Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα συχνά απασχολούν αναπτυξιακές συνθήματα για την επωφελή ανάπτυξη και μετάσταση. Εδώ, αναφέρουμε ότι ένα μόριο καθοδήγησης άξονα, Sema3E, εκφράζεται έντονα σε υψηλής ποιότητας ανθρώπινο καρκίνωμα ωοθηκών ενδομητριοειδές, αλλά όχι χαμηλού βαθμού ή άλλα επιθηλιακά καρκινώματα των ωοθηκών, και διευκολύνει την εξέλιξη του όγκου. Σε αντίθεση με τις γνωστές αγγειογενετική δραστηριότητα, Sema3E ενήργησε μέσω των υποδοχέων Plexin-D1 για να αυξήσει κυττάρων μεταναστευτικών ικανότητα και την ταυτόχρονη επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT). Sema3E επαγόμενη EMT σε ωοθηκών ενδομητριοειδές καρκινικά κύτταρα ήταν εξαρτημένη από την πυρηνική εντόπιση του Snail1 μέσω της ενεργοποίησης φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάσης και ERK /ΜΑΡΚ. Μεσολάβηση RNAi knockdown του Sema3E, Plexin-D1 ή Snail1 σε Sema3E-κύτταρα που εκφράζουν όγκου κατέληξε σε μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων, η ταυτόχρονη αναστροφή της ΕΜΤ και μειωμένη πυρηνικό εντοπισμό του Snail1. Αντίθετα, η αναγκαστική συγκράτηση Snail1 εντός του πυρήνα του Sema3E-αρνητικών καρκινικών κυττάρων που επάγεται ΕΜΤ και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι εκτός από τις αγγειογόνες επιδράσεις του Sema3E επί αγγειακό ενδοθήλιο του όγκου, μια στρατηγική ΕΜΤ θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν από Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου για να προάγουν την κυτταρική εισβολή /μετανάστευση

Παράθεση:. Tseng CH , Murray KD, Jou MF, Hsu SM, Cheng HJ, Huang PH (2011) Sema3E /Plexin-D1 Mediated Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκίνο των ωοθηκών ενδομητριοειδές. PLoS ONE 6 (4): e19396. doi: 10.1371 /journal.pone.0019396

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 31 Δεκεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 29 Μαρ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Tseng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα ταμείο από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο (NTUH98-P26-2 και NTUH99-Ρ21) που χορηγούνται σε PH Huang. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κακοήθη εξέλιξη ενός όγκου συχνά περιλαμβάνει απόκτηση της ενισχυμένης μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων για την τοπική εισβολή και απομακρυσμένη μετάσταση, και τα δύο από τα οποία είναι οι κύριοι προσδιοριστικοί παράγοντες για την κλινική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Παρόμοια βιολογικές διαδικασίες συμβαίνουν σε όλη την κανονική εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς και σε ορισμένες φυσιολογικές συνθήκες όπως επούλωση τραύματος [1], [2]. Insight από την αναπτυξιακή βιολογία θα μπορούσε, επομένως, να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε την επεμβατική φύση της κακοήθους εξέλιξης ενός όγκου.

σημαφορίνες (Sema) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια που εκκρίνεται και μεμβράνη που σχετίζονται πρωτεΐνες που παρέχουν περιβαλλοντικά συνθήματα για να προκαλούν διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων νευρωνική κυτταρική μετανάστευση, την καθοδήγηση άξονα, αγγειογένεση, μορφογένεση διακλάδωσης και καρδιακή οργανογένεση [3] – [8]. Σημαφορίνες δεσμεύουν plexin ή /και νευροπιλίνη υποδοχείς για την μεταγωγή ενδοκυτταρικά σήματα. Επί του παρόντος, οι πέντε κατηγορίες σημαφορινών, δύο neuropilins και τέσσερις οικογένειες των πλεξίνες ταυτοποιηθεί σε θηλαστικά [6]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν επίσης σηματοδότησης σημαφορίνη /plexin εμπλέκεται στην ογκογένεση [9] – [11]. Ωστόσο, οι ρόλοι τους είναι αρκετά διαφορετικές και εξαρτώνται από το συγκεκριμένο πλαίσιο του όγκου και της σύνθεσης του σεμαφορίνες, πλεξίνες, και ενδοκυτταρικό σήμα ανταποκρινόμενα στοιχεία τους. σηματοδότηση σημαφορίνης /plexin μπορούν είτε να προάγουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου από την άμεση ρύθμιση της μετανάστευσης κυττάρων ή απόπτωση. σηματοδότηση σημαφορίνης /plexin μπορεί επίσης να ελέγχει έμμεσα όγκου επεμβατική ανάπτυξη μέσω της ρύθμισης της αγγειογένεσης ή της ασυλίας του όγκου [10], [12] – [16].

Στην οθόνη της κατηγορίας 3 σεμαφορίνες σε συστοιχίες ιστό του όγκου (μερικά παραδείγματα δείχνονται στο Σχ. S1c), προσδιορίσαμε Sema3E όπως εκφράζεται ειδικά σε υψηλής ποιότητας καρκίνωμα ωοθηκών ενδομητριοειδές, ένας υπότυπος του επιθηλιακούς καρκίνους ωοθηκών (Εικ. 1). Κλινικά, οι περισσότερες διαγνώσεις καρκίνου των ωοθηκών υψηλής ποιότητας έχουν φτωχή πρόγνωση με μετάσταση όγκου και είναι ανθεκτικοί στη χημειοθεραπεία υπογραμμίζοντας την ανάγκη να κατανοήσουμε σε βάθος την παθογένεση των επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών και την εξέλιξη τους [17]. Χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο κύτταρο καρκινώματος ενδομητριοειδές γραμμή ωοθήκης και προέρχονται sublines με διαφορετικές επεμβατικές /μεταναστευτικών δυνατότητες [18], διερευνήσαμε την αλληλοσυσχέτιση των μηχανισμών Sema3E μοριακής και κυτταρικής σηματοδότησης και διεισδυτικότητα όγκου. Αναφέρουμε εδώ ότι Sema3E από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενεργεί για τον εαυτό τους μέσα Plexin-D1 για να προκαλέσει EMT και ταυτόχρονα να διευκολύνει τη μετανάστευση των κυττάρων και κακοήθη εξέλιξη.

Α, Β RNA

in situ υβριδισμού

με αντίθετης φοράς

Sema3E

καθετήρα και ανοσοϊστοχημεία με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα εναντίον Sema3E δείχνουν διαφορική έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης αντίστοιχα στα κύτταρα σε όλο τομές ιστού από υψηλής και χαμηλής ποιότητας ανθρώπινων επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών. Αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης (Η &? Ε) διεξήχθη επί παρακείμενα τμήματα να υποδείξει γενικές cytoarchitecture ιστού. μπαρ κλίμακα, 20 μm. C. Ανοσοϊστοχημεία δείχνει έλλειψη Sema3E έκφρασης σε τρεις διαφορετικές επιθηλιακά καρκινώματα μη-ωοθηκών. Α, ανάλυση Ε Ημι-ποσοτική RT-PCR της κατηγορίας 3 σημαφορίνης, νευροπιλίνη και έκφραση plexin στα κύτταρα P0 και Ρ4 ΣΜΕΟ δείχνει διάφορα επίπεδα της έκφρασης. Όλες οι τιμές πυκνότητας για τα θραύσματα PCR κανονικοποιούνται με εκείνη του

GAPDH

για την ποσοτικοποίηση.

Η

Αποτελέσματα

Sema3E υπερεκφράζεται σε υψηλής ποιότητας καρκίνωμα των ωοθηκών ενδομητριοειδές

με βάση τα προκαταρκτικά αποτελέσματα ανοσο-διαλογή, ερευνήσαμε διεξοδικά την έκφραση Sema3E και των υποδοχέων της, Plexin-D1 και νευροπιλίνη-1 (Npn1), σε ανθρώπινο ενδομητριοειδές καρκινώματα των ωοθηκών. δείγματα όγκων ελήφθησαν από 40 ασθενείς που διαγνώστηκαν ως πρωταρχικό ενδομητριοειδές καρκίνωμα των ωοθηκών στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο 1995 έως 2002. Εκτός από τον πρωτογενή όγκο, 9 περιπτώσεις είχαν μετάσταση λεμφαδένα, και ταίριασμα πρωτογενούς όγκου και των μεταστατικών λαγόνιο λεμφαδένα ήταν διαθέσιμα σε 7 περιπτώσεις. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων 40 όγκων, 25 διαγνώστηκαν ως υψηλής ποιότητας ενδομητριοειδές καρκίνωμα των ωοθηκών, και σε όλες τις περιπτώσεις ανιχνεύθηκε σημαντικό επίπεδο πρωτεΐνης Sema3E και μεταγραφής. Sema3E έκφραση είναι ανεξάρτητη της ηλικίας και του όγκου στάδιο των ασθενών, αλλά συσχετίστηκε σημαντικά με το βαθμό του όγκου (Πίνακας 1, και το Σχ. 1Α, κάτω πάνελ). Αντίθετα, οι περισσότερες περιπτώσεις με χαμηλού βαθμού καρκίνωμα ωοθηκών ενδομητριοειδές παρουσίασαν μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα Sema3E (Εικ. 1Α, πάνω φύλλα). Plexin-D1 και Npn1, τα συστατικά του υποδοχέα Sema3E, έδειξαν παρόμοια βαθμούς ανοσο-επισήμανση με χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας όγκων (Σχ. 1Β). Επιπλέον, Sema3E ήταν ειδικά υπερ-εκφράζεται σε υψηλής ποιότητας καρκίνωμα των ωοθηκών ενδομητριοειδές στο ότι άλλοι τύποι επιθηλιακών όγκων των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων ορώδες, βλεννώδες και σαφή όγκους των κυττάρων, χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας όσο, δεν εκφράζουν Sema3E (Εικ. 1Γ) . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έναν ισχυρό συσχετισμό μεταξύ της έκφρασης Sema3E και υψηλής ποιότητας ανθρώπινου καρκινώματος ενδομητριοειδές ωοθηκών.

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση των σημαφορινών και των υποδοχέων τους σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος ενδομητριοειδές ωοθηκών. Μια ανθρώπινη ενδομητριοειδές καρκίνωμα των ωοθηκών (OEC) κυτταρική γραμμή που ορίζεται ως P0 έχει προηγουμένως αποδειχθεί από 63-year-old γυναίκα ασθενή με ενδομητριοειδές καρκίνωμα σταδίου IIIc. Μια δευτερεύουσα γρα οριστεί ως P4 ιδρύθηκε επίσης με την επιλογή κλώνων που παρουσίασαν αυξημένη μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα προσδιορίστηκαν από transwell θάλαμο και πληγή της μετανάστευσης [18]. Σε αντίθεση με τα διαφορικά μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητες των κυττάρων P0 και Ρ4, δεν υπάρχει εμφανής διαφορά στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση παρατηρήθηκε [18] (επίσης βλέπε Σχ. S2C, D, και Ε). Ημι-ποσοτική RT-PCR αναλύσεις με ηλεκτροφόρηση πηκτής (Σχ 1ϋ.) Ή σε πραγματικό χρόνο (Σχ S2B.) Έδειξε ότι μεταξύ κλάση 3 σεμαφορίνες επίπεδα Sema3E ήταν σημαντικά υψηλότερα (& gt? 10-φορές) σε υψηλή επεμβατικές /μεταναστευτικά P4 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα P0. Αντίθετα, Sema3F γενικά θεωρείται ένας καταστολέας όγκου κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα Ρ4 [10], [19]. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκε μεταβλητή έκφραση plexin και νευροπιλίνη, Plexin-D1 και NPN 1 ήταν εξίσου εκφράζονται στα P0 και υψηλής επεμβατική κύτταρα χαμηλής επεμβατική P4 (Σχ. 1Ε και S2B). RNA

in situ υβριδισμού

ανάλυση σε καλλιεργημένα ενιαίο καρκίνο ενδομητριοειδές κύτταρα των ωοθηκών επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα (Εικ. S2A). Αυτό υποδηλώνει Sema3E έκφρασης των ωοθηκών ενδομητριοειδές καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να ενέχονται στην απόκτηση του κυτταρικού επεμβατική /μεταναστευτικών ικανότητα.

Η P61-Sema3E ισομορφή είναι πιθανό να δράσει με αυτοκρινή τρόπο μέσω Plexin-D1 για να ενισχυθεί η επεμβατική /μεταναστευτική ικανότητα των ωοθηκών ενδομητριοειδές καρκινικών κυττάρων

in vitro

σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο

Για να διερευνήσουν το ρόλο της Sema3E στη διαμεσολάβηση εισβολής ή /και τη μεταναστευτική ικανότητα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, πραγματοποιήσαμε το κέρδος και την απώλεια των λειτουργήσει μελέτες σε κύτταρα ΣΜΕΟ. Πρώτον, υπερεκφράζεται Sema3E σε γονική Sema3E αρνητικά, χαμηλά επεμβατική κύτταρα P0. Αυτές οι σταθερές κυτταρικές σειρές (ορίζεται P0-3E-

1, P0-3E-

3 και P0-3E-

10) εμφάνισαν ποικίλους βαθμούς Sema3E έκφραση όπως μετρήθηκε με ημιποσοτική RT-PCR, ανοσοκηλίδωση , και RNA

in situ υβριδισμού

(Εικ. 2Α). Δεύτερον, Sema3E έκφραση σε εξαιρετικά επεμβατική κύτταρα Ρ4 ήταν σταθερά χτυπηθεί κάτω από μεσολάβηση RNAi εξάντληση. Πήραμε δύο κλώνοι, που ορίζονται P4 /si3E-

1 και P4 /si3E-

2 στοχεύονται από διαφορετικές αλληλουχίες RNAi που έδειξε το 75% -90% μείωση στην Sema3E σε σχέση με τη γονική Ρ4 κύτταρα (Εικ. 2Β, δεξιά πάνελ ). Ελέγχου ΣΜΕΟ κλώνοι επιμολυσμένων είτε με άδειο-φορέα (-mock) ή ομελέτα ακολουθίες RNAi (-Έλεγχος). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και κυανού πειράματα αποκλεισμού έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό δεν μεταβλήθηκε σε P0-3E και Ρ4 /si3E κλώνους (Σχ. S2C και D).

A. Τροποποιημένο κυτταρικές γραμμές P0 (P0-3E-

x) εκφράζουν διάφορα επίπεδα του Sema3E όπως μετράται με ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR (αριστερά επάνω) και κηλίδωση Western (αριστερό κάτω). Οι τιμές έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σε

GAPDH

και OE-τουμπουλίνης για mRNA και πρωτεΐνης, αντίστοιχα. RNA

in situ

ανιχνευτές υβριδισμού από Sema3E στο P0-3E-

1 σε σύγκριση με κύτταρα P0 (δεξιά). B. κηλίδωση Western των Sema3E και Plexin-D1 σε P4 /si3E κλώνους (RNAi-1, -2 για τη στόχευση δύο διαφορετικές αλληλουχίες του Sema3E) και P0-3E-

1 κλώνους /siD1 (RNAi-1, -2 για στόχευσης δύο διαφορετικές ακολουθίες Plexin-D1). C, D, Ε, ΣΤ φωτεινού μικροφωτογραφίες από επούλωση της πληγής δοκιμασίες μετανάστευσης των διαφόρων P0-3E (C), P0-3E-

1 /siD1 (D), και Ρ4 /si3E (Ε) κυτταρικές γραμμές στο ξεκινώντας (0 h) και 16 ώρες μετά την επιφάνεια μηδέν. Πληγή άκρες έχουν σημανθεί με λευκές γραμμές (0 h) ή μαύρες γραμμές (16 ώρες). μπαρ κλίμακα, 0,5 mm. Μια σύνοψη της μέσης ταχύτητας μεταναστεύουσα (μm /h) για κάθε κλώνο χαράσσεται (F) με τυπική απόκλιση (n≥12). *,

P

& lt? 0,05, σε συνδυασμό

t-test

. Ζ, Η Εκπρόσωπος εικόνες (G) και περίληψη γράφημα (H) του προσδιορισμού εισβολής θάλαμο φρεατίων (n≥6). μπαρ κλίμακα, 30 μm. I. αναστολέας Η φουρίνη, δεκανοϋλ-RVKR-χλωρομεθυλοκετόνη, μεταβάλλει τη μεταναστευτική ικανότητα P0-3E-

1 κύτταρα στην επούλωση της πληγής και επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης θάλαμο. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος. Λευκή γραμμή, 0 h στη διαδικασία επούλωσης τραυμάτων? μαύρη γραμμή, 16 ώρες μετά την επιφάνεια το μηδέν. **

P

& lt? 0.005, *,

P

& lt? 0,05, σε συνδυασμό

t-test

, n = 5. μπαρ Κλίμακα, 0,5 mm. δοκιμασία εισβολής θάλαμο J. Transwell για τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά P0 P61-Sema3E ισομορφή (P0-3Ep61-

1 και P0-3Ep61-

2) σε σύγκριση με P0-3E-

1 κύτταρα και κύτταρα P0. **

P

& lt? 0.005, σε συνδυασμό

t-test

, n = 4. Κλίμακα bar, 0,3 χιλιοστά

Η

Οι επεμβατικές /μεταναστευτικά ικανότητες του. OEC κλώνοι αξιολογήθηκαν από

in vitro

επούλωση της πληγής, 3-διαστάσεων (3D) -matrigel μετανάστευσης, και μεταξύ φρεατίων δοκιμασίες εισβολής θάλαμο. Στον προσδιορισμό επούλωση της πληγής, Ρ4-παρωδία και P0-3E-

1 κύτταρα άρχισαν να γεμίζουν την πληγή το συντομότερο 4 ώρες μετά το μηδέν, ενώ P0-mock κύτταρα εμφάνισαν αργή κινητικότητα, ακόμη και μετά από 16 ώρες. Οι κλώνοι P0-3E μετανάστευσαν σε μία Sema3E δοσοεξαρτώμενο τρόπο τέτοιο ώστε η P0-3E-

1 και P0-3E-

9 κύτταρα, που εκφράζουν σχετικώς υψηλές ποσότητες Sema3E, κινήθηκε ταχύτερα και μακρύτερα από το P0- 3Ε-

3 και P0-3E-

10 κύτταρα, τα οποία εκφράζονται χαμηλότερες ποσότητες Sema3E (Σχ. 2C και F). Αντιστρόφως, η εξάντληση των Sema3E σε κύτταρα Ρ4 επιβράδυνε τη μεταναστευτική ταχύτητα και την απόσταση (Εικ. 2Ε και F). Παρόμοιες μεταβολές παρατηρήθηκαν στην δοκιμασία μετανάστευσης matrigel και δοκιμασία εισβολής θαλάμου Transwell: Ρ4 και P0-3E-

1 κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερη επεμβατική δυναμικό σε σύγκριση με P0-3E-

10, P4 /si3E ή γονική P0 κύτταρα όπου Sema3E επίπεδα μειωμένη ή απούσα (Σχ. 2G, Η και S2E). Ως εκ τούτου, η υπερέκφραση του Sema3E στα κύτταρα χαμηλής επεμβατική ΣΜΕΟ ενισχύει την κυτταρική μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες

in vitro

σε ένα κάνει-εξαρτώμενο τρόπο, και νοκ ντάουν του Sema3E μειώνεται το μεταναστευτικό /επεμβατική ικανότητες σε high-επεμβατική κύτταρα OEC .

Sema3E συνδέεται άμεσα με Plexin-D1 για τη μεταγωγή ενδοκυτταρικού σήματος κατά την εμβρυϊκή ή όγκου αγγειογένεση [20]. Εμείς προσδιοριστεί αν Plexin-D1 σε κύτταρα ΣΜΕΟ απαιτείται για τη μεσολάβηση Sema3E μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα που δεν σχετίζεται με την αγγειογένεση. Δύο σταθερές νοκ ντάουν κλώνους, P0-3E /siD1-

1 και P0-3E /siD1-

2, παρήχθησαν με RNAi στόχευση των ξεχωριστών αλληλουχιών Plexin-D1 η οποία μείωσε τα επίπεδα Plexin-D1 κατά 85% -95% όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western (Εικ. 2Β, το αριστερό πάνελ). Νοκ ντάουν της Plexin-D1 επηρεάζεται ούτε την έκφραση της Sema3E, ούτε τη βιωσιμότητα ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 2Β, S2C και S2D). Ωστόσο, η επεμβατική /μεταναστευτικών φαινότυπο που παρέχει το υπερ-έκφραση του Sema3E αντιστράφηκε από την απώλεια Plexin-D1 (Σχ. 2D, F, G, H). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Sema3E παρέχει τη μεταναστευτική ικανότητα στα κύτταρα ΣΜΕΟ μέσω Plexin-D1 με αυτοκρινή τρόπο.

Ολόσωμη πρωτεΐνες κατηγορίας 3 σημαφορίνη υπόκεινται σε κονβερτάσης μεσολάβηση διάσπασης, δημιουργώντας έτσι πολλαπλές ισομορφές με διαφορικό δραστηριότητες [ ,,,0],15], [21]. Σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, ρ87-Sema3E πρωτεΐνη διασπάται από φουρίνη σε P61 και Ρ26 ισομορφές, και είναι P61-Sema3E που επάγει την αγγειογένεση για επεμβατική ανάπτυξη [15]. Κατά την εκτέλεση Sema3E ανοσοαποτύπωση στα Sema3E-κύτταρα που εκφράζουν OEC, παρατηρήσαμε ότι ένα P61 μεγέθους μπάντα αντί της πλήρους μήκους ρ87-Sema3E ανιχνεύθηκε, ακόμη και αν όλα τα P0-3E κλώνοι επιμολυσμένα με πλήρους μήκους κατασκευή Sema3E cDNA ( Σχ. 2Α). Εξετάσαμε εάν αυτή η P61-πρωτεΐνης αντιστοιχεί στην φουρίνη επεξεργασία Sema3E. Ανοσοαποτύπωση έδειξε ότι η φουρίνη ήταν παρούσα σε όλα τα κύτταρα ΣΜΕΟ (Εικ. S3A). Όταν φουρίνη δραστηριότητα αναστέλλεται από δεκανοϋλ-RVKR-χλωρομεθυλοκετόνη, έκφραση P61-Sema3E μειώθηκε σημαντικά, ενώ πλήρους μεγέθους Ρ87-Sema3E έγινε εμφανής (Εικ. S3b). Επιπλέον, Sema3E μεσολάβηση μεταναστευτικά /επεμβατικές δραστηριότητες διακυβεύεται με την παρουσία του αναστολέα φουρίνης (Εικ. 2I). Να εξετάσει την πιθανότητα ότι P61-Sema3E μόνη της είναι αρκετή για την προώθηση της μεταναστευτικής /επεμβατική ικανότητα των κυττάρων OEC που απορρέουν από Sema3E, ιδρύσαμε P0-3Ep61 κλώνοι που εκφράζονται μόνο το P61-Sema3E ισομορφή. Τόσο

in vitro

(Σχ. 2J, S3C και S3D) και

in vivo

(Σχ. 3C) μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση της Ρ61-Sema3E μόνο ήταν αρκετή για να προωθήσει τα μεταναστευτικά /επεμβατική ικανότητα σε κύτταρα OEC. Μεσολάβηση RNAi knockdown του Plexin-D1 σε κύτταρα ΣΜΕΟ εκφράζονται σταθερώς P61-Sema3E μειωμένη μεταναστευτική ικανότητα που παρέχεται από P61-Sema3E (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για άγνωστους λόγους, δεν θα μπορούσαμε να παράγουν κύτταρα ΣΜΕΟ σταθερώς εκφράζουν μεταλλαγμένο ρ87-Sema3E ανθεκτικά στη φουρίνη διάσπαση. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα COS παροδικά επιμολυσμένα με είτε P61-Sema3E ή ρ87-Sema3E στην κυτταρική κινητικότητα του Sema3E αρνητικών /Plexin-D1-θετικών κυττάρων P0. Πράγματι, εξωγενής P61-Sema3E-ρυθμισμένο μέσο δοσοεξαρτώμενο προωθείται κυτταρική μετανάστευση και το αποτέλεσμα αυτό εξασθένησε όταν Sema3E είχε εξαντληθεί από το μέσο με προ-επώαση με αντι-Sema3E αντίσωμα (Σχ. S3E και F). Όταν εφαρμόστηκε μη μεταποιημένα ρ87-Sema3E-ρυθμισμένο μέσο, ​​όχι αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η P61-Sema3E, αλλά όχι πλήρους μήκους Ρ87-Sema3E, προωθεί μια Plexin-D1 εξαρτώνται από τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων ΣΜΕΟ.

Α. Gross και μικροσκοπικές αλλαγές στους πνεύμονες μετά από ενδοφλέβια (ί.ν.) ένεση σε ποντίκια NOD /SCID των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν διαφορετικούς ΣΜΕΟ Sema3E /δραστηριότητες Plexin-D1. Arrowhead δείχνει μικροσκοπικό φωλιές όγκου κοντά στην αγγειακή δέντρο. μπαρ κλίμακα, 50 μm. B. Η ανοσοϊστοχημεία των Sema3E, κυτοκερατίνης, και TTF1 στην πνευμονική μεταστατικούς όγκους των NOD /SCID ποντίκια ενδοφλεβίως ένεση με P0-3E-

1 κύτταρα. Γ Περίληψη

in vivo

μεταστατικό πειραματικά αποτελέσματα. Ο αριθμός των ποντικών με μικρο-μεταστατική οιδηματώδης βλάβη του πνεύμονα (αριστερά προς την κάθετο) έναντι του συνολικού αριθμού των ποντικών που εξετάστηκαν (δεξιά στο κάθετο) παρουσιάζεται. Μέσο βάρος των πνευμόνων διέφερε μεταξύ των ομάδων (*,

P

& lt? 0,05, του Student

t

-τεστ).

Η

Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης προωθεί μετάσταση καρκίνο των ωοθηκών ενδομητριοειδές

in vivo

η

Είμαστε δίπλα αξιολογηθεί η

in vivo

μεταστατική ικανότητα των κυττάρων ΣΜΕΟ με διαφορετική δραστηριότητα Sema3E /Plexin-D1 σε NOD ποντίκια /SCID. Ενδοφλέβια ένεση του Sema3E-αρνητικών κυττάρων P0 ουδέποτε οδήγησε σε μετάσταση όγκου σε οποιοδήποτε όργανο που εξετάστηκαν στις 8 εβδομάδες μετά την ενδοφλέβια ένεση των κυττάρων. Αντιθέτως, η έγχυση Sema3E εκφράζουν ΣΜΕΟ κλώνων προκλήθηκε μεταστατική ανάπτυξη του όγκου στον πνεύμονα, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του συνολικού βάρους των πνευμόνων (Εικ. 3C), το ακαθάριστο ενδοπνευμονική αιμορραγία (Σχ. 3Α, πάνω φύλλα), και η παρουσία των μικροσκοπικών καρκινικών φωλιές κοντά στα αγγειακά δέντρα (Εικ. 3Α, κάτω πάνελ). Οι πνευμονικών όγκων προήλθε από τα κύτταρα εγχέονται ΣΜΕΟ όπως καταδεικνύεται με θετική ανοσοδραστικότητα για την ανθρώπινη Sema3E και κυτοκερατίνη (δείκτες για τα ανθρώπινα κύτταρα), αλλά δεν TTF-1, ένας δείκτης για πνευμονοκύτταρα (Εικ. 3Β). Επιπλέον, παρατηρήθηκε μία Sema3E δοσοεξαρτώμενη και Plexin-D1-εξαρτώμενη μεταστατικό αποτέλεσμα. Ένα υψηλότερο ποσοστό των πνευμονικών μικρο-μεταστάσεις που αναπτύχθηκε σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με ΣΜΕΟ κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα Sema3E (P0-3E-

1, P0-3Ep61, κύτταρα Ρ4), ενώ τα κύτταρα με χαμηλή Sema3E /δραστικότητα Plexin-D1 (P0 -3E-

10, P4 /si3E, P0-3E-

1 /siD1) είχαν χαμηλότερο ποσοστό των όγκων (Σχ. 3C). Επίσης, P61-Sema3E μόνο ήταν σε θέση να παρέχουν πνευμονική μικρο-μετάσταση σε γονικά κύτταρα P0

in vivo

(Σχ. 3C). Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι P61-Sema3E μέσω Plexin-D1 σηματοδότηση είναι υπεύθυνος για την ανάθεση δοσοεξαρτώμενη διέγερση της πνευμονικής μεταστατική ανάπτυξη των κυττάρων ΣΜΕΟ.

Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότηση μεταβάλλει τη δυναμική της ενιαίας OEC κυτταρική μορφολογία, σύμφωνα με μια αλλαγή στην κυτταρική κινητικότητα

Εμείς παρατηρούνται αλλαγές στο ΣΜΕΟ κυτταρική μορφολογία που σχετίζεται με τη δραστηριότητα της Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης. Κύτταρα με υψηλή έκφραση Sema3E και ταχεία κινητικότητα των κυττάρων όπως P0-3E-

1 και Ρ4 κύτταρα ήταν συνήθως σχήμα ατράκτου με ένα διπολικό ή πολυ-γωνιακή ινοβλαστοειδή εμφάνιση (σχ. 4Α και Β), ενώ P0, P0 -3E-

10, P4 /si3E, και P0-3E-

1 /siD1 κύτταρα τα οποία είχαν χαμηλά Sema3E /δραστηριότητας Plexin-D1 και χαμηλή μεταναστευτική ικανότητα, διατήρησε ένα υψηλότερο ποσοστό στρογγυλά σχήματα με πλακόστρωτα, όπως εμφάνιση (Εικ. 4Α και Β). Εξετάσαμε τη συσχέτιση αυτή λεπτομερώς, από τον εντοπισμό μεμονωμένων ΣΜΕΟ οδών μετανάστευσης των κυττάρων και την εκτέλεση time-lapse φωτογραφία κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας επούλωση της πληγής. Σε αντίθεση με τις εντυπώσεις που δημιουργούνται από την σταθερή κατάσταση εικόνες, time-lapse φωτογραφία αποκάλυψε ένα δυναμικό πρότυπο κυτταρομορφολογική ποδηλασία μεταξύ γύρο, διπολική και πολυγωνική σχήματα που παρατηρήθηκε για όλα τα κύτταρα ΣΜΕΟ που εξετάστηκαν (Εικ. 4C). Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα Sema3E /Plexin-D1 επηρέασε σημαντικά τον χρόνο κύτταρα ΣΜΕΟ παρατηρήθηκαν σε ένα στρογγυλό σχήμα. Έτσι, P0 και P0-3E-

1 /siD1 διατηρείται μια στρογγυλή μορφολογία για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από ό, τι P4 και τα κύτταρα P0-3E-1, η οποία γρήγορα μεταπηδά μέσω στρογγυλό σχήμα και προχώρησε γρήγορα σε ένα πολωμένο σχήμα άξονα (Εικ. 4C και Ε) . Επιπλέον, μόνο τον εντοπισμό των κυττάρων αποκάλυψε ότι τα κύτταρα ΣΜΕΟ με Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης έτειναν να συνεχίσει να κινείται προς μία κατεύθυνση για μια μεγάλη απόσταση, αλλά τα κύτταρα με χαμηλή Sema3E δραστηριότητα /Plexin-D1 συχνά παύση και άλλαξε τα μεταναστευτικά διαδρομής (Εικ. 4D τους ). Κατά συνέπεια, P4 και P0-3E-

1 κύτταρα θα μπορούσε να κινηθεί γρήγορα προς μία κατεύθυνση για μια μεγάλη απόσταση, ενώ P0 και P0-3E-

1 /κύτταρα siD1 αδιέξοδο, συνεχώς αλλάζει κατευθύνσεις, και ήταν σε θέση να μετακινούνται μακριά σε μια κατεύθυνση (Εικ. 4D). Αυτό συσχετίζεται καλά με τις συνολικές μεταναστευτικές ικανότητες διαφορετικών Seam3E κυττάρων που εκφράζουν ΣΜΕΟ στη δοκιμασία επούλωση της πληγής. Πιο περίεργο, η κυτταρομορφολογική μετάβαση από γύρο σε άτρακτο σχήμα που σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την απόκτηση της κινητικότητας των κυττάρων μοιάζει με το φαινόμενο της λεγόμενης επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [22], γεγονός που υποδηλώνει ότι Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης κύτταρα OEC θα μπορούσαν να συμμετέχουν στη διαδικασία EMT.

Α. Εκπρόσωπος εικόνες τριών διαφορετικών κυττάρων σχήματα των κυττάρων OEC όπως στρογγυλό, διπολικά και multi-γωνιακή. B. Η ποσοτικοποίηση του ποσοστού κάθε μορφολογίας σε ένα συνολικό πληθυσμό (n≥400) της OEC κλώνων με μεταβλητή δραστηριότητα του Sema3E /Plexin-D1. Γ, Δ, Ε Time-lapse ανίχνευσης (έως 200 λεπτά, με 20 λεπτά διαστήματα ανίχνευσης) των μορφολογικών δυναμική των μεμονωμένων κυττάρων OEC σε μια διαδικασία επούλωσης τραυμάτων (C). Ενιαία ΣΜΕΟ μεταναστευτικές διαδρομές χαράχθηκαν (D). Τα βέλη δείχνουν την έναρξη κάθε εντοπισμό και χρωματιστές τελείες δείχνουν τη θέση του εντοπιστεί κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο. Κάθε βήμα στην μεταναστευτικών αλληλουχία σημάνθηκε με τους αριθμούς ίδιες με εκείνες στο (C). Το γράφημα μπαρ στο (Ε) συνοψίζονται μέσος χρόνος διαστήματος που δαπανάται από κάθε κύτταρο ΣΜΕΟ για κάθε επί μέρους σχήμα των κυττάρων. *,

P

& lt?. 0.05, σε συνδυασμό

t-test

Η

Sema3E /σήματα Plexin-D1 μέσω της PI3K και ΜΑΡΚ να προκαλέσει πυρηνική μετατόπιση Snail1 και επιθηλιακών -να-μεσεγχυματικά μετάβαση

Κατά τη διάρκεια της EMT, τα κύτταρα συχνά χάνουν τα επιθηλιακά μοριακών δεικτών τους και να αποκτήσουν δείκτες των μεσεγχυματικών κυττάρων [23] – [26]. Εξετάσαμε έτσι το μοριακό προφίλ διαφορετικών κλώνων ΣΜΕΟ να προσδιοριστεί εάν μορφολογικές μεταβολές Sema3E επαγόμενη συνδέθηκαν με ένα γεγονός EMT. E-cadherin, ένα επιθηλιακό δείκτη, ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε Sema3E εκφράζουν ΣΜΕΟ κύτταρα σε ένα Sema3E-εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, ενώ τα μεσεγχυματικά δείκτες βιμεντίνη και ινονεκτίνη ήταν αυξητικά (Εικ. 5Α, Β, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, RNAi-knockdown του Plexin-D1 σε Sema3E κύτταρα που εκφράζουν κατήργησε Sema3E επαγόμενη μοριακές μεταβολές χαρακτηριστικές του EMT (Σχ. 5Α και C). Παρόμοια Sema3E σχετιζόμενη μεταβολές των δεικτών ΕΜΤ παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα εξετάστηκαν με συνεστιακή ανοσο-φθορισμού μικροσκοπία (Σχ. 5C και S4A). Επιπλέον, ανοσοχρώση για νηματοειδή ακτίνης σε Sema3E κύτταρα που εκφράζουν προσδιορίζονται filopodia και το σχηματισμό ελασματοπόδια χαρακτηριστική ΕΜΤ μεταβολές που προκλήθηκαν από κυτταροσκελετικές, αλλά αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα με χαμηλή Sema3E /έκφραση Plexin-D1 (Εικ. 5C, κορυφή πάνελ).

Α, Β έκφραση κυτταρικών δεικτών του ΕΜΤ συσχετίζεται με επίπεδα δραστηριότητας Sema3E /Plexin-D1 σε τροποποιημένα κύτταρα ΣΜΕΟ όπως μετράται με ημι-ποσοτική RT-PCR (Α) και κηλίδωση Western (Β). Αντιθέτως, τα μέλη των παραγόντων της οικογένειας μεταγραφής σαλιγκάρι που ρυθμίζουν αναπτυξιακή EMT είναι ομοιόμορφα εκφράζονται σε γενετικά τροποποιημένες κυτταρικές σειρές OEC. εντάσεις σήματος ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

(Α) ή OE-τουμπουλίνη (Β), αντίστοιχα, και υποδεικνύονται ως αναλογίες. Γ, Δ ομοεστιακό μικροσκόπιο των κυττάρων ΣΜΕΟ δείχνει μια μετατόπιση από επιθηλιακά (E-cadherin) στην έκφραση μεσεγχυματικών (βιμεντίνη) δείκτη και μια ξεχωριστή πυρηνική μετατόπιση της Snail1 στα τροποποιημένα κύτταρα ΣΜΕΟ εμφανίζουν μεγαλύτερη Sema3E δραστηριότητα /Plexin-D1. Ανοσοαντιδραστικότητα για νηματοειδή ακτίνη, και χρώση των πυρηνικών DAPI χρησιμοποιήθηκαν ως γενική δείκτες της μορφολογίας των κυττάρων. μπαρ κλίμακα, 20 μm. Ε Πυρηνικός εντοπισμός των Snail1 σχετίζεται με υψηλής ποιότητας του ανθρώπινου ιστού OEC, αλλά όχι χαμηλού βαθμού ανθρώπινους ιστούς ΣΜΕΟ. Snail1 δεν ανιχνεύθηκε σε ωοθηκική ενδομητρίωση. μπαρ κλίμακα, 10 μm. δραστηριότητα υποκινητή F. Ε-καδερίνης, μετρούμενη με την έκφραση κανονικοποιημένες λουσιφεράσης σε τροποποιημένο γραμμές ΣΜΕΟ, ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα με υψηλή Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότηση. Αυτό εξαρτάται από Snail1 μετατόπιση από το νοκ ντάουν της Snail1 ή ένα μεταλλαγμένο E-box εμποδίζει την μεταγραφική καταστολή. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν S.E.M., n = 9. **,

P

& lt? 0,01, *,

P

& lt? 0,05, σε συνδυασμό

t-test

. G. Western blots απεικονίζουν μεσολάβηση RNAi knockdown του Snail1 σε Sema-3Ε που εκφράζουν P0-3E-

1 κύτταρα μέσω lenti-ιογενή λοίμωξη. Η Knockdown της έκφρασης Snail1 σε P0-3E-

1 κύτταρα μειώνει τη μετανάστευση στην επούλωση των πληγών δοκιμασία. I. εξόντωση Snail1 σε P0-3E-

1 κύτταρα προκαλεί μια μετατόπιση από ατρακτοειδή, vimentin θετικά σε ένα στρογγυλεμένο, E-cadherin θετική κυτταρική μορφολογία. μπαρ κλίμακα, 10 μm. J, Κ Φαρμακολογικώς επαγόμενη διατήρηση πυρηνικών Snail1 με leptomycin Β (20 ng /ml) αυξάνει τη μεταναστευτική ικανότητα και προκαλεί ένα σχήμα ατράκτου κυτταρική μορφολογία σε κύτταρα P0. μπαρ κλίμακα, 10 μm.

Η

Ένα σημαντικό ρυθμιστή της EMT κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου είναι η οικογένεια σαλιγκάρι μεταγραφικών παραγόντων δακτύλου ψευδαργύρου, εκ των οποίων σαλιγκάρι (Snail1) και Slug (Snail2) είναι η πιο εντατικά μελετηθεί [27] – [29]. Πολλοί επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα επάγουν ΕΜΤ μέσω πάνω ρύθμιση του Snail1 μεσολάβηση μεταγραφής [22]. Ωστόσο, Sema3E έκφραση σε κύτταρα ΣΜΕΟ δεν μετέβαλλε τα επίπεδα του mRNA ή της πρωτεΐνης του Snail1 (ή Snail2 και Twist) (Σχ. 5Α και Β). Η λειτουργία της Snail1 θα μπορούσε εναλλακτικά να διαμορφώνεται από υποκυτταρικού εντοπισμού του, έτσι ώστε πυρηνική μετατόπιση της κυτοσολικής Snail1 απαιτείται για την προσβασιμότητα των υποκινητών στόχου [30], [31]. Εξετάσαμε αν το σήμα Sema3E /Plexin-D1 διαμορφώνεται το υποκυτταρικό εντοπισμό των Snail1 σε ΣΜΕΟ κύτταρα. Ανοσο-φθορισμού μικροσκοπία αποκάλυψε ένα μικτό πληθυσμό κυττάρων ΣΜΕΟ με Snail1 είτε κατά κύριο λόγο βρίσκονται στον πυρήνα, ή στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, η πυρηνική εντόπιση του Snail1 συσχετίζεται θετικά με τη δραστηριότητα Sema3E /Plexin-D1. Σε κύτταρα με υψηλή δραστικότητα Sema3E /Plexin-D1 όπως P0-3E-

1 κύτταρα, τα περισσότερα εμφάνισε κυρίαρχη πυρηνικό εντοπισμό του Snail1 (64% ± 8% [μέση τιμή ± τυπική απόκλιση τριών πειραμάτων]), ενώ τα περισσότερα κύτταρα με χαμηλή Sema3E /Plexin-D1 δραστηριότητα εμφανίζεται μια κυρίως κυτοσολικό διανομή Snail1 (για παράδειγμα: P0, 78% ± 6% κυτοσολική Snail1 localization) (Εικ 5D.). Επιπλέον, ανοσοϊστοχημεία των Snail1 σε ανθρώπινα καρκινώματα ωοθήκης ενδομητριοειδές αποκάλυψε ότι οι όγκοι υψηλής ποιότητας είχαν υψηλότερο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων με πυρηνική όγκους Snail1 και χαμηλής ποιότητας είχαν κυρίως κυτοσολικό Snail1 εντοπισμού (Σχ. 5Ε). Αντιθέτως, καμία έκφραση Snail1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα κύστη-επένδυση ενδομητρίωση (Σχ. 5Ε). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης στον καρκίνο ενδομητριοειδές κύτταρα των ωοθηκών μπορεί να προκαλέσει EMT μέσα από την πυρηνική μετατόπιση της Snail1.

Για να προσδιορίσετε αν Snail1 είναι μεταγενέστερος στοιχείο απόκρισης για Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης στα κύτταρα ΣΜΕΟ μέσα το πλαίσιο της ΕΜΤ και κυτταρικής κινητικότητας, ελέγξαμε εάν η μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω του επιθηλιακού κυττάρου δείκτη Ε-καδερίνης σε απόκριση προς Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότηση εξαρτάται Snail1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5F, δοκιμασία δραστικότητας προαγωγέα λουσιφεράσης έδειξε ότι τα κύτταρα με υψηλή δραστικότητα Sema3E /Plexin-D1 παρουσίασαν δραστικότητα καταπιεσμένα προαγωγού της Ε-καδερίνης (για παράδειγμα, να συγκρίνουν P0-3E-

1 κυττάρων με P03E /siD1 ή κύτταρα P0). Αντίθετα, η μετάλλαξη στο E-box (ένα στόχο που αναγνωρίζεται από Snail1) ή RNAi-νοκ ντάουν της Snail1 είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της καταστολής της δραστηριότητας προαγωγού Ε-cadherin που απορρέουν από Sema3E /Plexin-D1. Επιπλέον, knockdown του Snail2 σε P0-3E-

1 κύτταρα δεν μπορούσαν αποαναστέλλουν την δραστικότητα καταπιεσμένη υποκινητή του Ε-καδερίνης (Εικ. 5F). Βρήκαμε επίσης ότι η RNAi-νοκ ντάουν της Snail1 σε Sema3E-κύτταρα που εκφράζουν προκάλεσε τα ατρακτοειδή κύτταρα tansformed σε σχήμα rounder και τις εκφράσεις της E-cadherin και βιμεντίνης ταυτόχρονα επανήλθε (Εικ. 5G και εγώ), υποδεικνύοντας ότι Snail1 απαιτείται για Sema3E επαγόμενη EMT. Επιπλέον, η αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα που παρέχεται από Sema3E στο P0-3E-

1 κυττάρων μειώνεται όταν Snail1 ήταν RNAi εξαντλημένο αλλά μεταβάλλεται από RNAi-εξάντληση των Snail2 (Σχ. 5Η). Αντιθέτως, η αναγκαστική συγκράτηση Snail1 εντός του πυρήνα με leptomycin αγωγή Β σε Sema3E-αρνητικά κύτταρα P0 αυξημένης μεταναστευτικής ικανότητας των κυττάρων και οδήγησε σε μετατροπή σε σχήματος ατράκτου κύτταρα (Σχ. 5J και Κ). Αυτό υποδηλώνει ότι Snail1 μετατόπιση στις λειτουργίες πυρήνα κατάντη της Sema3E σηματοδότησης να μεσολαβήσει κυτταρική μορφολογία και την κινητικότητα. Time-lapse εντοπισμό των Snail1 υποκυτταρικού εντοπισμού σε σχέση με τη μορφολογία των κυττάρων και των μεταναστευτικών ταχύτητα αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ Snail1 πυρηνικό εντοπισμό και το σχήμα των κυττάρων του άξονα, καθώς και με την αύξηση των μεταναστευτικών ταχύτητα (Εικ. S4B, Γ και Δ). Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι Sema3E /Plexin-D1 σηματοδότησης σε ωοθηκών ενδομητριοειδές καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να ρυθμίσει Snail1 μετατόπιση στον πυρήνα, προκειμένου να παρακινηθεί EMT και ταυτόχρονα αυξάνουν την κυτταρική κινητικότητα.

Το ενδοκυτταρικό μονοπάτι (ες) σηματοδότησης που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν Sema3E /Plexin-D1 μεσολάβηση μετατόπιση του Snail1 και επακόλουθη ΕΜΤ σε κύτταρα ΣΜΕΟ διερευνήθηκε με εξέταση της επίδρασης διαφόρων γνωστών αναστολέων κινάσης στην κυτταρική κινητικότητα και Snail1 υποκυτταρικό εντοπισμό. Η αναστολή της κινάσης ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης (SB203580), πρωτεϊνική κινάση C (GF109203X), και Jun Ν-τερματικής κινάσης (SP600125) σε Sema3E-κύτταρα που εκφράζουν ΣΜΕΟ είχε καμία επίδραση στην Sema3E-επαυξημένης μετανάστευση κυττάρου ή επί Snail1 πυρηνικού εντοπισμού. Αντιθέτως, η αναστολή της φωσφατιδυλινοσιτόλης-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) (LY294002 και wortmannin) ή εξωκυτταρικό κινάση σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ) /ενεργοποιημένης από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) (ΡΟ98059) δραστηριότητα οδήγησε σε κυτοσολικό κατακράτησης Snail1 και μια συνακόλουθη μείωση στην μεταναστευτικών ικανότητα που παρέχει Sema3E (Σχ. 6Α, Β και C). Ανοσοκαθήλωση κατέδειξε επίσης ότι Sema3E έκφραση συσχετίζεται με φωσφορυλιωμένη ERK1 έκφραση /ERK2, που περιόριζε κατά την κατεργασία PD98059 (Εικ. 6D). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι τα ενεργοποιημένα PI3K και ERK /MAPK είναι τα κύρια ενδοκυτταρικά συστατικά σηματοδότησης μεταγωγής Sema3E /Plexin-D1 μεσολάβηση Snail1 πυρηνική μετατόπιση.

Ένα, Cell φρεατίων δοκιμασία εισβολή P0-3E-

1 κύτταρα αποκαλύπτει μια σημαντική μείωση στην δραστηριότητα των μεταναστευτικών κυττάρων μετά φαρμακολογική αναστολή του ΡΙ3 κινάσης (LY294002, ή wortmannin) και ERK /ΜΑΡΚ (PD98059) αλλά όχι ρ38 μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση (SB203580), PKC (GF109203X), ή Jun-Ν-τερματικής κινάσης ( SP600125). μπαρ κλίμακα, 30 μm. **

P

& lt? 0,01, *,

P

& lt? 0,05, σε συνδυασμό

t-test

.