINE-1 μεθυλίωση δεν είναι ειδική για τον καρκίνο και, όπως δείχνουν τα αποτελέσματα μας, βρίσκεται στον καρκίνο στρωματικό ιστό. Με την τρέχουσα κατανόηση της μικροπεριβάλλον του όγκου και στρωματικών όγκων ετερογένεια, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να εκτελέσει την ανάλυση LCM για συγκεκριμένες ανάκτηση του DNA του ιστού. Επίσης, LINE-1 μεθυλίωσης θα αναμενόταν να ποικίλει σε γειτονικά «φυσιολογικά» κύτταρα ενός πρωτογενούς όγκου, δεδομένου ανάλυση μικροσκοπία φωτός παθολογία δεν είναι πάντα ακριβής για τον εντοπισμό μεταμόρφωση πρώιμο στάδιο των καρκινικών κυττάρων.

In-situ

SBM σχεδιάστηκε με βάση την on-slide SBM [14], το οποίο προσαρμόστηκε από μια έννοια όπως αναφέρθηκε από Nuovo et al [25]. On-slide SBM είναι ένα ισχυρό διαδικασία για την ανάλυση μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας τύρφη? Ωστόσο, μετά από on-slide SBM το δείγμα γίνεται πάρα πολύ συγκολλητικό στην γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα, γεγονός που καθιστά δύσκολο για LCM να συλλάβει αποτελεσματικά κύτταρα στόχους κατά καιρούς.

In-situ

SBM εξαλείφει τις πολυάριθμες απομόνωση DNA και καθαρισμό του κλασικού SBM, που είναι η κύρια αιτία της απώλειας του DNA κατά την αξιολόγηση χαμηλές ποσότητες DNA από περιορισμένο αριθμό κυττάρων. Η μελέτη μας περιγράφει

in situ

θεραπεία των ιστών /κυττάρων απευθείας από θειώδους δοκιμασία ενσωματωθεί με LCM. Ένας περιορισμός της ανάλυσης είναι ότι η ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης μεμονωμένων κυττάρων παραμένει δύσκολη λόγω της εξευτελιστική DNA φύση του πρωτοκόλλου SBM και περιορισμένη DNA για ανάλυση μεθυλίωσης.

Συνδυάζοντας LCM,

in-situ

SBM, και δοκιμασία AQAMA, LINE-1 υπομεθυλίωση αποδείχθηκε σε χαμηλή προς ενδιάμεσο βαθμό αδενώματος, ένα πρώιμο στάδιο της ογκογένεσης παχέος όπως φαίνεται προηγουμένως [5], [6]. Μια σημαντική μείωση LINE-1 μεθυλίωση μετρήθηκε συγκρίνοντας αδένωμα με το γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά φάνηκε όταν ο αδένωμα συγκρίθηκε με το συνεχόμενο καρκινικό στάδιο ιστός Tis οποίο επίσης αναφέρθηκε πρόσφατα από τους Kwon et al [26]. Αυτό το αποτέλεσμα διαφέρει από τις μελέτες για τον Ibrahim et al. και με Irahara et al. ότι διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές των LHI μεταξύ ορθοκολικού αδενώματος και CRC [24], [27]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι μελέτες αυτές δεν προσδιορίζει το ΤΝΜ στάδιο των δειγμάτων. Το μη σημαντική διαφορά μεταξύ αδενώματος και του καρκίνου των ιστών στη μελέτη μας εξηγείται από τη χρήση μιας ετερογενή ομάδα καρκινικών ιστών από το αρχικό στάδιο του καρκίνου (

in situ καρκίνωμα

, TIS). Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι τα επίπεδα LINE-1 μεθυλίωσης διαφέρουν ανάλογα με TNM-στάδια. Όταν LHI στα αδενώματα συγκρίθηκαν με πιο προχωρημένο στάδιο δείγματα CRC στη μελέτη μας οι διαφορές ήταν σημαντικές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό αποδεικνύει ότι η μη μεθυλιωμένα LINE-1 δεν μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, όταν τα κύτταρα αδένωμα να αποκτήσουν την πρώτη τους επεμβατική δραστηριότητα.

Η αυξημένη ετερογένεια που συναντάμε σε μεγαλύτερες, προηγμένες βλάβες είναι μια ένδειξη ότι υπάρχουν υποομάδες CRC ότι είναι σε θέση να διατηρήσει μεθυλίωση του LINE-1. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήσαμε ότι δύο περιπτώσεις Dukes στάδιο D είχε LHI του 0,9 που είχε δει μόνο σε αυτή την υποομάδα. Η ετερογένεια είναι ένα γνωστό κλινικό πρόβλημα ως αποτέλεσμα της νόσου ποικίλλει ευρέως για ασθενείς CRC με την ίδια ΤΝΜ σταδίου. Η ποικιλομορφία των LHIs μέσα στα διάφορα στάδια στη μελέτη μας μπορεί να αντανακλά αυτό. Οι μηχανισμοί που ελέγχουν τη συντήρηση των LINE-1 μεθυλίωση και πώς επηρεάζουν την εξέλιξη του όγκου είναι ακόμη άγνωστη.

Σε μια μεγάλη μελέτη από Baba et al [28], ένα σχέση με το στάδιο της νόσου έχει περιγραφεί με μεγαλύτερη LINE- 1 απομεθυλίωση σε πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου, αν και οι διαφορές ήταν πολύ μικρό. Επίσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, τα επίπεδα μεθυλίωσης LINE ήταν υψηλότερα κατά το στάδιο της νόσου II σε σύγκριση με το Ι στάδιο Αυτή η μελέτη ανέλυσε τα τμήματα ολόκληρη ιστού χωρίς τη χρήση μικροδιατομής. Ένας από τους λόγους που οι διαφορές ήταν μικρές και το στάδιο II έδειξαν υψηλότερη LINE-1 μεθυλίωση μπορεί να είναι ο βαθμός της μόλυνσης DNA μεσεγχυματικών κυττάρων στο DNA δείγμα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι όχι μόνο παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, αλλά και μεσεγχυματικών κυττάρων στον καρκίνο, δείχνουν περίπου το ένα τρίτο των LINE-1 υπομεθυλίωση. Αυτό υποστηρίζει έμφαση μας ότι η συγκεκριμένη απομόνωση κυττάρου-στόχου είναι απαραίτητη. Προγνωστική αξία της γραμμής 1-επίπεδα μεθυλίωσης στο CRC έχει αναφερθεί [29]? Ωστόσο, η διακύμανση μεταξύ των όγκων μπορεί να είναι αποτέλεσμα της μόλυνσης στρωματικών /μεσεγχυματικά συνιστώσα [30].

Η μελέτη μας δείχνει μια σαφή βαθμιδωτή θετική γραμμική σχέση της απώλειας LINE-1 μεθυλίωση για Τ-, Ν-, όπως καθώς και των Μ βαθμίδων. Τα επίπεδα LINE-1 απομεθυλίωση μπορεί συνεπώς να είναι χρήσιμες σε διάφορες κλινικές καταστάσεις. Προεγχειρητική ανάλυση υλικού βιοψίας CRCs που μπορεί να προβλέψει T-στάδιο (Tis εναντίον Τ1 ή Τ1 εναντίον Τ2) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αποφασίσει αν ενδοσκοπική εκτομή (δηλαδή transanal βλεννογόνου εκτομή του ορθού) μπορεί να επιχειρηθεί σε σχέση με ανοικτή χειρουργική εκτομή, η οποία συνδέεται με πολύ υψηλότερα ποσοστά νοσηρότητας /θνησιμότητας. πρόβλεψη Ν-στάδιο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να επιλέξετε CRC ασθενείς να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα της εισαγωγική θεραπεία. Επιπλέον, η πρόβλεψη Μ-στάδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την ανάληψη περαιτέρω μεταστατικό προεγχειρητική απεικόνιση με PET-CT scan εκτός από την κλασική επεξεργασία. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η προεγχειρητική υλικό της βιοψίας του όγκου από την αυλική πλευρά είναι αντιπροσωπευτική, αξιολογήσαμε την ετερογένεια των όγκων. Η σύγκριση μεταξύ βαθύτερο τμήμα και της επιφάνειας του όγκου έδειξε ότι η ετερογένεια του όγκου του LINE-1 κατάστασης μεθυλίωσης είναι σχετικά λεπτή. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CRC δείγματα βιοψίας που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της κολονοσκόπησης είναι αντιπροσωπευτικά και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της ανάλυσης κατάστασης μεθυλίωσης LINE-1 α του όγκου του. Η μέση LHI διέφερε σημαντικά μεταξύ του κόμβου θετικών και αρνητικών κόμβο CRCs? σύμφωνα με την οποία η ανάλυση ROC εμφάνισε αποτελέσματα διακρίσεις. Υπήρχε επικάλυψη των τιμών LHI μεταξύ του Ν + και N0 κατηγορίες και την ευαισθησία και ειδικότητα ήταν σχετικά χαμηλή. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης για Τ- και διακρίσεις Μ-στάδιο. Οι μεγαλύτερες μελέτες για να καθοριστεί η χρησιμότητα των LHI ως ένα ενιαίο βιοδείκτη ή συνδυασμό με άλλους βιοδείκτες.

Εν κατακλείδι, η μελέτη κατέδειξε ότι η κατάσταση μεθυλίωσης LINE-1 συσχετίζεται με παθολογικές στάδιο της CRC. Επιπλέον, η ακριβής ανάλυση του με LCM ή ισοδύναμες τεχνικές είναι απαραίτητο, όπως τα κύτταρα που περιβάλλουν καρκινικά υποστηρικτική μεσεγχυματικού ιστού σαφώς μπορούν να επηρεάσουν τα αποτελέσματα. Η έναρξη της LINE-1 απομεθυλίωση εμφανίζεται πολύ νωρίς, όταν η κανονική του παχέος βλεννογόνο εξελίσσεται σε ένα αδένωμα με χαμηλό ή ενδιάμεσο δυσπλασία. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια σαφή και σημαντική γραμμική συσχέτιση της εξέλιξης της απώλειας της μεθυλίωσης LINE-1 στοιχείο για την εξέλιξη της νόσου CRC (Σχήμα 7) σε σχέση με Τ- καθώς Ν- και Μ βαθμίδων. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συνεχή απώλεια της γονιδιωματικής μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης CRC, γεγονός που δείχνει ότι η υψηλή Γενετικής και έτσι γονιδιωματικής γεγονότα είναι τα βασικά χαρακτηριστικά της εξέλιξης του όγκου.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Μέτρηση της LINE- 1 υπομεθυλίωση

Η κατάσταση μεθυλίωσης του LINE-1 αξιολογήθηκε με προσδιορισμό AQAMA για την ακριβή αξιολόγηση των επιπέδων νησιού μεθυλίωσης CpG [31]. Πριν την εκτέλεση της δοκιμασίας AQAMA των LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης, SBM εφαρμόστηκε σε κάθε δείγμα DNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. AQAMA απαιτεί ένα εμπρός και ένα αντίστροφο έναυσμα που θα ενισχύουν την αλληλουχία-στόχο ανεξάρτητα από την κατάσταση μεθυλίωσης, όπως εκείνα προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή σύνολα δεν περιέχουν CpG. Η κατάσταση μεθυλίωσης αξιολογείται από δύο (MGB) ανιχνευτών-αύλακα δέσμευσης ελάσσονα μόριο που περιέχει (Applied Biosystems): ένα μεθυλίωσης ειδικό και ένα ειδικό unmethylation. Ο εκκινητής 5 ‘, 3′ εκκινητή, μεθυλίωση ειδικό ανιχνευτή και unmethylation-ειδικό ανιχνευτή παρατίθενται ως εξής: 5’-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3’ (αντίστροφο), FAM-5 ‘ -TGCGCGAGTCGAAGT-3′-MGB-BHQ και VIC-5′-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3’-MGB-BHQ. Το μίγμα της αντίδρασης για κάθε AQAMA PCR αποτελούνταν από DNA μήτρα, 0,4 μmol /L του προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή, 1,4 μονάδες

iTaq

DNA πολυμεράση (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 μmol /L κάθε τριφωσφορικό δεοξυνουκλεοτίδιο και 0,025 pmol από κάθε ανιχνευτή MGB με 5 mmol /L Mg

2+. PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με την ενεργοποίηση προ-θερμικού κύκλου της DNA πολυμεράσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση και επέκταση στους 60 ° C για 60 sec. Ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη που ενισχύοντας έξι διπλότυπων υποπολλαπλάσιο πρότυπα με γνωστούς αριθμούς αντιγράφων (10

* 6 σε 10

* 1 αντίγραφα). Έχουμε περιγράψει προηγουμένως τις μεθόδους για τη σύνθεση του πρότυπου δείγματος του γνωστού αριθμού αντιγράφων στην δοκιμασία AQAMA [31]. Για αρνητικό έλεγχο, η αντίδραση δοκιμασίας περιείχε καθολικής μη μεθυλιωμένο DNA ελέγχου που συντέθηκε όπως περιγράφεται σε ένα προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη [13]. Για ένα θετικό μάρτυρα, χρησιμοποιήσαμε την καθολική μεθυλιωμένο DNA ελέγχου που εξάγεται από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος από έναν υγιή δότη και υποβάλλεται σε επεξεργασία με

SSSI μεθυλτρανσφεράση

. Εν συντομία,

SSSI μεθυλτρανσφεράση

αγωγή, διθειώδες τροποποιημένα, δότη ΡΒΙ ΟΝΑ ενισχύθηκε με PCR με τον εκκινητή που να δημιουργήσει το πρότυπο δείγμα για πλήρως μεθυλιωμένα LINE-1. Για την κατασκευή του τυποποιημένου δείγματος για μη μεθυλιωμένου LINE-1 χρησιμοποιήσαμε καθολικής μη μεθυλιωμένου DNA ελέγχου, που παρασκευάσθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Το πλήρως μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων προϊόν PCR συνδέθηκε σε pCR 2.1-ΤΟΡΟ φορέα κλωνοποίησης (Invitrogen)? οι κλώνοι μετατράπηκαν σε

Escherichia coli DH5

-α κύτταρα? και οι καλλιέργειες επεκτάθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Τα πλασμίδια που περιέχουν το γονίδιο στόχος καθαρίστηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά με φασματοφωτομετρία UV. Αυτό χρησιμοποιήθηκε για να κάνει σειρά αραίωσης γνωστού αριθμού αντιγράφων να κατασκευάσει πρότυπες καμπύλες για την απόλυτη ποσοτικοποίηση. Όλοι οι ποσοτικοί προσδιορισμοί PCR εκτελέστηκαν με τυφλό τρόπο, χωρίς γνώση της ταυτότητας του δείγματος. Μέσες τιμές υπολογίστηκαν από εις τριπλούν αντιδράσεις. LINE-1 δείκτη υπομεθυλίωσης (LHI) κάθε δείγματος υπολογίστηκε ως εξής: LINE-1 LHI = μη μεθυλιωμένα αριθμού αντιγράφων /(αριθμός μεθυλιωμένο αντίγραφο + μη μεθυλιωμένα αριθμός αντιτύπου)

LCM

LCM ήταν. χρησιμοποιούνται για τη συλλογή δειγμάτων DNA για όλα τα πειράματα στη μελέτη μας. Οι Αρχές και τεχνική βάση της LCM περιγράφονται λεπτομερώς από Fend F et al. [34]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με σύστημα LCM που φιλοξενεί ένα ψηφιακό σύστημα κάμερας που ανιχνεύει τα επιλεγμένα κελιά. Αυτό επιτρέπει ότι το ίδιο ποσό των τετραγωνικών μικρομέτρων των κυττάρων μπορεί να ενταχθεί για κάθε δείγμα.

In-situ

SBM βελτιστοποίηση δοκιμασία

Για τη μέτρηση του δείκτη υπομεθυλίωση LINE-1 μετά μικροδιατομής χρήση LCM, αναπτύξαμε το

in-situ διαδικασία

SBM με βάση προηγουμένως εισαχθεί σε slide τεχνική SBM.

In-situ

SBM σχεδιάστηκε για να αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης των γονιδίων σε μικρή ποσότητα DNA που λαμβάνεται από φορμαλίνη τύρφη.

In-situ

SBM αποσκοπεί στην εξάλειψη της απομόνωσης DNA και καθαρισμό βήματα που εκτελούνται πριν από την πραγματική SBM στην κλασική διαδικασία που είναι η κύρια αιτία της απώλειας DNA.

In-situ

SBM περιέχει τρία βήματα? μετουσίωση του DNA, SBM και τη συλλογή τροποποιημένου DNA. Πρώτον, τα κύτταρα μικροδιατομή από αποπαραφινωθείσες και επανυδατώθηκαν τομές ιστού που κολλούν στο καπάκι που χρησιμοποιείται στην LCM επωάζονται σε 0,2 mol /L Ν & ΟΗ σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα στο καπάκι επωάστηκαν σε διάλυμα όξινου θειώδους νατρίου 3 mol /L με 0,5 mmol /L υδροκινόνη (ρΗ 5) στο σκοτάδι. Τρεις ρύθμιση επώαση ελέγχθηκαν σχετικά με τις τιμές μετατροπής (το ποσοστό της τροποποίησης της κυτοσίνης σε ουρακίλη) και οι αποδόσεις του τροποποιημένου DNA και η ρύθμιση της επώασης των 60 ° C για 8 ώρες επιλέχθηκε ως βέλτιστη (βλέπε Αποτελέσματα τμήμα). Μετά την επώαση, τα δείγματα στο καπάκι ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό, εμποτισμένο με 0,3 mol /L Ν & ΟΗ για 15 λεπτά για να desulfonate τα τροποποιημένα κυτοσίνες, και στη συνέχεια, αφαλατώθηκαν σε αποσταγμένο νερό στους 60 ° C για 2 ώρες. Τέλος, 50 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 4 μα πρωτεϊνάση Κ, 2.5% Tween 20, 50 mmol /L Tris, και 1 mmol /L EDTA προστέθηκαν στο καπάκι και επωάστηκε στους 50 ° C για 24 ώρες ακολουθούμενη από θερμική απενεργοποίηση της πρωτεϊνάσης Κ στους 95 ° C για 10 λεπτά. Σε κάθε επόμενη αντίδραση AQAMA, 1-2 μι λύμα χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο χωρίς καθαρισμό DNA.

Δήλωση Ηθικής

δείγματα ΤΥΡΦΗ της CRC ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε κολεκτομή ή πρωκτεκτομή μεταξύ του 1995 και 1998 στο Κέντρο Υγείας /John Wayne Ινστιτούτου για τον Καρκίνο του Αγίου Ιωάννη, Santa Monica, CA. Η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο του Αγίου Ιωάννη Κέντρο Υγείας /John Wayne Cancer Institute ‘Institutional Review (IRB) και της Δυτικής IRB. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς.

δείγματα ΤΥΡΦΗ CRC

Όλα τα δείγματα ιστού είχε καθοριστεί σε 10% ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης για 24 ώρες και ενσωματωμένες σε παραφίνη. Για LCM ακολουθούμενο από

in-situ

SBM και LINE-1 ανάλυση μεθυλίωσης από AQAMA, τομές (4 μm) κόπηκαν με μικροτόμο από κάθε μπλοκ τύρφης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με το αυτοματοποιημένο σύστημα LCM Veritas® (Life Technologies). Ένα από τα πλεονεκτήματα αυτού του συστήματος είναι ότι επιτρέπει τον έλεγχο της πλατείας μικρόμετρα των κυττάρων που επιβιβάζονται για κάθε δείγμα. Για την αξιολόγηση των διαφορών του LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης μεταξύ της κανονικής βλεννογόνου, αδένωμα, του καρκίνου και του καρκίνου μεσεγχυματικών συνδετικού ιστού, 25 δείγματα πρώιμης CRC σε αδένωμα (TisN0M0) επιλέχθηκαν από έναν παθολόγο (RRT) εξειδικεύεται στην CRC που περιείχαν τα τέσσερα από αυτά κατηγορίες ιστού. Για τη μελέτη κακοήθη αλλοίωση, 94 χειρουργικά δείγματα CRC είχαν αγοραστεί για να διερευνηθεί η μεταβολή του LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης σύμφωνα με την εξέλιξη του καρκίνου. LCM εκτελέστηκε σε αμφότερες τις ομάδες μελέτης. Η συσχέτιση μεταξύ των κλινικο-παθολογικές στάδιο όπως το στάδιο Τ, κομβικό κατάσταση και το στάδιο Dukes και το δείκτη μεθυλίωση LINE-1 αναλύθηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SD, και ποσοστά ανάλογα με την περίπτωση.