Αφηρημένο

Παρά τις παρενέργειες της, docetaxel (DTX) εξακολουθεί να αποτελεί θεραπεία πρώτης γραμμής κατά ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού (CRPC). Ως εκ τούτου, οι στρατηγικές για την αύξηση της αποτελεσματικότητας κατά του όγκου του και να μειώσει τις παρενέργειες του είναι κριτικά χρειάζεται. Στόχευση της συστατικής ενδοπλασματικού δικτύου (ER) στρες στα καρκινικά κύτταρα αποτελεί αντικείμενο έρευνας ως προσέγγιση χημειοευαισθητοποίηση. Υποθέσαμε ότι η ταυτόχρονη επαγωγή της ER-στρες και καταστολή της οδού επιβίωσης /AKT PI3K θα είναι μια πιο αποτελεσματική προσέγγιση. Σε μια CRPC κυτταρική γραμμή, C4-2B, παρατηρήσαμε σημαντική (ρ & lt? 0.005) ενίσχυση της DTX-επαγόμενης κυτταροτοξικότητας εξής coexposure να θαψιγαργίνη και ένα ΑΚΤ-αναστολέα. Ωστόσο, δεδομένου ότι αυτοί οι δύο παράγοντες δεν είναι κλινικά εγκεκριμένα, ερευνήσαμε αν ένας συνδυασμός νελφιναβίρη (NFR) και κουρκουμίνη (CUR), που είναι γνωστή για τη στόχευση και τις δύο αυτές μεταβολικές οδούς, μπορούν ομοίως να αυξήσει DTX κυτταροτοξικότητα σε CRPC κύτταρα. Μέσα σε 24 ώρες μετά την έκθεση σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις του NFR (5 μΜ) και CUR (5 μΜ) μία σημαντικά (ρ & lt? 0.005) ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα ήταν εμφανής με χαμηλή συγκέντρωση DTX (10 ηΜ). Αυτός ο συνδυασμός 3-φαρμάκου αυξήθηκε ταχέως απόπτωση σε επιθετικά κύτταρα C4-2B, αλλά όχι σε RWPE-1 κύτταρα ή στα επιθηλιακά κύτταρα πρωτογενή προστάτη (PrEC). Συγκριτικές μοριακές μελέτες αποκάλυψαν ότι ο συνδυασμός αυτός 3-φάρμακο προκάλεσε μια πιο έντονη καταστολή της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ-και υψηλότερες επαγωγή σε φωσφορυλιωμένη-eIF2α σε C4-2B κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα RWPE-1. Οξεία έκθεση (3-9 ώρες) σε αυτό το συνδυασμό 3-φάρμακο ενταθεί ER-στρες που προκαλείται από προ-αποπτωτικών δεικτών, δηλαδή ATF4, CHOP και TRIB3. Σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις, χρόνια (3 εβδ) ανοίγματα έναντι αυτών των τριών παραγόντων μείωσε δραστικά μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) από τα κύτταρα C4-2B.

In vivo

μελέτες με ποντικούς που περιέχει C4-2B ξενομοσχεύματα όγκου έδειξε σημαντική (ρ & lt? 0,05) αύξηση της DTX του (10 mg /kg) η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου εξής coexposure να NFR (20 mg /kg) & amp? CUR (100 mg /kg). Ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύσεις τμημάτων όγκου έδειξε μειωμένη χρώση Ki-67 και την αυξημένη ένταση TUNEL σε ποντίκια που εκτέθηκαν στο συνδυασμό 3-φάρμακο. Ως εκ τούτου, ανατρέποντας ER-στρες προς την απόπτωση χρησιμοποιώντας επικουρική θεραπεία με ΝΔΚ και CUR μπορεί chemosensitize τα CRPC κύτταρα να DTX θεραπεία

Παράθεση:. Mathur Α, Abd Elmageed ZY, Liu Χ, Kostochka ML, Zhang Η, Abdel- Mageed AB, et al. (2014) Ανατροπή ER-Stress προς την απόπτωση με νελφιναβίρη και κουρκουμίνη Coexposure Augments Docetaxel Αποτελεσματικότητα σε Ευνουχισμός ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10.1371 /journal.pone.0103109

Επιμέλεια: Allen Gao, UC Davis Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 12, Ιούν, 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίζονταν από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο άμυνας, σε DM (# PC080811) και να A.B.A. (# PC081598), και κονδύλια από την Λουιζιάνα Cancer Research Consortium (LCRC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους για τους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Η αρχική θεραπεία των εντοπισμένους όγκους αποτελείται από χειρουργική επέμβαση και ακτινοβολία, που ακολουθείται από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT). Ωστόσο, ADT είναι αποτελεσματική μόνο για ένα μέσο όρο 18-24 μήνες, και η υποτροπή του καρκίνου ανθεκτικού ευνουχισμού προστάτη (CRPC) υπαγορεύει νοσηρότητας και θνησιμότητας σε ασθενείς [1]. Παρά το γεγονός ότι τα νεότερα και πιο ισχυρές υποδοχέα (AR) ανταγωνιστές ανδρογόνων, π.χ. MDV-3100 (enzalutamide), έχουν δείξει κάποια υπόσχεση, η αντίσταση είναι ήδη αντιμετώπισε στην κλινική [2]. Ως εκ τούτου, η χημειοθεραπεία με ταξάνες παραμένει το φάρμακο επιλογής για ασθενείς με επιθετικό και μεταστατικό CRPCs. Ωστόσο, μια ασφαλής και αποτελεσματική στρατηγική για την αύξηση της αποτελεσματικότητας των ταξανίων αντιπροσωπεύει μια ανικανοποίητη κλινική ανάγκη.

docetaxel (DTX), ένα παράγοντα κατά των μικροσωληνίσκων, εγκρίθηκε από το FDA των ΗΠΑ ως θεραπεία στυλοβάτης κατά CRPC [3 ]. Αν και αρχικά αποτελεσματικές, DTX-based σχήμα έδειξε μόνο μια διάμεση επιβίωση των 18-20 μηνών και ποσοστό απόκρισης μόνο το 50%. Επιπλέον, DTX παρουσιάζει σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες σε ασθενείς με καταστάσεις συνοσηρότητας, το οποίο η μείωση της δόσης της εντολής που αυξάνει την πιθανότητα επιλογής ανθεκτικών κλώνων. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη αντοχής μετά από μακροχρόνια θεραπεία με DTX μπορεί να συμβεί λόγω της προς τα άνω ρύθμιση της PI3K σηματοδότησης /AKT στην CRPC κύτταρα [4], [5]. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση του PI3K /AKT σηματοδότησης στην CRPC κύτταρα θα πρέπει να αυξήσει την αποτελεσματικότητα αυτού του χημειοθεραπευτικού παράγοντα [6].

Επιθετική καρκινικά κύτταρα είναι επίσης ικανά να διαφεύγουν τη χημειοθεραπεία με τη διαμόρφωση κύρια ρυθμιστικά μονοπάτια που υπαγορεύουν την επιβίωση ή τον θάνατο απόφασή τους αποφάσεων ικανότητες. Από την άποψη αυτή, ο έλεγχος της πρωτεΐνης μετάφραση μέσω της εξαιρετικά ρυθμιζόμενη καταρράκτη ER-στρες έχει αποδειχθεί ότι προάγουν την επιβίωση των κυττάρων του όγκου και να ξεφύγουν από την απόπτωση [7]. Μια άμεση σύνδεση μεταξύ των επιθετικών φαινότυπο όγκου και αυξημένη έκφραση του δείκτη ER-στρες, ΒίΡ /Grp78, έχει τεκμηριωθεί [8] – [10]. Πράγματι, αρκετές πρόσφατες αναφορές έχουν αποδείξει ότι ER-στρες μπορεί να διευκολύνει την επίμονη αύξηση του όγκου και θεραπευτική αντοχή τους. Ως εκ τούτου, οι ερευνητές έχουν προτείνει ότι η στόχευση των ER-στρες μπορεί να είναι ένας ισχυρός χημειοευαισθητοποιητική στρατηγική [11] – [13]. Wu et al, (2009) έδειξαν ότι ο επαγωγέας ER-στρες methylseleninic οξύ (MSA) ευαισθητοποιεί κύτταρα PC-3 στην κυτταροτοξική δράση της πακλιταξέλης και DTX [11]. Φυσικές ενώσεις όπως επιγαλλοκατεχίνη, μια ένωση πολυφαινολικών στο πράσινο τσάι, μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα χημειοθεραπείας σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος με αύξηση ER-στρες [14]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της ταυτόχρονης κάτω ρύθμιση του PI3K /AKT οδό επιβίωσης και προς τα πάνω ρύθμιση της επαγόμενης ER-στρες απόπτωση ως ένα ισχυρό προσέγγιση χημειοευαισθητοποίηση δεν έχει δοκιμαστεί.

Οι μελέτες παρέχουν σαφείς ενδείξεις διασταυρούμενης συνομιλιών μεταξύ πολλαπλές οδούς μεταγωγής σήματος που ρυθμίζουν την τύχη του κυττάρου μετά την επαγωγή ER-στρες στα καρκινικά κύτταρα [7], [15] (ανατρέξτε στο Σχ. 1Α για μια λεπτομερή περιγραφή). Ένα ήπιο επίπεδο ER-στρες ενεργοποιεί μια απάντηση επιβίωσης που ονομάζεται ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη Ανταπόκριση (UPR). Ωστόσο, σοβαρή ER-στρες υπονομεύει αυτό το UPR για μια προ-αποπτωτικό μονοπάτι, το οποίο υπαγορεύεται από την έκφραση της επαγόμενης ER-στρες παράγοντες μεταγραφής ATF4 και CHOP, και την προκαλούμενη από ER-στρες TRIB3 αισθητήρα θάνατο. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπό ήπιες ER-στρες, χαμηλά επίπεδα TRIB3 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της ATF4 και CHOP που ευνοεί την επιβίωση των κυττάρων. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια σοβαρών ER-στρες, τα υψηλά επίπεδα ATF4 και CHOP αυξάνουν έκφραση TRIB3 και μια παράλληλη καταστολή της ΑΚΤ, η οποία ευνοεί την απόπτωση [16] – [18]. Ως εκ τούτου, TRIB3 φαίνεται να λειτουργεί ως κύριος «μοριακός διακόπτης» για επιβίωση

vs.

Σηματοδότησης θανάτου σε καρκινικά κύτταρα που υφίστανται ER-στρες (Εικ. 1Β). Έτσι, φαρμακολογικών παραγόντων που επάγουν υψηλά επίπεδα TRIB3 πρέπει ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπεία.

(Α). Υπό κανονικές ομοιοστατική συνθήκες, η ATF6, IRE1 και PERK πρωτεΐνες δεσμεύονται να ΣΣΕ /Grp78 στη μεμβράνη ER. Μια εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνης (UPR) απελευθερώνει αυτά τα μετατροπείς ER-στρες από την ΣΣΕ. Κυκλοφόρησε ATF6 μετατοπίζεται στον πυρήνα για να αυξήσει την έκφραση του γονιδίου XBP-1. Παράλληλη ενεργοποίηση IRE1 επιτρέπει μάτισμα XBP-1 mRNA, το οποίο κωδικοποιεί ένα παράγοντα μεταγραφής που διεγείρει διάφορες στρες διεγέρσιμο γονίδια. Κυκλοφόρησε PERK ενεργοποιεί eIF2α, η οποία στη συνέχεια αναστέλλει τη μετάφραση του καπακιού πρωτεΐνες που εξαρτώνται από την περαιτέρω προστασία των κυττάρων από UPR εξέλιξη. Έτσι, cross-συνομιλίες μεταξύ αυτών των μετατροπέων ER-στρες δρα μέσω παράλληλες πορείες για να διευκολύνει την επιβίωση των κυττάρων και την αποκατάσταση της κυτταρικής ομοιόστασης μετά από μια ήπια και παροδική ER-στρες. Ωστόσο, σύμφωνα με την παρατεταμένη ή σοβαρή ER-στρες, το καπάκι-ανεξάρτητη μετάφραση ATF4 συνεχίζεται. επιπέδων πυρηνικής ATF4 απορρύθμιση της κυτταρικής ομοιόστασης ενισχύοντας την έκφραση των αισθητήρων θανάτου ER-στρες, CHOP και TRIB3. (ΣΙ). TRIB3 ενεργεί ως «μοριακό διακόπτη» που υπαγορεύει τις αποφάσεις επιβίωση των κυττάρων ή κυτταρικό θάνατο μετά από ER-στρες. Τα χαμηλά επίπεδα των λειτουργιών TRIB3 μέσω αρνητικής ανάδρασης-βρόχο για να καταστείλει ATF4 και ψιλοκόψτε έκφρασης, επιτρέποντας έτσι την επιβίωση των κυττάρων (αριστερό πάνελ). Ωστόσο, τα υψηλά επίπεδα του TRIB3 ρυθμίζει προς τα κάτω την οδό επιβίωσης ΑΚΤ, αλλά δεν καταστέλλει ATF4 και CHOP που συνεχίζει να παράγει ανεξέλεγκτη επίπεδα TRIB3. Αυτή η ανισορροπία ανατρέπει τα UPR και ER-στρες απαντήσεις από μια κατάσταση επιβίωσης για την απόπτωση (δεξιά πλευρά).

Η

θαψιγαργίνη (Tg), ένα πολύ γνωστό επαγωγέα ER-στρες, μπορεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα PC-3 τόσο paclitaxel και DTX [11]. Επιπλέον, ο αναστολέας ΑΚΤ (ΑΚΤΗ-IV) μπορεί να ευαισθητοποιήσει κυτταρικές σειρές HeLa και τόσο SKOV3 να σισπλατίνη και ετοποσίδη [19]. Ωστόσο, αυτές οι πειραματικές ενώσεις δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ασθενείς, δεδομένου ότι εκδηλώνουν σημαντική

in vivo

τοξικότητες [11], [19]. Επιπλέον, κλινικές έγκριση νέων παραγόντων ότι οι στόχοι της ασφάλειας ΑΚΤ και ER-στρες θα είναι μια δαπανηρή και χρονοβόρα διαδικασία. Από την άποψη αυτή, η επανατοποθέτηση του φαρμάκου καθίσταται ένα πολύ ικανοποιητική αντικαρκινική και χημειοευαισθητοποιητική στρατηγική [20]. Ερευνήσαμε αν δύο εγκεκριμένες φαρμακολογικών παραγόντων, δηλαδή νελφιναβίρη και η κουρκουμίνη, που είναι γνωστό ότι στοχεύουν τις οδούς ER στρες και ΑΚΤ, μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου DTX εναντίον CRPC κυττάρων.

νελφιναβίρη (NFR) είναι ένα από τα πρώτα αναστολείς της HIV-1 πρωτεάσης (ΒΑΑ) είναι κλινικά εγκεκριμένα [21], [22] και επί του παρόντος επανατοποθετείται ως αντικαρκινικός παράγοντας, καθώς και (ClinicalTrials.gov). Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι NFR μπορεί τόσο chemosensitize και ραδιοευαισθητοποιεί μια ποικιλία διαφορετικών κυττάρων του όγκου [23] – [28]. Οι επιδράσεις ευαισθητοποίησης της έχει συνδεθεί με την επαγωγή της ER-στρες και την αναστολή της ΑΚΤ οδού [28]. Πράγματι, ριτοναβίρη, ένα άλλο ΕΙΠ με παρόμοιο μηχανισμό δράσης, επίσης δείχθηκε να ενισχύσει τις αντικαρκινικές δράσεις της DTX σε ένα εξαιρετικά επιθετική κυτταρική γραμμή PCa, DU-145 [29]. Ωστόσο, οι ευαισθητοποίηση του NFR εμφάνισαν μόνο σε συγκεντρώσεις ≥10 μm, το οποίο είναι υψηλότερο από την ασφαλή και φυσιολογικά εφικτά επίπεδα της, δηλ 4,5-6 μΜ [30], [31]. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός του ΝΔΚ με ένα άλλο ασφαλές ένωση που στοχεύει παρόμοια μονοπάτια ER-στρες και AKT μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική.

Η κουρκουμίνη (CUR) είναι το ενεργό συστατικό του

Curcuma longa

, ένα Ανατολή -Indian φυτό. Αυτό φυτοχημικές έχει γνωστά αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών ιδιότητες και ένας αριθμός εργαστηρίων ερευνά χρησιμότητα αυτό ως ένα πρόσθετο σε χημειοθεραπεία [32]. Πράγματι, CUR έχει αποδειχθεί αναστέλλουν την ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού και επάγουν χαμηλά επίπεδα ER-στρες ειδικά σε καρκινικά κύτταρα [33], [34]. Στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, CUR εμφάνισε συνεργιστικά αποτελέσματα κατά του όγκου όταν συνδυάζονται με DTX [35]. Πρόσφατα, CUR επίσης δείχθηκε να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω ER-στρες που προκαλείται από αυτοφαγία [36]. Ωστόσο, παρόμοια με NFR, το

in vitro

χημειοευαισθητοποιητική επιδράσεις της CUR ήταν εμφανείς μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις (≥10 μΜ), η οποία είναι δύσκολο να επιτευχθεί

in vivo

[37], [38 ]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι CUR και ΝΔΚ συνδυασμός θα πρέπει να αυξήσει ισχυρά ατομικά χημειοευαισθητοποιητική τις ικανότητές τους.

Οι έρευνες χρησιμοποιώντας C4-2B κύτταρα (α CRPC κυτταρική σειρά) έδειξαν σημαντικά αυξημένη αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των DTX παρακάτω coexposure να ΝΔΚ και CUR . Μηχανιστικά, αυτός ο συνδυασμός 3-φάρμακο synergized να καταστείλει την ΑΚΤ και να προκαλέσει ATF4, CHOP και τα επίπεδα TRIB3. Τόσο

in vitro

και

in vivo

ευρήματά μας εμπλέκουν σαφώς το δυναμικό της επικουρικής θεραπείας με φυσιολογικά εφικτό συγκεντρώσεις ΝΔΚ και CUR για να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της DTX σε CRPC ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα κύτταρα C4-2B, ένα κόκκαλο μεταστατικό CRPC υποσειρά που προέρχεται από LNCaP, ήταν ένα είδος δώρο από το εργαστήριο του Δρ Leland Chung του (Emory University) [39] . Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) από την Ατλάντα Biologicals (Lawrenceville, GA) και 1% στρεπτομυκίνη αντιβιοτικό διάλυμα πενικιλλίνης /(Cellgro). Η RWPE-1 κύτταρα, μία μη-ογκογονική ανθρώπινη προστατική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή αθανατοποιημένη με ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV-18), ελήφθησαν από την American Type Culture συλλογή (ATCC? # CRL-11609). Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού κερατινοκυττάρων (K-SFM) συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και το εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς, όλα ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (PrEC) ελήφθησαν από ATCC (# PCS-440-010) και καλλιεργήθηκαν σε βασικό μέσο προστάτη των επιθηλιακών κυττάρων και τα συμπληρώματα (ATCC? # PCS-440-030 και # 440-040 PCS-). Οι Μυελού των Οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs BM-) ελήφθησαν από τον πυρήνα κυττάρου εγκατάσταση στέλεχος στο Πανεπιστήμιο Tulane (Νέα Ορλεάνη, LA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 20% FBS και αντιβιοτικά. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C, σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2.

Αντιδραστήρια

μεσυλική νελφιναβίρη (NFR) σκόνη εκχυλίστηκε και καθαρίστηκε από 250 mg δισκία ( Agouron Pharmaceuticals? San Diego, CA). Η κουρκουμίνη (CUR) ελήφθη από την Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Docetaxel (DTX) και θαψιγαργίνη (Tg) ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) και η ΑΚΤ-αναστολέα (ΑΚΤΗ-IV? Κατάλογος Νο 124.005.) Ελήφθη από την Calbiochem (Billerica, ΜΑ). Για

in vitro μελέτες

, όλα τα φάρμακα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Πρωτογενή αντισώματα έναντι συνολικού-ΑΚΤ και φωσφο-ΑΚΤ, συνολικής eIF2α και φωσφο-eIF2α, και κατά της ανθρώπινης BIP /Grp78, PARP και CHOP, ήταν όλοι αγοράζονται από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα κατά της ανθρώπινης TRIB3 και ATF4 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), το αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης β-ακτίνης από την Fisher Scientific (Waltham, ΜΑ) και έναντι Ki-67 ήταν από την Spring Biosciences (Pleasanton, CA). Όλα τα δευτερογενή αντισώματα, όπως κατσίκα αντι-ποντικού, κατσίκας αντι-κουνελιού και βοοειδών αντι-κατσίκα, ήταν όλα αγοράστηκαν από την Santa-Cruz Biotechnology.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου] δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από έκθεση στις ενώσεις δοκιμής [40]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Επιθυμητές συγκεντρώσεις ενώσεων, μόνες ή σε διάφορους συνδυασμούς, προστέθηκαν στα κύτταρα σε 3 φρεάτια πανομοιότυπα. Μετά από 24-72 ώρες επώασης, το ΜΤΤ (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 3 ώρες και κρύσταλλοι φορμαζάνης ανιχνεύθηκαν με μωβ χρώμα. Η επί τοις εκατό επιβίωση υπολογίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 540 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μQuant από την Bio-Tek (Seattle, WA).

DNA κατακερματισμό δοκιμασία

Η δοκιμασία κατάτμησης DNA διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες [41]. Εν συντομία, κύτταρα σε 10 cm δίσκους ιστοκαλλιέργειας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις επιθυμητές συγκεντρώσεις των DTX, NFR και CUR, μόνο και σε συνδυασμό. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες σε ένα ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης {0,2% Triton-X 100, 10 mM Tris-Cl (ρΗ 7,4) και 10 mM EDTA (ρΗ 8,0)}, ακολουθούμενη από επεξεργασία με 100 μg /ml RNAse Α (Sigma ) και 0,5 mg /ml πρωτεϊνάση-K (Sigma). Το χαμηλό μοριακό βάρος του DNA εκχυλίστηκαν με την προσθήκη ίσων όγκων φαινόλης, χλωροφορμίου και ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1) και επιπλέον με χλωροφόρμιο και ισοαμυλική αλκοόλη (24:1). Απομονωμένου DNA καταβυθίστηκε με αιθανόλη (300 mM NaCl και 100% παγωμένης αιθανόλης), επαναδιαλύθηκε σε 1Χ ΤΕ (τρις /EDTA) ρυθμιστικό και ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 2% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο (0,1 μg /ml). κατακερματισμού του DNA οπτικοποιήθηκε υπό υπεριώδες φως χρησιμοποιώντας την Ποσότητα Ένα λογισμικό (Bio-Rad? Hercules, CA).

κασπάσης-3

δοκιμασία

Η EnzChek κασπάσης-3 Kit δοκιμασίας (Molecular Probes? Eugene, OR) ανιχνεύει την απόπτωση με μέτρηση πρωτεολυτική διάσπαση ενός αμινο-μεθυλοκουμαρίνη (AMC) που προέρχεται φθορίζον υπόστρωμα, Ζ-DEVD-AMC. Εν συντομία, τα κύτταρα σε 10 cm τρυβλία Petri υποβλήθηκαν σε αγωγή με DTX, NFR και CUR, μόνο και σε συνδυασμό. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες, λύθηκαν και Caspase-3 δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι μέσες εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν με τη χρήση ενός αναγνώστη μικροπλακός Flx800 (BioTek) με διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος ορίζεται σε 360 ± 20 nm και 460 ± 20 nm, αντίστοιχα.

Western ανοσοανίχνευση

λύματα ολόκληρων κυττάρων συνελέγησαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία (30 λεπτά έως 9 ώρες) μετά την έκθεση σε DTX, NFR και θεραπείες CUR χρησιμοποιώντας 1Χ ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (Cell Signaling Technology? Danvers, ΜΑ). Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το BCA αντιδραστηρίου ανάλυσης πρωτεΐνης (Thermo Scientific? Rockford, IL). Περίπου 30 μg πρωτεΐνης κλασματοποιήθηκε πάνω σε πηκτές 10% SDS-PAGE από την Bio-Rad (Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με επώαση των μεμβρανών με ένα Blok-CH χημειοφωταύγειας blocker (Millipore) και υβριδοποιήθηκε με επιθυμητά πρωτογενή αντισώματα (1:1,000 αραίωση) επί μία νύκτα στους + 4 ° C και στη συνέχεια με το HRP-σημασμένο δευτερογενή αντισώματα (1:5,000 αραίωση) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) και του υποστρώματος SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). εντάσεις Band ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-J (ΝΙΗ) και πυκνομετρική τιμή για κάθε πρωτεΐνη κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες β-ακτίνης επίπεδα σε κάθε δείγμα.

Μονάδες Σχηματισμού Αποικίας δοκιμασία

C4- κύτταρα 2Β σπάρθηκαν σε 6 cm δίσκους με 200 κύτταρα /τρυβλίο. Drugs, μόνος ή σε συνδυασμό, προστέθηκαν μετά από 48 ώρες και θεραπείες διεξήχθησαν σε 3 φρεάτια πανομοιότυπα. Τόσο NFR και CUR ήταν αναπληρώνονται δύο φορές την εβδομάδα και DTX αναπληρώθηκε μία φορά την εβδομάδα μαζί με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης. Μετά από τρεις εβδομάδες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 100% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με μπλε του μεθυλενίου, και μονάδες σχηματισμού αποικίας (CFU) καταμετρήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού One Ποσότητα (Bio-Rad).

μελέτες ξενομοσχεύματος όγκου

Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα που αφορούν πειραματόζωα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ και εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο Tulane (IACUC? πρωτόκολλο # 4295). Η

in vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της DTX, μόνη ή σε συνδυασμό με NFR και CUR, προσδιορίστηκαν σε ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (NCI? Frederick, MD). Για κάθε ποντικό (ηλικίας 4 εβδομάδων), κύτταρα C4-2B (2 × 10

6) επαναιωρήθηκαν σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό και ενέθηκαν υποδορίως (sc) μαζί με 100 μΙ Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Όταν οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο 50-75 mm

3 (~ 2 εβδομάδες μετά την ένεση), τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν για θεραπεία με είτε όχημα, DTX (10 mg /kg), ή με DTX (10 mg /kg) + NFR (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) με ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ένεση. Πριν από κάθε ένεση, φάρμακα προσφάτως διαλύθηκαν σε αντίστοιχα οχήματα τους [23], [43], [44]. DTX χορηγήθηκε μία φορά την εβδομάδα, και NFR και CUR χορηγήθηκαν 5 ημέρες /εβδομάδα. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα Vernier δαγκάνα και στον όγκο όγκοι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο, 0,5 × μήκος × πλάτος

2 [45]. Βάρος κάθε ποντικού μετρήθηκε και αναλογίες όγκου-όγκου προς συνολικό βάρος υπολογίστηκαν σε κάθε χρονικό σημείο. Οι όγκοι αποκόπηκαν, στο τέλος της περιόδου θεραπείας (4 εβδομάδες), εγκλεισμένα σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC).

Ανοσοϊστοχημεία

Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες που ακολουθείται από 70% αιθανόλη και στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τμήματα (~ 5 μm) κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). IHC για έκφραση Ki-67 διεξήχθη για να προσδιοριστεί ο αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Εν συντομία, τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, ενυδατωμένο, και το αντιγόνο ανακτάται με τη χρήση 10 mM κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6,0). Οι τομές πρώτα αποκλείστηκαν με 3% Η

2O

2 και στη συνέχεια με 1,5% ορό φραγμού (κιτ Vectastain ABC, Vector εργαστήρια? Burlingame, CA). Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίσωμα αντι-Ki-67 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από δύο πλύσεις σε PBS, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα και στη συνέχεια με το αντιδραστήριο ενζύμου (Vectastain ABC kit? Vector Laboratories). Οι τομές χρωματίστηκαν με διαμινοβενζιδίνη (DAB) και αντιχρώσθηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη πυρηνική χρώση (εργαστήρια Vector? # Η-3401). Μόνιμη μέσα στερέωσης προστέθηκε και χρώση Ki-67 οπτικοποιήθηκε και κατέλαβε με τη χρήση ενός Eclipse Ε-400 μικροσκόπιο (Nikon Instruments, Melville, ΝΥ). Σε κάθε διαφάνεια, 5 διαφορετικά πεδία εμφανίστηκαν για Ki-67 προετοιμασμένα κύτταρα και ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-J

δοκιμασία TUNEL

Αυτό το κιτ δοκιμασίας αδιέξοδο Χρωματομετρική ΤΟΥΝΕΛ (Promega?. Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αποπτωτικά κύτταρα σε τομές όγκων, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Αυτή η δοκιμασία μετρά βιοτινυλιωμένο ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων στο DNA, το οποίο στη συνέχεια ορατή με HRP-σημασμένη στρεπταβιδίνη και DAB. Η χρώση οπτικοποιήθηκε με Eclipse Ε-400 μικροσκόπιο και οι εικόνες συλλήφθηκαν από 4 διαφορετικούς τομείς σε κάθε τμήμα του όγκου.

Synergy προσδιορισμός

Το λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί ο δείκτης συνδυασμού (CI) με βάση την μέθοδο Chou-Talalay [46]. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην εξίσωση μέσου-αποτελέσματος που περιλαμβάνει Michaelis-Menton, Hill και το Henderson-Hasselbalch εξισώσεις και παρέχει μια ποσοτική μέτρηση για το συμπλήρωμα (CI = 1), συνεργιστική (CI & lt? 1) ή ανταγωνιστική (CI & gt? 1) επιδράσεις.

η στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το GraphPad Prism έκδοση-4,00 Λογισμικό (San Diego, CA, USA). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως τυπικό σφάλμα του μέσου (± SEM). Σημαντικές αλλαγές από τους ελέγχους προσδιορίστηκαν με t-test δύο ουρών του Student και ρ-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

συνδυασμένη έκθεση σε θαψιγαργίνη και ΑΚΤ-αναστολέα ευαισθητοποιεί C4. 2Β κύτταρα να DTX-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα

για την αντιμετώπιση κεντρική μας υπόθεση ότι η ταυτόχρονη στόχευση του ER-στρες και AKT πορείες θα οδηγήσει σε χημειοευαισθητοποίηση CRPC κύτταρα, εξετάσαμε πρώτα αν Tg και Ακτή-IV coexposure μπορεί να ευαισθητοποιήσει C4 2Β κύτταρα να DTX-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 2Α). Τα αποτελέσματα των αυξανόμενων συγκεντρώσεων του φαρμάκου και τον χρόνο των ανοιγμάτων πρώτα παρακολουθήθηκε με ΜΤΤ-δοκιμασίες. Σε 72 ώρες μετά την έκθεση, το IC

50 τιμές για DTX, Tg και Ακτή-IV ήταν 35,8 nM, 80,8 nM και 5,5 μΜ, αντίστοιχα (Πίνακας S1 στο S1 αρχείου). Πιθανές συνεργιστικά αποτελέσματα του συνδυασμού φαρμάκων στη συνέχεια διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις χαμηλότερες από τις αντίστοιχες IC

50 αξίες τους. Μελέτες Coexposure έδειξαν σαφώς ότι ο συνδυασμός του DTX (10 ηΜ), Tg (25 ηΜ) και η Ακτή-IV (2,5 μΜ) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική (ρ & lt? 0,0005) μείωση στην κυτταρική επιβίωση C4-2B, σε σύγκριση με DTX μόνο ( Σχ. 2Β). Μελλοντικές μελέτες διεξήχθησαν για να διερευνηθεί αν coexposure σε δύο ασφαλή και εγκεκριμένα μέσα, δηλαδή ΝΔΚ και CUR, μπορούν ομοίως να αυξήσει DTX ευαισθητοποίηση των κυττάρων C4-2B.

(Α). Ταυτόχρονη επαγωγή της ER-στρες με θαψιγαργίνη (Tg) και η καταστολή της ΑΚΤ από Akt αναστολέα (Akt-Ι) μπορεί να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση των χημειοθεραπεία. (ΣΙ). Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της DTX, μόνη της ή σε συνδυασμό με Tg ή /και Akt-I, στη βιωσιμότητα των κυττάρων C4-2B. Coexposure να Tg (25 ηΜ) και Akt-I (2,5 μΜ) ενισχυμένη DTX (10 ηΜ) προκάλεσε κυτταροτοξικότητα σε 72 ώρες μετά την έκθεση (n = 3). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τιμές ± SEM και οι σημαντικές διαφορές εμφανίζονται ως Ρ-τιμές (***, p & lt? 0.0005).

Η

Coexposure σε φυσιολογικά εφικτό συγκεντρώσεις NFR & amp? CUR ευαισθητοποιεί κύτταρα C4-2B να DTX-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα

Το IC

50 τιμές για DTX, NFR ή CUR υπολογίστηκαν μετά από έκθεση σε μεμονωμένα φάρμακα για 24, 48 και 72 ώρες (Πίνακας S1 στο File S1 ). Παρατηρήθηκε μια συγκέντρωση και χρονο-εξαρτώμενη καταστολή στην κυτταρική επιβίωση (ΜΤΤ-ανάλυση). Σε μεταγενέστερες μελέτες, η υπο-IC

50 συγκεντρώσεις φαρμάκων χρησιμοποιήθηκαν σε 2- ή 3- συνδυασμούς φαρμάκων και την επιβίωση των κυττάρων παρακολουθήθηκε σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, (Α) C4-2B, (Β) RWPE-1, ( C) BM-MSC και (D) PrEC (Εικ. 3). Παρά το γεγονός ότι στις 24 ώρες το IC

50 για DTX, NFR και CUR μόνος δείχθηκαν να είναι 590,5 ηΜ, 30.3 μΜ και 59 μΜ, αντίστοιχα, μια σημαντική αύξηση (ρ & lt? 0,0005) σε C4-2B κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε όταν DTX ήταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με NFR και CUR. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ταχεία κυτταροτοξικότητα που παρατηρείται σε κύτταρα C4-2B δεν ήταν εμφανής στα μη ογκογονικά RWPE-1 κύτταρα ή στα πρωτογενή κύτταρα, δηλ BM-MSCs και PRECs. Η ανάλυση συνδυασμός δείκτης (CI) έδειξε μία τιμή 0,045 σε κύτταρα C4-2B, υποδηλώνοντας μία ισχυρή συνεργική δράση του συνδυασμού 3-φαρμάκου. Ωστόσο, οι τιμές CI για RWPE-1 κύτταρα και ΒΜ-MSC βρέθηκαν να είναι πολύ υψηλότερη, δηλ 0.527 και 0.639, αντίστοιχα. Επιπλέον, η τιμή CI στα κύτταρα PrEC ήταν 2.074, υποδηλώνοντας ανταγωνιστική δράση. Παρόμοιες μελέτες σε άλλη επιθετική γραμμή κυττάρων του προστάτη, PC-3, που αναφέρεται επίσης σημαντική (p & lt? 0.0005) αύξηση DTX ευαισθητοποίηση παρακάτω coexposure τόσο ΝΔΚ και CUR (Πίνακας S1 στο αρχείο S1 και Σχ S1 Α στο αρχείο S1.). Είναι ενδιαφέρον όμως, σε αντίθεση με C4-2B κύτταρα, συνέργεια φαρμάκου σε κύτταρα PC-3 παρατηρήθηκε μόνο σε 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι coexposure να NFR και CUR μπορεί γρήγορα και συνεργικά αυξάνει DTX-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα στην CRPC γραμμή C4-2B, αλλά όχι στο μη-ογκογόνα γραμμή, RWPE-1. Ως εκ τούτου, το μοριακό μηχανιστικές μελέτες διεξήχθησαν για να οριοθετηθούν τις διαφορικές δράσεις αυτού του συνδυασμού 3-φαρμάκου σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της DTX (10 ηΜ), μόνο και σε συνδυασμό με NFR (5 μΜ) και ή /CUR (5 μΜ), παρουσιάζονται στους ακόλουθους τέσσερις τύπους κυττάρων, (Α) C4-2B, (Β) RWPE-1, (C) PrEC και (D) BM-MSC. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων διεξήχθησαν σε 24 ώρες μετά την έκθεση και ποσοστιαία αλλαγή σε κυτταρική επιβίωση, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (έλεγχος), προσδιορίστηκαν. Οι ΜΤΤ-δοκιμασίες διεξήχθησαν σε 3 φρεάτια επαναληπτικές και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές (η = 3). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM και σημαντικές διαφορές μεταξύ DTX-μόνο και η ομάδα + ΝΔΚ + CUR DTX εμφανίζονται ως Ρ-τιμές (***, p & lt? 0,0005? **, p & lt? 0.005)

Η

Διαφορικές του ΝΔΚ & amp? CUR συνδυασμός για DTX-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα C4-2B και RWPE-1

Εμείς παρακολουθείται κατά πόσον η απόκλιση κυτταροτοξικότητα σε C4-2B

vs.

Κύτταρα RWPE1 μετά από θεραπεία με το συνδυασμό 3-φάρμακο οφείλεται σε διαφορές απόπτωσης (Εικ. 4). Κυτταρική απόπτωση εκτιμήθηκε με πολλαπλές τεχνικές όπως ο κατακερματισμός DNA (Σχήμα 4Α & amp?. 4Β), της κασπάσης-3 επαγόμενη παραγωγή AMC (σχήμα 4Γ & amp?. 4D) και διάσπαση PARP (Εικ. 4Ε & amp? 4F). Η δοκιμασία κατάτμησης DNA έδειξε ότι τα μεμονωμένα φάρμακα δεν διεγείρει απόπτωση? Ωστόσο, η αύξηση των laddering μοτίβο ήταν εμφανής όταν DTX συνδυάστηκε είτε με NFR ή CUR και απόπτωση ενισχύθηκε περαιτέρω με το συνδυασμό 3-φαρμάκου. Παρά το γεγονός ότι παρόμοια πρότυπα κατάτμηση του DNA ήταν εμφανής στις RWPE-1 κύτταρα, η δοκιμασία AMC κατέδειξε σαφώς ένα σημαντικά υψηλότερο δραστικότητα κασπάσης-3 σε κύτταρα C4-2B σε σύγκριση με τα κύτταρα RWPE-1. Ούτε ΝΔΚ ούτε CUR μόνη βρέθηκε να αυξήσει την παραγωγή της AMC? Ωστόσο, συνδυασμένη έκθεση τους αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης-3, και αυτό ήταν εμφανές ακόμη και εν απουσία του DTX ταυτόχρονης θεραπείας. Επιπλέον, αν και ΝΔΚ ή CUR μόνο θα μπορούσε να αυξήσει την δράση της κασπάσης-3 σε DTX εκτεθειμένα κύτταρα, οι σημαντικότερες αυξήσεις παρατηρήθηκαν όταν και οι δύο ΝΔΚ και CUR χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με DTX (συγκρίνετε λωρίδες 5 και 8). Δεδομένα από ποσοτικούς προσδιορισμούς διάσπασης PARP επιβεβαίωσε περαιτέρω αυτή διαφορικό αποτέλεσμα του συνδυασμού φαρμάκου επί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Σε κύτταρα C4-2B, αύξηση 9 φορές παρατηρήθηκε στο 9-ώρες μετά την έκθεση? Ωστόσο, μόνο μια αύξηση 2,3 φορές παρατηρήθηκε στα κύτταρα RWPE-1. Ως εκ τούτου, συνδυασμένη έκθεση σε NFR και CUR αυξάνει βαθιά DTX-επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων C4-2B.

Η επαγωγή της απόπτωσης σε C4-2B (A, C, D) και RWPE-1 (Β, Ε, F κύτταρα) μετά από θεραπεία με DTX (10 ηΜ), μόνο και σε συνδυασμό με NFR (5 μΜ) και /ή CUR (5 μΜ) αξιολογήθηκε με DNA-κατακερματισμό (Α και Β), δοκιμασία Caspase-3 (C και Ε ) και η διάσπαση PARP (D και F). Οι δοκιμασίες DNA-κατακερματισμός και Caspase-3 απεικονίζουν την απόπτωση μετά από 24 ώρες μετά την έκθεση. Αλλαγές στην διάσπαση PARP μετρήθηκε στα 9 ώρες μετά την έκθεση. Η laddering πρότυπο κατακερματισμένου DNA ήταν ενδεικτική της απόπτωσης, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την αυξημένη AMC που απελευθερώνονται από ενεργοποιημένα κασπάσης-3 (n = 3) (*, ρ & lt? 0,05). Έκφραση τόσο ολικής και διασπασμένη PARP προσδιορίστηκε με δοκιμασίες κηλίδος Western. Τα βέλη υποδεικνύουν διασπάται επίπεδα PARP. Πτυχές αλλαγές στην διάσπαση PARP σε φάρμακο που εκτίθενται κύτταρα (λωρίδες 2-8) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (λωρίδα-1) παρουσιάζονται παρακάτω ομαλοποίηση με τους αντίστοιχους β-ακτίνης επίπεδα.

Η

Συνδυασμένη θεραπεία με DTX, ΝΔΚ & amp? CUR καταργεί ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότηση σε κύτταρα C4-2B

Για να ξετυλίξουν των υποκείμενων μηχανισμών που εμπλέκονται στην χημειοευαισθητοποίηση από το συνδυασμό 3-φαρμάκου, μελέτες δυτική ανοσοανίχνευση διεξήχθησαν για την παρακολούθηση τόσο της ενεργοποίησης ΑΚΤ και την έκφραση αρκετών ER- δείκτες στρες (Εικ. 5 και Σχ. S2 σε File S1). Αρχικές μελέτες διεξήχθησαν για την παρακολούθηση των χρόνου και εξαρτώμενη από τη δόση επιδράσεις της DTX, μόνη της ή σε συνδυασμό με NFR ή /και CUR, στα κύτταρα C4-2B (Εικ. S2 σε S1 File). Για τον προσδιορισμό χρονικών αποτελεσμάτων τους επί της ΑΚΤ μονοπάτι σηματοδότησης, τα κύτταρα C4-2B πρώτα εκτέθηκαν σε φάρμακα από 30 λεπτά έως 6 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας-1 (IGF1? 10 ng /ml) για 15 λεπτά. Τόσο οι συνολικές ΑΚΤ (t-ΑΚΤ) επίπεδα και ΑΚΤ φωσφορυλιώνεται στη σερίνη-473 (ρ-ΑΚΤ) προσδιορίστηκαν. Σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα, π-ΑΚΤ αυξήθηκε κατά 3-4 φορές μετά από διέγερση IGF1 (δεν φαίνεται). Σε C4-2B κύτταρα, το p-ΑΚΤ καταστολή θα μπορούσε να δει μέσα σε 30 λεπτά από την έκθεση, και ήταν σαφώς εντός μέσα σε 3 ώρες. Είναι ενδιαφέρον, αν και DTX μόνο ήταν σε θέση να αυξήσει p-ΑΚΤ επίπεδα μέσα σε 30 λεπτά, η αύξηση αυτή στην πορεία επιβίωσης AKT δεν είχε δει σε κύτταρα coexposed να ΝΔΚ & amp? ΚΟΠΡΊΤΗΣ. Οι προκαλείται από π-ΑΚΤ επίπεδα IGF-1 είχαν σχεδόν καταργηθεί σε 6 ώρες μετά την έκθεση των ναρκωτικών (Εικ. S2A στο αρχείο S1). Ούτε η συγκέντρωση ούτε το χρόνο της έκθεσης στο φάρμακο ήταν σε θέση να μεταβάλει σύνολο ΑΚΤ (t-ΑΚΤ) επίπεδα σε οποιονδήποτε τύπο κυττάρου. (2).