Οστών

Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) οστικές μεταστάσεις έχουν εδώ και καιρό πιστεύεται ότι είναι οστεοβλαστική λόγω των οστών αναδιαμόρφωση οδηγώντας στο σχηματισμό νέου οστού. Ωστόσο, οι πρόσφατες μελέτες που απεικονίζονται αυξημένη δραστηριότητα οστεολυτική στα αρχικά στάδια του προστάτη οστικές μεταστάσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στόχευση τόσο οστεολυτικές και οστεοβλαστικές μεσολαβητές θα ήταν πιθανόν να αναστέλλει την αναδιαμόρφωση των οστών και του προστάτη μετάσταση στα οστά. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα κύτταρα του προστάτη θα μπορούσε να τονώσει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών μέσα από το πάνω ρύθμιση RANKL, RUNX2 και οστεοποντίνη, προωθώντας την ανάπλαση του οστού. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι διαμορφώνονται ισοφλαβόνης και 3,3′-Diindolylmethane (BR-DIM) ήταν ικανά να αναστείλουν την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών μέσω της αναστολής της μεταγωγής σήματος κυττάρου σε RANKL, οστεοβλαστικής, και κυτταρική σηματοδότηση PCa. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφραση του miR-92a, η οποία είναι γνωστό ότι σχετίζονται με σηματοδότηση RANKL, ΕΜΤ και την εξέλιξη του καρκίνου. Με πορεία και ανάλυση του δικτύου, παρατηρήσαμε επίσης τις ρυθμιστικές επιπτώσεις των ισοφλαβονών και BR-ΔΗΜ σε πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης όπως AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, MITF, κ.λπ. Ως εκ τούτου, ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ με multi τους -targeted συνέπειες θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για την πρόληψη της εξέλιξης προστάτη, ειδικά από εξασθένηση των μηχανισμών μετάσταση στα οστά

Παράθεση:. Li Υ, Κονγκ D, Ahmad A, Bao Β, Sarkar FH (2012) Στόχευση οστικής ανακατασκευής από Isoflavone και 3,3′-Diindolylmethane στο πλαίσιο του καρκίνου του προστάτη μετάσταση στα οστά. PLoS ONE 7 (3): e33011. doi: 10.1371 /journal.pone.0033011

Επιμέλεια: Μουζαφέρ Cicek, Mayo Clinic College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Δεκεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 2 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7, Μαρτίου 2012 |

Copyright: © 2012 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (5R01CA083695, 5R01CA108535, 5R01CA132794 και 5R01CA131151 απονέμεται σε FHS). Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Puschelberg και Guido θεμέλια για τη γενναιόδωρη οικονομική συνεισφορά τους. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συγγραφέας Fazlul Sarkar και συν-συγγραφέας Aamir Ahmad είναι PLoS ONE Editorial μελών του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μια κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου των σχετικών οι θάνατοι στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες, με εκτιμώμενη 241.740 νέα κρούσματα και 28.170 θάνατοι αναμένεται το 2012 [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας των PCA είναι οφείλεται κυρίως στην ανάπτυξη της μετάστασης. Προστάτη εμφανίζει συνήθως προοδευτική χαρακτηριστικά του μέσα από καταρράκτες της εξάρτησης των ανδρογόνων να ευνουχίσει αντίσταση με ενδεχόμενη μετάσταση. Ακόμη και αν η PCa μπορεί να θεωρηθεί εντοπισμένο στον προστάτη, εξακολουθεί να υπάρχει 15% έως 20% συχνότητα εμφάνισης της μετέπειτα μετάσταση [2]. Έχει αναφερθεί ότι το 35% των ασθενών με προστάτη αναπτύσσουν hematogeneous μεταστάσεις και ότι μετάσταση στα οστά του προστάτη είναι η πιο συχνή (-90%) μεταξύ των hematogeneous μεταστάσεις [3]. Του προστάτη οστικές μεταστάσεις έχουν από καιρό πιστεύεται ότι είναι οστεοβλαστική λόγω του σχηματισμού νέου οστού. Ως εκ τούτου, η στόχευση οστεοβλαστικής μόρια όπως ενδοθηλίνη-1, ΒΜΡ, και σηματοδότηση Wnt έχει θεωρηθεί ως στρατηγικές για την αναστολή της μετάστασης του προστάτη του οστού [2]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες διαπιστώθηκε αυξημένη δραστηριότητα οστεολυτική στα αρχικά στάδια των μεταστάσεων προστάτη των οστών [4], [5]. Αρκετοί αυξητικοί παράγοντες βρέθηκαν να απελευθερωθεί από τη μήτρα του οστού κατά τη διάρκεια της αποδόμησης όταν τα κύτταρα του προστάτη κάνει μετάσταση στο κόκκαλο. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να εξαπλωθεί στα οστά και να αξιοποιήσει την τοπική μηχανήματα κυτοκίνης να διεγείρει την οστεοκλαστογένεση, με αποτέλεσμα την οστική απορρόφηση και καρκινικών κυττάρων ανάπτυξη [6]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η ανάπλαση του οστού περιλαμβανομένων των διαδικασιών οστεολυτικές και οστεοβλαστικές συμβαίνει κατά τη διάρκεια του προστάτη μετάσταση στα οστά και, με τη σειρά της, ευνοεί την ανάπτυξη των κυττάρων προστάτη στο νεοσχηματισμένο οστό. Ως εκ τούτου, η μοριακή στόχευση τόσο οστεολυτικές και οστεοβλαστικές μεσολαβητών θα ήταν πιθανόν αναστέλλουν την αναδιαμόρφωση των οστών, η οποία θα μπορούσε να γίνει μια νεότερη θεραπευτική στρατηγική για την αναστολή της μετάστασης του προστάτη του οστού.

Για την αναστολή της διαδικασίας οστεολυτικές, διάφορες στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί συμπεριλαμβανομένης της χρήσης των διφωσφονικών και η στόχευση των βιολογικών ρυθμιστές της οστεοκλαστογένεσης, όπως οστεοπροτεγερίνη (OPG), ενεργοποιητής του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANK) και ενεργοποιητής του υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANKL). Το πιο σημαντικό μηχανήματα κυτοκίνη, η οποία εμπλέκεται στην οστική ανακατασκευή και PCa μετάσταση των οστών, είναι OPG /RANK /RANKL σηματοδότηση [7], [8]. RANKL εκφράζεται από οστεοβλάστες, και είναι αναγκαίο και επαρκές για την οστεοκλαστογένεση [9]. RANKL δεσμεύεται με τον υποδοχέα του RANK η οποία είναι παρούσα στην επιφάνεια των προδρόμων οστεοκλαστών, που επάγει τον σχηματισμό οστεοκλαστών και της ενεργοποίησης [9], [10]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα RAW264.7, ένα από τα πρόδρομα οστεοκλαστών των μακροφάγων, θα μπορούσε να διαφοροποιηθούν σε οστεοκλάστες όταν καλλιεργείται με την παρουσία του RANKL [10]. Τα κύρια χαρακτηριστικά των οστεοκλαστών περιλαμβάνουν τις ικανότητες να απορροφούν οστό, για να εκφράσουν όξινη φωσφατάση ανθεκτική σε τρυγικό (TRAP), και για να εκφράσουν πρωτεάσες συμπεριλαμβανομένης μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), οι οποίες ευνοούν εισβολή καρκίνου και μετάσταση [10], [11]. Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση του RANKL έχει επίσης βρεθεί σε μερικά καρκινικά κύτταρα, καθώς και σε ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα [6], [11], [12]. Ως εκ τούτου, RANKL σηματοδότηση έχει πιστεύεται ότι είναι ένα θεραπευτικό στόχο για την αναστολή της οστικής ανακατασκευής και των οστών μετάσταση [13].

Επιπλέον, πολλά μόρια που περιλαμβάνουν την ενδοθηλίνη-1, ΒΜΡ, και Wnt έχουν πίστευαν ως το σημαντικό ρυθμιστικές αρχές για τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και το σχηματισμό των οστών [2], [14] – [16]. Οι ιστολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι οστεοβλαστικές βλάβες του προστάτη μετάσταση στα οστά η οποία χαρακτηρίζεται από την απόθεση των νέων οστών, τα οποία παράγονται από οστεοβλάστες, ανοργάνωτη και interlaced μεταξύ εστίες καρκινικών κυττάρων. Σε οστεοβλάστες, ενδοθηλίνη-1, ΒΜΡ, και τα μόρια σηματοδότηση Wnt είναι εντόνως εκφρασμένα. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα του οστού-ειδική αλκαλική φωσφατάση του ορού, ένας δείκτης της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών και του πολλαπλασιασμού, συχνά παρατηρείται σε ασθενείς με καρκίνο με μετάσταση στα οστά [17], υποδηλώνοντας τη σημασία αυτών των μορίων σε PCa μετάσταση στα οστά. Ως εκ τούτου, η στόχευση αυτών των οστεοβλαστική μόρια θα μπορούσαν να εμποδίσουν την αναδιαμόρφωση των οστών και τη μετάσταση του προστάτη των οστών.

Πρόσφατα, φυσικές ουσίες έχουν λάβει μεγάλη προσοχή στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο. Isoflavone genistein που βρίσκονται κυρίως σε σόγια έδειξε την ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

χωρίς τοξικότητα. Έχουμε βρει προηγουμένως ότι ισοφλαβόνης genistein θα μπορούσε να αναστείλει ΝΡ-κΒ και την ενεργοποίηση Akt σε καρκινικά κύτταρα [18]. Επιπλέον, έχουμε αναφέρει ότι τα διαιτητικά genistein θα μπορούσε να αναστείλει PCA σε πειραματική μετάσταση στα οστά σε έναν SCID-ανθρώπινο μοντέλο [19] και ότι η genistein θα μπορούσε να ενισχύσει την απόπτωση που επάγουν επιδράσεις χημειοθεραπευτικών παραγόντων μέσω προς τα κάτω ρύθμιση του NF-κΒ [20]. 3,3′-Diindolylmethane (DIM) είναι ένα άλλο φυσικό παράγοντα και βρίσκονται κυρίως στα μέλη της οικογένειας Cruciferae, όπως μπρόκολο. Εμείς και άλλοι έχουν βρει ότι DIM και επεξεργασμένου προϊόντος της (BR-DIM που κατασκευάζεται από την Βιοαντίδραση, LLC. Με ενισχυμένη βιοδιαθεσιμότητα) θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του AR, Akt και NF-κΒ, που οδηγεί στην αναστολή της ανάπτυξης του προστάτη και της επαγωγής της απόπτωσης

in vitro

και

in vivo

[21], [22]. DIM επίσης βρέθηκε να ενισχύει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών [23]. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε αν μείγμα ισοφλαβόνες G2535 περιέχει 70,5% genistein, και BR-DIM θα μπορούσε να αναστείλει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών διαμεσολαβείται μέσω της ρύθμισης των μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ανάπλαση του οστού και του προστάτη μετάσταση στα οστά.

Αποτελέσματα

Διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών στο σύστημα συγκαλλιέργειας με κύτταρα προστάτη

Για να διερευνήσουν το ρόλο της κυτταρικής σηματοδότησης των οστών που σχετίζονται με την ανάπλαση του οστού κατά τη διάρκεια του προστάτη μετάσταση στα οστά, έχουμε αναπτύξει για πρώτη φορά ένα συν ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ σύστημα για να επιτραπεί στα κύτταρα του προστάτη και των οστεοκλαστών ή οστεοβλαστών καλλιεργούνται υπό τις ίδιες συνθήκες μέσο καλλιέργειας. Βρήκαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα PC-3 προστατικού θα μπορούσε να αυξηθεί όμορφα με προ-οστεοκλαστών κύτταρα (RAW264.7) (Σχήμα 1Α) και ότι οι δύο C4-2B κύτταρα και προ-οστεοβλαστών (κύτταρα hFOB1.19) θα μπορούσε να αυξηθεί μαζί (Σχήμα 1Β) . Στη συνέχεια, κατεργάζεται συν-καλλιέργεια των PC-3 και τα κύτταρα RAW264.7 με ΚΑΝΚΕ ή ΤΟΡ-β να επάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Επωάσαμε το συν-καλλιέργεια κυττάρων C4-2B και hFOB1.19 στους 39 ° C για να επάγει διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. χρώση TRAP διεξήχθη για την ανίχνευση διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, ενώ η αλκαλική φωσφατάση χρώση διεξήχθη για την ανίχνευση της διαφοροποίησης οστεοβλάστης. Παρατηρήσαμε σχηματισμό πολυπύρηνων και το σκούρο καφέ σε κόκκους στις διαφοροποιημένες οστεοκλάστες που περιβάλλεται από PC-3 κύτταρα (Σχήμα 2Α), προτείνοντας ότι η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών μπορούσε να προκληθεί με ΚΑΝΚΕ ή ΤΟΡ-β σε PCa περιβάλλον ανάπτυξης. Παρατηρήσαμε επίσης σκούρο μπλε κόκκους σε κύτταρα hTOB1.19 περιβάλλονται από κύτταρα C4-2B (Σχήμα 2Β), υποδηλώνοντας ότι η οστεοβλάστη μπορούσε να διαφοροποιηθεί όταν καλλιεργείται μαζί με κύτταρα προστάτη.

A. PC-3 κύτταρα (υποδεικνύεται από μαύρο τρίγωνο) συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα RAW264.7 (υποδεικνύεται με μαύρο βέλος) σε χαμηλή κυτταρική πυκνότητα (a, b) και υψηλής κυτταρικής πυκνότητας (c, d). κύτταρα Β C4-2B (υποδεικνύεται με λευκό τρίγωνο) συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα hFOB1.19 (υποδεικνύεται με λευκό βέλος) σε χαμηλή κυτταρική πυκνότητα (e, f) και υψηλής πυκνότητας κυττάρων (g, h). × 100.

Η

Α. RAW264.7 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC-3 (που δείχνεται με μαύρο βέλος) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ng /ml RANKL (a, b) ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β (c, d) για 8 ημέρες. χρώση TRAP έδειξε σκούρο καφέ σε κόκκους (που υποδεικνύεται με λευκό βέλος) σε διαφοροποιημένα οστεοκλάστες που περιβάλλεται από PC-3 κύτταρα. κύτταρα Β hFOB1.19 καλλιεργήθηκαν μόνα τους (e, f) ή συν-καλλιεργημένα (g, h) με C4-2B κύτταρα (υποδεικνύεται με μαύρο τρίγωνο) σε 39 ° C για 5 ημέρες. χρώση αλκαλική φωσφατάση έδειξε σκούρο μπλε κόκκους (υποδεικνύεται με λευκό τρίγωνο) σε διαφοροποιημένες οστεοβλάστες. × 200.

Η

επάγεται ΤΟΡ-β διαφοροποίηση των οστεοκλαστών μέσω RANKL

Από τη στιγμή που παρατηρείται διαφοροποίηση των οστεοκλαστών από τον TGF-β, ελέγξαμε την επίδραση του ΤΟΡ-β στην έκφραση του RANKL . Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης του RANKL αυξήθηκε σημαντικά από την ΤΟΡ-β θεραπεία σε C4-2B και PC-3 κύτταρα (Σχήμα 3Α), υποδηλώνοντας ότι η επαγωγή της διαφοροποίησης οστεοκλαστών από τον TGF-β είχε προκαλείται μέσω της πάνω ρύθμιση του RANKL και ότι τα κύτταρα του προστάτη θα μπορούσε να παράγει RANKL να επάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Παρατηρήσαμε επίσης ότι το επίπεδο έκφρασης της CXCR-4, ένα από τα κρίσιμα γονίδια για μετάσταση, αυξήθηκε σημαντικά από την ΤΟΡ-β θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το αυξημένο επίπεδο του ΤΟΡ-β από κύτταρα όγκου ή στρωματικών θα μπορούσαν να προωθήσουν την αναδιαμόρφωση των οστών και προστάτη metatstasis μέσω RANKL και CXCR-4 σηματοδότηση

Α:. C4-2B και τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 ng /ml OPG ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β για 24 ώρες. Η έκφραση του RANKL και CXCR-4 πρωτεΐνης μετρήθηκε με ανάλυση Western Blot. Β και C: RAW246.7 (Β) και hFOB1.19 (C) κύτταρα σε κατώτερους θαλάμους συν-καλλιεργήθηκαν με C4-2B (C4), PC-3 (PC), ARCaP

Μ (Μ) και ARCaP

E (Ε) κύτταρα καρκίνου προστάτη στο άνω θαλάμων για 48 ώρες. ανάλυση Western Blot διεξήχθη για να μετρηθεί η έκφραση των οστεοκλαστών ή οστεοβλαστών δείκτες στα κύτταρα RAW264.7 ή hFOB1.19.

Η

Συγκαλλιέργεια με τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη αυξάνεται η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών

Για να διερευνήσουν κατά πόσο τα κύτταρα του προστάτη θα μπορούσε να προωθήσει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών, καλλιεργήσαμε κύτταρα RAW264.7 ή hFOB στον κάτω θάλαμο του συστήματος καλλιέργειας και καλλιεργούνται διάφορα κύτταρα του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων C4-2B, PC-3, ARCaP

Μ , και ARCaP

E κύτταρα στον άνω θάλαμο, έτσι ώστε οι πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να τεθεί κάτω θάλαμο από ανώτερο θάλαμο μέσω μιας μεμβράνης με 1 μm πόρου. Western Blot ανάλυση διεξήχθη για να μετρηθούν οι δείκτες διαφοροποίησης οστεοκλαστών και οστεοβλαστών. Βρήκαμε ότι η συν-καλλιέργεια των κυττάρων RAW264.7 με κύτταρα προστάτη αύξησε την έκφραση του TRAcP, ένας από τους σημαντικότερους δεικτών διαφοροποίησης οστεοκλαστών σε κύτταρα RAW264.7 (Σχήμα 3Β). Η έκφραση της φιμπρονεκτίνης ήταν επίσης αυξημένη όταν συν-καλλιεργήθηκαν με C4-2B και PC-3 κύτταρα (Σχήμα 3Β). Παρατηρήσαμε επίσης αυξημένη έκφραση του RUNX2, ένας από τους δείκτες οστεοβλαστών, σε κύτταρα hFOB1.19 (Σχήμα 3C). Η έκφραση οστεοποντίνης, ένα από τα σημαντικά γονίδια για οστικής ανακατασκευής, επίσης επάγεται όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα προστάτη (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα του προστάτη θα μπορούσε να παράγει ορισμένα μόρια που συμβάλλουν στην επαγωγή της διαφοροποίησης των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών, προκαλώντας οστική ανακατασκευή.

Isoflavone και BR-DIM ανέστειλε την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών

για τη διερεύνηση των επιδράσεων της ισοφλαβόνης και BR-DIM στο differntiation των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών, εμείς επεξεργασμένα κύτταρα RAW264.7 ή hFOB1.19 με 10 έως 25 μΜ G2535 ή BR-DIM κατά τη διάρκεια των διαδικασιών του οστεοκλαστών και οστεοβλαστών διαφοροποίησης. Διενεργήσαμε TRAP ή χρώση με αλκαλική φωσφατάση για την ανίχνευση της διαφοροποίησης των οστεοκλαστών ή οστεοβλαστών. Παρατηρήσαμε ότι η επαγόμενη από ΤΟΡ-β σχηματισμό πολυπύρηνων οστεοκλαστών και ότι ισοφλαβόνη και BR-DIM θεραπείες μειώθηκαν σημαντικά το σκούρο καφέ σε κόκκους σε κύτταρα RAW264.7 (Σχήμα 4Α) και τις σκοτεινές μπλε κόκκους σε κύτταρα hFOB1.19 όταν καλλιεργούνται μόνο του (Σχήμα 4Β ) ή συν-καλλιεργήθηκαν με C4-2B (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σαφώς ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα μπορούσε να αναστείλει την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών, που θα μπορούσαν να εξασθενούν κατά τη διάρκεια της οστικής ανακατασκευής PCa μετάσταση και θα ήταν ιδιαίτερα επιθυμητό για την αναστολή της μετάστασης του προστάτη του οστού

Α:. RAW246. 7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng /ml μόνο ή σε συνδυασμό με 10 μΜ G2535 για 8 ημέρες ΤΟΡ-β. χρώση TRAP διεξήχθη. Σκούρο καφέ σε κόκκους έδειξε τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. × 100. Β και C: κύτταρα hFOB1.19 καλλιεργήθηκαν μόνο (Β) ή συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα C4-2B (C) στους 39 ° C. Τα κύτταρα υπέστησαν επίσης αγωγή με 20 μΜ G2535 ή 10 μΜ BR-DIM για 5 ημέρες. χρώση αλκαλική φωσφατάση έδειξε σκούρο μπλε κόκκους στο διαφοροποιούνται οστεοβλάστες. × 200.

Η

Isoflavone και BR-DIM ρυθμιζόμενη RANKL και σηματοδότηση του καρκίνου του προστάτη, η οποία θα μπορούσε να αναστείλει την οστεοκλαστογένεση και τον καρκίνο του προστάτη ανάπτυξη

Δεδομένου ότι βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM ανέστειλε τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, ερευνήσαμε περαιτέρω τον μοριακό μηχανισμό της ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ δράσης για οστεοκλαστογένεση. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων C4-2B αντιμετωπίζονται με G2535 ή BR-ΔΗΜ. Με τη χρήση Ingenuity Pathway Analysis, βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM ανέστειλε την μεταγωγή κυτταρικών σημάτων στο μονοπάτι σηματοδότησης RANKL (Σχήμα 5Α και Πίνακας 1) και του προστάτη σηματοδότησης (Σχήμα 5Β και Πίνακας 1). BR-DIM και ισοφλαβόνη ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του MITF, ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες transcrption εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου οστεοκλαστικής (Εικόνα 5Α και στον Πίνακα 1). BR-DIM και ισοφλαβόνη ανέστειλαν επίσης τις μεταγωγές σήματος σε PCa σηματοδότηση με προς τα πάνω ρύθμιση της ρ27 και προς τα κάτω ρύθμιση PSA και κυκλίνης D (Σχήμα 5Β και Πίνακας 1). Επιπλέον, ισοφλαβόνης και BR-DIM ρυθμίζονται τα μόρια στα δίκτυα μεταγωγής σήματος με ρύθμιση προς τα κάτω της Akt, NKX3-1, STK-4, CDK13 και MITF (Σχήμα 5C, 5D και Πίνακας 1), που οδηγεί στην αναστολή της οστεοκλαστογένεσης και την ανάπτυξη του προστάτη. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε πραγματικού χρόνου RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων από μικροσυστοιχία και Ingenity Ανάλυση Pathway. Παρατηρήσαμε ότι BR-DIM και ισοφλαβόνες κάτω ρυθμίζεται η έκφραση της MITF, Akt, NKX3-1, κυκλίνη D και PSA, και up-ρύθμιση της έκφρασης του p27, p38 και CREB στο mRNA (Σχήμα 6 Α και 6Β) και πρωτεΐνη επίπεδα (Σχήμα 6C και 6D). Τα αποτελέσματα αυτά είναι συνεπή με τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, γεγονός που υποδηλώνει ότι BR-DIM και ισοφλαβόνες θα μπορούσε να αναστείλει την οστεοκλαστογένεση και την ανάπτυξη του προστάτη.

BR-ΔΗΜ ρυθμίζονται τα μόρια σε RANKL σηματοδότησης (Α), τη σηματοδότηση του καρκίνου του προστάτη (Β), και το σήμα δίκτυα μεταγωγής (C, D) αναλύθηκαν με μικροσυστοιχιών και ανάλυση Ingenuity Pathway σε κύτταρα C4-2B. Κόκκινο δείχνει τα επάνω ρυθμισμένη μόρια, ενώ το πράσινο διευκρινίζει κάτω-ρυθμίζονται μόρια. Τα στοιχεία αυτά δημιουργούνται αυτόματα από το λογισμικό Ingenuity Διαδρομή ανάλυση.

Η

BR-ΔΗΜ και ισοφλαβόνες ρυθμίζεται η έκφραση της MITF, p38, Akt, NKX3-1, p27, κυκλίνη D, CREB και PSA σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης δοκιμάζονται με πραγματικού χρόνου PCR (Α, Β) και ανάλυση Western Blot (C, D). κύτταρα C4-2B (A, C) και PC-3 (B, D) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ G2535 ή 25 μΜ BR-DIM για 24 ώρες (για την εκχύλιση RNA) ή 48 ώρες (για την εκχύλιση πρωτεΐνης). . (BD: BR-DIM)

Η

RANKL up-ρύθμιση της έκφρασης του miR-92a, ενώ ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ abragated το up-ρύθμιση του miR-92a διεγείρεται από το RANKL

με μηχανογραφικό πρόβλεψη των miRNAs στόχου, βρήκαμε ότι RANKL θα μπορούσε να ρυθμίσει διάφορες miRNAs όπως miR-92a και miR-155, οδηγώντας σε αυξημένη οστεοκλαστογένεσης. Για να επιβεβαιώσει εάν miR-92a είναι ένα νόμιμο στόχο του RANKL ή όχι, είμαστε αντιμετωπίζονται C4-2B κυττάρων με 100 ng /ml RANKL για 24 ώρες. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία RANKL που προκαλείται από την έκφραση του miR-92a στα κύτταρα του προστάτη (Σχήμα 7Α). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι η θεραπεία των κυττάρων με isoflaone ή BR-DIM μείωσε την έκφραση του miR-92a και εξασθένησε την επαγωγή της έκφρασης miR-92a διεγείρεται από το RANKL σε PCa κύτταρα (Σχήμα 7Α), προτείνοντας μια μηχανιστική σύνδεση μεταξύ RANKL, ΜΙΚ 92α και η βιολογική δραστηριότητα των ισοφλαβονών ή BR-DIM

Α:. C4-2B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml RANKL, 25 μΜ G2535, 25 μΜ BR-DIM, ή συνδυασμός των RANKL και G2535 ή BR-DIM για 24 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και η έκφραση του miR-92a ανιχνεύθηκε σε επεξεργασία C4-2B κύτταρα. Β: κύτταρα C4-2B καλλιεργήθηκαν στο κάτω θάλαμο του συστήματος συγκαλλιέργειας. RAW246.7 και hFOB1.19 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στον άνω θάλαμο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ G2535 ή 25 μΜ BR-DIM για 48 ώρες. Η έκφραση της Ε-καδερίνης και βιμεντίνης μετρήθηκε με ανάλυση Western Blot. C: κύτταρα hFOB1.19 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ G2535 ή 25 μΜ BR-DIM για 48 ώρες. Η έκφραση του periostin ανιχνεύθηκε με ανάλυση Western Blot.

Η

Isoflavone και BR-DIM ρυθμίζεται Επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά Μετάβασης (ΕΜΤ) δείκτες, Ε-καδερίνη και βιμεντίνης

Επειδή παρατήρησε ότι ισοφλαβόνες και BR-DIM θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση του miR-92a το οποίο θα μπορούσε να προωθήσει τη μετάσταση και τη ρύθμιση EMT στοχεύοντας κάτω ρύθμιση στην έκφραση της E-cadherin [24], ερευνήσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα των ισοφλαβονών και BR-DIM για η έκφραση της E-cadherin και βιμεντίνης, τα δύο πιο σημαντικά και καλά αποδεκτή δείκτες EMT που έχουν άμεση σχέση με την EMT φαινότυπο. Καλλιεργήσαμε κύτταρα C4-2B στο κάτω θάλαμο ενός συστήματος συν-καλλιέργειας όπου καλλιεργούνται κύτταρα RAW264.7 και hFOB1.19 στον άνω θάλαμο για να μιμηθεί το μικροπεριβάλλον του όγκου των κυττάρων του προστάτη και την αλληλεπίδραση των οστεοκλαστών /οστεοβλαστών. Στη συνέχεια, έχουμε κατεργασία των κυττάρων με 25 μΜ G2535 ή 25 μΜ BR-DIM για 48 ώρες. Βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης ή BR-DIM θεραπεία αύξησε την έκφραση της Ε-καδερίνης και μείωσε την έκφραση της βιμεντίνης (Σχήμα 7Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα μπορούσε να αποτρέψει την επαγωγή της ΕΜΤ ρυθμίζοντας την έκφραση του miR-92a, Ε -cadherin και βιμεντίνη.

isoflavone και BR-DIM ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου οστεοβλαστικών

Επειδή παρατηρήσαμε ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα μπορούσε να αναστείλει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών, ερευνήσαμε περαιτέρω το μοριακό στόχο του ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ δράσης για τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα hFOB1.19 με 25 μΜ G2535 ή 25 μΜ BR-DIM για 48 ώρες. Βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης ή BR-DIM θεραπεία ανέστειλε την έκφραση του periostin (Σχήμα 7C), ένα από τα σημαντικά γονίδια για τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της periostin θα μπορούσε να είναι ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ισοφλαβόνης και BR-DIM ανέστειλε τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών.

Συζήτηση

Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα του προστάτη συχνά μεταστάσεις σε το οστό. Στο οστό, μετάσταση κυττάρων προστάτη θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει τα θρεπτικά συστατικά από το αίμα στο μυελό των οστών, αλληλεπιδρούν με προ-οστεοκλάστες και προ-οστεοβλάστες, και διεγείρει την οστική αναδιαμόρφωση [25], [26]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του προστάτη και προ-οστεοκλάστες /προ-οστεοβλάστες είναι ένα κρίσιμο βήμα για την ανάπλαση του οστού κατά τη διάρκεια του προστάτη οστικής μετάστασης [26]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ενός συστήματος συν-καλλιέργειας με κύτταρα προστάτη και προ-οστεοκλάστες /προ-οστεοβλάστες είναι σημαντική για τη διερεύνηση των μοριακών αλληλεπιδράσεων μονοπάτια σηματοδότησης κατά την διάρκεια του προστάτη μετάσταση στα οστά και την ανάπλαση του οστού. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ανδρογόνα-ευαίσθητο κύτταρα του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων PC-3 και C4-2B κύτταρα θα μπορούσε να αυξηθεί όμορφα με προ-οστεοκλαστών ή προ-οστεοβλάστες με τον ίδιο δίσκο καλλιέργειας με ορισμένο μέσο, ​​το οποίο μιμείται

in vivo

περιβάλλον με άμεση αλληλεπίδραση των κυττάρων του προστάτη και των τοπικών κύτταρα των οστών. Στο σύστημα συν-καλλιέργειας μας, τα κύτταρα PCa, προ-οστεοκλάστες, και προ-οστεοβλαστών θα μπορούσε επίσης να αυξηθεί σε επιμέρους θαλάμους που διαχωρίζονται από μια μεμβράνη επιτρέποντας πρωτεΐνες (διαλυτές παράγοντες) κατανομή μεταξύ των δύο θαλάμων ενώ το διαχωρισμό διαφορετικών τύπων κυττάρων σε ατομικούς θαλάμους . Με αυτόν τον τρόπο, η επίδραση των πρωτεϊνών που εκκρίνονται (διαλυτών παραγόντων) από κύτταρα του προστάτη σε κύτταρα οστών ή τα αποτελέσματα της εκκρινόμενες πρωτεΐνες από τα κύτταρα των οστών σε κύτταρα προστάτη θα μπορούσε να διερευνηθεί. Χρησιμοποιώντας συγκαλλιέργεια, ελέγξαμε τις μοριακές αλλαγές σε οστεοκλάστες ή οστεοβλάστες διεγείρεται από τα κύτταρα του προστάτη. Πρόσφατες μελέτες από άλλους ερευνητές έδειξαν ότι συν-καλλιέργεια των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών μπορεί να είναι χρήσιμη για την εξέταση του μεταβολισμού των οστών και την οστεοκλαστογένεση [27], [28]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το σύστημα συν-καλλιέργειας είναι πολύ χρήσιμη για τη διερεύνηση των μοριακών αλλαγών όταν τα κύτταρα του προστάτη επανακάμπτοντας στο οστό, η οποία θα επιτρέψει την αξιολόγηση αλλοιώσεις στις μεταγωγές σήματος μεταξύ των κυττάρων του προστάτη και των τοπικών κύτταρα των οστών κατά τη διάρκεια του προστάτη μετάσταση στα οστά και οστά αναδιαμόρφωση όπως τεκμηριώνεται από τα αποτελέσματα μας.

Η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ή οστεοβλαστών είναι ένα σημαντικό στάδιο κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου στο αναδιαμόρφωση των οστών και των οστών. Με τη χρήση του συστήματος συν-πολιτισμό μας, βρήκαμε ότι οι προ-οστεοκλάστες θα μπορούσε να διαφοροποιήσει το να ωριμάσει οστεοκλαστών, όταν συν-καλλιεργήθηκαν μαζί με κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, προ-οστεοβλάστες θα μπορούσε επίσης να διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες να ωριμάσει όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα προστάτη. Επιπλέον, βρήκαμε ότι συν-καλλιέργεια των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών με κύτταρα προστάτη θα μπορούσε να αυξήσει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα μόρια που παράγονται από κύτταρα του προστάτη θα μπορούσε να επάγει την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα μπορούσε να αναστείλει την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα είναι χρήσιμες για την αναστολή του προστάτη μετάσταση στα οστά και οστική ανακατασκευή (Εικόνα 8) . Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα PCA σε μετάσταση στα οστά διεγείρει την ανάπλαση του οστού ενώ οστικής ανακατασκευής διευκολύνει PCa οστών μετάσταση και εισβολή στο οστό [29] – [31], η οποία είναι γνωστή ως έναν φαύλο κύκλο της οστικής ανακατασκευής και μετάσταση στα οστά. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ ανέστειλε τη διαφοροποίηση των κυττάρων των οστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ θα μπορούσε να αναστείλει προστάτη μετάσταση στα οστά μέσα από διαταράσσοντας την ανάπλαση του οστού.

Η

Έχει αναφερθεί ότι η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών συμβεί πρώτο κατά τη διάρκεια της οστικής ανακατασκευής όταν τα κύτταρα του προστάτη μεταστάσεις στο κόκκαλο [4], [5]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της διαφοροποίησης οστεοκλαστών είναι σημαντική για τη διακοπή του προστάτη μετάσταση στα οστά και παλιννόστησης. Είναι καλά γνωστό ότι RANK /RANKL /OPG σηματοδότηση είναι βασικός ρυθμιστής για τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών [32]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία RANKL θα μπορούσε να προκαλέσει σημαντικά τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, το οποίο είναι σύμφωνο με δημοσίευσε έκθεση [33]. Το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι ο ΤΟΡ-β θα μπορούσαν να ρυθμίζουν την έκφραση του RANKL, που οδηγεί στην διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Αυτά τα αποτελέσματα συνάδουν επίσης με αναφορά από άλλες ερευνητή [31], υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β, η οποία συνήθως παρατηρείται σε προχωρημένο PCa, θα μπορούσε να τονώσει την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, οδηγώντας σε επαναρρόφηση οστού και την ανάπλαση του οστού. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι ο ΤΟΡ-β θα μπορούσε επίσης να επάγει ΕΜΤ [34], το οποίο διευκολύνει PCa εξέλιξης συμπεριλαμβανομένης της εισβολής και της μετάστασης οστών. Σημαντικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ισοφλαβόνης θα μπορούσε να εξασθενήσει ΤΟΡ-β επαγόμενη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, και ότι ισοφλαβόνη και BR-DIM θα μπορούσε να ρυθμίσει την έκφραση των δεικτών EMT (Σχήμα 8), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα φυσικά παράγοντες θα μπορούσαν να είναι χρήσιμοι για την πρόληψη της εξέλιξης προστάτη και μετάσταση στα οστά.

Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι η microRNAs (miRNAs) ρυθμίζει πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες [35]. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι εκτός από τη ρύθμιση οστεοκλάστες, RANKL θα μπορούσε επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση του miR-92a. Το miR-92a έχει βρεθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση των γονιδίων κατά του όγκου, με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [36]. Πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι η Ε-καντερίνη είναι ένας άμεσος στόχος του miR-92a και ότι η έκφραση του miR-92a προωθείται λεμφαδένα μετάσταση του οισοφαγικού καρκινώματος πλακωδών κυττάρων ανθρώπου μέσω της κάτω ρύθμιση της E-cadherin [24]. Ως εκ τούτου, RANKL θα μπορούσε επίσης να προωθήσει προστάτη εξέλιξη μέσω up-ρύθμιση του miR-92a και, κατά συνέπεια, από τα κάτω ρύθμιση της E-cadherin. Είναι ενδιαφέρον, ισοφλαβόνης και BR-DIM ήταν σε θέση να εξασθενήσει την αυξητική ρύθμιση του miR-92a διεγείρεται από κατεργασία RANKL, γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία αυτών των φυσικών παραγόντων (ισοφλαβόνες και BR-DIM) στην αναστολή προστάτη εξέλιξη και μετάσταση των οστών (Εικόνα 8 )

.

Εκτός από τα ανασταλτικά αποτελέσματα επί οστεοκλαστών, ισοφλαβόνης και BR-DIM inhibted επίσης τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών με προς τα κάτω ρύθμιση periostin, ένα από τα σημαντικά γονίδια για τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Ως εκ τούτου, στοχεύοντας τόσο οστεοκλαστών και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών, ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ μπορούσε να διακόψει αποτελεσματικά οστικής ανακατασκευής, παρέχοντας δυσμενείς micoenvironment για την παλιννόστηση των κυττάρων του προστάτη στο κόκκαλο. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ έδειξε ανασταλτικά αποτελέσματα επί των κυττάρων των οστών διαφοροποίησης, οι εμπλεκόμενοι μόρια και τροποποιημένα επίπεδα με ισοφλαβόνες ή BR-ΔΗΜ θεραπείας δεν ήταν τα ίδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι σύνθετων ρυθμιστικών μηχανισμών που εμπλέκονται. Με πορεία και ανάλυση του δικτύου, βρήκαμε ότι οι ισοφλαβόνες και BR-DIM μπορεί να επηρεάσει πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης όπως AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, Ι.ΕΡ1 /κυκλίνη D1, MITF /NR3C1, κλπ BR-ΔΗΜ αντιμετωπίζονται C4 2Β κύτταρα, βρήκαμε πιο ισχυρή ρύθμιση προς τα κάτω του PSA το οποίο έχει βρεθεί να διαμορφώνουν τα γονίδια που εμπλέκονται στην οστική αναδιαμόρφωση και την διαφοροποίηση των οστεοβλαστών [37]. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν τα πολυ-στόχευση επιπτώσεις των ισοφλαβονών και BR-DIM, το οποίο θα κάνει ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ ισχυρά μέσα για την αναστολή της ανάπτυξης του προστάτη στα οστά μικροπεριβάλλον.

Εν κατακλείδι, ισοφλαβόνες και BR-ΔΗΜ ήταν σε θέση να στοχεύουν τόσο οστεοκλαστών και οστεοβλαστών διαφοροποίηση, και επίσης θα μπορούσε να στοχεύσει πολλαπλά μόρια στα κύτταρα του προστάτη? Ως εκ τούτου, αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσε να αναστείλει την αναδιαμόρφωση των οστών και την ανάπτυξη PCa, υποδηλώνοντας ότι ισοφλαβόνης και BR-DIM θα μπορούσε να είναι πολύ χρήσιμη για την πρόληψη του προστάτη εξέλιξης, ειδικά μετάσταση στα οστά. Η βιολογική δράση των ισοφλαβονών και BR-DIM προκαλείται μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση των πολλαπλών οδών σηματοδότησης περιλαμβανομένων RANKL, AR /PSA, και σηματοδότηση Akt, η οποία τους καθιστά πολύ ελπιδοφόρα παράγοντες για την πρόληψη ή /και θεραπεία του προστάτη και των οστών μετάσταση του σε συνδυασμό με τη συμβατική χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές, τα αντιδραστήρια και τα αντισώματα

PC-3 (ATCC, Manassas, VA), C4-2B, ARCaP

Ε και ARCaP

Μ (Novicure, Birmingham, AL) κυττάρων καρκίνου του προστάτη και προ-οστεοκλαστών RAW264.7 κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου , 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Προ-οστεοβλαστών hFOB1.19 κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 χωρίς ερυθρό της φαινόλης (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 34 ° C. μίγμα ισοφλαβονών G2535 (70,5% genistein, 26,3% δαϊδζεΐνη και 0,31% glycetein κατασκευάζονται από Οργανικά Τεχνολογίες και λαμβάνονται από ΝΙΗ) διαλύθηκε σε DMSO για να κάνει ένα μητρικό διάλυμα που περιείχε 50 mM genistein. Οι συγκεντρώσεις του ισοφλαβόνης που περιγράψαμε σε αυτό το άρθρο αναφέρονται όλα στη συγκέντρωση της γενιστεΐνης σε μείγμα ισοφλαβόνης. BR-DIM (Βιοαντίδραση, LLC, Boulder, CO?. Διατυπωθεί-ΔΗΜ με υψηλότερη βιοδιαθεσιμότητα

in vivo

[38]) προβλέφθηκε γενναιόδωρα από τον Dr. Michael Zeligs και διαλύθηκε σε DMSO για να κάνει μια mM απόθεμα 50 λύση. Anti-ΟΧΟΚ-4 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), αντι-φιμπρονεκτίνης (Santa Cruz), αντι-RUNX2 (Santa Cruz), αντι-οστεοποντίνη (Santa Cruz), αντι-periostin (Santa Cruz), αντι-E -cadherin (Santa Cruz), αντι-βιμεντίνη (Dako), αντι-RANKL (R &? Α, Danvers, ΜΑ), αντι-TRAcP (Sigma, St. Louis, ΜΟ), αντι-MITF (Santa Cruz), αντι- ρ27 (Santa Cruz), αντι-PSA (Santa Cruz), αντι-κυκλίνης D (Santa Cruz), αντι-ρ38 (Santa Cruz), αντι-β-ακτίνης (Sigma) και αντι-GAPDH (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αντισώματα για ανάλυση Western Blot.

συν-καλλιέργεια κυττάρων προστάτη με οστεοκλάστες και οστεοβλάστες

για να μιμηθούν προστάτη των κυττάρων που καλλιεργούνται σε ένα οστεοκλαστικής περιβάλλον, PC-3 κύτταρα και κύτταρα RAW264.7 συνκαλλιεργήθηκαν στο 1:01 αναλογία σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml RANKL ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β για 8 ημέρες για να διεγείρουν διαφοροποίηση κυττάρου RAW264.7. Ομοίως, για να μιμηθεί PCa κύτταρο καλλιεργείται σε οστεοβλαστική περιβάλλον, C4-2B και hFOB1.19 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν σε 1:02 αναλογία σε RPMI 1640 /F12 (1:01) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 39 ° C για 5 ημέρες για την τόνωση των οστεοβλαστών διαφοροποίηση των κυττάρων hFOB1.19.