Αφηρημένο

Ιστορικό

Παθολογικό παίζει αγγειογένεση ένα ουσιαστικό ρόλο στην επιθετικότητα του όγκου και οδηγεί σε δυσμενή πρόγνωση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ανιχνεύει την εν δυνάμει ρόλο της πρωτεΐνης που δεσμεύεται με ρετινοβλάστωμα 2 (RBP2) στην αγγειογένεση των όγκων του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC).

Μέθοδοι

Η ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της έκφρασης της RBP2, υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και CD34. Δύο ζευγάρια αλληλουχιών siRNA και pcDNA3-ΗΑ-RBP2 χρησιμοποιήθηκαν για να μειορυθμίζουν και up-ρυθμίζουν την έκφραση RBP2 σε H1975 και SK-MES-1 κύτταρα. Μια δοκιμασία σχηματισμού ενδοθηλιακού σωλήνα, ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία VEGF, σε πραγματικό χρόνο PCR και κηλίδωση Western διεξήχθησαν για ανίχνευση των πιθανών μηχανισμών που προκαλούνται από RBP2 στην αγγειογένεση των όγκων.

Αποτελέσματα

Από το 102 σταδίου Ι δείγματα NSCLC που αναλύθηκαν, η έκφραση της πρωτεΐνης υψηλής RBP2 συνδέεται στενά με το μέγεθος του όγκου (Ρ = 0,030), η υψηλή HIF-1α έκφρασης (Ρ = 0,028), η έκφραση υψηλού VEGF (Ρ = 0,048), αυξημένη αγγειογένεση όγκου (Ρ = 0.033 ) και κακή πρόγνωση (P = 0,037)? υψηλή MVD συσχετίστηκε με υψηλή HIF-1α έκφρασης (Ρ = 0,034), η έκφραση υψηλού VEGF (Ρ = 0,001) και κακή πρόγνωση (Ρ = 0,040). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι RBP2 είχε ανεξάρτητη επίδραση στην επιβίωση των ασθενών με NSCLC σταδίου Ι (P = 0,044). Με ρύθμιση της έκφρασης του RBP2, τα ευρήματά μας πρότεινε ότι η εξάντληση πρωτεΐνη RBP2 μειωμένο σχηματισμό σωλήνα HUVECs μειορρυθμίζοντας VEGF σε ένα ρυθμισμένο μέσο. RBP2 τόνωσε την αυξητική ρύθμιση του VEGF, η οποία εξαρτιόταν από HIF-1α, και ενεργοποίησε τον HIF-1α μέσω φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι σηματοδότησης. Επιπλέον, ο VEGF αύξησε την ενεργοποίηση της Akt ρυθμίζεται από RBP2.

Συμπεράσματα

Ο RBP2 πρωτεΐνη μπορεί να διεγείρει την έκφραση του HIF-1α, μέσω της ενεργοποίησης του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι υπό νορμοξία σηματοδότησης και, στη συνέχεια, διεγείρουν VEGF έκφραση. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι RBP2 μπορεί να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση των όγκων και να χρησιμεύσει ως ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο κατά της επιθετικότητας του όγκου σε ασθενείς με NSCLC σε πρώιμα στάδια

Παράθεση:. Qi L, Zhu F, Li Sh, Si Lb, Hu Λουκ, Tian η (2014) ρετινοβλάστωμα Δεσμευτική πρωτεΐνη 2 (RBP2) Προωθεί HIF-1α-VEGF-αγγειογένεσης επαγόμενης από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μέσω της AKT οδό. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10.1371 /journal.pone.0106032

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Απρίλη, 2014? Αποδεκτές: 27 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου, 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30571844), το Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Ανάπτυξης της επαρχίας Shandong (Όχι . 2009GG10002007), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong (Νο ZR2009CM090). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι από τις πιο κοινές κακοήθειες που οδήγησαν στο θάνατο του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις πολυάριθμες βελτιώσεις στις χειρουργικές τεχνικές και επικουρική χημειοραδιοθεραπεία για NSCLC κατά τις τελευταίες δεκαετίες, η πρόγνωση παραμένει σχετικά χαμηλή [2]. Μία ποικιλία νέων μοριακών δεικτών και των πιθανών νέων στόχων έχουν βρεθεί για τη θεραπεία της νόσου. Ωστόσο, η εξέλιξη του όγκου είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων και ο μοριακός μηχανισμός υποκείμενο πνεύμονα καρκινογένεση είναι σε μεγάλο βαθμό ασαφής.

Η παθολογική αγγειογένεση είναι ένα σχετικά πρώιμο συμβάν στην καρκινογένεση, και αυξημένη αγγειογένεση όγκου συσχετίζεται με διηθητική ανάπτυξη και μετάσταση όγκου και κακή πρόγνωση [3], [4]. Έχει προταθεί ότι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α) παίζουν κρίσιμους ρόλους στην αγγειογένεση των όγκων. VEGF, η οποία είναι η πιο εκτεταμένα χαρακτηριζόμενη ενδοθηλιακού κυττάρου-ειδικό αγγειογόνο παράγοντα, οδηγεί σε αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα και παίζει σημαντικό ρόλο στην φυσιολογική και παθολογική αγγειογένεση [5], [6]. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν καταδείξει ότι η HIF-1α, μια ετεροδιμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από HIF-1α και HIF-1β υπομονάδες, συνδέεται με διάφορες πτυχές της κυτταρικής και φυσιολογική διαδικασία. Κάτω από νορμοξία, HIF-1α είναι προλυλ-υδροξυλιωμένη, ubiquitylated και υποβαθμισμένη σε πρωτεασώματα με σύνδεση προς το συγκρότημα νοη Hippel Lindau (VHL). Μετά τη σταθεροποίηση υποξία, HIF-1α δεσμεύεται με HIF-1β στον πυρήνα και εκκινεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων μέσω της υποξίας-αποκριτικού στοιχείου [7], [8], [9]. Τα τελευταία χρόνια, πολλές μελέτες έχουν προτείνει ότι HIF-1α επίσης, θα μπορούσε να οδηγήσει στην αυξημένη έκφραση διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται σε ποικίλες βιολογικές λειτουργίες υπό φυσιολογική οξυγόνωση, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση [10], [11].

ρετινοβλάστωμα δέσμευσης πρωτεΐνης 2 (RBP2), ένα μέλος της οικογένειας JARID πρωτεϊνών, είναι μια πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη με δραστηριότητα διμεθυλάση για λυσίνη 4 ιστόνης Η3 (Η3-Κ4) [12], [13], [14 ]. Φάνηκε ότι RBP2 ασκεί λειτουργία της εν μέρει από την καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση και ότι η σύνδεση με την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (pRB) μετατρέπει RBP2 από μεταγραφικό καταστολέα σε ένα μεταγραφικός ενεργοποιητής [15], [16]. Πρόσφατη έρευνα στον καρκίνο του πνεύμονα απέδειξε ότι RBP2 συσχετίζεται με τη μετανάστευση του όγκου και εισβολή από απευθείας σύνδεση με ιντεγκρίνης β1 (ITGB1) υποκινητές [17]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι RBP2 up-ρυθμίζει την έκφραση του Ν-καδερίνης και σαλιγκάρι μέσω της ενεργοποίησης της Akt σηματοδότησης [18]. Επιπλέον, ITGB1 και σηματοδότηση Akt συσχετίζονται σημαντικά με την αγγειογένεση του όγκου [19], [20], [21], [22]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια ογκογόνο ρόλο για RBP2 στην αγγειογένεση και την εξέλιξη του όγκου.

Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση RBP2 βρέθηκε να είναι αυξημένη σε κυτταρικές γραμμές NSCLC καθώς και στους ιστούς NSCLC από τους ασθενείς. Για να διερευνηθεί περαιτέρω τα πιθανά ρόλους των RBP2 στην αγγειογένεση των όγκων, παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία που δείχνουν ότι η έκφραση υψηλού RBP2 σε κυτταρικές σειρές NSCLC προάγει σημαντικά την αγγειογένεση όγκων και τη διαλεύκανση του μηχανισμού που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της Akt σηματοδότησης, επαγωγή της συσσώρευσης πρωτεΐνης HIF-1α και της έκφρασης του VEGF υπό φυσιολογική οξυγόνωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή για να δημοσιεύουν τις λεπτομέρειες περίπτωση, καθώς και η απόκτηση των δειγμάτων ιστού εκτελείται όπως καθορίζεται από τις οδηγίες του ιδρύματος.

Ασθενείς

Ένα σύνολο 102 ασθενών (71 άνδρες και 31 γυναίκες, μέσης ηλικίας 62 ± 3,56 χρόνια) με το στάδιο Ι NSCLC οι οποίοι υποβλήθηκαν σε πλήρη εκτομή του όγκου (λοβεκτομή ή πνευμονεκτομή) με περιφερειακές λεμφαδένων μεταξύ του Ιανουαρίου 2006 και του Δεκεμβρίου 2008 το Τμήμα Θωρακικής Χειρουργικής, Qilu Νοσοκομείο, συμπεριλήφθηκαν στην η μελέτη. Η ιστολογική εξέταση και ο βαθμός διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων έγιναν με βάση το σύστημα ταξινόμησης της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας αναθεωρήθηκε το 2004 και το σύστημα ΤΝΜ σταδιοποίηση της UICC 2009. Επιπλέον, 3 ασθενείς (2 περιπτώσεις με καρκίνο μεγάλου κυττάρου και 1 περιστατικό με τον καρκίνο αδενοχοληδωτό ) υποβλήθηκαν σε πλήρη εκτομή του όγκου κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου είχαν αποκλειστεί λόγω του πολύ μικρού μεγέθους του δείγματος. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών 102 παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για RBP2, HIF-1α, VEGF και CD34 πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης μέθοδος . Εν συντομία, 4-μm πάχους τομές κόπηκαν από τεμάχια εμπεδωθεί με παραφίνη, και τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον RBP2 (Bethyl, Montgomery, ΤΧ, USA, αραίωση 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, USA, αραίωση 1:100), VEGF (Α-20? Santa Cruz βιοτεχνολογίες, CA, USA, αραίωση 1:150) και CD34 (SC-19621? Santa Cruz βιοτεχνολογίες, CA, USA, αραίωση 1: 100) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκαν βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα και συζευγμένη με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη σύμπλοκο αντιδραστηρίου, ακολουθούμενη από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη Mayer του. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι περιλήφθηκαν σε κάθε βήμα. Η έκφραση της πρωτεΐνης RBP2 αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό ενός συνολική βαθμολογία ανοσοχρώση ως το προϊόν τόσο της βαθμολογίας ένταση (0, αρνητική χρώση? 1, ασθενής χρώση? 2, μέτρια χρώση? 3, ισχυρή χρώση) και σκορ ποσοστό (0, κανένας? 1, & lt? 10%? 2, 10-50%? 3, 51-80%? 4, & gt? 80%). Έτσι, η συνολική βαθμολογία κυμαίνεται από 0 έως 7. Οι ανοσοχρωματισμένες πλακίδια αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές με τυφλό τρόπο και επαναξιολογηθεί από αυτούς τους ερευνητές κάτω από ένα μικροσκόπιο multihead σε ασύμφωνα περιπτώσεις να επιτευχθεί συναίνεση. Για την αξιολόγηση της θετικής χρώσης RBP2, τουλάχιστον 3 τμήματα ή περιοχές από κάθε δείγμα μετρήθηκαν.

Για σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση ποσοτικοποίηση, την πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) αξιολογήθηκε μετρώντας CD34-θετικά ανοσοχρωματισμένη ενδοθηλιακά κύτταρα. CD34-θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και συστάδες των ενδοθηλιακών κυττάρων που είχαν διαχωρίζονται σαφώς από παρακείμενες μικροαγγείων μετρήθηκαν ως μετρήσιμα μικροαγγείων [23], [24], [25]. Για να ποσοτικοποιηθεί η MVD, πέντε εξαιρετικά αγγειακές περιοχές σαρώθηκαν σε χαμηλή ισχύ για τον εντοπισμό «θερμών σημείων» και μετρήθηκαν μικροσκοπικώς σε υψηλής ισχύος (200 × μεγέθυνση) πεδία. Ο μέσος αριθμός των δέκα πεδία όραμα καταγράφηκε ως το τελικό MVD (δύο παρατηρητές και πέντε αγγειακή hot spots καθένα).

Η τιμή αποκοπής για RBP2 και έκφραση MVD προσδιορίστηκε με βάση την αξία της ετερογένειας μετριέται μέσα από ένα ημερολόγιο rank στατιστική ανάλυση σε σχέση με τη συνολική επιβίωση [26]. Το τελικό σκορ χρώση των 4 επιλέχθηκε ως σημείο αποκοπής για την διάκριση μεταξύ υψηλής και χαμηλής έκφρασης RBP2. Ως εκ τούτου, οι όγκοι με τελικό σκορ χρώση ≥4 ορίστηκαν ως υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη RBP2. Όγκους με μικροαγγείων ≥57 είχαν χαρακτηριστεί ως υψηλού MVD? όγκους με μικροαγγείων & lt? 57 είχαν ταξινομηθεί ως χαμηλή MVD. HIF-1α θεωρήθηκε υπερεκφράζεται όταν & gt? 1% των πυρήνων ήταν θετικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Όγκοι με τελικό σκορ χρώση ≥3 ορίστηκαν ως υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη VEGF [28].

κυτταρικές σειρές, συνθήκες καλλιέργειας, Επιμόλυνση και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA Θεραπεία

Το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 , SPCA-1 και H1975 αγοράστηκαν από το National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA). Το ανθρώπινο πνεύμονα πλακωδών κυττάρων γραμμή SK-MES-1 και η ανθρώπινη βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή BEAS2B ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Οι BEAS2B, Α549, SPCA-1 και H1975 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Memorial Institute Πάρκο Roswell του (RPMI) 1640 (Hyclone, Logan, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Gibco, Gaithersburg, USA). Τα SK-MES-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 20% FBS. HUVECs καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης ενδοθηλιακού κυττάρου Μ199 συμπληρωμένο με 15% FBS, 1 mg /ml συμπληρώματα ανάπτυξης χαμηλών ορό και 2 mM γλουταμίνη. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C. RBP2 υπερεκφράζεται χρησιμοποιώντας pcDNA3-ΗΑ-RBP2, μια γενναιόδωρη δωρεά από W.G Καείίη [12], και siRNA για RBP2 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Το πλασμίδιο pcDNA3-ΗΑ-HIF-1α αγοράστηκε από Addgene (πλασμίδιο 18949) [29], και siRNA για HIF-1α (ONTARGET συν SMART πισίνα, L-004018) αγοράστηκε από την Dharmacon RNA Technologies (Chicago, IL, USA) . Το πλασμίδιο pcDNA3 Myr ΗΑ Akt1 αγοράστηκε από Addgene (πλασμίδιο 9008) [30]. Για το μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) κατεργασία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (3.0 χ 10

5 /φρεάτιο) όλη τη νύκτα και στη συνέχεια διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι ακόλουθες αλληλουχίες siRNA χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: RBP2 siRNA1 5′-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ‘? RBP2 siRNA2 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ‘? ελέγχου siRNA 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 ‘.

Προετοιμασία του ρυθμισμένου μέσου

Τα κύτταρα κύτταρα RBP2-siRNA1 H1975, τα κύτταρα και RBP2-siRNA2 H1975 ελέγχου siRNA H1975 καλλιεργήθηκαν κάτω από ελεύθερο ορού συνθήκες σε μέσο RPMI 1640 για 24 ώρες, αντίστοιχα. Το υπερκείμενο ακολούθως συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε, διηθήθηκε μέσω φίλτρου 0,22-mm (Millipore, Billerica, USA) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμασία ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) και ο σχηματισμός σωλήνα.

ενδοθηλιακών κυττάρων Tube δοκιμασία σχηματισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Εν συντομία, HUVECs (1 × 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων επικαλύπτονται με Matrigel (50 μΙ) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα για τον πολυμερισμό. HUVECs (1 × 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πηγάδια με διαφορετικά προσαρμοσμένα μέσα από κύτταρα RBP2-siRNA1 H1975, τα κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975 και τα κύτταρα ελέγχου siRNA H1975. Ένας αναστολέας VEGFR (sunitinib μηλικό, 2,5 μΜ) [32] προστέθηκε στο ρυθμισμένο μέσο του μάρτυρα κυττάρων siRNA H1975 και ανασυνδυασμένο ανθρώπινο VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA, 2 ng /ml) προστέθηκε σε το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων RBP2-siRNA2 H1975. Οι πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν για 6 ώρες, και ο σχηματισμός σωλήνας έπειτα φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Η ικανότητα σχηματισμού σωλήνα ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας τον συνολικό αριθμό των πλήρων σωλήνων, και ο μέσος όρος των τριών τυχαίων × 200 πεδία ανά φρέαρ καταγράφηκε ως η τιμή ανά φρεάτιο.

VEGF Enzyme-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

τα επίπεδα του VEGF στα διάφορα ρυθμισμένα μέσα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη Labsystems Multiscan. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με μετρήσεις εις τριπλούν σε κάθε πείραμα.

SDS-PAGE και κηλίδωση Western

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως. Ίσες ποσότητες (20 μg) της πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ανάλυση SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια RBP2 (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, USA), ο HIF-1α (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ , USA), VEGF (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA), Akt και φωσφο-Akt (Ser-473) (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, USA). LY294002 αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Haimen, Κίνα). Οι ζώνες της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας μέθοδο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Η πυκνότητα οπτική ζώνη ποσοτικοποιήθηκε (Imager της Alpha Corporation, San Leandro).

RNA Extraction, αντίστροφη-μεταγραφή Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Ολικό κυτταρικό RNA στα κύτταρα από διάφορες επεξεργασίες εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε με SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (QRT-PCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix (Bio-Rad) για HIF-1α και VEGF σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα του HIF-1α και RNA του VEGF αγγελιοφόρου (mRNA) κανονικοποιήθηκαν με το επίπεδο έκφρασης ανθρώπινης β-ακτίνης και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την

2 (- ΔΔCT) μέθοδος [33]. Οι εκκινητές για HIF-1α ήταν 5′-TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG-3′ (αντίστροφο). Οι εκκινητές για τον VEGF ήταν 5’-ATCTTCAAGCCATCCTGTGTGC- 3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTC-3′ (αντίστροφο). Οι εκκινητές για β-ακτίνη ήταν 5’-GCATCCACGAAACTACCT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3’ (αντίστροφο). Οι συνθήκες των κύκλων είχαν ως εξής: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 s, 60 ° C για 30 s και 72 ° C για 15 s

Ακολουθήστε. -up

Όλοι οι ασθενείς εξιτήριο από το νοσοκομείο παρακολουθήθηκαν στα εξωτερικά ιατρεία κάθε 3 έως 6 μήνες. Η παρακολούθηση της αξιολόγησης των ασθενών αποτελείτο από τη φυσική εξέταση, εξετάσεις αίματος, αξονική τομογραφία, υπερηχογράφημα, ακτινογραφία θώρακος και βρογχοσκόπηση αν είναι απαραίτητο. Παρακολούθηση ολοκληρώθηκε σε όλους τους ασθενείς μέχρι τον Δεκέμβριο του 2013, και η μέση περίοδος παρακολούθησης ήταν 66 μήνες (εύρος: 16~96 μήνες).

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις εξετάστηκαν με τη χρήση SPSS 17.0 στατιστικό λογισμικό. Ποσοτικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD για κάθε ομάδα, και οι συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση t-test του Student. Chi-square τεστ έγιναν για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ RBP2, MVD και διάφορα κλινικοπαθολογική παράγοντες. Η συσχέτιση μεταξύ ενδοογκική MVD και τα επίπεδα πρωτεΐνης RBP2 αναλύθηκε με μη παραμετρική δοκιμή (Mann-Whitney U test). Ο χρόνος παρακολούθησης λογοκρίθηκε εάν ο ασθενής χάθηκε κατά την παρακολούθηση. Οι καμπύλες επιβίωσης σχεδιάζονται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. ανάλυση παλινδρόμησης Η πολυπαραγοντική Cox χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό σημαντικών ανεξάρτητων προγνωστικών παραγόντων.

P τιμές

υπολογίστηκαν από δύο-ουρά στατιστικά τεστ. Μια διαφορά θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

1. Συσχέτιση των πρωτεϊνών RBP2 και MVD με κλινικοπαθολογική παράγοντες

Ανοσοϊστοχημεία με RBP2 (Εικ. 1Α και η Εικ. 1Β) και HIF-1α (Εικ. 1 D και το Σχ. 1 Ε) αντισώματα παρουσίασαν θετική αντίδραση στον πυρήνα, και αντισώματα VEGF (Εικ. 1 F και Εικ. 1G) παρουσίασαν θετική αντίδραση στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. RBP2 ανιχνεύθηκε ως υπερεκφράζεται σε 52 (51%) του 102 δειγμάτων NSCLC σύμφωνα με τα προαναφερθέντα κριτήρια. Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης RBP2 και κλινικοπαθολογική παράγοντες που εξετάστηκαν από το chi-square test και τα δεδομένα μας έδειξαν ότι RBP2 υπερέκφραση συσχετίστηκε με το μέγεθος του όγκου (

P

= 0,030), υψηλή έκφραση του HIF-1α (

P

= 0,028) και υψηλή έκφραση του VEGF (

P

= 0,048). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία στατιστική σημασία στις σχέσεις μεταξύ της έκφρασης RBP2 και άλλα κλινικοπαθολογική μεταβλητές (

P

& gt? 0,05, Πίνακας 1) έκφραση της πρωτεΐνης υψηλής RBP2

(Α) σε καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων. ? (Β) υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης RBP2 σε αδενοκαρκίνωμα? (C) αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης RBP2 σε NSCLC? (D) έκφραση υψηλού HIF-1α σε καρκίνο πλακωδών κυττάρων? (Ε) υψηλής HIF-1α έκφραση πρωτεΐνης σε αδενοκαρκίνωμα? (F) υψηλή έκφραση VEGF σε καρκίνο πλακωδών κυττάρων? (G) υψηλής VEGF σε αδενοκαρκίνωμα? (H) υψηλής έκφρασης CD34 σε καρκίνο πλακωδών κυττάρων? (Ι) υψηλής έκφρασης CD34 σε αδενοκαρκίνωμα.

Η

Η ενδονεοπλασματική MVD ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας CD34-θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα στην ίδια σειρά των ιστών καρκίνου του πνεύμονα (Εικ. 1 και το Σχ. 1Ι), και η μέση αριθμός μικροαγγείων σε δέκα πεδία μετρήθηκε σαν μέτρο της MVD για κάθε δείγμα. Ο μέσος αριθμός των μικροαγγείων των MVD σε κάθε δείγμα όγκου κυμαινόταν ευρέως, από 6.4 έως 102. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, οι όγκοι με μικροαγγείων ≥57 ταξινομήθηκαν ως υψηλή MVD, και 46 περιπτώσεις (45,1%) παρουσίασαν υψηλό MVD. Η chi-square test έδειξαν ότι οι υψηλές MVD συσχετίστηκε με υψηλή έκφραση του HIF-1α (

P

= 0,034) και έκφραση υψηλής VEGF (

P

= 0.001), αλλά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ MVD και άλλων κλινικοπαθολογική παραγόντων (

P

& gt? 0,05, Πίνακας 1).

Ανοσοϊστοχημική χρώση των διαδοχικών τομών ιστών του καρκίνου έδειξε ότι η διάμεσος MVD ήταν 59.6 στην ομάδα έκφραση υψηλού RBP2 (7,8 να 102) και 35.4 στην ομάδα χαμηλής RBP2 έκφραση (6,4 έως 94),. Επιπλέον, η στατιστική ανάλυση κατέδειξε μας ότι τα υψηλά MVD ανιχνεύθηκε συχνότερα σε όγκους με πρωτεΐνη RBP2 υπερέκφραση σε σχέση με εκείνους χωρίς υπερέκφραση (

P

= 0,033, Mann-Whitney U test, Σχ. 2Α). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι RBP2 μπορεί να προωθήσει την παθολογική αγγειογένεση σε εξέλιξη NSCLC.

(Α) Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RBP2 και MVD στο στάδιο Ι NSCLC. NSCLC με έκφραση πρωτεΐνης υψηλής RBP2 έδειξε σημαντικά υψηλότερες ενδοογκική MVD από εκείνο με χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης RBP2 (

P

= 0,033, Mann-Whitney test U). (Β) κατά Kaplan-Meier καμπύλες της συνολικής επιβίωσης κατέδειξε ένα φτωχό συνολικό ποσοστό 5ετούς επιβίωσης σε ασθενείς με πρωτεΐνη RBP2 υπερέκφραση (53,8% έναντι 72,0%,

P

= 0.037). (C) Kaplan-Meier καμπύλες της συνολικής επιβίωσης κατέδειξε ένα φτωχό συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών σε ασθενείς με υψηλή MVD (52,2% έναντι 71,4%,

P

= 0,040).

Η

μια ανάλυση Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση έδειξε επίσης ένα φτωχό συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών σε ασθενείς με πρωτεΐνη RBP2 υπερέκφραση (53,8% έναντι 72,0%,

P

= 0.037? Εικ. 2Β) και υψηλή MVD ( 52,2% έναντι 71,4%,

P

= 0.040, Σχ. 2C). Όλα τα στατιστικά σημαντικές μεταβλητές που αξιολογούνται στην μονοπαραγοντική ανάλυση συμπεριλήφθηκαν σε ένα μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι μόνο RBP2 είχε ανεξάρτητη επίδραση στην επιβίωση των ασθενών με NSCLC σταδίου Ι (

P

= 0,044, Πίνακας 2).

Η

2. RBP2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC

Το επίπεδο πρωτεΐνης του RBP2 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκίνο των πνευμόνων κυτταρικές γραμμές SK-MES-1, Α549, SPCA-1 και H1975 σε σύγκριση με την ανθρώπινη βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή BEAS2B (Εικ. 3Α). Το επίπεδο έκφρασης των RBP2 σε H1975 κυττάρων ήταν υψηλότερη από ότι σε BEAS2B, SK-MES-1, SPCA-1 και κύτταρα Α549.

(Α) RBP2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές σειρές SK-MES-1 , Α549, SPCA-1 και H1975 σε σύγκριση με τα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα κυτταρική γραμμή BEAS2B. (Β) Επιπτώσεις της RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 και pcDNA3-ΗΑ-RBP2 για την έκφραση της πρωτεΐνης RBP2.

Η

Δύο κομμάτια siRNAs και pcDNA3-ΗΑ-RBP2 στόχευση RBP2 χρησιμοποιήθηκαν για ένα λειτουργικό ανάλυση σε H1975 και SK-MES-1 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RBP2-siRNA1 και RBP2-siRNA2 μπορούσε σημαντικά ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της πρωτεΐνης RBP2 σε H1975 κύτταρα. Επιπλέον, οι δύο siRNAs έδειξαν σχεδόν τα ίδια αποτελέσματα RNAi, ενώ ο αρνητικός siRNA ελέγχου δεν επηρέασε σημαντικά την έκφραση του RBP2. Εν τω μεταξύ, pcDNA3-ΗΑ-RBP2 σημαντικά up-ρύθμιση της έκφρασης του RBP2 σε SK-MES-1 κύτταρα, ενώ pcDNA3-ΗΑ δεν επηρέασε σημαντικά RBP2 έκφρασης. Ως εκ τούτου, επελέγησαν RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 και pcDNA3-ΗΑ-RBP2 να μελετήσει περαιτέρω τις λειτουργίες της πρωτεΐνης RBP2 in vitro.

3. Η εξάντληση της πρωτεΐνης RBP2 μειώνει το σχηματισμό σωλήνα HUVEC που προκαλείται από το εξαρτημένο μέσο

Για να αξιολογηθεί η λειτουργική σημασία της RBP2 στην αγγειογένεση του όγκου, RBP2 χτυπήθηκε κάτω σε κυτταρικές σειρές H1975. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο αριθμός των πλήρων σωλήνων που προκαλείται από το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων RBP2-siRNA1 H1975 (12.33 + 3.06) και κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975 (9,67 + 1,53) ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με αυτή του μάρτυρα κυττάρων siRNA H1975 (38,67 2.52, Σχήμα 4 Α-Δ,

P

& lt? 0,01)

δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα:.. (Α) κύτταρα ελέγχου-siRNA H1975? (Β) κύτταρα RBP2-siRNA1 H1975? κύτταρα (C) RBP2-siRNA2 H1975. (Δ) Ποσοτική ανάλυση του σχηματισμού σωλήνα με HUVECs που επάγεται από ρυθμισμένο μέσο? (Ε) προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτείνης RBP2 μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του VEGF σε ρυθμισμένα μέσα. (F) Ο σχηματισμός σωλήνα που διεγείρεται από το ρυθμισμένο μέσο ελέγχου κυττάρων siRNA H1975 εμποδίστηκε από τον αναστολέα VEGFR (sunitinib μηλικό, 2,5 μΜ). (G) Το μειωμένο σχηματισμό σωλήνα που επάγεται από το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων RBP2-siRNA2 H1975 διασώθηκε με την προσθήκη VEGF-165 (2 ng /ml).

Η

4. Κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών RBP2 μειώνει τα επίπεδα έκφρασης του VEGF σε ρυθμισμένο μέσο

Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι υψηλές MVD συσχετίστηκε με υψηλή έκφραση του VEGF (chi-square test,

P

= 0,001, Πίνακας 1), μπορούμε επόμενο διερεύνησε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων RBP2 και VEGF πρωτεΐνης στα ρυθμισμένα μέσα χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF στο ρυθμισμένο μέσο της RBP2-siRNA1 (0,99 ± 0,11 ng /ml) και RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975 κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA H1975 (1,87 ± 0,10 ng /ml), (Σχ 4Ε,

P

& lt?. 0.01). Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι ο σχηματισμός σωλήνα που διεγείρεται από το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων ελέγχου siRNA H1975 αποκλείστηκε με την προσθήκη ενός αναστολέα VEGFR (sunitinib μηλικό, 2,5 μΜ, 10,33 + 2,22,

P

& lt? . 0.01, Σχήμα 4F)? ο μειωμένος σχηματισμός σωλήνων που προκαλείται από το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων RBP2-siRNA2 H1975 διασώθηκε με την προσθήκη του VEGF-165 (2 ng /ml, 41,03 + 3,25,

P

& lt? 0,01, Σχήμα 4G.).

5. RBP2 διεγείρει HIF-1α και VEGF mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης

HIF-1α είναι ένας σημαντικός παράγοντας της μεταγραφής και παίζει κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση των όγκων. Επιπλέον, ο παράγοντας μεταγραφής HIF-1α ρυθμίζει το επίπεδο εκφράσεως διαφόρων γονιδίων υποξίας-απόκρισης, περιλαμβανομένων των VEGF [11]. Στην συνέχεια διερευνήσαμε εάν RBP2 μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του HIF-1α σε έκτοπη RBP2 εκφράζουν SK-MES-1 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η αναγκαστική έκφραση του RBP2 up-ρύθμιζε την έκφραση της πρωτεΐνης HIF-1α σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο κάτω από νορμοξικές συνθήκες, και η μέγιστη τιμή της έκφρασης HIF-1α εμφανίστηκε στις 36 ώρες μετά την επιμόλυνση διεξήχθη. Ωστόσο, ο HIF-1α ήταν ασταθής και αποικοδομείται από πρωτεασώματα υπό φυσιολογική οξυγόνωση [9], και τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι HIF-1α έκφραση μειώθηκε μετά την επιμόλυνση διεξήχθη 48 ώρες. Επομένως, για να διερευνηθεί η πιθανή ρύθμιση της αγγειογένεσης του όγκου με RBP2, εξετάσαμε την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής HIF-1α και VEGF σε RBP2 υπερεκφράζουν και -depleted NSCLC κύτταρα υπό φυσιολογική οξυγόνωση στις 36 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β και Σχ. 5C, η ρύθμιση προς τα κάτω του RBP2 σε H1975 κύτταρα οδήγησε στην μειωμένη έκφραση του HIF-1α και VEGF, ενώ έκτοπη έκφραση RBP2 σε SK-MES-1 κύτταρα με pcDNA3-ΗΑ-RBP2 οδήγησε στην ανοδική ρύθμιση του HIF-1α και VEGF.

(Α) RBP2 επάνω ρυθμισμένο το HIF-1α πρωτεΐνης σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο κάτω από νορμοξικές συνθήκες. (Β) Εξάντληση RBP2 μείωσε την έκφραση του HIF-1α και VEGF σε H1975 κύτταρα. (C) πάνω ρύθμιση RBP2 αύξησε την έκφραση του HIF-1α και VEGF σε SK-MES-1 κύτταρα. (D) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του HIF-1α και VEGF μειώθηκαν σημαντικά σε H1975 κύτταρα RBP2 εξαντλημένο σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. (Ε) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του HIF-1α και VEGF αυξήθηκαν σημαντικά σε RBP2 υπερεκφράζουν SK-MES-1 κύτταρα.

Η

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του HIF -1α (

P

siRNA1 = 0.006,

P

siRNA2 = 0.001) και VEGF (

P

siRNA1 = 0.000,

P

siRNA2 = 0.000) ήταν σημαντικά μειωμένη σε H1975 κύτταρα RBP2 εξαντλημένο. Επιπλέον, ο HIF-1α (

P

= 0,001) και VEGF (

P

= 0.000) αυξήθηκαν σε RBP2 υπερεκφράζουν SK-MES-1 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 5D και Το Σχ. 5Ε). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι RBP2 παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης του όγκου, μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση του HIF-1α και VEGF.

6. επαγωγή RBP2 του VEGF εξαρτάται από HIF-1α

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της RBP2 στη ρύθμιση του HIF-1α σε κύτταρα NSCLC, θα διαμορφωθεί η έκφραση του HIF-1α με επιμόλυνση κυττάρων με siRNA ειδικό κατά HIF-1α (SI -HIF-1α) και ένα πλασμίδιο pcDNA3-ΗΑ-HIF-1α, και αξιολόγησε την έκφραση του VEGF μετά από 36 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α και το Σχ. 6Β, knockdown έκφρασης HIF-1α σε έκτοπη 1 SK-MES-κύτταρα RBP2 εκφράζουν οδήγησε στην προς τα κάτω ρύθμιση των VEGF σε σύγκριση με το σκαρφάλωμα μη ειδικό siRNA ελέγχου? up-ρύθμιση της έκφρασης HIF-1α σε κύτταρα H1975 RBP2-εξαντλημένο οδήγησε στην ανοδική ρύθμιση του VEGF. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η RBP2 μεσολάβηση αγγειογένεσης όγκου των κυττάρων NSCLC μπορούσε εν μέρει να ρυθμίζονται μέσω της ενεργοποίησης του HIF-1α.

(Α) Μείωση του HIF-1α με siRNA ειδικό κατά HIF-1α σε RBP2- υπερεκφράζουν SK-MES-1 κύτταρα οδήγησε στην προς τα κάτω ρύθμιση των VEGF σε σύγκριση με το σκαρφάλωμα μη ειδικό έλεγχο siRNA. (Β) Up-ρύθμιση της έκφρασης HIF-1α σε κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975 οδήγησε στην ανοδική ρύθμιση του VEGF.

Η

7. RBP2 ενεργοποιεί HIF-1α μέσω του /Akt μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ

Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι RBP2 ρυθμίζει Ν-cadherin και σαλιγκάρι μέσω της ενεργοποίησης της Akt σηματοδότησης [18]. Επιπλέον, σύμφωνα με ορθοξικές συνθήκες, η έκφραση και η δραστικότητα του HIF-1α και οι επακόλουθες εκκρίνονται αγγειογόνοι παράγοντες για τον καρκίνο μπορεί να είναι ασυνήθιστα up-ρυθμίζονται από διαφορετικές οδούς σηματοδότησης [34], [35], [36] που περιλαμβάνουν Akt και κατάντη επενεργητές του [20], [22]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι RBP2 ρυθμίζει HIF-1α μέσω της ενεργοποίησης του Akt σηματοδότησης, και περαιτέρω επεδίωξε να ανιχνεύσει τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην σηματοδότηση RBP2 μεσολάβηση αγγειογένεσης όγκου. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι αποσιώπηση της έκφρασης RBP2 είτε με RBP2-siRNA1 ή RBP2-siRNA2 σε H1975 κύτταρα μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση της Akt, ενώ η αναγκαστική έκφραση RBP2 με pcDNA3-ΗΑ-RBP2 σε SK-MES-1 κύτταρα αύξησε τη δραστικότητα της Akt (Εικ. 7Α). Επιπλέον, όταν εκφράστηκε συστατικώς μια δραστική μορφή της Akt σε κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975, η έκφραση του HIF-1α και VEGF αυξήθηκαν σε σύγκριση με τον έλεγχο? η ΡΙ3Κ /Akt αναστολέα LY294002 ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του HIF-1α και VEGF σε pcDNA3-ΗΑ-RBP2 SK-MES-1 κύτταρα (Σχ. 7Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RBP2 προάγει αγγειογένεση όγκου μέσω της ενεργοποίησης της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σηματοδότησης σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

(Α) σίγαση της έκφρασης RBP2 σε H1975 κύτταρα μειώθηκε σημαντικά η φωσφορυλίωση της Akt, και η αναγκαστική έκφραση του RBP2 σε SK-MES-1 κύτταρα αύξησε την δραστικότητα της Akt. (Β) Όταν Akt ήταν μόνιμα ενεργοποιημένη σε RBP2-siRNA2 H1975, η έκφραση του HIF-1α και VEGF αυξήθηκαν σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ο αναστολέας LY294002 ΡΙ3Κ /Akt ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του HIF-1α και VEGF σε pcDNA3-ΗΑ-RBP2 SK-MES-1 κύτταρα. (Γ) Westernblots που δείχνει τη χρονική πορεία της φωσφορυλίωσης Akt σε κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975 λόγω VEGF-165 (25 ng /mL). (Δ) Με την παρουσία του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου διέγερση VEGF-165, η ενεργοποίηση της Akt αυξήθηκε σε κύτταρα RBP2-siRNA2 H1975 και RBP2 υπερεκφράζουν SK-MES-1 κύτταρα (25 ng /mL, 30 λεπτά).

VEGF έχει δειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής της Akt σε ορισμένες περιπτώσεις [37]. Είμαστε δίπλα διερευνηθεί αν VEGF θα μπορούσε να ενεργοποιήσει Akt. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, επεξεργασία των κυττάρων RBP2-siRNA2 H1975 με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη VEGF-165 (25 ng /mL) αύξησε την ενεργοποίηση του Akt μέσα σε 15 με 30 λεπτά. Όπως φαίνεται στο Σχ.