Αφηρημένο

κινητικότητα των κυττάρων του καρκίνου είναι ένα βασικό φαινόμενο που ρυθμίζουν την εισβολή και τη μετάσταση. Κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση και μετάσταση διαφόρων καρκίνων. Η σχέση μεταξύ διαιτητική συμπλήρωση του καρκίνου του παχέος εντέρου και του ασβεστίου έχει ερευνηθεί εκτενώς. Ωστόσο, η επίδραση του ασβεστίου (Ca

2+) συμπληρώματα για καλπάίνης-ΡΑΚ-κινητικότητα δεν είναι απολύτως κατανοητή. Επιδιώξαμε να εντοπίσει τον μηχανισμό διάσπασης της FAK με Ca

2+ δεσμεύεται γαλακτικό (Cala), κατάντη σηματοδότησης και το ρόλο του στην κινητικότητα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι η θεραπεία HCT116 και ΗΤ-29 κυττάρων με Κάλα αυξηθεί αμέσως τις ενδοκυτταρικές Ca

2 + (ICA

2+) επίπεδα για μια παρατεταμένη χρονική περίοδο. Ca

2+ επαγόμενη εισροή διάσπαση του ΡΑΚ σε ένα Ν-τερματικό FAK (FERM τομέα) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η φωσφορυλιωμένη FAK (ρ-FAK) επίσης διασπάται στο p-Ν-τερματικό FAK της. Cala αυξημένη καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα κινητικότητα. Καλπεπτίνη, ένας αναστολέας καλπαΐνης, ανέστρεψε τα αποτελέσματα του Cala επί FAK και διάσπαση pFAK σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Το διασπασμένο FAK μετατοπίζεται στον πυρήνα και ρυθμίζει σταθερότητα p53 μέσω MDM2 που σχετίζεται ουβικουϊτινίωση. Cala προκαλείται από Ca

εισροή 2+ αύξησε την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου που προκαλείται από δραστικότητα καλπάίνης μέσω της FAK και pFAK πρωτεΐνη αποσταθεροποίηση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η προσεκτική εξέταση μπορεί να δοθεί στην απόφαση διατροφικές Ca

2 + συμπληρώματα σε ασθενή που υποβάλλεται σε θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο

Παράθεση:. Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et al. (2015) Διαμόρφωση του ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου από γαλακτικό ασβέστιο Επηρεάζει του παχέος εντέρου Κινητικότητα Cancer Cell μέσω ασβεστίου-Εξαρτημένων καλπαΐνη. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10.1371 /journal.pone.0116984

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 31 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 17 Δεκεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 28η Ιανουαρίου 2015

Copyright: © 2015 Sundaramoorthy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Gachon Ινστιτούτο Φαρμακευτικής Επιστημών Ταμείου Έρευνας το 2013, το Πανεπιστήμιο Gachon, Δημοκρατία της Κορέας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας πάνω από 600.000 θανάτους κάθε χρόνο με αυξανόμενη συχνότητα. Καρκινογόνες επαγωγή στο παχύ έντερο παρουσιάζεται μέσα από μια αλληλουχία γεγονότων που οδηγεί σε μετάσταση συμμετοχή διαφόρων ογκογόνων πρωτεϊνών. Κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και είναι ένα σημαντικό ογκογόνο πρωτεΐνη που εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την κινητικότητα [1,2]. Η καλπαΐνη είναι μια καλά συντηρημένη πρωτεάση κυστεΐνης που ενεργοποιούνται από αυξημένο ενδοκυτταρικό Ca

2+ (ICA

2+). Είναι εντοπίζεται σε εστιακό πρόσφυση, και ενδεχομένως προκαλεί διάσπαση της εστιακής πρωτεϊνών προσκόλλησης. Συγκριτικά, μεταστατικούς όγκους περιέχουν υψηλότερα επίπεδα καλπαΐνης από μη-μεταστατικών όγκων. Η καλπαΐνη μεσολάβηση FAK αποικοδόμησης είναι κρίσιμη για την κινητικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [3]. Φαίνεται ότι η λειτουργία της καλπαΐνης σε κυτταρική προσκόλληση και κινητικότητα περιορίζει την ικανότητά τους να διασπούν τα συστατικά του εστιακού συγκροτήματα, τα οποία με τη σειρά της μπορεί να αυξήσει τον κύκλο εργασιών συγκόλλησης και λειτουργικά σημαντικό εξέλιξης του όγκου [4,5].

του ICA

2+ ιόντων είναι ένα σημαντικό μόριο σηματοδότησης που ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες στη φυσιολογία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου κυτταρική κινητικότητα. Του ICA

2+ διατηρείται σε χαμηλή συγκέντρωση (~ 100 ηΜ) σε σύγκριση με το εξωκυτταρικό ελεύθερο Ca

2+ (1,2 mM) [6,7]. Τα χαμηλά επίπεδα της κυτταροπλασματικής Ca

2+ διατηρείται μέσω της ενεργού εκροή από κύτταρα μέσω της μεμβράνης πλάσματος Ca

2 + ATPase αντλίας, ενώ sarcoendoplasmic δικτυωτό Ca

2 + ΑΤΡ αφαιρεί Ca

2+ με ανταλλαγή πρωτονίων . Άλλες Ca

2 + διαπερατά κανάλια, όπως είναι αποθηκευμένα κανάλια ασβεστίου που λειτουργούν, το δυναμικό (ΤΚΡ) κανάλια παροδική υποδοχέα και του ενεργοποιημένου απελευθέρωση ασβεστίου κανάλι (CRAC) πρωτεΐνη 1 εμπλέκονται επίσης στην iCa

2 + ομοιόσταση. Αναδιαμόρφωση ή απορρύθμιση των iCa

2 + ομοιόσταση των καρκινικών κυττάρων προκαλεί αλλαγές στην εξέλιξη του καρκίνου [8]. Διαιτητικά συμπληρώματα του Ca

2+ ήταν γνωστό ότι μειώνουν τον κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος και καρκίνου του [9]. Ωστόσο, ο αντίκτυπος του Ca

2 + διαιτητικά συμπληρώματα παραμένει άγνωστη για τη μετάσταση του καρκίνου.

Τα φυσιολογικά κύτταρα έχουν μια χαμηλή συγκέντρωση του εξωκυττάριου γαλακτικού κυμαίνονται μεταξύ 0,5 και 2 mM, αλλά η συγκέντρωση για τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι τόσο υψηλή όσο 30-40 mM [10]. επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου απαιτεί ένα αλκαλικό ενδοκυτταρικό περιβάλλον και όξινο εξωκυττάριο περιβάλλον [11,12]. Μονοκαρβοξυλικό μεταφορείς (MCTs) ελέγχουν κυρίως την κίνηση των ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών γαλακτικό οξύ [13]. Αυξημένα επίπεδα MCT1 έχουν ανιχνευθεί σε καρκίνους μαστού, κόλου, στομάχου, του τραχήλου της μήτρας και καρκίνους. έκφραση MCT4 είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε καρκίνωμα νεφρικών, του τραχήλου της μήτρας και του προστάτη [14]. MCT4 απελευθερώνει το γαλακτικό ως απάντηση στην υποξία, ενώ το γαλακτικό πρόσληψη σε οξυγονωμένο καρκινικά κύτταρα συμβαίνει μέσω MCT1 [15,16]. Γαλακτική δρα ως υπόστρωμα για οξειδωτικό μεταβολισμό σε οξυγονωμένο καρκινικά κύτταρα.

Με βάση την πληροφορία σχετικά με Ca

2+ διαιτητικό συμπλήρωμα σε μεταστατικό καρκίνο, διερευνήσαμε την κινητικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων με άμεση έκθεση των Ca

2+ δεσμεύεται γαλακτικό (Cala). Εμείς επικεντρώθηκε στην οδό καλπαΐνη-ΡΑΚ-κυττάρων για την κατανόηση υποκείμενη μοριακούς μηχανισμούς ανθρώπινου κόλου κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

Όλες οι κυτταρικές σειρές ήταν αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassa, Va). Ανθρώπινου κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές HCT116, ΗΤ-29, και DLD1were καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640. Κανονική κόλου κυτταρική γραμμή CCD-18Co καλλιεργήθηκε σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C που περιέχει 5% CO

2.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Cala, αναστολέας της FAK (TAE226), αναστολέα καλπάίνης (Καλπεπτίνη), γρίπη-τρεις αγοράστηκε από Sigma (St. Louis, Μο). Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση κηλίδος western (ΡΑΚ, pFAK, καλπαΐνη-2, ρ53, MDM2, pMDM2, α-τουμπουλίνης, Lamin B, GADPH) και τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (USA).

Θερμοδυναμική ιόντος δισθενούς μετάλλου δέσμευσης σε γαλακτικό οξύ

για τη μέτρηση των ισόθερμων σύνδεσης για αλληλεπίδραση του δισθενούς μεταλλικού ιόντος Ca

2+ σε γαλακτικό οξύ, θερμιδομετρία ισοθερμικής τιτλοδότησης πειράματα (ITC) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός Microcal 200 ισοθερμικό τιτλοποίηση μικροκαλορίμετρο (Microcal, Inc., Northampton, ΜΑ). Η συλλογή δεδομένων, την ανάλυση και αποτύπωση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Windows-based Προέλευση πακέτο λογισμικού (έκδοση 7.0? παρέχονται από Microcal). Η μικροκαλορίμετρο τιτλοδότηση περιείχε δείγματος και αναφοράς κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μια αδιαβατική περίβλημα. Το κύτταρο αναφοράς ήταν γεμάτη με αποσταγμένο νερό. Τυπικά τιτλοδοτήσεις εμπλέκονται έγχυση 1.5 μί 5 mM Ca του

2+ ιόντων (χρησιμοποιώντας ένα ελεγχόμενο από υπολογιστή έγχυσης) εντός του κυττάρου δείγματος (γεμάτο με 0,5 mM του γαλακτικού οξέος σε ρΗ 7,0). Τα δείγματα εγχύθηκαν σε διαστήματα 2 λεπτών για να εξασφαλιστεί ότι οι καμπύλες τιτλοδότησης επανήλθαν στη γραμμή βάσης πριν από την επόμενη ένεση. Ο ρυθμός ανάδευσης σύριγγα ορίστηκε σε 1.000 rpm. Η απορρόφηση ή απελευθέρωση της θερμότητας κατά τη διάρκεια κάθε ένεση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το θερμιδόμετρο. ισόθερμες τιτλοδότηση για τις δεσμευτικές αλληλεπιδράσεις αποτελείται η διαφορική θερμική ροή για τις διάφορες ενέσεις. Αυτές οι τιμές στη συνέχεια ενοποιούνται ώστε να προσδιοριστεί η μεταβολή ενθαλπίας που σχετίζεται με κάθε ένεση. αλλαγές θερμότητα που προκαλείται από την ένεση του κάθε μεταλλικού ιόντος σε αποσταγμένο νερό ήταν αμελητέες. Τα δεδομένα αραίωσης αφαιρούνται από τα δεδομένα του δείγματος και κακά σημεία δεδομένων αφαιρέθηκαν. Το εξάρτημα δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Origin (έκδοση 7.0) και η διαδικασία προσαρμογής τιτλοδοτήθηκε μέχρι να ληφθεί το καλύτερο κατάλληλο προσδιορίζεται με τη μέθοδο ελαχιστοποίησης chi-square. Τοποθέτηση των ισόθερμων σύνδεσης με αυτό τον τρόπο παρέχονται δεδομένα που σταθερά δέσμευσης (Ka), η αλλαγή στην ενθαλπία (ΔΗ) και στοιχειομετρία δέσμευσης (n). Η δέσμευση ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔΟ) υπολογίστηκε από την αλλαγή ενθαλπίας (ΔΗ) και σταθερά δέσμευσης (Ka) χρησιμοποιώντας την εξίσωση: ΔΟ = RTlnKa = ΔHTΔS, όπου R είναι η σταθερά των αερίων και Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία σε βαθμούς Kelvin [17]. Εν τω μεταξύ, η στοιχειομετρία του (n) των διαφόρων αλληλεπιδράσεων προσδιορίστηκαν από το ένα σύνολο τοποθεσίες μοντέλα.

Μέτρηση iCa

2+ συγκέντρωση

κυτοσολίου χωρίς Ca

2+ συγκεντρώσεις ιόντων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (Leica, Heidelberg, Germany). Καλλιεργημένα HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα φορτώθηκαν με 10 μΜ Fluo-3 /ΑΜ και 1 μΐ 25% Pluronic F-127 (διαλυμένο σε DMSO) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Μετά τη φόρτωση ανιχνευτές φθορισμού, 2.5 mM του Cala προστέθηκε και η εικόνα αποκτήθηκε. Fluo-3 /ΑΜ ήταν ενθουσιασμένος στα 488 nm και εκπεμπόμενος φθορισμός μετρήθηκε στα 515 nm. Ενδοκυττάριο Ca

2+ επίπεδα εκφράζονται ως F αναλογίες /F0, όπου F0 είναι η αρχική ένταση φθορισμού (ανάλυση λογισμικού J Image).

πληγή επούλωση δοκιμασία

Για πληγή δοκιμασία επούλωσης, χρησιμοποιήθηκε ibidi ενθέτου καλλιέργειας που αποτελείται από δύο δεξαμενές χωρίζονται από ένα παχύ τοίχωμα 500 μm. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δύο θαλάμων (100 μΐ 4 × 10

5 κύτταρα /ml) ibidi ένθετης καλλιέργειας. Μετά από 24 ώρες επώαση, ο θάλαμος απομακρύνθηκε ήπια δημιουργώντας ένα διάκενο ~ 500 μm. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στο απογυμνωμένο περιοχές για 6 ώρες. Η απεικόνιση ζωντανών κυττάρων έγινε με τη χρήση του Juli Br, αναλυτή ζωντανό κύτταρο (NanoEnTek Inc, Νότια Κορέα).

ανάλυση Western blot

Κινητά λύματα προετοιμάστηκαν και μια ίση ποσότητα πρωτεΐνης που χωρίζονται από SDS PAGE και στυπώθηκαν επί φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,19,20]. Ειδικά πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από ΗΚΡ-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας σύστημα ECL (AbClon) για την ανίχνευση του σήματος.

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με Κάλα για 12 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 100% ψυχρή αιθανόλη για 20-30 λεπτά στους-20 ° C, κατέστησαν διαπερατά με 0,3% Triton Χ100 σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκε σειριακά σε PBS. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν με 3% ορό αλόγου σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα FAK (1: 800) με 3% ορό αλόγου σε PBS στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexa-488 αντίσωμα συζευγμένο δευτερεύον για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια σφραγίζεται με μέσα στερέωσης που περιείχε ϋΑΡΙ (Vectashield, Vector Laboratories). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακό λέιζερ σάρωσης μικροσκοπία (CLSM, Nikon Α1 +, Ιαπωνία)

Στατιστικές αναλύσεις

.

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση t-test και Φοιτητών

P

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Το γαλακτικό οξύ συνδέεται με ιόντα ασβεστίου με υψηλή συγγένεια

Αναλύσαμε τις θερμοδυναμικές ιδιότητες του Cala και δεσμευτικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ Ca

2+ και γαλακτικό οξύ με ισοθερμική θερμιδομετρία τιτλοδότησης (ITC). Αντιπροσωπευτικά δεδομένα ITC σχετικά με την σύνδεση του γαλακτικού οξέος προς Ca

2+ σε ρΗ 7,0 παρουσιάζεται στο Σχ. 1. Περαιτέρω λεπτομέρειες συμπεριλαμβανομένων των υπολογιζόμενων σταθερών σύνδεσης και ενθαλπίας και εντροπίας των ενώσεων που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το γαλακτικό οξύ συνδέεται με Ca

2 + με Κ

δ 6,2 × 10

-5 Μ, ένα θερμοδυναμικά κατάλληλη κατάσταση για να σχηματίσει Cala άλατος. θερμοδυναμικοί υπολογισμοί μας έδειξαν ότι ένα μόριο γαλακτικού συνδέεται με 0.361 Ca

2+ ιόντων, παρότι δύο-γαλακτικού μόριο συνδέεται προς ένα Ca

2+ ιόντων στη θεωρία. Τα δεδομένα ITC καταδεικνύει την πιθανότητα ότι εξωκυτταρική γαλακτικό οξύ με τη μορφή του γαλακτικού μπορεί να σχηματίσει CALA άλας, το οποίο μπορεί να υπάρχει ως διαλυτή μορφή κάτω από το όριο συγκέντρωσης υδατική διαλυτότητα (7,9 g /100 ml). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν επίσης ότι Κάλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη χορήγηση ενδοκυτταρικό ασβέστιο, το οποίο μπορεί διίστανται υπό μεταβλητή περιβάλλον.

Τρεις αντιπροσωπευτικές ισοθέρμων φαίνεται απεικονίζει πρόσδεσης ως συνάρτηση του ρΗ σε 37 ° C. Άνω και κάτω πάνελ δείχνουν τα αποτελέσματα της θερμιδομετρικής τιτλοδότησης του 1,5 μΙ 5 mM Ca

2+ και 0,5 mM μείγμα γαλακτικού οξέος σε 5 mM Tris-HCI σε ρΗ 7,0. Για κάθε τιτλοδότηση, τα ανεπεξέργαστα δεδομένα εμφανίζονται στο επάνω πάνελ και ενσωματώνονται τα δεδομένα θερμότητας εμφανίζεται στο κάτω πάνελ.

Η

διοίκησης Cala αυξημένη iCa

2+ επίπεδα

Έχουμε αξιολόγησε την επίδραση της χορήγησης Cala για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και αναλύθηκαν τα επίπεδα των διαχωριστεί iCa

2+. HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 2.5 mM Cala η οποία έδειξε μια αξιοσημείωτη διαφορά σε 0 και 600 δευτερόλεπτα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η πειραματική επιβεβαίωση έγινε με τη χρήση ιονομυκίνης, ιονοφόρο χρησιμοποιείται για να αυξήσει iCa

2+ επίπεδα. Ιονομυκίνη (10 μΜ) αυξήθηκε δραματικά iCa

2 + στα πρώτα λίγα δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από μία βαθμιαία μειώθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2). Αν και ιονομυκίνης έθεσε iCa

2+ επίπεδα, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ιονομυκίνη δεν είναι σταθερό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, σε κύτταρα HCT116, Cala αυξηθεί σταδιακά iCa

2+ στο μέγιστο επίπεδό της σε 480 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν (Εικ. 2Α). ΗΤ-29 κύτταρα έφθασαν στο μέγιστο iCa

2+ συγκέντρωση μεταξύ 50 και 100 δευτερολέπτων, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν (Εικ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Cala αυξημένη iCa

2+ επίπεδα και διατηρούνται αυτά τα επίπεδα για μια παρατεταμένη χρονική περίοδο.

Καλλιεργημένα HCT116 (Α) και 29 HT-κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φθορισμό Fluo-τρεις ανιχνευτές όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 2.5 mM Cala και 10 μΜ Ιονομυκίνη σε DMSO (έλεγχος). Εικόνα αποκτήθηκε σε ένα χρονικό σημείο 0 δευτερόλεπτα, όπως την αρχική και 600 δευτερόλεπτα, όπως μέγιστη χρήση συνεστιακής λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (Leica, Heidelberg, Germany). Το Ca

2+ εικόνα φθορισμού μετατράπηκε σε ένταση φθορισμού και απεικονίζονται ως αναφέρεται F /F0 (λογισμικό ανάλυσης J Image). F0 είναι η αρχική ένταση φθορισμού.

Η

Cala διαμορφωμένου σταθερότητα FAK

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υπερέκφραση της FAK ογκογονίδιο συνδέεται με την καρκινογένεση διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [21,22]. Η iCa

2 + ενεργοποιεί την καλπαΐνη, η οποία υποβαθμίζει FAK και ενισχύει την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων [3,4,5,9]. Αφού παρατηρηθεί ότι αυξάνει Cala iCa

2+ επίπεδα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, διερευνήσαμε την επίδραση της στη σταθερότητα Cala FAK στα κύτταρα αυτά. Εξετάσαμε την έκφραση της FAK και pFAK σε φυσιολογικό κόλον (CCD-18Co) και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (Σχ. 3Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα CCD-18Co έχουν ονομαστική έκφραση του FAK και έτσι χαμηλότερα επίπεδα pFAK σε σύγκριση με καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του FAK και pFAK. Κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου έδειξε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της FAK και pFAK. κύτταρα CCD-18Co έδειξε κανονικό επίπεδο pFAK. ΗΤ-29 και DLD-1 κύτταρα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα pFAK σε σύγκριση με HCT116. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στις γραμμές HCT116 και ΗΤ-29 κυττάρων για περαιτέρω μελέτες σχετικά με την σταθερότητα της πρωτεΐνης FAK. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση εξαρτάται από τη δόση για τις επιπτώσεις της Cala επί HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα (Σχ. 3Β). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του Cala για 12 ώρες και αξιολογήθηκε η διάσπαση FAK. Το πλήρες μήκος του FAK και pFAK είναι μια 125 kDa. Cala διασπάται ΡΑΚ σε ένα 90 kDa πρωτεΐνη Ν-FAK (τομέας FERM) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις που έχουν την υψηλότερη δραστικότητα σε 2,5 mM. Ομοίως, pFAK διασπάστηκε σε προς Ρ-Ν-ΡΑΚ της σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με βέλτιστη δραστικότητα σε 2,5 mM του Cala (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Cala αποσταθεροποιεί FAK και pFAK και προκαλεί διάσπαση και των δύο πρωτεϊνών σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α) εκφράσεις FAK αναλύθηκαν στο φυσιολογικό κόλον επιθηλιακή κυτταρική σειρά CCD-18Co και διαφορετικές καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ( HCT116, ΗΤ-29 και DLD1). HCT116 και ΗΤ-29 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cala για 12 ώρες. Western αποτύπωση πραγματοποιήθηκε από λύματα κυττάρων έδειξαν ότι Cala προκαλείται από FAK και pFAK διάσπαση σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Η

ΡΑΚ αποσταθεροποίησης μέσω της δραστηριότητας CAPLAIN από Cala

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η FAK και της φωσφορυλιωμένη μορφή είναι σημαντικά για την εστιακή του κύκλου εργασιών συγκόλλησης. ΡΑΚ διασπάται από καλπαΐνης, ένα Ca

2+ εξαρτώμενη πρωτεάση, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εστιακή δυναμική προσκόλληση σε κινητικά κύτταρα [4]. Η καλπαΐνη εμπλέκεται σε διάφορες βασικές πτυχές της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, και η μετάσταση [23]. Από Cala αυξημένο Ca εισροή

2+ και διασπάστηκε ΡΑΚ, έτσι ώστε να προσδιορίζονται τα αποτελέσματα της Cala στην καλπάίνης στα HCT116 και τα κύτταρα ΗΤ-29 (Εικ. 4). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Κάλα προκάλεσε εξαρτώμενη από το χρόνο διάσπασης των πρωτεϊνών FAK και pFAK αλλά δεν υπήρξε καμία επίδραση στα επίπεδα επί καλπαΐνη-2 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε καλπεπτίνη, έναν ενεργοποιητή κινάσης Rho και έναν αναστολέα της καλπαΐνης η οποία είναι μέρος μιας οικογένειας πρωτεασών κυστεΐνης ασβέστιο-εξαρτώμενη. Καλπεπτίνη (20 μΜ) ανέστρεψε τα αποτελέσματα του Cala επί FAK και διάσπαση pFAK στις δύο κυτταρικές σειρές χωρίς επιδράσεις στα επίπεδα της πρωτεΐνης καλπαΐνης-2 (Εικ. 4). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Cala αυξημένο Ca

2 + εισροή και τη δραστηριότητα της καλπαΐνης, αλλά δεν τα επίπεδα της πρωτεΐνης του. Είναι γνωστό ότι διασπάται FAK μεσολαβεί αποικοδόμηση της ρ53 μέσω πυρηνική μετατόπιση του Ν-FAK. Κύτταρα κατεργασμένα με Cala έδειξαν μειωμένα επίπεδα p53, η οποία αναστρέφεται από καλπεπτίνη. Καλπεπτίνη ανέστειλε την καλπαΐνη-2, εμποδίζοντάς την διάσπαση ΡΑΚ, εξασθένηση υποβάθμιση p53. Αυτά τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι Κάλα-επαγόμενη διάσπαση FAK αυξημένη αποικοδόμηση της ρ53 και της δραστηριότητας καλπαΐνης-2 αλλά χωρίς συνέπειες για τα επίπεδα της πρωτεΐνης καλπαΐνης.

HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 2.5 mM Cala σε συνδυασμό με τον αναστολέα καλπαΐνης ( calpetin 20 μΜ) σε προκαθορισμένο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. δεδομένα κηλίδος Western αποδεικνύουν ότι αναστολέα καλπαΐνης, καλπεπτίνη, μείωσε την διάσπαση FAK και pFAK καθώς και αποικοδόμηση ρ53.

Η

διασπασμένου FAK μετατοπίζεται στον πυρήνα

Μελέτες έδειξαν ότι η μετατόπιση των πυρηνικών FAK προωθούνται κυτταρική επιβίωση μέσω της ενισχυμένης υποβάθμιση ρ53 υπό συνθήκες κυτταρικού στρες [24,25]. Cala επαγόμενη διάσπαση του ΡΑΚ σε μια πρωτεΐνη 90-kDa, η οποία μετατοπίζεται εντός του πυρήνα. Σύκο. 5 παριστά την ανάλυση κηλίδος western από ολόκληρα, κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με Cala, και ανοσοκυτταροχημεία τους. Το όλο προϊόν λύσης κυττάρου και κυτταροπλασματικό κλάσμα δύο κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με Cala έδειξε FAK και διασπάστηκε FAK. Πυρηνική κλάσματα των μη επεξεργασμένων κυττάρων είχαν χαμηλά επίπεδα FAK αλλά η θεραπεία με Cala αυξημένη FAK και διασπάται επίπεδα FAK στα πυρηνικά κλάσματα (Σχ. 5Α). Οι πυρηνικές μετατοπίσεις του Ν-FAK στα HCT116 και ΗΤ-29 (Εικ. 5 Β και Γ) έγιναν ορατές μετά από επώαση με αντι-ΡΑΚ πρωτογενές αντίσωμα που ακολουθείται από χρώση με Alexa-488 αντίσωμα συζευγμένο δευτερεύον. Το ομοεστιακό μικροσκόπιο των κυττάρων ελέγχου έδειξαν DAPI χρώση των πυρήνων χωρίς Alexa-488-βάφονται FAK. Ωστόσο, συνεστιακή απεικόνιση του Κάλα-κατεργασμένων κυττάρων έδειξαν μετατόπιση της Alexa-488 βάφονται Ν-ΡΑΚ σε DAPI χρώση των πυρήνων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι 2,5 mM Cala διασπαστεί σε όλο το μήκος της FAK που μετατοπίζεται στον πυρήνα.

Η μετατόπιση του Ν-FAK αναλύθηκε με western blot (Α) και ανοσοκυτοχημεία (Β-Γ). HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα ήταν σπόρο σε ένα θάλαμο 8 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2.5 mM Κάλα για 12 ώρες. Μετατόπιση αναλύθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία. ΕΜΕΙΣ, εξαγωγή ολόκληρο το κύτταρο? CE, κυτταροπλασματική εξαγωγή? NE, πυρηνική εξαγωγή? μετατοπίζεται Ν-ΡΑΚ υποδεικνύεται με ένα βέλος. Ράβδος κλίμακας:. 2,5 μΜ

Η

Cala αύξησε την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Δεδομένου ότι FAK είναι γνωστό ότι παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση στα καρκινικά κύτταρα [ ,,,0],1,2], μελετήσαμε τα αποτελέσματα της Cala στις ακόλουθες κυτταρικές ιδιότητες στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμό επούλωσης τραύματος σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με Cala μόνη ή σε συνδυασμό με καλπεπτίνη (Εικ. 6). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Κάλα (2,5 mM) αύξησε την κινητικότητα των κυττάρων HCT116. Καλπεπτίνη μόνη της δεν φάνηκε να αλλάξετε την κινητικότητα. Είναι ενδιαφέρον, αποδείχθηκε ότι η εφαρμογή του καλπεπτίνη (20 μΜ) σε συνδυασμό με μειωμένη Cala η επίδραση της Cala και ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου (Εικ. 6 Α-Β). Περαιτέρω, παρατηρήσαμε ότι TAE226 (αναστολέας ΡΑΚ) μείωσε σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ca

2 + εισροή διαμεσολαβεί υποβάθμιση ΡΑΚ μέσω της δραστηριότητάς της καλπαΐνης. TAE226 έδειξε επιδράσεις κατά του όγκου στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Είναι μείωσε το μέγεθος των όγκων και διαδίδονται παρατεταμένη επιβίωση σε ποντικούς που φέρουν όγκο [26]. Για να επιβεβαιώσετε τις παρατηρήσεις μας, πραγματοποιήσαμε μια συγκριτική ανάλυση των επιπέδων FAK και pFAK σε HCT116 και ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας TAE226 (Εικ. 6C). TAE226 (2,5 μΜ) ανέστειλε την έκφραση pFAK σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο δεν ανέστειλε συνολικό FAK. Cala προκαλείται από FAK και της διάσπασης pFAK αυξημένη κινητικότητα σε σύγκριση με TAE226, η οποία καταστέλλεται δραστηριότητα pFAK και μειωμένη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων.

τραύματος δοκιμασία επούλωσης πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HCT116. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Cala, και ιδιότητα επούλωσης τραυμάτων αναλύθηκε από 0 έως 6 ώρες μετά την πληγή (Α), και μέσες τιμές περιοχής τραύματος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας γράφημα με πολλές γραμμές (Β). HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 2.5 mM της Cala στο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο προκαλούμενη FAK και η διάσπαση pFAK (C). αναστολέας pFAK (TAE226 2,5 μΜ) μείωσε τα επίπεδα pFAK όπως ανιχνεύεται με κηλίδα western.

Η

Διασπασμένη-ΡΑΚ μεσολάβηση της υποβάθμισης p53 μέσω MDM2-εξαρτώμενη ουμπικουιτίνωση

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η δομή του FERM -FAK μπορεί να μετατοπίσει σε πυρήνα και ρυθμίζουν τη σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 μέσω MDM2 [25]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε το μηχανισμό της p53 κάτω ρύθμιση από Cala. Cala μόνη που προκαλείται διάσπαση των FAK και pFAK. Θεραπεία του MG132 με Cala ανακτηθεί παραδόξως τη διάσπαση FAK και pFAK (Εικ. 7). Η επεξεργασία των κυττάρων με Cala ανέστειλε ρ53 επίπεδα ενώ MG132 ανακτώνται τα επίπεδα της ρ53. Θεραπεία της MG132 σε συνδυασμό με Κάλα ανακτηθεί το αποτέλεσμα της Cala στην υποβάθμιση του p53 proteosomal. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι MDM2 και τα επίπεδα πρωτεΐνης PMDM2 δεν άλλαξαν από θεραπείες με Cala, MG132 ή και τα δύο. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι MG132 ανακτηθεί ρ53 από MDM2 Cala μέσω σχετιζόμενη ουβικουϊτινίωση.

HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 2.5 mM Cala σε συνδυασμό με έναν αναστολέα πρωτεασώματος (MG132 10 μΜ) για 10 ώρες. κηλίδα Western διεξήχθη από λύματα κυττάρων και πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι το ασβέστιο γαλακτικό επαγόμενη Ca

2+ εισροή αυξάνει την κινητικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μέσω αποσταθεροποίησης πρωτεϊνών FAK και pFAK. Η μελέτη αυτή αποδεικνύει την επίδραση της iCa

2+ επί της οδού κινητικότητα καλπαΐνη-FAK-κυττάρων. Cala μεσολάβηση διάσπαση FAK και pFAK ήταν διαιτησία μέσω δραστικότητα καλπαΐνης, η οποία αύξησε την κινητικότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Η διασπάται FAK μετατοπίζεται στον πυρήνα και αυξημένη αποικοδόμηση ρ53, καθώς και δραστηριότητα καλπαΐνη. Η επίδραση της εξωκυττάριας γαλακτικού αναφέρθηκε σε αρκετές μελέτες σχετικά με την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων. έχουν Μια σημαντική διαφορά μεταξύ της παρούσας μελέτης και προηγούμενες μελέτες σχετικά με γαλακτικό είναι η χημική οντότητα.

μονοκαρβοξυλικό μεταφορείς (MCTs) συνήθως μεσολαβούν γαλακτικό εισροή και εκροή και ότι τα αυξημένα επίπεδα του MCT1 έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [16]. Γαλακτικό απελευθέρωση σε υποξικά κύτταρα επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση MCT4, ενώ η πρόσληψη γαλακτικού σε οξυγονωμένο καρκινικά κύτταρα διαμεσολαβείται μέσω MCT1 [15,16]. Φαίνεται ότι η ίδια Cala αυτή μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα, ως εκ τούτου, αυξάνοντας iCa

2+ και γαλακτικό συγκεντρώσεις συμπτωματικά παρατηρούνται. Ωστόσο, ο συγκεκριμένος μηχανισμός μεταφοράς δεν έχει εντοπιστεί. Τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χαμηλή συγκέντρωση της Cala μεσολάβηση της FAK εξαρτώμενη κινητικότητας σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το γαλακτικό νάτριο χρησιμοποιείται σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 20 mM [10]. Αυτή η υψηλή φάσμα παρατηρήθηκε σε κακοήθεις και μεταστατικούς όγκους μεγάλων μεγεθών. Υψηλές συγκεντρώσεις γαλακτικού σε όγκους συσχετίστηκαν με υψηλή συχνότητα μακρινή μετάσταση και άλλες κακοήθεις συμπεριφορές των καρκινικών κυττάρων [27]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται χαμηλές συγκεντρώσεις γαλακτικού για την αποφυγή της μετάστασης του καρκίνου. Με κατεργασία των κυττάρων με χαμηλές συγκεντρώσεις της Cala, Ca

2+ εισροή αυξημένη και διατηρήθηκε για μία παρατεταμένη χρονική περίοδο, η οποία αυξήθηκε δραστικότητα καλπαΐνης. Η ενδοκυτταρική θειόλη πρωτεάση καλπαΐνη καταλύει την περιορισμένη πρωτεόλυση των διαφόρων δομικών πρωτεϊνών εστιακής προσκόλλησης και ένζυμα σηματοδότηση σε προσκολλημένα κύτταρα. Οι καλπαΐνες συμμετέχουν σε διάφορες βασικές πτυχές της μετανάστευσης, συμπεριλαμβανομένης της πρόσφυσης και της εξάπλωσης. Η φαρμακολογική αναστολή της καλπαΐνες μειωμένη διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη κυτταρική μετανάστευση [23]. Πρόσφατες μελέτες παρέχουν περαιτέρω στήριξη για την καλπαΐνη ως σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής κινητικότητας μέσω της ικανότητάς της να ρυθμίζει εστιακό δυναμική πρόσφυση. Η καλπαΐνη μεσολάβηση FAK αποικοδόμησης είναι κρίσιμη για την κινητικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [3]. Υψηλά επίπεδα έκφρασης FAK συσχετίζεται με αυξημένο διεισδυτικότητα σε κακοήθεις όγκους. Ωστόσο, οι μηχανισμοί ενεργοποίησης FAK, διάσπαση, και η απορρύθμιση της κινητικότητας, δεν είναι σαφείς. Σηματοδοσίας γεγονότα κατάντη της ενεργοποίησης FAK και της διάσπασης μπορεί να συμβάλλει στην κινητικότητα των κυττάρων ανθρώπινου καρκινώματος παχέως εντέρου.

Cala μπορούν να διαμορφώσουν τη μεταναστευτική δυναμικό των οξυγονούχων καρκινικά κύτταρα, τα οποία υπάρχουν γύρω από τα αιμοφόρα όγκου. Σε ιστό όγκου, η αγγείωση περιορίστηκε να παράσχει οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες, όπως η γλυκόζη και γλουταμίνη. Υποξική όγκοι εμφανίζονται να διαφοροποιούνται ελάχιστα αλλά υποξία διαδραματίζει έναν άμεσο ρόλο στη διατήρηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [29]. Υποξική όγκοι τείνουν να παράγουν μία διαβάθμιση γαλακτικό, το οποίο χρησιμοποιείται από οξυγονωμένο καρκινικά κύτταρα μέσω μεσολάβηση MCT1 μεταφορά, έτσι ώστε οι υποξικών καρκινικών κυττάρων μπορεί να αξιοποιήσει τη γλυκόζη. Αυτό το φαινόμενο είναι γνωστό ως μεσοκυττάρια λεωφορείο γαλακτικό. Κατά συνέπεια, θα μπορούσε να υποτεθεί ότι στο εξωκυτταρικό περιβάλλον που περιβάλλει υποξικών κυττάρων συσσωρεύεται σταδιακά γαλακτικό σε ελεύθερη μορφή. Ωστόσο, οξυγονωμένο κύτταρα που παρέχονται από το ασβέστιο μέσω της παροχής αίματος, γαλακτικό εισήχθη μέσω MCT1, μειώνοντας την εξωκυττάρια συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος και μικροπεριβάλλον του περιέχει λιγότερο γαλακτικό και κυρίως συνδεδεμένο με το ασβέστιο [31]. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι οξυγονωμένο κύτταρα είναι λιγότερο κινητικά σε σχέση με υποξικά κύτταρα και ότι η μετάσταση εμπλέκει υποξικά κύτταρα και όχι οξυγονωμένο κύτταρα. Η ύπαρξη και το ποσό της Cala σε ένα εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να είναι ένας καθοριστικός παράγοντας για την μετάσταση μέσω της διαφοροποίησης της FAK. Επιπλέον, μπορεί ενδεχομένως Cala ελέγχουν κυτταρική κινητικότητα και μεταβολισμό της ενέργειας. Η ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη προλαμβάνει την εξέλιξη του καρκίνου μέσω πολλών μηχανισμών συμπεριλαμβανομένων απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Υπάρχει σαφώς χαρακτηρισμένος σύνδεσμος μεταξύ του μεταβολισμού και της γενετικής ρύθμισης των p53, όπου p53 ρυθμίζει την ενεργειακή ισορροπία του κυττάρου μεταξύ γλυκόλυση και οξειδωτική φωσφορυλίωση [30,31]. Ομοίως, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Cala μπορεί να προκαλέσει proteosomal υποβάθμιση του p53 (Εικ. 4) μέσα από την πυρηνική μετατόπιση του FERM-FAK και MDM2 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση (Εικ. 7).

Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η επίδραση του συμπληρωματικού Ca

2+ για τους μοριακούς μηχανισμούς του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου. Η σημασία της Cala στη διαμόρφωση της φυσιολογίας των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου δεν περιορίζεται στις βασικές μελέτες, αλλά και να έχει αντίκτυπο στην κλινική διατροφική αποτέλεσμα. Ca

2 + παίζει διάφορους ρόλους στην εξέλιξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της απόπτωσης ή την αναστολή του πολλαπλασιασμού στο κόλον. Επιπλέον, Ca

2+ σύνδεση προς χολικά άλατα, αυξημένη σε υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά δίαιτες, έχουν συσχετιστεί με κολονική καρκινογένεση [28]. Κάλα-επαγόμενη διάσπαση FAK και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα των κυττάρων HCT116 δημιουργεί μια παραδοχή ότι οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου χρειάζονται περισσότερο προσεκτικοί όταν εξετάζουν Ca

2 + διαιτητικά συμπληρώματα. Επειδή το εξωκυτταρικό ασβέστιο μπορεί να ιονίζεται με γαλακτικό, οδηγεί σε Ca

εισροή 2+ προκαλώντας αυξημένη διάσπαση της FAK και καρκινικών κυττάρων κινητικότητα.

Συμπεράσματα

Η παρούσα μελέτη αποσαφηνίζει ότι Cala αυξημένη κινητικότητα των καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα με δραστηριότητα καλπάίνης μέσω destabilizations πρωτεϊνών FAK και pFAK. Η συγκέντρωση και η χημική οντότητα της Cala μπορεί να είναι παράγοντας που συμβάλλει για καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική κινητικότητα. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι επιδράσεις επί της κινητικότητας καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να σχετίζεται με τη χρήση του Ca

2+ διαιτητικά συμπληρώματα. Ακόμη και μια χαμηλή συγκέντρωση του Ca

2 + μπορεί να προκαλέσει αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων.