Αφηρημένο

Ιστορικό

In vitro

κυτταρικής καλλιέργειας πειράματα με πρωτογενή κύτταρα έχουν αναφέρει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επιβραδύνεται με την παρουσία του περιβάλλοντος σε σύγκριση με τις φυσιολογικές O

2 επίπεδα. Ο καρκίνος είναι κυρίως μια ασθένεια των ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επομένως, μελετώντας τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται υπό ατμοσφαιρικό O

2 μπορεί να είναι ανεπιθύμητη. Για την καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων της O

2 για τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων

in vitro

, συγκρίναμε το δυναμικό ανάπτυξης ενός πάνελ των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών υπό συνθήκες περιβάλλοντος (21%) ή φυσιολογικές (3% ) O

2.

Κύρια Ευρήματα

Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι παρόμοια με πρωτογενή κύτταρα, πολλά καρκινικά κύτταρα διατηρούν μια έμφυτη ευαισθησία στο O

2, αλλά κάποια ένδειξη ευαισθησίας σε αλλαγές στο

συγκέντρωση O 2. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε μια σχέση μεταξύ ελαττωματικό G2 Μ ρύθμισης /κυτταρικού κύκλου μετάβασης και Ξ

2 αναισθησία που προκύπτει από την υπερέκφραση του 14-3-3 σ. Στόχευση 14-3-3 σ υπερέκφραση με RNAi αποκατασταθεί O

2 ευαισθησία σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, βρήκαμε ότι μεταστατικούς όγκους των ωοθηκών συχνά υπερεκφράζουν 14-3-3 σ, η οποία σε συνδυασμό με φωσφορυλιωμένη RB, οδηγεί σε κακή πρόγνωση.

Συμπεράσματα

Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν απόκλιση πολλαπλασιαστικές ευαισθησία στις αλλαγές στο

συγκέντρωση O 2. Παρά το γεγονός ότι δεν είχε προσδιοριστεί μια άμεση σχέση μεταξύ O

2 αναισθησία και μετάσταση, αυτή η έρευνα έδειξε ότι ένα Ξ

2 αδρανείς φαινοτύπου σε καρκινικά κύτταρα να συσχετίζονται με τη μεταστατική εξέλιξη του όγκου

Παράθεση:. Ravi D, Chen Υ, Καρυά Β, Μπράουν Α, Gu ΤΤ, Li J, et al. (2011) 14-3-3 σ Έκφραση Επιδράσεις G2 /M Ανταπόκριση σε οξυγόνο και συσχετίζεται με καρκίνο των ωοθηκών μετάσταση. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10.1371 /journal.pone.0015864

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Αυγούστου, 2010? Αποδεκτές: 25 του Νοέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Ravi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την NIEHS (Κ22-ES12264) και Voelcker Ταμείο Νέων Ερευνητών Βραβείο από την Max και Minnie Tomerlin Ταμείο Voelcker να AJR Επίσκοπος. Kleberg Κέντρο Μοριακής Μαρκαδόροι στο Αντικαρκινικό Κέντρο MD Anderson, το MD Anderson Κέντρο Καρκίνου Ιατρός Επιστήμονας Πρόγραμμα, η McNair μελετητές Πρόγραμμα υποστηρίζεται από το Robert και Janice McNair Ιδρύματος και την Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας (ASCO) ίδρυμα καρκίνου Βραβείο Ανάπτυξης Σταδιοδρομίας (CDA ), Ίδρυμα Καρκίνου και από ένα Ίδρυμα Επιστήμης της Ιρλανδίας (SFI) /Ερευνητικό συμβούλιο Υγείας (HRB (Ιρλανδία)) Μεταγραφική Βραβείο Έρευνας (TRA), όλα στην BT Hennessy. Β Καρυά υποστηρίζεται από DOD CDRMP Breast Cancer Research Program Predoctoral βραβείο πρακτικής άσκησης (BC093931). A. Brown υποστηρίζεται από NIA επιχορήγηση της κατάρτισης Τ32 (T32AG021890). Y. Chen υποστηρίζεται από ΝΙΗ /NCI επιχορήγηση κέντρο καρκίνου (Ρ30 CA054174-17) και επιχορήγηση ΝΙΗ /NCRR CTSA (1UL1RR025767). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ασθενείς με καρκίνο παρέχει μια πειραματικά διαχειρίσιμο σύστημα μοντέλο που διευκολύνει τις έρευνες στη βιολογία του καρκίνου και της θεραπείας της. Η απεριόριστες δυνατότητες πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της κακοήθειας, ωστόσο η χρήση πρωτοκόλλων καλλιέργειας πρότυπο ιστού συχνά περιορίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως παρατηρείται με πρωτογενείς κυτταρικές σειρές [1], [2], [3], [4]. Αν και η χρήση των φυσιολογικών συνθηκών είναι γνωστό ότι έχουν επίδραση

in vitro

πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [5], [6], [7] και είναι πρωτογενή κύτταρα είναι γνωστό ότι διαδίδονται καλύτερα σε φυσιολογικές O

2, η αντίκτυπο των φυσιολογικών O

2 στο

in vitro

πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων είναι σχετικά ανεξερεύνητη. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι η αλλοιωμένη συγκεντρώσεις O

2 οδηγεί σε σαφείς διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανταπόκριση στη θεραπεία φαρμάκου στα καρκινικά κύτταρα [8], [9], [10].

Οξυγόνο , εκτός από τα θρεπτικά συστατικά και παράγοντες ανάπτυξης, είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή ανάπτυξη των κυττάρων και τη διαθεσιμότητά του έχει άμεση επίπτωση επί του κυτταρικού μεταβολισμού, μονοπάτια σηματοδότησης, του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της επιβίωσης [3], [11], [12], [13]. Πολλοί

in vitro

έρευνες έχουν καταδείξει τα πλεονεκτήματα της φυσιολογικής O

2 για καλλιέργεια ιστού. Για παράδειγμα, η βιολογική συμπεριφορά καλλιεργειών πρωτογενών κυττάρων με φυσιολογικό συγκέντρωση O

2 (2.7 – 5.3%) είναι κατά πολύ ανώτερη σε σύγκριση με τη συνήθη πρακτική της καλλιέργειας κυττάρων υπό ατμοσφαιρική ή «περιβάλλοντος» O

συγκέντρωση 2 ( 21% O

2) [4]. Στην πραγματικότητα, οι δύο αυτές συνθήκες ανάπτυξης γνωστό ότι οδηγεί σε διακριτές μεταβολικές και μοριακά χαρακτηριστικά [13].

Η σημασία της εξέτασης O

2 έντασης στη βιολογία του καρκίνου είναι καλά εδραιωμένη. Για παράδειγμα, το γεγονός ότι υπάρχουν πολλές μορφές καρκίνου σε «υποξική» κατάσταση έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη της θεραπείας υποξία στόχευσης [14], [15]. Σε γενικές γραμμές το υποξικό συγκέντρωση O

2 είναι & lt? 1% για τα περισσότερα συμπαγείς όγκους, ωστόσο η υποξική συγκέντρωση θα μπορούσε να ποικίλουν ανάλογα με τους τύπους των κυττάρων και η κατάσταση κανονικής αιμάτωση [16] και επιπλέον, υποξία τείνει να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [ ,,,0],17]. Φυσιολογικές O

2 ένταση κυμαίνεται από 2.7-5.3% στο διάμεσο χώρο [18], όπου πολλές πρωτογενείς όγκους κατοικούν, σε 14,7% στην αρτηριακή κυκλοφορία και τους πνεύμονες, όπου μεταναστεύουν και δυνητικά μεταστατικών καρκινικών κυττάρων που βρίσκονται συχνά. Ως εκ τούτου, οι μελέτες του καρκίνου που διεξάγεται μόνο σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (21%) O

2 μπορεί να χάσετε σχετικές βιολογικές παρατηρήσεις. Αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντικό κατά την προσπάθεια για να μελετηθεί η εξέλιξη του καρκίνου σε μεταστατική νόσο, η οποία είναι ένα σημαντικό γεγονός στην αιτιολογία του καρκίνου και σχετίζεται με κακή πρόγνωση [19]. Λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορές στην O

2 ένταση σε διαφορετικά διαμερίσματα του σώματος, την κατανόηση της επίδρασης της O

2 συγκέντρωσης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να παράσχει χρήσιμες πληροφορίες για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην παθολογική εξέλιξη του καρκίνου.

τα καρκινικά κύτταρα που έχουν αποκτήσει μεταλλάξεις είτε ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου εμφανίζει μια χαρακτηριστική ανεξέλεγκτη φαινότυπο πολλαπλασιασμό [20]. Για παράδειγμα, καταστολείς όγκων όπως ρ53 ή RB δρουν ως «μοριακό φύλακες» είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Μετάλλαξη αυτών των παραγόντων διευκολύνει απεριόριστα τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [20]. εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου συνεπάγεται διαδοχικές σειρές των γεγονότων που καταλύεται από κυκλίνες και εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDKs) [21], και σε φυσιολογικά κύτταρα είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία. Το ογκοκατασταλτικό ρ53 είναι ένας κύριος ρυθμιστής του G1 /S και G2 M μετάπτωση /φάση του κυτταρικού κύκλου [22] και είναι γνωστό ότι έχει ένα σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση συγκέντρωση οξυγόνου, ιδιαίτερα υποξία (& lt? 1% O

2) [23] ή υπεροξία (95% O

2) [24]. Παρόλο που εξετάζει την επίδραση των ακραίων O

2 συνθήκες είναι τόσο σημαντική και αποκαλυπτική, θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι προηγούμενες μελέτες δεν διερεύνησε την ανταπόκριση του p53 σε φυσιολογικές (3%) O

2 και του περιβάλλοντος (21%) O

2. ρ21 και 14-3-3 σ είναι μεταγραφική στόχους της ρ53 τα οποία εμπλέκονται στη ρύθμιση G1 /S και G2 /M μεταπτώσεων του κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση CDK2 και CDC2 (επίσης γνωστή ως CDK1), αντίστοιχα [22], [25] . Η CDKs, με τη σειρά του, ρυθμίζει τη λειτουργία RB πρωτεΐνης, να μεσολαβήσουν προόδου του κυτταρικού κύκλου μέσω της G1 /S και G2 /M [26]. Ως εκ τούτου, η διατάραξη της RB λειτουργίας θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει τον έλεγχο της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου [26]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι διαφορές O αποτέλεσμα

συγκέντρωση 2 και σε διαφορετική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε πρωτογενή κύτταρα, αλλά τα καρκινικά κύτταρα συχνά εμφανίζουν ελαττώματα έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, υπάρχει σαφώς η δυνατότητα ότι αυτά τα ελαττώματα μπορεί να επηρεάσουν το πώς τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε μεταβάλλεται O

2 επίπεδα με έναν τρόπο που θα μπορούσε να έχει μια βαθιά επίδραση στην εξέλιξη του καρκίνου.

Εδώ εξετάσαμε τη βιολογική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών υπό φυσιολογικές και περιβάλλοντος O

2. Είναι ενδιαφέρον ότι, κάποιες από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης είχε μια φυσιολογική απόκριση σε O

2 συγκέντρωση, (

δηλαδή

μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων με αυξημένη O

2 συγκέντρωση), ενώ τον πολλαπλασιασμό άλλων κυτταρικών γραμμών καρκίνου των ωοθηκών δεν επηρεάστηκε από αυτό το O

2 αύξηση. Περαιτέρω, οι έρευνες μας αποκάλυψαν ότι 14-3-3 σ και το ρόλο του στον κυτταρικό κύκλο επηρεάζουν την πολλαπλασιαστική απόκριση να μεταβληθεί O

2 επίπεδα. Λαμβάνοντας υπόψη την μεταβολή της μερικής πίεσης του οξυγόνου σε όλο το σώμα και την δυνητική σημασία ότι αυτό το πλαίσιο μπορεί να έχει για την πρόοδο του καρκίνου, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε την επίδραση των O

2 συγκέντρωσης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του καρκίνου. Παρέχουμε αποδείξεις ότι η εξαγορά της O

2 αναισθησία μπορεί να είναι ένα συστατικό στην εξέλιξη του καρκίνου και το σήμα κατατεθέν της επιτυχούς μεταστατική νόσο.

Αποτελέσματα

Φυσιολογικές αποτελέσματα του οξυγόνου στο αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα

Στην αρχική μας μελέτες που συνέκριναν την επίδραση της φυσιολογικής (3% O

2) και του περιβάλλοντος (21% O

2) συγκέντρωση οξυγόνου χρησιμοποιώντας Α2780 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και παρατήρησαν ότι 12 ημέρες κυτταρικής καλλιέργειας υπό αυτές τις συνθήκες οδήγησαν σε 2,6 φορές καταστολή της ανάπτυξης κάτω από 21% O

2 (Σχήμα 1). Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την επίδραση της O

2 συγκέντρωσης για τις δυνατότητες ανάπτυξης των έξι κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας φυσιολογικές (3% O

2) και του περιβάλλοντος (21% O

2) συγκεντρώσεις οξυγόνου. Δεδομένου ότι η παρούσα ορού σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων μπορεί επίσης να έχει δεσπόζουσα επιρροή στην ανάπτυξη, δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ορού. Ανεξάρτητα από την ποσότητα του παρόντος ορού στο μέσο ανάπτυξης, καλλιέργεια σε 21% O

2 γενικά ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για τέσσερις από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης (Α2780, OVCAR5, OVCAR8 και HOC8) σε σύγκριση με 3 % O

2 (Σχήμα 2). Η μόνη εξαίρεση που παρατηρήθηκε ήταν με κύτταρα HOC8 παρουσία της υψηλότερης συγκέντρωσης του ορού (10% ν /ν), όπου παρατηρήθηκε μια ασήμαντη επίδραση O

2-εξαρτώμενη ανάπτυξη (Σχήμα 2). Προφανώς η έλλειψη απάντησης σε Hoc8 προκύπτει από μια κυρίαρχη επιρροή του ορού, η οποία δεν παρατηρήθηκε με το Α2780, OVCAR5 και OVCAR8. Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών SKOV3 και HeyA8 με την αύξηση του O

2 συγκέντρωση έως 21%, ανεξάρτητα από τις συγκεντρώσεις ορού (Σχήμα 2). Η παρατηρούμενη εξαίρεση ήταν HeyA8 καλλιεργούνται κάτω του 2% ορού, η οποία έδειξε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στο 21% O

2 σε σύγκριση με 3% O

2 (

ρ

& lt? 0.001). Σε αντίθεση με την επίδραση των Ο

2 επίπεδα, η αύξηση της συγκέντρωσης του ορού οδήγησε σε μια ανάλογη αύξηση της ανάπτυξης του καρκίνου των ωοθηκών Α2780 κυτταρικές σειρές, OVCAR5 και OVCAR8 (

ρ

& lt? 10

– 5, Σχήμα 2). Η συγκέντρωση στον ορό είχε μια μέτρια επίδραση στην αύξηση της SKOV3 και HeyA8 (Σχήμα 2)? μια συγκέντρωση στον ορό μεταξύ 2 και 6% είχαν σημαντική επίδραση (

σ

& lt? 10

-5) σε SKOV3, ενώ η συγκέντρωση HeyA8 ορού μεταξύ 2 και 10% ορό είχαν τη μεγαλύτερη επίδραση στο 3% O

2 (

σ

& lt? 10

-5) (Σχήμα 2). Η αύξηση της συγκέντρωσης στον ορό από 6% έως 10% είχε μικρή επίδραση επί της ανάπτυξης HeyA8, SKOV3 και HOC8 (Σχήμα 2). Μαζί, φαίνεται ότι και οι δύο τα επίπεδα οξυγόνου και της συγκεντρώσεως του ορού επηρεάζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών, αλλά με ανεξάρτητο τρόπο. Όπως αναμενόταν από την εργασία από άλλους με πρωτογενή κύτταρα [4], παρατηρήσαμε ότι η πλειοψηφία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται μειωμένα πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος O

συγκέντρωση 2 σε σύγκριση με τις φυσιολογικές

συγκέντρωση O 2. Ωστόσο, δύο γραμμές κυττάρων δεν φαίνεται να έχει αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στο υψηλότερο (περιβάλλοντος) O

2 επίπεδα. Ως εκ τούτου, κατηγοριοποιούνται τα κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με βάση αυτές τις διαφορές, που είναι είτε O

2 ευαίσθητα (Α2780, OVCAR5, OVCAR8 και HOC8) ή αδρανείς (SKOV3 και HeyA8) (Σχήμα 2). Συνολικά, αυτές οι διαφορές υποδηλώνουν ανομοιογένεια στη ρύθμιση αποκρίσεων ανάπτυξης σε φυσιολογικές νύξεις από O

2 επίπεδα σε αυτές τις καλλιεργημένες κυτταρικές σειρές.

Ίσοι αριθμοί Α2780 ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων σπάρθηκαν σε cm τρυβλίο petri 10 και ήταν συνήθως διατηρηθεί κάτω από το 3% O

2 (φυσιολογικές) ή 21% O

2 (περιβάλλοντος). Η αύξηση του αριθμού των κυττάρων προσδιορίστηκε μετρώντας το χέρι μία φορά σε τρεις ημέρες, και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκαν και σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας γραμμική κλίμακα (στο γράφημα Α) και λογαριθμική κλίμακα (στο γράφημα Β).

Η

ωοθηκών κυτταρικές σειρές καρκίνου του καλλιεργήθηκαν υπό 3% ή 21% O

2 και η έκταση του πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκε μετά από 3 ημέρες ανάπτυξης (βλέπε τμήμα Υλικά και Μέθοδοι). Για κάθε κυτταρική σειρά, η επί τοις εκατό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά 3% O

2 (φως σκιασμένες ράβδοι) και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του ορού σε σύγκριση με τον πολλαπλασιασμό κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας ιστού που αποτελείται από 21% (περιβάλλοντος) O

2 (σκούρα σκιασμένες ράβδοι) και 10% FBS. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις τυπικές αποκλίσεις των μέσων και στατιστικά σημαντικές (με δοκιμασία Student t test) διαφορές στον πολλαπλασιασμό μεταξύ 3% και 21% O

2 για κάθε συγκέντρωση ορού υποδεικνύεται από έναν αστερίσκο [(*)

p

& lt? 0,05, (**)

σ

& lt? 0.001 και (***)

σ

& lt?. 0.0001]

Η

είναι πιθανό ότι η φαινομενική O

2 αναισθησία και οι διαφορές στον πολλαπλασιασμό προέκυψαν από διαφορές στο χρόνο διπλασιασμού από κάθε κυτταρική σειρά. Για παράδειγμα, εάν SKOV3 και HeyA8 (το Ο

2 αδρανείς κυτταρικές γραμμές) πολλαπλασιάζονται πιο αργά, O

2 μεταβολές που εξαρτώνται από τον πολλαπλασιασμό μπορεί να είναι πολύ ασήμαντο για να μετρηθούν. Ως εκ τούτου, μετρήσαμε την κυτταρική χρόνος διπλασιασμού για όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπό πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας ιστού (10% ορό και 21% O

2) τον χρόνο διπλασιασμού για όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών ήταν κάπως παρόμοια (& lt? 24 ώρες), εκτός για HOC8, το οποίο είχε ένα παρατεταμένο χρόνο διπλασιασμού περίπου 45,5 ± 4,9 ώρες (Πίνακας S1, και να δούμε Μέθοδοι S1). Ως εκ τούτου, οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών ήταν διαιρώντας με περίπου ίσο ρυθμό, και το ακαθάριστο διαφορά στο χρόνο διπλασιασμού είναι απίθανο να είναι ένας παράγοντας για τις παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ πολλαπλασιασμό κυτταρικών σειρών υπό διαφορετικές συνθήκες.

συσχετισμοί ευαισθησία Οξυγόνο με δυναμικές αλλαγές στο S και G2 φάσεις του κυτταρικού κύκλου

Λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορές στον πολλαπλασιασμό που παρατηρήθηκε για κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών που καλλιεργούνται υπό είτε 3% ή 21% O

2, εξετάσαμε αν O

συγκέντρωση 2 μεταβάλλει το προφίλ του κυτταρικού κύκλου από κάθε κυτταρική σειρά. Ανεξαρτήτως της συγκέντρωσης στον ορό, συγκρίνοντας 3% O

2 έως 21% O

2 είχε ως αποτέλεσμα μία σημαντική μείωση στο ποσοστό των κυττάρων που ήταν στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και τη σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση S (Πίνακας 1), η οποία αναμενόταν με βάση την προηγούμενη παρατηρήσεις που έγιναν με πρωτογενή κύτταρα [27]. Περαιτέρω, σε τρία από το Ο

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5 και OVCAR8) το ποσοστό του κυτταρικού πληθυσμού στην φάση G2 αυξήθηκε σημαντικά σε 21% O

2. Ωστόσο μια σημαντική αύξηση σε G2 δεν παρατηρήθηκε στο τέταρτο O

2 ευαίσθητος κυτταρική γραμμή, HOC8 (Πίνακας 1). Παρόμοια με HOC8, ο O

2 αναίσθητη κυτταρικές σειρές, SKOV3 και HeyA8, δεν εμφανίζει σημαντική μεταβολή στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου όταν καλλιεργείται κάτω από το 3% O

2 ή 21% O

2 (Πίνακας 1). Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές πολλαπλασιαστεί πιο αργά σε 21% O

2 σε σύγκριση με 3% O

2 παρά το γεγονός ότι μικρότερα ποσοστά του πληθυσμού των κυττάρων τους στο G1 και ένα αυξημένο ποσοστό σε S και G2, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα αυτά πρέπει να προχωρούν πιο αργά διαμέσου του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, για τους O

2 αναίσθητος κυτταρικές σειρές και HOC8 (με σημαντικά παρατεταμένο χρόνο διπλασιασμού), δεν παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε G2 όταν το Ο

2 επίπεδα αυξήθηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αν και οι φάσεις G1 και S του κυτταρικού κύκλου ανταποκρίνεται παρόμοια σε μεταβολές O

2 συγκέντρωση σε αμφότερα Ο

2 ευαίσθητες και μη ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές, είναι η φάση G2 του κυτταρικού κύκλου η οποία είναι δεν ανταποκρίνεται σε O

2 συγκέντρωση στα O

2 αναίσθητη κυτταρικές σειρές. Ως εκ τούτου, η διαφορά στην απόκριση του κυτταρικού κύκλου που παρατηρείται με τις εν λόγω κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να είναι στο επίπεδο της ρύθμισης κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου από G2 σε Μ φάση. Είναι επίσης δυνατόν ότι οι αλλαγές που παρατηρούνται με G2 και O

2 ευαισθησία σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου αντικατοπτρίζεται στην μιτωτική συστατικό του κυτταρικού κύκλου. Η παρατήρησή μας των μιτωτικών κυττάρων που υπάρχουν στο O

2 ευαίσθητες και μη ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές καλλιεργούνται κάτω από 3% και 21% O

2 υποστηρίζει το συμπέρασμα αυτό? ο O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν ανάλογη μείωση στο μιτωτικό κυτταρικό πληθυσμό παρατηρήθηκε σε 21% O

2 σε σύγκριση με 3% O

2, (Σχήμα 3), που αντιστοιχεί σε μια συσσώρευση των κυττάρων στο G2 κατά 21% O

2 (Πίνακας 1). Παρομοίως, στις O

2 αναίσθητος κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) η αναλογία των μιτωτικών κυττάρων παρέμειναν αμετάβλητα ανεξάρτητα από O

2 συγκεντρώσεις (Σχήμα 3). Αυτό είναι αναμενόμενο διότι, όπως σημειώθηκε προηγουμένως (Πίνακας 1), η αναλογία των κυττάρων στο G2 στην O

2 αναίσθητος κυτταρικές σειρές ήταν επίσης ανεπηρέαστα από O

συγκέντρωση 2. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα διατηρούν την ικανότητα να ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο σε απόκριση στις μεταβολές O

2 συγκέντρωση συγκρίσιμη με κύτταρα άγριου τύπου [27]. Ωστόσο, ορισμένα καρκινικά κύτταρα μπορεί να χάσουν O

2 εξαρτάται από τη συγκέντρωση έλεγχος του κυτταρικού κύκλου (όπως στην O

2 αναίσθητος καρκινικές κυτταρικές σειρές), με αποτέλεσμα μια διακριτή φαινότυπο.

μιτωτικό δείκτη στην ωοθηκική καρκινικές κυτταρικές γραμμές που καλλιεργήθηκαν κάτω από 3% ή 21% O

2 για 3 ημέρες προσδιορίστηκαν μετρώντας πυρήνες με συνοπτικές χρωμοσώματα, μεταξύ των τουλάχιστον 1000 κυττάρων που υπάρχουν σε κάθε πείραμα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με ANOVA και τη σημαντική διαφορά στο μιτωτικό δείκτη μεταξύ 3% και 21% O

2 υποδηλώνεται με έναν αστερίσκο [(*)

ρ

& lt? 0,05, (***)

σ

& lt? 0.0001]

η

οξυγόνο αναισθησία συσχετίζεται με αλλοιωμένη G2 συστατικά /Μ

Έτσι τώρα έχουμε αποδείξει ότι Ξ

2. ευαίσθητη ανταπόκριση του κυτταρικού κύκλου στην G2 /M μετάβαση λείπει στα

2 αναίσθητη κυτταρικές σειρές O. Ως εκ τούτου, πήγε για να χαρακτηρίσουν αυτή την παρατήρηση περαιτέρω με τον προσδιορισμό του τι συνιστώσα του G2 /M ρύθμιση είναι ανεπαρκή στο O καρκίνος

2-αναίσθητη κύτταρα. Η κύρια τελεστή του G2 /M μετάπτωσης είναι CDC2 [22], [28]. CDC2 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με την κυκλίνη Β [29], [30], η οποία φωσφορυλιώνει διάφορες δομικές πρωτεΐνες με αποτέλεσμα την κατάρρευση του πυρηνικού φακέλου, τη συμπύκνωση και το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων [30], [31] και αδρανοποίηση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών άλλων κυτταρικού κύκλου, όπως όπως WEE1, RB και CDC25C [30], [32]. Σε φυσιολογικά κύτταρα, τα συνολικά επίπεδα CDC2 πρωτεΐνης διατηρείται σταθερή καθ ‘όλη τη κυτταρικού κύκλου [33] και ρυθμίζονται από μετα-μεταφραστική τροποποίηση [33] και την κυτταρική εντόπιση [30], [31]. Μόλις το υπόλειμμα Tyr15 επί CDC2 αποφωσφορυλιώνεται με CDC25C, ενεργοποιημένα CDC2 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με κυκλίνη Β, συσσωρεύεται στον πυρήνα, και προωθεί την G2 /M μετάπτωσης [30], [33], [34]. Αυτό συμβαίνει με σταδιακό τρόπο μέσω της αύξησης ποσότητες πρωτεΐνης πυρηνικής CDC2 [30]. Η μελέτη της συνολικής πρωτεΐνης CDC2 και φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη CDC2 αποκάλυψαν ότι και οι δύο είναι σημαντικά χαμηλότερη στην O

2-αναίσθητη κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) σε σύγκριση με τα O

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α). Αν και τα επίπεδα της CDC2 ήταν σχετικά υψηλός στην O

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5 και OVCAR8) (Σχήμα 2), παρατηρήσαμε μια μείωση στην Tyr15 κατάσταση φωσφορυλίωσης ανεξάρτητα από O

2 συγκέντρωσης για Α2780, OVCAR5 και OVCAR8 με την αύξηση των επιπέδων ορού (Εικόνα 4Α). Αυτό συσχετίζεται με την παρατήρηση ότι προκαλεί συγκέντρωση αύξηση στον ορό αυξήθηκε κυτταρικού πολλαπλασιασμού και έχει σαν αποτέλεσμα μια συνακόλουθη μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε G2 /M (σύγκρινε με τον Πίνακα 1). Ωστόσο, δεν έκδηλη O

2-εξαρτώμενη μεταβολή είτε ολική ή φωσφορυλιωμένη κυκλίνη Β ή CDC25C παρατηρήθηκε στην O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5, OVCAR8 και HOC8) σε σύγκριση με O

2 αδρανείς κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) (Σχήμα 4Α). Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι η παρατηρούμενη μείωση του πληθυσμού κυττάρων σε G2 σε 21% O

2 μπορεί να μην είναι εξαρτάται από την φωσφορυλίωση με μεσολάβηση αδρανοποίηση της CDC2. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ασύγχρονα αναπτυσσόμενα κύτταρα, και ως εκ τούτου είναι πιθανό ότι παροδικές διαφορές στην κατάσταση CDC2 είχαν χαθεί. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα CDC2, κυκλίνη Β και Cdc25C (ο αρνητικός ρυθμιστής του CDC2) ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε O

2 αναίσθητος κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) σε σύγκριση με O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5, OVCAR8 και HOC8) (Σχήμα 4Α). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έναν εγγενή ανεπάρκεια των βασικών στοιχείων που συμμετέχουν στην εξέλιξη G2 /M στο O

2 αναίσθητος κυτταρικές σειρές.

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάζονται από τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών διατηρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που αποτελείται από την αύξηση της οι συγκεντρώσεις του ορού και 21% ή 3% O

2 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (Α) Σε σύγκριση με O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, μειωμένη έκφραση των βασικών στοιχείων που συμμετέχουν στην G2 /M του κυτταρικού κύκλου εξέλιξης CDC2 /σύμπλοκο κυκλίνης Β1 και ενεργοποιητή cdc25C του παρατηρείται στην O

2 αναίσθητος κυτταρικές γραμμές ( υποδεικνύονται με αστερίσκο και πλάγια γράμματα), ενώ η έκφραση του 14-3-3 σ, μια πρωτεΐνη που αναστέλλει CDC2 είναι αυξημένη στους O

2 αναίσθητος κυτταρικές γραμμές. (Β) Η φωσφορυλίωση των RB και Wee1 παρακολουθήθηκαν ως δείκτης για τη λειτουργία CDC2, διότι τόσο RB και Wee1 είναι γνωστοί στόχοι για φωσφορυλίωση από CDC2. Ίση φόρτωση των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης παρακολουθήθηκαν ανιχνεύοντας τα απογυμνώνεται κηλίδες Western με το πρωτογενές αντίσωμα για β-ακτίνη.

Η

ρ53, ρ21 και 14-3-3 σ είναι παράγοντες που έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν αρνητικά δραστηριότητα CDC2 και G2 /M μετάπτωσης [22]. Η τρέχουσα αντίληψη είναι ότι η ρ53 και η επιρροή ρ21 του κυτταρικού κύκλου σε υποξικές και υπεροξικές συνθήκες [23], [24], [35], [36]. Λαμβάνοντας υπόψη τα μειωμένα επίπεδα των CDC2 και το φαινομενικά ελαττωματικό G2 /M σημείο ελέγχου στο O

2 ευαίσθητο κυτταρικές σειρές (HeyA8 και SKOV3), θα διερευνηθεί το ενδεχόμενο απομείωσης οφείλεται σε ελάττωμα σε οποιοδήποτε από αυτά τα μοριακά ρυθμιστικών αρχών. Η ανάλυση στυπώματος Western βρέθηκε ρ53 και ρ21 να υπερεκφράζεται σε ένα O

2-αναίσθητη κυτταρική γραμμή (HeyA8). Ωστόσο, και οι δύο ήταν απούσα στο άλλο O

2-αναίσθητη κυτταρική γραμμή (SKOV3), και το πρότυπο έκφρασης για τις πρωτεΐνες αυτές παρέμειναν αμετάβλητα ανεξάρτητα από τις αλλαγές σε O

2 ή συγκέντρωση στον ορό (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι ούτε p53 p21 ούτε είναι σχετικό με τη λειτουργία CDC2 σε O

2 ευαισθησίας. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια σημαντική ανύψωση στην έκφραση του 14-3-3 σ (Σχήμα 4Α) στο O

2 αναίσθητος κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) σε σύγκριση με τα O

2-ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές. Παρά το γεγονός ότι, το επίπεδο της έκφρασης 14-3-3 σ ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όλες O

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με HeyA8 και SKOV3, δεν είχαμε παρατηρήσει μια αύξηση στην έκφραση της 14-3-3 σ στο 21% O

2 με Α2780 (Εικόνα 4Α). Αν και αντιφατική με το γνωστό ανασταλτικό ρόλο της 14-3-3 σ για τη δραστηριότητα CDC2, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα υψηλά επίπεδα της 14-3-3 σ συνδυασμό με μειωμένα επίπεδα της CDC2 σε ένα καρκινικό κύτταρο πολλαπλασιαζόμενο μπορεί να υποδηλώνει μια έλλειψη ελέγχου των G2 /Μ εξέλιξη σε απόκριση O

2 επίπεδα.

για να διευκρινιστεί η συνέπεια των χαμηλών επιπέδων CDC2 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στις O

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές, προσδιορίσαμε την λειτουργική δραστηριότητα του υπόλοιπου CDC2 εξετάζοντας την φωσφορυλίωση των δύο υποστρωμάτων του, RB και WEE1. Η φωσφορυλίωση του RB στη Ser 807 κατάλοιπο διαμεσολαβείται από CDC2 [32], και παρατηρήσαμε αυτή τη φωσφορυλίωση ανεξάρτητα από τα επίπεδα CDC2 ή O

2 επίπεδα με ορό 10% για όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός HOC8 (Σχήμα 4Β), δεικνύοντας άριστης CDC2 δραστικότητα σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Μια μείωση στη φωσφορυλιωμένη RB συσχετίζεται με μείωση της συγκέντρωσης στον ορό (Σχήμα 4Β) και συσχετίζεται με αυξημένη συσσώρευση του συνόλου RB στην O

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5 και OVCAR8), αλλά όχι σε HOC8 (Σχήμα 4Β) . Σύνολο RB ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στα O

2-αναίσθητη κυτταρικές γραμμές (HeyA8 και SKOV3) (Σχήμα 4Β), με την εξαίρεση του 2% ορό κατά 3% O

2 κατάσταση στην κυτταρική γραμμή HeyA8. Είναι ενδιαφέρον ότι, από τη σύγκριση μεταξύ του προτύπου RB έκφραση (Σχήμα 4Β) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2) απεκάλυψε ότι HOC8, HeyA8 και SKOV3 κύτταρα αναπτύσσονται καλύτερα σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας με μια χαμηλή συγκέντρωση ορού (2%) σε σύγκριση με Α2780, OVCAR5 και OVCAR8. Επομένως, φαίνεται ότι η συνολική ανταπόκριση επίπεδο πρωτεΐνης RB παραμένει ανέπαφη σε

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές O και ότι αυτή η απάντηση είναι ίσως πιο σχετική με τις συγκεντρώσεις στον ορό από O

2 επίπεδα. Ο άλλος στόχος για CDC2 μεσολάβηση αδρανοποίηση με φωσφορυλίωση είναι WEE1, η οποία μπορεί επίσης αμοιβαίως αναστείλει την λειτουργία CDC2 με φωσφορυλίωση [37]. Παρατηρήσαμε αυξημένη φωσφορυλίωση του WEE1 στην O

2 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5 και OVCAR8), μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα σε HOC8, (Σχήμα 4Β) και μια πλήρης απουσία των O

κυττάρου 2-insensitive γραμμές ( HeyA8 και SKOV3, Σχήμα 4Β). Αυτό το μοτίβο ήταν σε μεγάλο βαθμό ανακεφαλαιώνονται για τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης WEE1 (Σχήμα 4Β). Ως εκ τούτου, η απουσία φωσφο-WEE1 στους O

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές δεν υποδεικνύει την απουσία δραστηριότητας CDC2, αλλά μάλλον την απουσία του υποστρώματος WEE1. Από τα αποτελέσματα αυτά καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι, παρά τις μειωμένες ποσότητες CDC2 στην

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές O, CDC2 είναι λειτουργικά ενεργό και ανεμπόδιστη από τα αυξημένα επίπεδα της 14-3-3 σ. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι RB και CDC2 πράξη ένα πάνω στο άλλο για τη ρύθμιση κάθε άλλων λειτουργία [38], και το καθεστώς φωσφορυλίωσης του RB [26] ή CDC2 [39] θα μπορούσε να επηρεάσει E2F μεσολάβηση έκφραση των κυκλινών που είναι απαραίτητα για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Συνεπώς, λαμβάνοντας υπόψη αυτό το πολύπλοκο σχέση μεταξύ RB και CDC2, το πρότυπο φωσφορυλίωσης της RB είναι ανεπαρκής για να προβλέψουμε G2 /M πρόοδο.

Εν ολίγοις, η O

2-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Α2780, OVCAR5 και HOC8 ) έδειξε αυξημένη έκφραση του CDC2 και κυκλίνη Β συνδυάζεται με χαμηλό επίπεδο έκφρασης 14-3-3 σ. Αυτό υποδηλώνει ότι τα συστατικά του κυτταρικού κύκλου απαιτείται για μια δυναμική πολλαπλασιαστική απόκριση σε διαφορές στην O

συγκέντρωση 2 είναι παρούσα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, στην O

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλά επίπεδα της 14-3-3 σ και τα χαμηλά επίπεδα της CDC2 και CDC25C μια τέτοια δυναμική απόκριση του κυτταρικού κύκλου με τις αλλαγές στην O

2 συγκέντρωση θα μπορούσε να έχει απομειωθεί. Ως εκ τούτου, επιδιώκεται η πιθανότητα ότι αυτό αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ 14-3-3 σ και CDC2 θα μπορούσε να είναι σημαντική για την O

2-ευαίσθητη ρύθμιση της G2 /M μετάπτωσης.

14-3-3 σ και μιτωτική πρόοδο στην ευαισθησία οξυγόνου

προηγούμενες παρατηρήσεις μας δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ αυξημένα επίπεδα της 14-3-3 σ και Ο

2-αναισθησία που πρέπει να επιβεβαιωθεί. Ως εκ τούτου, θα θέλαμε να επιβεβαιώσουμε ότι 14-3-3 σ επηρεάζει πράγματι O

2-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό. Για αυτό το μέρος της μελέτης, μπορούμε περιορίζεται ανάλυσή μας σε δύο κυτταρικές σειρές με άγριου τύπου ρ53: ο O

2-ευαίσθητο Α2780 [40], και Ο

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές HeyA8 [41]. Μέχρι στιγμής έχουμε χρησιμοποιήσει ανάλυση Western blot να παρακολουθεί τα συνολικά επίπεδα έκφρασης 14-3-3 σ και CDC2 (Εικόνα 4Α). Ωστόσο, δεδομένου ότι οι λειτουργικές αποκρίσεις αυτών των πρωτεϊνών εξαρτώνται από τον κυτταρικό εντοπισμό τους, θα χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό ανοσοφθορισμού κυτταρική θέση τους κάτω από το 3% O

2 και 21% O

2. Στο O

2-ευαίσθητη Α2780 κυτταρική γραμμή, ο εντοπισμός της 14-3-3 σ περιορίστηκε στο κυτόπλασμα κάτω του 3% O

2 (Σχήμα 5Α), αλλά βρέθηκε τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα σε 21% O

2 (Σχήμα 5Α). CDC2 διανεμήθηκε σε όλο το κύτταρο και τον εντοπισμό της ήταν ανεπηρέαστες από O

συγκέντρωση 2. Φαίνεται επομένως ότι η πυρηνική αποκλεισμός της 14-3-3 σ συσχετίζεται με μειωμένο κλάσμα των κυττάρων στην G2 /M φάση και μία ανεμπόδιστη πορεία του κυτταρικού κύκλου όταν Α2780 αναπτύσσεται σε 3% O

2, όπως σημειώθηκε πριν (πίνακας 1). Σε αντίθεση, η O

2-αναίσθητη HeyA8 κυτταρική γραμμή έδειξαν υψηλά επίπεδα της 14-3-3 σ και χαμηλά επίπεδα CDC2 (Σχήμα 4Α), με σημαντική ποσότητα 14-3-3 σ στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 5Α). Περαιτέρω, 14-3-3 σ παρέμεινε αποκλείονται από τον πυρήνα ακόμη και στο 21% O

2 στην HeyA8 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Οι παρατηρήσεις αυτές περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western των κλασμάτων πυρηνικών και κυτοσολικού κυττάρων που λαμβάνονται από αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 5Β). Τέλος, για να επιβεβαιώσει την επίδραση στην G2 /M μετάπτωσης, προσδιορίσαμε το ποσοστό αυτών των κυττάρων στη φάση Μ για διαφορετικές O

2 συγκεντρώσεις χρησιμοποιώντας τη μίτωση ειδικό δείκτη φωσφο-ιστόνης Η3. Στα κύτταρα O Α2780

2-ευαίσθητα, κάτω των 21% O

2, παρατηρήσαμε μια μείωση στην μιτωτικός δείκτης (Ρ & lt? 0.001), σε σύγκριση με 3% O

2 (Σχήμα 5C). Καμία τέτοια O

2-εξαρτώμενη αλλαγή στο μιτωτικό δείκτη παρατηρήθηκε για τα O

2-αναίσθητη κύτταρα HeyA8 (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την αρχική μας συμπέρασμα, ότι οι O

2-αναίσθητη κυτταρικές σειρές έχουν μια ανεπάρκεια στην ρύθμιση πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M σε απόκριση στην αυξημένη O

2 επίπεδα (Σχήμα 2).

(Α) Κυτταρικός εντοπισμός με ανοσοφθορισμό δείχνει ότι 14-3-3 σ (Πράσινο) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και CDC2 (Κόκκινο) είναι παρόν στον πυρήνα (Μπλε). Σε σύγκριση με O

2 ευαίσθητα κύτταρα Α2780, το επίπεδο της 14-3-3 σ είναι υψηλότερος και CDC2 είναι χαμηλή στους O

2 αναίσθητη κύτταρα HeyA8. Στο O

2 ευαίσθητο Α2780, 14-3-3 σ εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα στο 21% O

2. (Μια διακεκομμένη κίτρινη γραμμή, περιγράφει μια αντιπροσωπευτική πυρήνες να αναφέρει σχετική εντοπισμό των 14-3-3 σ και CDC2 σε αυτά τα κύτταρα). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των πυρηνικών και κυτταροπλασματικά κλάσματα παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα 14-3-3 σ στον πυρήνα σε σύγκριση με κυτταρόπλασμα, με αυξημένες ποσότητες 14-3-3 σ είναι παρόν στο κυτταρόπλασμα του O

2 αναίσθητη κύτταρα HeyA8. Το επίπεδο CDC2 είναι υψηλότερο τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα του O

2 ευαίσθητο Α2780, αλλά υπάρχουν σε χαμηλότερο ποσό μόνο στον πυρήνα του O

2 αναίσθητος κύτταρα HeyA8. Η ιστόνη Η1 και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης για τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, αντίστοιχα. (Γ) Οι μιτωτικές κύτταρα προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά για ένα συγκεκριμένο δείκτη μίτωσης, φωσφο-ιστόνης Η3 από το συνολικό πληθυσμό κυττάρων. (ΝΤΟ). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.