Αφηρημένο

Στόχος

προηγούμενη μελέτη μας προτείνει τις πιθανές κλινικές επιπτώσεις της BCAR1 σε καρκίνος μη-μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC) (Mol Diagn Ther 2011. 15 (1):. 31-40). Στο παρόν, έχουμε ως στόχο να αξιολογήσει την προβλεπτική ικανότητα των BCAR1 ως δείκτης για την κακή πρόγνωση σε περιπτώσεις NSCLC, επαληθεύει τις καρκινογόνες ρόλους BCAR1 στην κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα, και μαρτυρούν τον άξονα BCAR1 /φωσφο-ρ38.

Μέθοδοι

Μεταξύ Ιανουαρίου 2006 και Ιουνίου του 2010, υπήρχαν συνολικά 182 ασθενείς με ΜΜΚΠ (151 περιπτώσεις με τα διαθέσιμα δεδομένα παρακολούθησης, και 31 περιπτώσεις έχασαν την παρακολούθηση λόγω της μη έγκυρες πληροφορίες επαφής). Εμείς επιθεωρούνται BCAR1, φωσφο-BCAR1 (Tyr410), φωσφο-ρ38 (Thr180 /Tyr182) και της έκφρασης p38 σε ιστούς NSCLC και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ανοσοαποτύπωση και ανοσοϊστοχημεία. Μετά BCAR1-RNA παρεμβολής σε κύτταρα Α549, που επιθεωρείται την έκφραση της πρωτεΐνης (BCAR1, φωσφο-BCAR1, φωσφο-p38 και p38) και πραγματοποιούνται πειράματα κυτταρικής βιολογίας (κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και τον κύκλο).

Αποτελέσματα

BCAR1 υπερεκφράστηκε σε ιστούς NSCLC (177/182) και κυτταρικές γραμμές (Α549 και Calu-3). Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε στο φυσιολογικό γειτονικό ιστό σε 161 από τις 182 περιπτώσεις. Υψηλότερα επίπεδα BCAR1 συνδέθηκαν στενά με πιο φτωχά διαφοροποιημένα NSCLC και προέβλεψε φτωχότερη πρόγνωση. BCAR1 knockdown προκαλείται διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, η αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων και διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων Α549. Η υπερέκφραση του BCAR1 συνδέθηκε με την ενεργοποίηση της ρ38 σε περιπτώσεις NSCLC, και BCAR1 knockdown προκάλεσε μείωση των επιπέδων φωσφο-ρ38 σε κύτταρα Α549.

Συμπέρασμα

Η υπερέκφραση του BCAR1 είναι ένας προγνωστικός δείκτης της κακής πρόγνωσης σε NSCLC και παίζει σημαντικό ρόλο καρκινογόνων στην καρκινογένεση, πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης της p38 MAPK. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες αμέσως

Παράθεση:. Huang W, Ντενγκ Β, Wang Ε-W, Tan Q-Υ, Ο Υ, Jiang Υ-G, et al. (2012) BCAR1 η πρωτεΐνη παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και προβλέπει κακή πρόγνωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10.1371 /journal.pone.0036124

Επιμέλεια: Keiran Smalley, Η Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Δεκέμβρη, 2011? Αποδεκτές: 26, Μαρτίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 Απριλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC) (Αρ 81101782), έργο NSFC CQ CSTC (Αρ CSTC2011BB5020), και NSFC Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Νο 2010XQN36). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, υπάρχουν 1,35 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου του πνεύμονα στον κόσμο [1]. Παγκοσμίως, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους [2]. Λόγω των περίπλοκων βιολογικών λειτουργιών, την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει πολύ κακή [1]. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας να αποκαλύψει τις βιολογικές λειτουργίες της νόσου για χάρη της βελτίωσης της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας [3].

Ο καρκίνος του μαστού αντι-οιστρογόνο αντίσταση 1 (BCAR1), δικαιούνται επίσης p130cas, ήταν ένα από το CAS μέλη (Crk σχετίζεται με υπόστρωμα) οικογένεια πρωτεϊνών. Αρχικά αναγνωρίστηκε ως κυτταρική πρωτεΐνη που μεταναστεύει στα 130 kDa, και να υπερφωσφορυλιωμένα σε v-Crk και v-Src μετασχηματισμένα κύτταρα [4], [5]. Αρχικά, εντατικές μελέτες επικεντρώθηκαν στην συσχέτιση μεταξύ καρκίνου του μαστού και BCAR1 [6], [1], [7], [8]. Για παράδειγμα, Brinkman et al. [7] πρότεινε BCAR1 υπερέκφραση σε ZR-75-1 καρκινικών κυττάρων του μαστού γραμμή καθιστά αντιοιστρογόνο αντίσταση στα κύτταρα. Επιπλέον, Dorssers et al. [8] ανέφεραν ότι η έκφραση BCAR1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση και το συνολικό χρόνο επιβίωσης του καρκίνου του μαστού.

Πρόσφατα, η μελέτη μας πρότεινε υπάρχει κλινική επίπτωση BCAR1 στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου ( NSCLC) [9]. Ερευνήσαμε επίπεδα BCAR1 ορού σε 80 περιπτώσεις NSCLC και 80 υγιείς ελέγχους, αντίστοιχα, με τη χρήση ενός ειδικού συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) [9]. Περιέργως, βρήκαμε ότι τα επίπεδα BCAR1 ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε NSCLC σχέση με την ομάδα ελέγχου, αυξάνεται σταδιακά με την εξέλιξη της στάσης του όγκου, και μειωμένη μετά την απομάκρυνση των κακοηθών αλλοιώσεων [9]. Ωστόσο, οι ογκογόνο μηχανισμοί BCAR1 σε NSCLC εξακολουθούν να είναι τα αινίγματα.

Εδώ, πραγματοποιήσαμε τις περαιτέρω έρευνες για να αξιολογήσει την προβλεπτική ικανότητα των BCAR1 ως βιοδείκτη για την κακή πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC. Και επαληθεύσαμε τις καρκινογόνες ρόλους των BCAR1 μέσω παρεμβολής RNA (RNAi) στο Α549 πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς. Πειράματα in vivo και in vitro κατέδειξαν την κλειστή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BCAR1 και ενεργοποίηση της ρ38 η οποία είναι ένα κρίσιμο κλάδο της ΜΑΡΚ (ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση) οδό [10], [11].

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

το πρωτόκολλο της μελέτης εξετάστηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Έρευνας δεοντολογία της Daping νοσοκομείο (Chongqing City, PRChina) [αναφορά όχι. TMMU-ΟΡΗ /2006-012], και εν επιγνώσει συναίνεση γράφτηκε και λαμβάνεται από όλους τους ασθενείς.

Στη μελέτη που πραγματοποιήθηκε μεταξύ του Ιανουαρίου 2006 και Ιουνίου του 2010, υπήρχαν συνολικά 182 ασθενείς με NSCLC. Η πνευμονική νεοπλασία διαγνώστηκε ακτινολογικά και επιβεβαιώθηκε από την παθολογία. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει θεραπεία πριν από την εγγραφή στη μελέτη. Τα δημογραφικά και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε λοβεκτομή και λεμφαδενεκτομή. Εκατόν τριάντα πέντε ασθενείς έλαβαν μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία (πακλιταξέλη συν νεδαπλατίνη). Μετεγχειρητική παρακολούθηση ήταν διαθέσιμα σε 151 περιπτώσεις μέσω τηλεφώνου ή e-mail συνέντευξη, και 31 περιπτώσεις έχασαν την παρακολούθηση λόγω της μη έγκυρες πληροφορίες επαφής.

Η

Cell Culture

Α549 και Calu -3 πνεύμονα κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 /10% FBS, αντίστοιχα

παρεμβολή RNA του BCAR1

Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα ζεύγη ολιγοριβονουκλεοτίδιο.: 5′- CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 ‘και 5′-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3’. Ολόκληρες οι αλληλουχίες προήλθαν από την αλληλουχία του ανθρώπινου mRNA BCAR1. Τα ολιγονουκλεοτίδια ελήφθησαν από SunBio Ιατρική Βιοτεχνολογία CO., Ltd (Shanghai City, P.R.China). Τα συμπληρωματικά δύο κλώνοι (κάθε στα 20 μΜ) σε 60 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αναδιάταξης (SunBio Medical Biotechnology CO., Ltd, Shanghai City, P.R.China) θερμάνθηκαν για 5 λεπτά στους 95 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, η GFP-tagged φορέα λεντοϊού pLVT351.LV για BCAR1-RNAi κατασκευάστηκε με την προσθήκη των νουκλεοτιδίων ανόπτηση στο site Ηλικία I + ΕοοΚ Ι του pMAGic 4.1 (SunBio Ιατρική Βιοτεχνολογία CO., Ltd, Shanghai City, PRChina).

Δεύτερον, Α549 κυτταρική γραμμή επιστρώθηκε σε 2,3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο πλάκας 24 φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων και μολύνονται με φακοϊό σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 10. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με pLVT351- LV και CMV-GFP-LV (κενό φορέα λεντοϊού, pMAGic 4.1) ονομάστηκε ως Α549-BCAR1-RNAi και Α549-αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα.

Western Blotting ανάλυση των BCAR1, φωσφο-BCAR1, φωσφο-ρ38 και ρ38 σε ιστούς και τα κύτταρα NSCLC

NSCLC και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (τουλάχιστον 5 cm μακριά από τις πρωτογενείς όγκους) ήταν διαθέσιμα από ένα σύνολο εξήντα (συμπεριλαμβανομένων 35 αδενοκαρκινώματα και 25 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα) περιπτώσεις για western αποτύπωση . Κατά τη διάρκεια των εργασιών, τα δείγματα συλλέχθηκαν από τους τεχνικούς αμέσως παρακάτω μετακομίσεις. Εκτός αυτού, παρασκευάσαμε επίσης τα κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων Calu-3, Α549, Α549-αρνητικό έλεγχο και Α549-BCAR1-RNAi.

Στη συνέχεια, προϊόντα λύσης από ιστούς και κυτταρικές σειρές παρασκευάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 50 mM Tris -ΗΟΙ ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0,1% SDS, 0,5% δεσοξυχολικό οξύ και 0,02% αζίδιο του νατρίου. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίζονται με BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL).

Οι πρωτεΐνες μετουσιώθηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά, και 50 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα επιλύθηκε με δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (SDS-PAGE) χρησιμοποιώντας 10% πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες στυπώθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Thermo), τα οποία στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες ανοσοστυπώθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-BCAR1 (BD Transduction Laboratories, USA, 1:1000), αντι-φωσφο-BCAR1 (Tyr410) αντίσωμα (Abcam, ΗΠΑ, 1:1000), αντι-ρ38 (BD Transduction Laboratories υλικό, USA , 1:1000) και αντι-φωσφο-ρ38 (Thr180 /Tyr182) αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση Transduction Laboratories, USA, 1:1000). Ένα αντι-β-ακτίνης (Sigma) ή GAPDH αντίσωμα (Sigma) χρησίμευσε ως μάρτυρας.

Gray κλίμακες ανοσοστύπωμα NSCLC και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών αναλύθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας απόκτηση εικόνας και λογισμικό ανάλυσης (Image Lab λογισμικό, ΒΙΟ-RAD, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κατασκευή ιστών μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημική (IHC) προσδιορισμός των BCAR1, φωσφο-BCAR1, p38 και φωσφο-ρ38 σε NSCLC ιστούς

η αιματοξυλίνη και ηωσίνη (η & amp? Ε) -stained διαφάνειες όλων των 182 περιπτώσεων επιθεωρήθηκαν. Για κάθε περίπτωση, η παθολογική διάγνωση αναγνωρίστηκε στην Η &? Ε-χρώση slide και στη συνέχεια σε κύκλο. Μια αντίστοιχη διαφάνεια των κανονικών γειτονικών ιστών σημαδεύτηκε επίσης. Tissue μικροσυστοιχία κατασκευάστηκε σύμφωνα με τα προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [9]. Η σήμανση slide ήταν ευθυγραμμισμένη με την επιφάνεια του αντίστοιχου μπλοκ δότη. Στη συνέχεια, η περιοχή ήταν αισθητή στο μπλοκ ιστού παραφίνης. Από κάθε δείγμα, πυρήνες ιστού με διάμετρο 1,5 mm τρυπήθηκαν και κατόπιν μαζεύτηκαν επί ένα μπλοκ δέκτη παραφίνη. Τμήματα (4 mm) από αυτά τα μπλοκ μικροσυστοιχιών κόπηκαν και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση IHC.

Οι τομές επωάστηκαν με ορό διάλυμα αποκλεισμού και πρωτεύοντα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντι-BCAR1 (BD Transduction Laboratories, USA, 1: 100), αντι-φωσφο-BCAR1 (Tyr410) αντίσωμα (Abcam, ΗΠΑ, 1:100), αντίσωμα αντι-ρ38 (BD Transduction Laboratories, USA, δύο παρα δέκα) και αντι-φωσφο-ρ38 (/Tyr182) αντίσωμα Thr180 ( κυτταρικής σηματοδότησης Transduction Laboratories, USA, 1:10), βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα, και υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης-ραφανιδικής. Διαμινοβενζιδίνη διάλυμα χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. Τα πλακίδια στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν σε ένα διάλυμα αιματοξυλίνης. Τα αποτελέσματα IHC στις πρωτεΐνες αφθονία ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τα ποσοστά των θετικών κυττάρων ως εξής: -, αρνητική χρώση? +, Αδύναμη θέση (& lt? 25%)? ++, Μέτρια θέση (& lt? 50%)? +++, Ισχυρή θέση (≥50%). «& Lt? 25%» ταξινομήθηκε ως χαμηλή έκφραση, διαφορετικά, όπως υψηλή έκφραση Τρεις παρατηρητές διενεργείται με γκολ των διαφανειών και μέσες τιμές ελήφθησαν τελικά

dUTP nick δοκιμασία τέλος επισήμανση TDT μεσολάβηση (TUNEL) της.. NSCLC ιστούς

Διενεργήσαμε δοκιμασία TUNEL σε τομές ιστού από όλες τις 182 περιπτώσεις. η απόπτωση στον όγκο επιθεωρήθηκε με επιτόπου κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου POD (Roche, Germany). τομές ιστού deparaffinize σε ξυλόλιο, και ενυδατωμένο μέσω διαβαθμισμένη αιθανόλη και προκατεργάστηκαν με ανάκτηση αντιγόνου με μικροκύματα (κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 7.5). η ενδογενής υπεροξειδάση παρεμποδίστηκε με 0.3% η

2O

2 σε μεθανόλη για 15 λεπτά. στη συνέχεια, οι τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3% βόεια αλβουμίνη ορού για 30 λεπτά και επωάστηκαν με μίγμα της αντίδρασης TUNEL. (TDT: dUTP, 1:20) για 45 λεπτά στους 37 ° C τομές ιστού συνδυάζονται με Converter-POD, που ακολουθείται από πλύση και DAB (Zhong Shong, Κίνα) χρωματική αντίδραση . Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας TUNEL, τα τμήματα πλύθηκαν σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS). Τομές ιστού βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αιθανόλης, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και τοποθετημένα. Για αρνητικούς ελέγχους, απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκε αντί του TDT. Οι θετικοί έλεγχοι αποτελούνταν από φλεγμονή ανθρώπινης αμυγδαλής. Τα κύτταρα θεωρούνται θετικά όταν έντονο καστανό αντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε στους πυρήνες. δείκτης αποπτωτικά υπολογίστηκε το ποσοστό των πυρηνικών θετικών λεκέ σε 1.000 κύτταρα σε πέντε διαφορετικά σημεία του κάθε τμήματος σε 400 χ μεγέθυνση.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του RNAi του BCAR1, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR σε κύτταρα ελέγχου Α549-Α549 αρνητικού-BCAR1-RNAi και. Είτε των κυττάρων σπάρθηκε σε συγκέντρωση 1 × 10

5cells /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από δύο ημέρες σπορά, ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε με M-MLV μεταγραφάσης (Promega) και ολίγο dT. Real-time PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR κύριο μείγμα (TAKARA) και το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν ως εξής: 5′-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 ‘και 5′-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3’. Η εξειδίκευση της ανιχνεύονται σήματα επιβεβαιώθηκε από μια καμπύλη διάστασης που αποτελείται από μία μονή κορυφή. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν σε κάθε πείραμα. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με την ανθρώπινη β-ακτίνη.

Cell Growth Δοκιμασία

Για την αξιολόγηση της ανάπτυξης των κυττάρων, τα κύτταρα Α549-αρνητικό έλεγχο και Α549-BCAR1-RNAi απλώθηκε στο 2,0 × 10

2 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων, αντίστοιχα. Και είτε των κυττάρων επιθεωρήθηκε και φωτογραφήθηκε μετά από χρώση Giemsa, έντεκα ημέρες μετά την επιμετάλλωση.

Κυττάρων Η μετανάστευση Δοκιμασία

Για την αξιολόγηση της κινητικότητας των κυττάρων, δοκιμασίες μετανάστευσης θάλαμος διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα ένθετο κυτταρικής καλλιέργειας ( 8-μm μέγεθος πόρων, τη μορφή 24-καλά? εισβολή των κυττάρων Assay Kit Cat CHEMICON, Νο ECM550).. Α549-αρνητικό έλεγχο και Α549-BCAR1-RNAi κύτταρα σπάρθηκαν εις διπλούν με πυκνότητα 3,0 × 10

5 κύτταρα /θάλαμο. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα τα οποία δεν είχαν μετακινηθεί στα κάτω φρεάτια αφαιρέθηκαν από την άνω όψη των φίλτρων χρησιμοποιώντας μπατονέτες, και τα κύτταρα που είχαν μετακινηθεί στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κινητό Invasion Δοκιμασία Cat Kit. (Chemicon, Νο ECM550). Η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε ποσοτικά με οπτική καταμέτρηση μετά να φωτογραφηθούν. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Οι μέσες τιμές για τα τρία τυχαία πεδία ελήφθησαν για κάθε φρεάτιο.

Αναλύσεις Κύκλου Κυττάρου

Για τον προσδιορισμό κυτταρομετρίας ροής των κύκλων των κυττάρων, 2.0 × 10

6 κυττάρων ελέγχου Α549-Α549 αρνητικά και κύτταρα -BCAR1-RNAi σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, αντίστοιχα. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν επί FACScan κυτταρόμετρο ροής για σχετικό κυτταρικών κύκλων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν.

κυτταρικής απόπτωσης Αναλύσεις

Εμείς αξιολογούνται κυτταρική απόπτωση χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρομετρητή ροής. 2,0 × 10

6 κυττάρων Α549-αρνητικό μάρτυρα (48 ώρες μετά την παροδική διαμόλυνση), τα κύτταρα ελέγχου Α549-αρνητικό (σταθερή επιμόλυνση), κύτταρα Α549-BCAR1-RNAi (48 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση) και Α549-BCAR1-RNAi κύτταρα (σταθερή διαμόλυνση) σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, αντίστοιχα. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν επί FACScan κυτταρόμετρο ροής για σχετικό κυτταρικής απόπτωσης. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν.

Ανάλυση Δεδομένων

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test του Student, Mann-Whitney τεστ U, τεστ Kruskal-Wallis,

X

2 δοκιμών και rho του Spearman, αντίστοιχα. Θάνατος από οποιαδήποτε αιτία συμπεριλήφθηκε στον υπολογισμό της μετεγχειρητικής επιβίωσης. Η ασθένεια συγκεκριμένη επιβίωσης υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και αναλύθηκαν από την δοκιμασία log-rank. Προγνωστικοί παράγοντες εξετάστηκαν από μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνους. Όλα τα προαναφερθέντα υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 11.0 λογισμικό για Windows (SPSS, Inc., Chicago, USA). Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 (δύο όψεων) θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

BCAR1 υπερεκφράζεται σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές

έκφραση BCAR1 ανιχνεύθηκε (είτε. στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα ή και τα δύο) σε 57 από τις 60 περιπτώσεις NSCLC χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 1α), και 177 της 182 NSCLC περιπτώσεις με χρήση του προσδιορισμού IHC (Σχήμα 1γ), αντίστοιχα. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε στο φυσιολογικό γειτονικό ιστό σε 53 από τις 60 περιπτώσεις με τη χρήση ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 1α), και 161 των 182 περιπτώσεις με χρήση του προσδιορισμού IHC (Σχήμα δεν φαίνεται), αντίστοιχα. Ανάλυση του γκρι κλίμακες ανοσοαποτύπωση πρότεινε επίσης BCAR1 επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε NSCLC από ό, τι στην κανονική παρακείμενο ιστό (48,2 ± 24,7 vs 11,0 ± 9,8, t-test του Student,

P

& lt? 0.001, Εικόνα 1β).

Α: Ανοσοστύπωμα αναφέρεται είτε BCAR1 ή φωσφο-ρ38 (Thr180 /Tyr182) επίπεδα σε τρεις NSCLC ιστούς (C) ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι στις γειτονικές φυσιολογικούς ιστούς (Ν). Αλλά φωσφο-BCAR1 (Tyr410) και ρ38 επίπεδα σε NSCLC και τα γειτονικά φυσιολογικών ιστών ήταν παρόμοια. BCAR1, φωσφο-BCAR1, p38 και εκφράσεις φωσφο-ρ38 ανιχνεύθηκαν επίσης στα Α549 και Calu-3 κυτταρική σειρά NSCLC χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανοσοαποτύπωσης. BCAR1 νοκ ντάουν προκαλεί την αισθητή μείωση των επιπέδων φωσφο-BCAR1 και φωσφο-ρ38 στα κύτταρα Α549. B: γκρι ανάλυση ανοσοστύπωσης πρότεινε επίσης BCAR1 και φωσφο-ρ38 (/Tyr182 Thr180) επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε NSCLC από ό, τι στην κανονική παρακείμενο ιστό (48,18 ± 24,7 vs 10,97 ± 9,8,

P

& lt? 0.001 ? 16.03 ± 5.8 vs 28.82 ± 8.0,

P

& lt? 0.001). Ωστόσο, φωσφο-BCAR1 (Tyr410) και p38 δεν είχε την τάση (20.72 ± 6.4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22? 25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476 ). C: IHC πρότεινε τις εκφράσεις του BCAR1 (είτε στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα), φωσφο- BCAR1 (επιρρεπείς να εντοπίσετε στο κυτταρόπλασμα), φωσφο-ρ38 (επιρρεπείς να εντοπίσετε στον πυρήνα), ρ38 (επιρρεπείς να εντοπίσετε στο κυτταρόπλασμα ) και αποπτωτικών σωμάτων. Σημείωση: N (παρακείμενο φυσιολογικό ιστό)? C (NSCLC ιστού)? ** (

P

& lt? 0.001)? # (

P

& gt? 0,05).

Η

Ωστόσο, φωσφο-BCAR1 (Tyr410) ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα σε 29 από τις 60 NSCLC χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 1α), και 32 περιπτώσεις από τις 182 περιπτώσεις NSCLC χρησιμοποιώντας δοκιμασία IHC (Σχήμα 1γ), αντίστοιχα. Ωστόσο, ανιχνεύθηκε επίσης στο φυσιολογικό γειτονικό ιστό σε 30 από τις 60 περιπτώσεις με τη χρήση ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 1α), και 34 των 182 περιπτώσεις με χρήση του προσδιορισμού IHC (Σχήμα δεν φαίνεται), αντίστοιχα. Ανάλυση του γκρι κλίμακες ανοσοαποτύπωση πρότεινε δεν υπήρχε σημαντική διαφορά των επιπέδων BCAR1 μεταξύ NSCLC και το φυσιολογικό γειτονικό ιστό (25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476, t-test του Student, σχήμα 1β) .

BCAR1 και φωσφο-BCAR1 (Tyr410) ανιχνεύθηκε σε Α549 και Calu-3 κύτταρα NSCLC χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 1α).

Ανώτατη BCAR1 επίπεδα συνδέονται στενά με την πιο φτωχά διαφοροποιημένο όγκους και προβλέπει χειρότερη πρόγνωση

με τη χρήση της δοκιμασίας IHC στις 182 περιπτώσεις NSCLC, βρήκαμε ότι τα υψηλότερα επίπεδα BCAR1 είχαν συσχετίζεται έντονα με πιο φτωχά διαφοροποίηση. (Τεστ Kruskal-Wallis,

P

= 0,01? Πίνακας 1). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία αξιόλογη συσχέτιση μεταξύ BCAR1 και άλλες κλινικές-παθολογικές χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, την ιστολογία, το στάδιο TNM, το μέγεθος του όγκου και λεμφαδένα μετάσταση (Πίνακας 1). Παρά έκφραση BCAR1 ανιχνεύθηκε είτε σε κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα, ή και τα δύο σε NSCLC, δεν υπήρχε αισθητή συσχέτιση μεταξύ της θέσης της πρωτεΐνης και κλινικές-παθολογικές παράμετροι (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εκτός αυτού, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ φωσφο-BCAR1 και τα κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το ποσοστό επιβίωσης της ομάδας υψηλού έκφραση BCAR1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από της ομάδας χαμηλής έκφρασης (

P

= 0,001, Σχήμα 2Α). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα BCAR1 (αναλογία κινδύνου 1.777,

P

= 0,028), μετάσταση λεμφαδένα (αναλογία κινδύνου 1.277,

P

= 0,040) και το στάδιο ΤΝΜ (αναλογία κινδύνου 1.298,

P

= 0.007) ήταν σημαντική και ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτες για τις περιπτώσεις NSCLC (Πίνακας 2)

Α:. Το ποσοστό επιβίωσης των BCAR1 υψηλής εξέφρασε ομάδας ήταν σημαντικά χαμηλότερη από της χαμηλής εκφράζεται ομάδα (

P

= 0,001). Β: Φωσφο-ρ38 θετικά κύτταρα ήταν σημαντικά και θετικά με ποσοστά BCAR1 θετικών κυττάρων, στα 182 ιστούς NSCLC (rho Spearman, η συντελεστής συσχέτισης = 0,811, ρ & lt? 0.001). Και τα ποσοστά του φωσφο-ρ38 θετικά κύτταρα σε BCAR1 υψηλής εκφράζεται ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερες από ό, τι χαμηλής εκφράζεται ιστούς (Mann-Whitney U test z = -3.689

P

& lt? 0.001). C: Οι διαδοχικές τομές χρωματίστηκαν για BCAR1, φωσφο-BCAR1, φωσφο-ρ38 και ρ38, η οποία κατέδειξε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν BCAR1 έχουν επίσης ένα υψηλότερο επίπεδο φωσφο-ρ38 (χ 200). Είτε φωσφο-BCAR1 ή p38 ήταν ελαφρώς θετική.

Η

BCAR1 νοκ ντάουν προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, η αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων και τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων Α549

Εμείς ιδρύθηκε ανθρώπινο NSCLC κύτταρα καρκίνου του Α549, ότι σταθερά εκφράζεται pLVT351-LV (Κύτταρα Α549-BCAR1-RNAi) και CMV-GFP-L.V. (Κύτταρα ελέγχου αρνητικός Α549-) μέσω της χρήσης ενός λεντοϊού συστήματος. Τουλάχιστον μια μείωση κατά 80% στα επίπεδα mRNA των BCAR1 σε κύτταρα Α549-BCAR1-RNAi επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 3α) και κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 1α), αντίστοιχα. Ταυτόχρονα, μπορούμε να δούμε την αναστολή της φωσφο-BCAR1 μαζί με BCAR1 νοκ ντάουν (Σχήμα 1α)

Α:. Τουλάχιστον μια μείωση κατά 80% σε mRNA των BCAR1 στα κύτταρα Α549-BCAR1-RNAi επιβεβαιώθηκε με πραγματικό χρόνος RT-PCR. Β: Αποικία μονάδες σχηματισμού του Α549-BCAR1-RNAi ήταν ανιχνεύσιμα μικρότερο των κυττάρων ελέγχου Α549-αρνητικό, έντεκα ημέρες μετά τον εμβολιασμό. C: δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων πρότεινε BCAR1 νοκ-άουτ εμπόδισε τη μετανάστευση των κυττάρων των κυττάρων Α549-BCAR1-RNAi. D: Η κυτταρομετρία ροής έδειξε BCAR1 νοκ-άουτ προκάλεσε επίσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων Α549-BCAR1-RNAi. Ε:. Κυτταρομετρίας ροής έδειξε νοκ-άουτ BCAR1 δεν αυξήσει το ποσοστό απόπτωσης μετά είτε παροδική (39,1% έναντι 42,1%) ή σταθερή διαμόλυνση (0,33% έναντι 0,4%) σε κύτταρα Α549

Η

Σχήμα 3β προτεινόμενες μονάδες σχηματισμού αποικίας των κυττάρων Α549-BCAR1-RNAi ήταν ανιχνεύσιμα μικρότερο από των κυττάρων ελέγχου Α549-αρνητικό, έντεκα ημέρες μετά την επίστρωση (σχήμα 3β). δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων προτεινόμενες BCAR1 knockdown εμπόδισε μετανάστευση κυττάρων Α549 κυττάρων-BCAR1-RNAi (Σχήμα 3c). Και κυτταρομετρία ροής έδειξε BCAR1 νοκ ντάουν προκάλεσε επίσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων Α549-BCAR1-RNAi (Σχήμα 3δ).

BCAR1 είναι αρνητικά συσχετισμένη με αποπτωτικό δείκτη σε ιστούς NSCLC. Ωστόσο, BCAR1 νοκ ντάουν δεν μπορεί να αυξήσει την απόπτωση στα Α549 κύτταρα

σώματα αποπτωτικά ανιχνεύθηκαν σε όλους τους ιστούς 182 NSCLC (Σχήμα 1γ). Μεταξύ των ιστών, υπήρξε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ BCAR1 και αποπτωτικό δείκτη (rho του Spearman, συντελεστής συσχέτισης = -0.183?

P

= 0,013). Δείκτης αποπτωτικών σε BCAR1 υψηλής εξέφρασε ιστούς ήταν σημαντικά χαμηλότερο από ό, τι στην BCAR1 χαμηλής εξέφρασε ιστούς (έλεγχος τ t = 2.312

P

= 0.022).

Ωστόσο, σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα κύτταρα, BCAR1 νοκ-άουτ δεν αυξήσει το ποσοστό απόπτωσης μετά είτε παροδική (39,1% έναντι 42,1%) ή σταθερή διαμόλυνση (0,33% έναντι 0,4%) σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3e).

η υπερέκφραση του BCAR1 συσχετίζεται με την ενεργοποίηση του p38 σε περιπτώσεις NSCLC και BCAR1 νοκ ντάουν προκαλεί μείωση της φωσφο-ρ38 στα κύτταρα Α549

φωσφο-ρ38 έκφραση ανιχνεύθηκε σε 31 από τις 60 περιπτώσεις NSCLC χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωση (Σχήμα 1α), και 91 του 182 NSCLC περιπτώσεις (επιρρεπείς να εντοπίσετε στον πυρήνα) χρησιμοποιώντας δοκιμασία IHC (Σχήμα 1γ). Παρόμοια με την τάση των επιπέδων BCAR1, γκρι ανάλυση κλίμακες αποκάλυψε επίπεδα φωσφο-p38 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε NSCLC από ό, τι στους φυσιολογικούς γειτονικούς ιστούς (16.03 ± 5.8 vs 28.82 ± 8.0,

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1β) . Ωστόσο, p38 δεν είχε την τάση (20.72 ± 6.4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22) (Σχήμα 1β). Εκτός αυτού, IHC προτεινόμενες θετικό ρυθμό είτε BCAR1 ή φωσφο-ρ38 ήταν σημαντικά υψηλότερο σε NSCLC απ’ότι στους φυσιολογικούς ιστούς (

P

& lt? 0.001 και Ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα) (Πίνακας 1). Ωστόσο, p38 δεν είχε τέτοια τάση (

P

= 0,62).

Βρήκαμε ποσοστά της φωσφο-ρ38 θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά και θετικά με εκείνες των BCAR1 θετικών κυττάρων, σε όλα τα 182 NSCLC ιστούς (rho του Spearman, συντελεστής συσχέτισης = 0.811, p & lt? 0.001? Σχήμα 2β). Και τα ποσοστά του φωσφο-ρ38 θετικά κύτταρα σε BCAR1 υψηλής εκφράζεται ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερες από ό, τι BCAR1 χαμηλής εκφράζεται ιστούς (Mann-Whitney U test z = -3.689

P

& lt? 0,001? Εικόνα 2b). Ωστόσο, δεν υπήρχε καμία συσχέτιση μεταξύ φωσφο-BCAR1 και τα επίπεδα φωσφο-ρ38 (P = 0,892).

Σε μια προσπάθεια να απεικονίσει την ισχυρή συσχέτιση μεταξύ BCAR1 θετική και φωσφο-ρ38 θετικά κύτταρα, παρουσιάσαμε τη διαδοχική τομές χρωματίστηκαν σε μία περίπτωση για BCAR1, φωσφο-BCAR1, φωσφο-ρ38 και ρ38, η οποία κατέδειξε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν BCAR1 έχουν επίσης ένα υψηλότερο επίπεδο φωσφο-ρ38 (Σχήμα 2c).

επίπεδα

BCAR1 σε Calu-3 κύτταρα με ανιχνεύσιμο υψηλότερο σε σύγκριση με κύτταρα Α549 (Σχήμα 1Α). Περιέργως, Σχήμα 1α προτεινόμενα επίπεδα φωσφο-ρ38 είχαν επίσης την ίδια τάση. Επιπλέον, BCAR1 νοκ ντάουν προκαλεί επίσης την αισθητή μείωση της φωσφο-ρ38 αφθονία σε κύτταρα Α549 (Σχήμα 1α).

Συζήτηση

BCAR1 ως πρωτεΐνη προσαρμογέα εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 16q22-q23

7 , και κυρίως αποτελείται από τέσσερα λειτουργικά τμήματα συμπεριλαμβανομένης μιας αμινο-τερματικό Src ομολογίας 3 (SH3) περιοχή, μία Src-πεδίο σύνδεσης (SBD), έναν τομέα μεγάλο υπόστρωμα (SD) και ένα πεδίο έλικας-θηλιάς-έλικας (HLH) [12 ], [13]. BCAR1 τοποθετεί πανταχού in vitro και σε in vivo [14], [15], [16], και εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης, χημειοταξία, την απόπτωση, κυτταρικό κύκλο, διαφοροποίηση και ούτω καθεξής [17], [18].

Μέχρι στιγμής, πολύ λίγες μελέτες επικεντρώθηκαν στην καρκινογένεση του BCAR1 στον καρκίνο του πνεύμονα. Wei et al. [19] πρότεινε ότι αγκύρωση-ανεξάρτητο φωσφορυλίωση BCAR1 προστατεύεται κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα από anoikis. Πρόσφατα, η μελέτη μας υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα BCAR1 ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε NSCLC σχέση με την ομάδα ελέγχου, αυξάνεται σταδιακά με την εξέλιξη της στάσης του όγκου, και μειωμένη μετά την απομάκρυνση των κακοηθών αλλοιώσεων [9]. Ως αποτέλεσμα, έχουμε θεωρείται ένα μυθιστόρημα ογκογόνο ρόλο της BCAR1 σε NSCLC. Στο παρόν, έχουμε ως στόχο να επαληθεύσει τις κλινικές επιπτώσεις της BCAR1 υπερέκφραση και NSCLC, και για τη διαλεύκανση των καρκινογόνο μηχανισμούς BCAR1 σε NSCLC. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε BCAR1 πρωτεΐνη είναι ιδιαίτερα πλούσιες σε κύτταρα NSCLC και τους ιστούς. Και οι μελέτες μας in vivo και in vitro έδειξαν τη στενή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BCAR1 και ενεργοποίηση της p38 MAPK. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η φωσφορυλίωση τυροσίνης του BCAR1 μπορεί να είναι κρίσιμη για τους μεταγενέστερους σηματοδότηση [20], η μελέτη μας έδειξε ότι φωσφο-BCAR1 (Tyr410) ανιχνεύθηκε σε μόνο 34 από τις 182 περιπτώσεις, και δεν συσχετίζεται με την κλινική-παθολογική χαρακτηριστικά. Μέχρι στιγμής, τα πολυάριθμα αξιοθέατα της φωσφορυλίωσης ανθρώπινης BCAR1 βρεθεί ως: τυροσίνης υπολείμματα αα 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666? υπολείμματα σερίνης αα 134, 139, 292, 437, 639? και τα κατάλοιπα θρεονίνης αα 269, 326, 385. Υποθέτουμε ότι ορισμένες ειδικές θέσεις φωσφορυλίωσης είναι ζωτικής σημασίας για τους καταρράκτες του σήματος της BCAR1 σε NSCLC. Περιέργως, τα παρακείμενα φυσιολογικών ιστών παρουσιάζουν πολύ υψηλότερα επίπεδα φωσφο-BCAR1 από του BCAR1 πρωτεϊνών (Σχήμα 1α). Επιβεβαιώσαμε επίσης την αναστολή της φωσφο-BCAR1 μαζί με BCAR1 knockdown σε μια προσπάθεια να επαληθευθεί η αποτελεσματικότητα αυτού του αντισώματος. Υποθέτουμε ότι ένα ειδικό ένζυμο στους ιστούς των πνευμόνων αποσυντίθεται συγκεκριμένα μη-φωσφο-BCAR1, ωστόσο, φωσφο-BCAR1 μπορεί να επιβιώσει. Και όλες οι προαναφερθείσες υποθέσεις αξίζουν περαιτέρω περισσότερες έρευνες.

Τα πειράματά μας in vitro έδειξαν ότι BCAR1 νοκ ντάουν σε κύτταρα Α549 προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων, αναστολή του κυτταρικού κύκλου και την αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι BCAR1 νοκ ντάουν σε κύτταρα Α549 δεν προκαλούν κυτταρική απόπτωση, υπήρξε μια αξιόλογη και αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ BCAR1 και αποπτωτικό δείκτη σε ιστούς NSCLC. Δεν γνωρίζουμε τους λόγους για ασυμφωνία μεταξύ NSCLC κυττάρων και ιστών. Επιπλέον, η μελέτη μας in vivo έδειξαν ότι τα επίπεδα BCAR1 σημαντικά και αντιστρόφως ανάλογη με τη διαφοροποίηση του όγκου, είτε με καταμέτρηση θετικά ποσοστά των κυττάρων (τεστ Kruskal-Wallis,

P

= 0,010) ή την αξιολόγηση χρωματισμένο ένταση (achromasy = 0 , stramineous = 1, αδρής = 2, καφέ = 3? Kruskal-Wallis test,

P

= 0,014). Καμπύλη Kaplan-Meier έδειξε επίσης ότι τα υψηλότερα επίπεδα της BCAR1 προβλέψει χειρότερη πρόγνωση σε 151 περιπτώσεις με έγκυρα δεδομένα παρακολούθησης. Όλες οι προαναφερθείσες πειράματα πρότειναν BCAR1 είχε έναν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση. Εκτός αυτού, BCAR1 είναι γνωστή ως Src υπόστρωμα, και Src αναστολέα AZD0530 μπορεί επίσης να οδηγήσει σε σημαντική αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και matrigel εισβολή στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [21], το οποίο υποστηρίζει την δυνητικά καρκινογένεση του άξονα Src /BCAR1.

Χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση, Greenberg et al. [22] βρήκαν ότι μόνο ενεργοποιημένη ρ38 ΜΑΡΚ αυξήθηκε σταθερά σε NSCLC σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, υποδηλώνοντας έναν επιπλέον ρόλο προς αυτήν την οδό σε κακοήθη κυτταρική ανάπτυξη ή μετατροπή. Πράγματι, πολλές μελέτες είχαν αποκάλυψε τις καρκινογόνο δραστηριότητες της ρ38, συμπεριλαμβανομένων διέγερση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης [1], [23], [24]. Matsuda Κ et al. [23] διαπίστωσε ότι το ΕΤΠ προωθεί τον πολλαπλασιασμό μέσω p38 ΜΑΡΚ καταρρακτών σηματοδότησης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος ASPC-1, PANC-1 και Τ3Μ4, και p38 ΜΑΡΚ αναστολέα SB203580 μπορεί να αναστείλει EGF-διεγείρεται μιτογένεση. Εκτός αυτού, το μονοπάτι ΜΑΡΚ p38 έχει ενοχοποιηθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων επειδή ανασταλτική δραστικότητα p38MAPK ρυθμίζει προς τα κάτω το VEGF διεγείρεται μετανάστευση [24]. Πρόσφατα, Wendt et al. Μελέτη [25] έδειξαν ότι αύξηση της έκφρασης είτε της πλήρους μήκους ή απλά καρβοξυλο άκρο του BCAR1 σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού αυξημένη ενεργοποίηση ρ38. Περιέργως, σε 182 ιστούς NSCLC, βρήκαμε υπήρχε μια στενή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των BCAR1 και φωσφο-ρ38. Με την αξιολόγηση χρωματισμένο ένταση της φωσφο-ρ38 και BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, αδρής = 2, καφέ = 3, «& lt? 2 βαθμολογίες» ταξινομήθηκαν ως χαμηλή έκφραση, διαφορετικά, όπως υψηλή έκφραση), βρήκαμε την αφθονία των φωσφο-ρ38 επίσης σημαντικά και θετικά με εκείνη του BCAR1 (rho του Spearman, p & lt? 0.001). Εκτός αυτού, BCAR1 νοκ ντάουν προκάλεσε επίσης την αισθητή μείωση των επιπέδων φωσφο-ρ38 στα κύτταρα Α549 Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί αξίζουν περαιτέρω έρευνες Επιπρόσθετα..