Αφηρημένο

Το Ε7 ογκοπρωτεΐνη των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) είναι ένα ιδανικό στόχο για ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών στρατηγικών ενάντια στους όγκους του HPV-συνδέονται. Ωστόσο, επειδή ανοσογόνα που βασίζονται σε πρωτεΐνη μόνο είναι κακή επαγωγής της κυτταροτοξικής Τ-λεμφοκυττάρων (CTL) αποκρίσεις, που ήταν δύσκολο να εκμεταλλευτούν για θεραπευτικούς σκοπούς. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι ένα ανασυνδυασμένο λιποπρωτεΐνη που αποτελείται από ανενεργές Ε7 (E7m) βιολογικώς συνδέεται με μια βακτηριακή λιπιδική μονάδα (rLiPO-E7m) επάγει την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων ποντικού προέρχονται από μυελό οστών μέσω ΤοΙΙ υποδοχέα 2 (TLR2), στρεβλώνει την ανοσοαποκρίσεις προς τις απαντήσεις Th1 και επάγει Ε7-ειδικές αποκρίσεις CTL. Μελετήσαμε περαιτέρω την ικανότητα των rLiPO-E7m να παρέχουν προστασία έναντι πρόκλησης κυττάρου όγκου TC-1 σε ένα ζωικό μοντέλο. Ποντίκια ανοσοποιήθηκαν προφυλακτικά με δύο 10-μg δόσεις rLiPO-E7m βρέθηκαν να είναι απαλλαγμένα από την ανάπτυξη του όγκου TC-1. Πειράματα σε ένα θεραπευτικό μοντέλο ανοσοποίηση έδειξε ότι ο όγκος όγκου σε ποντικούς που λαμβάνουν μόνο δόση rLiPO-E7m ήταν μικρότερη από 0,01 cm

3 κατά την ημέρα 40, ενώ ο όγκος του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με rE7m ήταν 2,28 ± 1,21 cm

3. Ο όγκος του όγκου του συνόλου της ομάδας ελέγχου ήταν πάνω από 3 εκατοστά

3. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι τα CD8 + Τ κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσία κατά του όγκου όταν χορήγηση rLiPO-E7m. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι rLiPO-E7m μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια για θεραπεία όγκων HPV που σχετίζονται

Παράθεση:. Huang C-Υ, Chen JJW, Shen Κ-Υ, Chang L-S, Yeh Υ-C, Chen Ι-Η, et al. (2012) Η ανασυνδυασμένη λιπιδιωμένη HPV Ε7 Προκαλεί μια Th-1-Μεροληπτική ανοσολογική απάντηση και προστατευτική ανοσία κατά του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας σε ένα μοντέλο ποντικού. PLoS ONE 7 (7): e40970. doi: 10.1371 /journal.pone.0040970

Επιμέλεια: Silke Appel, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 23, Νοέμ του 2011? Αποδεκτές: 18 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από έναν ερευνητή Βραβείο Έρευνας από το Εθνικό Δίκτυο Έρευνας Υγείας Ινστιτούτα (VC-098-PP-04 με S-JL) και (VC-098-PP-06 έως C-HL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) λοιμώξεις μπορεί να ευθύνεται για την ανάπτυξη αρκετών καρκίνων? ιδίως, η μόλυνση από HPV μπορεί να προκαλέσει καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Ως εκ τούτου, νέες θεραπείες χρειάζονται επειγόντως για τον έλεγχο της θνησιμότητας του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Μέχρι σήμερα, έχουν HPV Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνες έχουν αναγνωριστεί ως τους κύριους στόχους για την ανάπτυξη θεραπευτικών εμβολίων έναντι όγκων HPV που σχετίζονται. Επιπλέον, όπως ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες (πυρηνική), τα γονιδιακά προϊόντα Ε6 και Ε7 μπορούν να κρύβονται από την χυμική ανοσολογική απόκριση. Η προσοχή έχει έτσι επικεντρώθηκε στην παραγωγή ενός εμβολίου ικανού να επάγει ή διεγείρει μία κυτταρική ανοσολογική απόκριση προς HPV Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών [2]. Αρκετές προσεγγίσεις έχουν ληφθεί για την ανάπτυξη του HPV θεραπευτικά εμβόλια, συμπεριλαμβανομένων των ζώντων οργανισμούς φορείς, πεπτίδιο /πρωτεΐνης-, νουκλεϊκά οξύ- και ολόκληρο προσεγγίσεις που βασίζονται σε κύτταρα. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει την σημασία των απαντήσεων των Τ-κυττάρων στην προστασία έναντι των όγκων σε μοντέλα ανθρώπων και ζώων [3]. Από αυτές τις προσεγγίσεις, συνθετικό πεπτίδιο και προσεγγίσεων που βασίζονται σε πρωτεΐνες είναι οι πλέον ελκυστικοί υποψήφιοι? Ωστόσο, γενικά, πεπτιδίων και πρωτεϊνών και μόνο είναι μη ανοσογόνα. Χωρίς επιπλέον ανοσοενισχυτικό, είναι δύσκολο να επάγει ισχυρή, αποτελεσματική ανοσοαποκρίσεις χαρακτηρίζονται από την παραγωγή κυτοκινών Th1 και ιϊκή ογκοπρωτεΐνη-ειδικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CTLs) [3].

TLR αγωνιστές είναι φυσικά ανοσο-διεγερτικών επαγωγείς της έμφυτης ανοσίας. TLR2 εκφράζεται σε πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων δενδριτικών κυττάρων, μακροφάγων, και λεμφοκύτταρα. υποψήφιοι Ως εκ τούτου, οι αγωνιστές TLR2 όπως βακτηριακές λιποπρωτεϊνες υποσχόμενη για να χρησιμοποιηθεί ως μια νέα γενιά ανοσοενισχυτικό για ανοσοθεραπεία.

Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια πλατφόρμα για την παραγωγή υψηλής απόδοσης ανασυνδυασμένων λιποπρωτεϊνών [4]. Η λιπιδική μονάδα της λιπο-ανοσογόνο είναι ταυτόσημη με εκείνη των βακτηριακών λιποπρωτεΐνες, οι οποίες αναγνωρίζονται ως σήματα κινδύνου από το ανοσοποιητικό σύστημα. Έτσι, και η έμφυτη και προσαρμοστική άνοση αποκρίσεις μπορεί να προκληθεί από λιποπρωτεΐνες [5], [6]. Η δομή των λιπιδίων του ανασυνδυασμένου λιποπρωτεΐνης είναι διαφορετική από εκείνη των συνθετικών τρι-ακυλιωμένα λιποπεπτίδιο [7]. Η διάκριση αυτή καθιστά ανασυνδυασμένη λιποπρωτεΐνη προκάλεσε διαφορετικές ανοσοαποκρίσεις από συνθετικό λιποπεπτίδιο επάγοντας διαφορετικά επίπεδα βιολογικής κυτοκινών και χημειοκινών [8]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι αποκρίσεις αντισωμάτων εξουδετέρωσης του ιού προκαλείται από λιπίδιο μορφή ενός ανοσογόνου ήταν ισχυρότερες από εκείνες που προκαλούνται από μία μη-λιπιδική μορφή ενός ανοσογόνου [4], [9]. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι οι δυσκολίες της χρησιμοποίησης πρωτεϊνών και μόνο για να επάγουν αποκρίσεις CTL θα μπορούσαν να ξεπεραστούν με τη χρήση του λιπο-ανοσογόνο στρατηγική. Μία μορφή λιπιδίων του μεταλλαγμένου Ε7 (rLiPO-E7m) και ένα μη-λιπιδικό μορφή rE7m από τον τύπο του HPV 16 (HPV16) παρήχθησαν, και την ικανότητα αυτών των ανοσογόνων για την ενεργοποίηση DCs προέρχονται από μυελό των οστών ποντικού (ΒΜ-DCS) ήταν αξιολογηθεί. Οι ανοσοαποκρίσεις του Β και Τ κύτταρα ερευνήθηκαν επίσης. Τέλος, εξετάστηκε κατά πόσον οι ανοσολογικές αντιδράσεις που προκαλούνται από rLiPO-E7m ήταν σε θέση να προστατεύσει τα ποντίκια εναντίον πρόκλησης όγκων. Οι μελέτες αυτές δεν παρέχουν μόνο πληροφορίες σχετικά με rLiPO-E7m ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ανάπτυξη ενός θεραπευτικού εμβολίου κατά του HPV όγκων που σχετίζονται αλλά και να παρουσιάσει μια στρατηγική για την ανάπτυξη επιτυχημένων ανοσοθεραπεία χρησιμοποιώντας τους υποψηφίους με βάση τις πρωτεΐνες.

Αποτελέσματα

Παραγωγή ανασυνδυασμένων Ανοσογόνα

το ανασυνδυασμένο E7m (rE7m), το οποίο κατασκευάζεται για να περιέχει μια ετικέτα εξαϊστιδίνης (HisTag) στο C-τελικό άκρο της, παρήχθη να συγκρίνουν τις επιδράσεις του rE7m στην λιπιδιωμένη στόχο. rE7m καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου μετάλλου στήλη (IMAC) (Σχήμα 1 b, λωρίδες 1-4). rE7m ανιχνεύθηκε με αντισώματα αντι-HisTag (Σχήμα 1β, λωρίδες 5-8). Έχουμε προηγουμένως ταυτοποιηθεί μια αλληλουχία σύντηξης (D1) η οποία μπορεί να συντήκονται με ένα μη λιπιδιωμένη ανοσογόνο για να επιτευχθούν υψηλά επίπεδα έκφρασης του ανασυνδυασμένου λιπο-ανοσογόνο [4]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη στρατηγική, το γονίδιο E7m συντήχθηκε με D1 στο Ν-άκρο της και μηχανικής ένα HisTag στο C-άκρο του. Αυτή η ανασυνδυασμένη λιπιδιωμένη E7m (rLiPO-E7m) καθαρίστηκε με χρήση στήλης IMAC (Σχήμα 1β, λωρίδες 9-11). rLiPO-E7m ανιχνεύθηκε με αντισώματα αντι-HisTag (Σχήμα 1β, λωρίδες 12-14). Αφού το λιποπολυσακχαρίτη (LPS) απομακρύνθηκε (λιγότερο από 0,003 EU /μg), κεκαθαρμένο rLiPO-E7m και rE7m ήταν συγκριτικά αναλύθηκαν για την ανοσογονικότητα και την αποτελεσματικότητά τους σε ζωικά μοντέλα.

(α) Η ευθυγράμμιση του αμινοξέος ακολουθία του άγριου τύπου HPV16 Ε7 (αριθμός προσχώρησης: NP_041326) και τους άεργους Ε7 (E7m). Κάθε μεταλλαγμένο ιστοσελίδα της E7m τονίζεται. Η αλληλουχία DNA του γονιδίου E7m προήλθε χρησιμοποιώντας κωδικονίου χρήση του

E. coli

και πλήρως συντεθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR συναρμολόγησης. Το PCR προϊόν κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pET22b για έκφραση rE7m και στον τροποποιημένο φορέα pET22b με ένα λιπίδιο πεπτίδιο σήμα για έκφραση rLiPO-E7m. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες περιείχαν μια επιπλέον αλληλουχία HHHHHH (HisTag) στο Ο-άκρο και εκφράστηκαν υπό τον έλεγχο του υποκινητή Τ7. (Β) Ο-E7m rLiPO διαδικασία καθαρισμού πρωτεΐνης και rE7m παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας 15% αναγωγική SDS-PAGE που ακολουθήθηκε από χρώση Coomassie Blue χρώση και ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-HisTag αντισώματα. Η ανασυνδυασμένη rLiPO-E7m εκφράστηκε στο

Ε. coli

στελέχη C43 (DE3). Διαδρομή 1, η έκφραση rE7m μετά από επαγωγή IPTG? διαδρομή 2, η έκφραση της πρωτεΐνης σε απουσία επαγωγής IPTG? λωρίδα 3, εξάγεται κλάσμα του rE7m? λωρίδα 4, καθαρισμένη ανασυνδυασμένη rE7m. Λωρίδες 5-8 δείχνουν ανοσοαποτύπωση για την παρακολούθηση της διαδικασίας καθαρισμού rE7m, και τα δείγματα στις λωρίδες αυτές είναι οι ίδιες με εκείνες στις λωρίδες 1-4, αντίστοιχα. Διαδρομή 9, έκφραση rLiPO-E7m μετά την επαγωγή IPTG? λωρίδα 10, η έκφραση της πρωτεΐνης σε απουσία επαγωγής IPTG? λωρίδα 11, καθαρίζεται rLiPO-E7m. Λωρίδες 12-14 δείχνουν ανοσοαποτύπωση για την παρακολούθηση της διαδικασίας καθαρισμού rLiPO-E7m, και τα δείγματα στις λωρίδες αυτές είναι οι ίδιες με εκείνες στις διαδρομές 9-11, αντιστοίχως. Το μη-λιπιδιωμένη μορφή rE7m εκφράστηκε στο

Ε. coli

BL21 (DE3) στέλεχος αστέρων. Τα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των ηλεκτροφορητική rE7m ή rLiPO-E7m στις πηκτές ή κηλίδες. (Γ) άθικτη rLiPO-E7m αναλύθηκε με LC /MS. LC /MS ανάλυση έδειξε την παρουσία των πέντε μεγάλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των rLiPO-E7m. Οι μοριακές μάζες (σε daltons) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μέγιστο αλγόριθμο εντροπίας. Οι πέντε μεγάλες κορυφές εμφανίζονται μάζες των 15.384,5, 15400, 15412,5, 15426 και 15439. (δ) ελήφθησαν Ν-τερματικά θραύσματα rLiPO-E7m και εντοπίστηκαν μετά την πέψη της rLiPO-E7m με θρυψίνη. Το χωνεμένο δείγμα αναλύθηκε σε ένα φασματόμετρο μάζας MALDI Waters® μικρο MX ™. Η MALDI-TOF MS φάσματα αποκάλυψε την ύπαρξη πέντε κορυφές με m /z τιμές του 1452, 1466 και 1480, 1492 και 1506.

Η

ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των καθαρισμένα Ανοσογόνα

rLiPO-E7m και rE7m αφομοιώθηκαν με θρυψίνη για την αξιολόγηση πεπτίδιο μάζα δακτυλικών αποτυπωμάτων τους (PMF). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι οι κύριες κορυφές στα φάσματα μάζας ελήφθησαν από rLiPO-E7m και rE7m (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί η λιπιδική μονάδα του rLiPO-E7m, άμεση έγχυση του δείγματος ESI-MS των ανέπαφων rLiPO-E7m πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο Q-TOF. Μετά την επεξεργασία των δεδομένων, πέντε μεγάλες κορυφές με μάζες των 15.384,5, 15400, 15412,5, 15426 και 15439 Da εντοπίστηκαν (Σχήμα 1γ). Με βάση προηγούμενες μελέτες μας, θεωρείται η ύπαρξη αυτών των μεγάλων κορυφών ως την υπογραφή του λιπιδίου τροποποιήσεις των λιποπρωτεϊνών [4], [7].

Στη συνέχεια μετράται η ακριβής μάζα Ν-τερματικών θραυσμάτων της rLiPO -E7m. Πέντε κορυφές με m /z τιμές του 1452, 1466, 1480, 1492, και 1506 ταυτοποιήθηκαν (Εικόνα 1δ). Ο καθαρισμός των typtic λιπο-θραύσματα για ανάλυση μάζας αποκάλυψε δύο ακόμα κορυφές που δεν έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί. Για να επαληθευθεί ότι το λιπίδιο τροποποίηση κάθε κορυφής είναι στη Ν-τερματικό υπόλειμμα κυστεϊνυλ, Ν-τερματικά θραύσματα rLiPO-E7m υποβλήθηκαν σε ανάλυση MALDI-TOF-TOF για να προσδιοριστεί η αλληλουχία του κάθε κορυφή. Οι αλληλουχίες αυτών των πέντε κορυφές ήταν τα ίδια, και η ταυτοποιημένη αλληλουχία από Υ5 προς y1 ήταν «SQEAK» (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιβεβαιώσαμε ότι οι κορυφές του rLiPO-E7m συνδέθηκαν με τη λιπιδιωμένη κατάλοιπο κυστεΐνης και επαλήθευσε ότι rLiPO-E7m περιέχει ένα τμήμα βακτηριακού λιπιδίου στο Ν-άκρο της.

rLiPO-E7m Ενεργοποιεί μυελό οστών δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται Μέσω TLR2

για να αξιολογηθεί η λειτουργία του rLiPO-E7m, εξετάσαμε πρώτα την απόκριση πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων στα ανασυνδυασμένα ανοσογόνα και να ελέγχει αγωνιστές. Οι LPS (TLR4 αγωνιστής) και το συνθετικό λιποπεπτίδιο παλμιτοϋλο-3-Cys-Ser- (Lys) 4 (Pam3, έναν αγωνιστή TLR2) που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των σπληνοκυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. rLiPO-E7m βρέθηκε να διεγείρει τα σπληνοκύτταρα σε συγκεντρώσεις 10 ηΜ και 100 ηΜ [rLiPO-E7m συγκεντρωτικά στα 1000 ηΜ σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS)]. Σε αντίθεση, rE7m απέτυχε να επάγει πολλαπλασιασμό σπληνοκυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η χαρακτηριστική ομάδα λιπιδίου rLiPO-E7m είναι ικανό να ενεργοποιεί ανοσοκύτταρα (Σχήμα 2α).

(α) Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από ποντικούς άγριου τύπου και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις LPS (0-1000 μg /ml), Pam3 (0-1000 μg /ml), rLiPO-E7m (0-100 μg /ml) ή rE7m (0-1000 μg /ml) για 48 ώρες. Κατά τη διάρκεια των τελικών 24 ώρες, 1 μCi [

3Η] -θυμιδίνης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να μετρηθεί η σύνθεση DNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. (Β) ΒΜ-DCs από ποντικούς άγριου τύπου καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με LPS (0,01 μg /ml), rE7m (10 μg /ml) ή rLiPO-D1E3 (10 μg /ml) παρουσία ή απουσία της πολυμυξίνης Β (20 μg /ml). Μετά από επώαση 24 ωρών, η έκφραση των δεικτών δενδριτικών CD40 κυτταρικής επιφάνειας και CD86 αναλύθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και η μέση ένταση φθορισμού (MFI) των κυττάρων που καλλιεργούνται μόνο σε μέσο ορίστηκε ως 100%. (Γ) Για τις μελέτες έκκριση κυτοκίνης, BM-DCs καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με LPS (0,01 μg /ml), Pam3 (0,15 μg /ml), rE7m (0,1-10 μg /ml) ή rLiPO-E7m (0,1- 10 μg /ml) παρουσία ή απουσία της πολυμυξίνης Β (20 μg /ml). Μετά από επώαση 24 ωρών, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για ΤΝΡ-α και IL-12 (ρ40) παραγωγή με ELISA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) BM-DCs από άγριου τύπου, TLR1-knockout (TLR1-KO), TLR2-KO ή TLR6-ΚΟ ποντικούς καλλιεργήθηκαν είτε σε μόνο του ή σε μέσο συμπληρωμένο με LPS (0,01 μg /ml), Pam3 μέσο (0,15 μg /ml), rE7m (10 μg /ml), ή rLiPO-E7m (10 μg /ml). Μετά από επώαση 24 ωρών, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για παραγωγή ΤΝΡ-α με ELISA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD δειγμάτων εις τριπλούν.

Η

Στη συνέχεια χρησιμοποιείται BM-ΑΧ ως μοντέλο για τη μελέτη των ανοσο-διεγερτικές ιδιότητες της rLiPO-E7m. Η πολυμυξίνη Β προστέθηκε στο παρακολουθεί κάθε παρεμβολή που προκαλείται από LPS σε υπολειμματικό λειτουργική δοκιμασία. rLiPO-E7m up-ρυθμίζεται η έκφραση των δεικτών επιφάνειας όπως CD40 και CD86 επί ΒΜ-DCs, ενώ rE7m δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 2β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε μελέτες έκκρισης κυτοκίνης. Η έκκριση του TNF-αand IL-12ρ40 προκλήθηκε με rLiPO-E7m αλλά όχι από ομάδα rE7m (Σχήμα 2c). Πολυμυξίνη Β ανέστειλε μεσολαβεί ο LPS διέγερση της BM-ΑΧ, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στις διεγερτικές ιδιότητες της rLiPO-E7m. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του BM-DCs με rLiPO-E7m δεν οφειλόταν σε υπολειμματικό LPS και ότι η ανοσο-διεγερτική δραστικότητα του rLiPO-E7m συνδέεται με χαρακτηριστική ομάδα λιπιδίου του.

Επειδή η λιπιδική δομή του rLiPO -E7m είναι ένας αγωνιστής για TLR1 /TLR2 και /ή TLR2 /TLR6, το επόμενο εξετάστηκε ποια από αυτά τα TLRs είναι απαραίτητη για την ανοσο-διεγερτική δραστικότητα του rLiPO-E7m. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, BM-ΑΧ από άγρια-δακτυλογραφημένο, TLR6-νοκ-άουτ (KO) ποντίκια TLR1-, TLR2- και χρησιμοποιήθηκαν. rLiPO-E7m και Pam3 προκαλούμενη έκκριση του TNF-α σε BM-ΑΧ από TLR1-KO και TLR6-ΚΟ, αλλά απέτυχε να τονώσει BM-δενδριτικά κύτταρα από ποντίκια TLR2-KO, δείχνοντας ότι το TLR2 είναι αναγκαία για την ανοσο-διεγερτική δράση του rlipo- E7m (Σχήμα 2d). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι το ανοσογόνο συντηγμένο με βακτηριακή λιπίδιο ήμισυ ενεργοποιήσει την ωρίμανση του BM-DCs μέσω TLR2.

Ανοσοποίηση με rLiPO-E7m Βελτιώνει αντιγόνου ειδικά αντισώματα και παράγει ένα Th1 πολωμένα Response

Για την αξιολόγηση των εγγενών ανοσοενισχυτικές ιδιότητες του rLiPO-E7m

σε

vivo

, αναλύσαμε το μέγεθος της απόκρισης αντισώματος με εξειδίκευση σε αντιγόνο σε ποντικούς ανοσοποιημένους είτε με rE7m ή rLiPO-E7m (Σχήμα 3α) . Οι τίτλοι αντισωμάτων που προκαλούνται από rLiPO-E7m ήταν 100 φορές υψηλότερα από εκείνα που προκαλούνται από rE7m την εβδομάδα 4, 6 και 8. Στη συνέχεια, για την ανάλυση των ισοτύπων αντισώματος που προκαλείται κατά την ανοσοποίηση με rE7m ή rLiPO-E7m, τα επαγόμενη επίπεδα IgG 1 και IgG2b μετρήθηκαν. Τα επίπεδα IgG 1 ήταν συγκρίσιμες τόσο rE7m- και rLiPO-E7m ανοσοποιημένα ποντίκια? Ωστόσο, τα επίπεδα IgG2b στις rLiPO-E7m-immunzed ποντικοί ήταν υψηλότερες από αυτές των rE7m-ανοσοποιημένους ποντικούς (σχήμα 3β). Αυτό το φαινόμενο μπορεί να παρατηρηθεί σαφώς με σύγκριση των αναλογιών /IgG1 IgG2b σε αυτά τα ποντίκια (Σχήμα 3Β, ένθετο).

(α) C57BL /6 ποντίκια (η = 5) ανοσοποιήθηκαν δύο φορές με υποδόρια ένεση 30 μg του rE7m σε PBS ή 30 μg του rLiPO-E7m σε PBS σε διαστήματα δύο εβδομάδων. Οροί συλλέχθηκαν και IgG ή (β) αποκρίσεις IgG2b /IgG1 έναντι rE7m εκτιμήθηκαν με ELISA. Οι αναλογίες IgG2b /IgG1 και στις δύο ομάδες που φαίνεται στο ένθετο. (Γ) ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση 30 μα rE7m ή rlipoE7m δύο φορές σε διαστήματα δύο εβδομάδων. Επτά ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση, τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν και διεγέρθηκαν με rE7m (10 μg /ml) για 4-5 ημέρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα της IFN-γor IL-5 μετρήθηκαν με ELISA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο + SD των δειγμάτων (η = 5).

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε την έκκριση INF-γ και IL-5 σε σπληνοκύτταρα ποντικών ανοσοποιημένων με rE7m ή rLiPO-E7m. Το επίπεδο της INF-γinduced κατόπιν rLiPO-E7m ανοσοποίηση ήταν 4 φορές υψηλότερη από αυτή που επάγεται κατά rE7m ανοσοποίηση (Σχήμα 3γ)? Εν τούτοις, η ανοσοποίηση προκάλεσε μία rE7m 7 φορές υψηλότερη έκκριση της IL-5 από σπληνοκύτταρα από ό, τι το rLiPO-E7m ανοσοποίηση (Σχήμα 3c). Μαζί, τα αποτελέσματα του κυττάρου Τ και Β κυττάρων δοκιμασίες δείχνουν ότι σύντηξη ενός ανοσογόνου σε ένα βακτηριακό λιπίδιο τμήμα καταλήγει σε μία ανοσολογική αντίδραση Th1 που βασίζεται προκαλείται από την λιπιδιωμένη ανοσογόνο.

Ανοσοποίηση με rLiPO-E7m Προκαλεί Ε7 συγκεκριμένες απαντήσεις κυττάρων Τ

Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον rLiPO-E7m ανοσοποίηση ήταν σε θέση να επάγει Ε7-ειδικές αποκρίσεις CTL. C57BL /6 ποντίκια ανοσοποιήθηκαν υποδορίως την ημέρα 0 και 7 με rLiPO-E7m, rE7m ή μάρτυρα PBS. Τα σπληνοκύτταρα από τους ανοσοποιημένους ποντικούς διεγέρθηκαν με το πεπτίδιο RAHYNIVTF (RAH, Ε7

49-57) και ο αριθμός των Ε7-ειδικών ΙΡΝ-γ-κυττάρων που εκκρίνουν προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ELISPOT (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Ανοσοποίηση με rLiPO-E7m προκάλεσε μια αύξηση του αριθμού των INF-γsecreting κύτταρα από ότι έκανε η ανοσοποίηση με rE7m (Σχήμα 4α). Επιπλέον, η χρώση με RAH /H-2D

b R-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένο τετραμερούς έδειξε μια δραματική αύξηση στην Ε7-ειδικά CD8 + Τ κυττάρων μετά από ανοσοποίηση με rLiPO-E7m. Ο αριθμός των Ε7-ειδικών CD8 + Τ κυττάρων που επάγεται από rLiPO-E7m ανοσοποίηση ήταν περισσότερο από 4 φορές που επάγεται από rE7m ανοσοποίηση (Σχήμα 4β). Για να δοκιμαστεί δραστικότητα θανάτωσης κυττάρων Τ μετά rLiPO-E7m ή rE7m ανοσοποίηση, RAH εμφυτευμένα πεπτίδια Τ2 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα στόχοι σε μία τυποποιημένη ανίχνευση απελευθερώσεως χρωμίου 4-hr. rLiPO-E7m ανοσοποίηση που προκαλείται από ένα υψηλό επίπεδο Ε7-ειδική CTL δραστικότητα. Σε αντίθεση, rE7m ανοσοποίηση προκάλεσε μόνο ένα χαμηλό επίπεδο Ε7-ειδική CTL δραστηριότητα (Σχήμα 4γ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι οι HPV Ε7-ειδικές αποκρίσεις CTL επήχθησαν με rLiPO-E7m εμβολιασμό.

(α) Σπληνοκύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) από ανοσοποιημένους ποντικούς επωάστηκαν με ή χωρίς 10 μg /ml του RAHYNIVTF (RAH) πεπτίδιο για 48 ώρες σε ένα αντι-ΙΡΝ-γ-επικαλυμμένη πλάκα 96 φρεατίων ELISPOT. Οι ΙΡΝ-γ που εκκρίνει κηλίδες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ELISPOT. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο + SD από έξι ζώα ανά ομάδα. (Β) Οι RAH-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα ανιχνεύθηκαν με χρώση τετραμερούς και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των τετραμερών-θετικών κυττάρων ανάμεσα στα CD8 + Τ κύτταρα υποδεικνύεται μέσα σε κάθε φάτνωμα. Οι αριθμοί των TetraRAH-τετραμερούς + /CD8 + κύτταρα σε ολικά κύτταρα CD8 (1 × 10

5) από τρία πειράματα έδειξαν. γραφικές παραστάσεις Bar αναφέροντας το μέσο ποσοστό RAH τετραμερούς + /CD8 + κυττάρων μεταξύ των κυττάρων CD8 +. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος + SD. * P & lt? 0,05. (Γ) Για την εκτίμηση της κυτταροτοξική δράση του rLiPO-E7m ανοσοποίηση επί κυττάρων όγκου, μία πρότυπη δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου πραγματοποιήθηκε. Απομονωμένα σπληνοκύτταρα (κύτταρα τελεστές) διεγέρθηκαν με RAH (10 μg /ml) για 7 ημέρες παρουσία του rIL-2 (10 μονάδες /ml). Τα κύτταρα στόχοι (5 × 10

3 /φρεάτιο) επωάστηκαν με διαφορετική αναλογία κυττάρων τελεστών (1:25 1:50, 1:100). Ειδική λύση (%) υπολογίστηκε ως εξής:. 100 x (Δείγμα releasecpm – Αυθόρμητη releasecpm) /(Μέγιστη releasecpm – Αυθόρμητη releasecpm)

Η

Αξιολόγηση της θεραπευτική και προφυλακτική αποτελεσματικότητα της rLiPO-E7m

στο προφυλακτικό μοντέλο, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν δύο φορές με PBS, rE7m ή rLiPO-E7m σε διάστημα δύο εβδομάδες, και τα κύτταρα TC-1 εγχύθηκαν υποδορίως σε 7 ημέρες μετά την τελευταία ανοσοποίηση. Την ημέρα 58 μετά την πρόκληση, οι όγκοι παρέμειναν μόλις μετρήσιμη σε rLiPO-E7m-ανοσοποιημένους ποντικούς. Αντίθετα, το μέσο μέγεθος του όγκου σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με PBS ήταν μεγαλύτερη από 2.5 cm

3, και ο μέσος όγκος του όγκου ήταν 0,59 ± 0,62 cm

3 σε ποντικούς που εμβολιάστηκαν με rE7m (Σχήμα 5α). Για την εκτίμηση της θεραπευτικής μοντέλο, ποντικοί C57BL /6 εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα TC-1 σε ράχη. Επτά ημέρες αργότερα, αυτά τα ποντίκια έλαβαν 30 μ§ είτε rLiPO-E7m ή rE7m ή έλαβαν μόνο PBS μέσω υποδόριας ένεσης της κοιλιάς. Την ημέρα 58 μετά την πρόκληση, οι όγκοι ήταν μόλις και μετά βίας ανιχνεύσιμα σε ποντικούς που λαμβάνουν rLiPO-E7m. Αντίθετα, το μέσο μέγεθος του όγκου σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με PBS ήταν πάνω από 3 cm

3, και ο μέσος όγκος του όγκου σε ποντικούς ανοσοποιημένους με rE7m ήταν μεγαλύτερη από 2,0 cm

3 (Σχήμα 5β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο οι προφυλακτική και θεραπευτική αποτελεσματικότητες του ανασυνδυασμένου ανοσογόνα αυξήθηκε δραματικά όταν παραδίδονται σε μια λιπιδιωμένη μορφή.

(α) Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν δυο φορές με υποδόρια ένεση rE7m /rLiPO-E7m (10 μg ) ή PBS σε διαστήματα μίας εβδομάδας. Επτά ημέρες μετά την τελική ανοσοποίηση, οι ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με 2 χ 10

5 TC-1 κύτταρα σε συνολικό όγκο 200 μΐ υποδορίως. (Β) Οι ποντικοί υποδορίως εμβολιάσθηκαν με TC-1 κύτταρα (2 χ 10

5 /ποντικό). Μετά από 7 ημέρες, τα ποντίκια που φέρουν όγκο (5-10 ποντίκια ανά ομάδα) εγχύθηκαν μία φορά με rE7m /rLiPO /rE7m (30 μg /ποντικό) ή PBS. Το μέγεθος του όγκου παρουσιάζεται ως μήκος χ πλάτος χ πλάτος /2 (mm

3). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο + SEM. (Γ) Τρεις ομάδες (rLiPO-E7m /CD4, rLiPO-E7m /CD8 και rLiPO-E7m /Rat IgG) από τα ποντίκια ενέθηκαν του αντι-CD4, αντι-CD8 και αντισώματα ελέγχου, αντίστοιχα, μία ημέρα πριν από την ένεση της TC -1 κύτταρα. Αυτές οι ομάδες και δύο επιπλέον ομάδες (rLiPO-E7m και PBS) εγχύθηκαν μία φορά με rLiPO-E7m (10 μg /ποντικό) ή PBS επτά ημέρες μετά εμβολιάζεται με TC-1 κύτταρα (2 χ 10

5 /ποντικό). Το μέγεθος του όγκου παρουσιάζεται ως μήκος χ πλάτος χ πλάτος /2 (mm

3). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο + SEM.

Η

Πέντε ομάδες ποντικών C57BL /6 χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν περαιτέρω ποια υποσύνολο των Τ κυττάρων συμβάλλει στην ανοσία κατά του όγκου. Τρεις ομάδες ενέθηκαν του αντι-CD4 (rLiPO-E7m /CD4), αντι-CD8 (rLiPO-E7m /CD8) και αντισώματα ελέγχου (rLiPO-E7m /Rat IgG) μία ημέρα πριν από την ένεση των κυττάρων TC-1. Επτά ημέρες αργότερα, αυτά τα ποντίκια έλαβαν 10 μg rLiPO-E7m. Θεραπείες PBS και 10 μg rLiPO-E7m είχαν χρησίμευσαν ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα. Την ημέρα 30 μετά τον εμβολιασμό του όγκου, ο μέσος όγκος του όγκου PBS και ομάδων rLiPO-E7m ήταν 1,1 cm

3 και 0,14 cm

3, αντίστοιχα. Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων της rLiPO-E7m, rLiPO-E7m /CD4 και rLiPO-E7m /Rat IgG. Αντιθέτως, η προστατευτική επίδραση καταργήθηκε όταν CD8 + κύτταρα εξαντλούνται στην ομάδα rLiPO-E7m /CD8 (ρ & lt? 0.005, Εικόνα 5c). Αυτό το αποτέλεσμα προφανώς κατέδειξε ότι η χορήγηση rLiPO-E7m θα μπορούσε να παράγει κύτταρα CD8 + που προκαλείται αντικαρκινική δράση.

Συζήτηση

Έχουμε παρήγαγε μια λιπιδιωμένη ανοσογόνο, rLiPO-E7m, η οποία αποτελείται από το αδρανοποιημένο E7 πρωτεΐνη του HPV16 βιολογικά συγχωνευμένο σε ένα τμήμα βακτηριακού λιπιδίου. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η rLiPO-E7m επάγει μόνος Th1 ανοσοαποκρίσεων, Ε7-ειδικές αποκρίσεις CTL, και ογκο-προστατευτικής ανοσίας σε ένα μοντέλο όγκου ποντικού.

Η πρόκληση της ανάπτυξης ανοσοθεραπείες που βασίζονται σε πρωτεΐνες κατά των όγκων είναι ότι η ανοσογόνα πρωτεΐνη με βάση τα ίδια έχουν χαμηλή ανοσογονικότητα και να μην προκαλούν εύκολα αποκρίσεις CTL. Διατυπώνοντας το ανοσογόνο με επικουρικά είναι η πιο κοινή προσέγγιση για την ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων και ξεπερνώντας τον περιορισμό των ανοσοθεραπείες που βασίζονται σε πρωτεΐνες. Έχουμε επεκτείνει αυτή την ιδέα με ομοιοπολική σύνδεση ενός ανοσογόνου με ένα ανοσοενεργοποιητής, δημιουργώντας μια λιποπρωτεΐνη που βασίζεται εμβόλιο με εγγενή δραστικότητα ανοσοενισχυτικό.

Πρώιμες μελέτες έδειξαν την ισχυρή δραστικότητα ανοσοενισχυτικού βακτηριακής λιποπρωτεΐνης, συνθετικά λιπίδια με τα αντιγόνα πεπτιδίου και λιπιδίων -ουράς γλυκο-πεπτίδια [10], [11], [12]. Για παράδειγμα, η ανασυνδυασμένη λιπιδιωμένη OspA θα μπορούσε να επάγει προστατευτική ανοσία σχετίζεται με την ανάπτυξη αντισωμάτων. Αυτό το εμβόλιο της νόσου του Lyme (LYMErixTM) ήταν άδεια από τον FDA των ΗΠΑ το 1998 [13], [14]. Μία άλλη ανασυνδυασμένη προσέγγιση λιποπρωτεΐνης βασίζεται στην λιποπρωτεΐνης εξωτερικής μεμβράνης Ι (ΟΡγ) από Pseudomonas aeruginosa. ΟΡγ-based σύνθεση εμβολίου χρησιμοποιώντας την κλασική πανώλη των χοίρων (CSF) Ε2 και NS3 προωθούνται ενεργοποίηση DC στο χοίρο, με αποτέλεσμα αυξημένες αποκρίσεις κυττάρων Τ, μαζί με χυμική ανοσολογική άμυνα [15]. Η ΟΡγ έχει επίσης συντηχθεί με ένα αντιγόνο 85Α φυματίωση εμβόλιο υποψήφιος, mycolyl-τρανσφεράσης (Ag85A). Υποδόρια ενισχύοντας με αυτή την πρωτεΐνη σύντηξης με την απουσία του ανοσοενισχυτικού αύξησε σημαντικά τις Ag85A-ειδική χυμική ανοσοαποκρίσεις [16]. MALP-2 (μακροφάγων-ενεργοποιώντας λιποπεπτίδιο-2) έχει δείξει ενθαρρυντικά αντι-καρκινική δράση σε ορισμένα μοντέλα [17], [18]. Oldford και συνεργάτες απέδειξαν ότι Pam3CSK4 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μαστοκυττάρων και των μαστοκυττάρων που προέρχονται από την IL-6-εξαρτώμενο τρόπο [19]. Αργότερα ένα τριών συστατικών εμβόλιο GLP με Ingale και συνεργάτες (α Pam3CSK4 ήμισυ τρία παλμιτικό οξύ, ένα CD4 + και ένα επίτοπο Β-κυττάρων) έδειξε επαγωγή ισχυρής IgG αποκρίσεις όγκου-ειδικά [20]. Πρόσφατα, Renaudet και συνεργάτες έδειξαν τεσσάρων συνιστώσα HER-GLP κατασκεύασμα εμβόλιο (ένα CD4 + επίτοπο Τ-κυττάρου, ένα επίτοπο CD8 + Τ-κυττάρου OVA, ένας υδατάνθρακας επιτόπιο Β-κυττάρου και ένα ενσωματωμένο ανοσοενισχυτικό παλμιτικό οξύ) ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ανοσοποιημένους ποντικούς-GLP HER [21].

Επικουρική χρήση των λιποπεπτιδίων προκαλεί τόσο Th1 και Th2 κυτοκινών, ανάλογα με το μοντέλο αντιγόνο που χρησιμοποιείται σε εμβόλια. Για παράδειγμα, εντελώς συνθετικά λιποπεπτίδια συμπεριλαμβανομένων πεπτίδιο παλμιτοϋλο-λιπιδιωμένη και χοληστερίνη-λιπιδιωμένη πεπτίδιο αποτελέσματα που θα μπορούσε να προκαλέσει μια Th1-εξαρτώμενη προστατευτική ανοσία [22]. Σε αντίθεση, το διακυλιωμένο λιποπεπτίδιο FSL-1 επάγει TLR2 αποκρίσεις Th2 [23]. Ωστόσο, οι ανοσολογικές αποκρίσεις μπορεί να είναι ασύμμετρη από λιποπρωτεΐνες και λιποπεπτίδια προς τις αποκρίσεις Th1 εξακολουθούν να παρατηρούνται πολλές φορές. Ένα συνθετικό pam3 λιποπεπτιδίου της OspA διεγείρει την ανάπτυξη φαινότυπο Th1 σε αβ υποδοχέα των Τ-κυττάρων διαγονιδιακών ποντικών [5]. Bettahi και συνεργάτες βρήκαν ότι το λιποπεπτίδιο προκάλεσε μια πολωμένη Th1 ανοσοαπόκριση [24]. Imanishi και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η Pam3-CysSK4 και MALP-2 ως ειδικός ενεργοποιητής της κυτταρικής λειτουργίας Th1 και συνεπάγεται τη συμμετοχή σε Th1 αποκρίσεις [25].

Έχουμε αποδείξει ότι μια λιπο-ανοσοποιητικό μπορούσε επιτυχώς ενισχύσει την παραγωγή αντισωμάτων εξουδετέρωσης κατά του ιού του δάγγειου πυρετού [4], [7]. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε rLiPO-E7m να αποδείξει ότι τα ανοσοποιητικά λιποπρωτεΐνη μπορεί να προκαλέσει όγκου ειδικές αποκρίσεις CTL. Είναι σημαντικό, αυτή η προηγμένη προσέγγιση παρέχει ένα ορθολογικό σχεδιασμό για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου για το μέλλον. Πιστεύουμε ότι αυτή η λιπο-ανοσογόνο προσέγγιση μπορεί να αναπτυχθεί σε ένα νέο χαμηλού κόστους και αποτελεσματική θεραπεία για τον HPV καρκίνο που σχετίζεται. Επιπλέον, η ίδια η λιπιδική δομή είναι ένας αγωνιστής TLR2 [26] και μπορεί να περάσουν από τη διαδικασία εκτυλίσσεται και αναδίπλωση κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας, χωρίς να επηρεάζουν τη λειτουργία της. Αυτό το πλεονέκτημα επιτρέπει ανασυνδυασμένη λιπο-ανοσογόνα για να διατηρήσουν μεγαλύτερη ευελιξία και επιτρέπει την ισχυρή παραγωγή λιπιδιωμένης ανοσογόνων. Αν και αμφισβητήθηκε η έγκριση της λιπιδιωμένης OspA για τα αρθριτογόνα αποκρίσεις που προκαλούνται από το μοριακό μιμητισμό της OspA, δεν ζητήματα ασφάλειας προκύπτει σχετικά με την λιπιδική μονάδα του ανασυνδυασμένου λιπο-ανοσογόνα [27]. Στην τεχνολογία της πλατφόρμας μας, έχουμε βελτιστοποιήσει τα ανάντη και κατάντη διεργασίες για την παραγωγή της ανασυνδυασμένης λιποπρωτεΐνης, rAg473 του

Neisseria meningitides

Ομάδα Β, και έχουν χαρακτηρίσει το rAg473 χρησιμοποιώντας τις βελτιστοποιημένες διαδικασίες [28]. Οι προ-κλινικές τοξικολογικές και μελέτες σε ζώα των rAg473 έχουν ολοκληρωθεί και έχουμε ήδη δώσει τα δεδομένα για την ασφάλεια στην Ταϊβάν Τροφίμων και Φαρμάκων για Ερευνώμενο New Drug (IND) εφαρμογή.

Για να επάγουν αντιδράσεις CTL, σε πρωτεΐνες ανοσογόνα βάση πρέπει κανονικά να τυποποιηθούν με έκδοχα (ανασκόπηση [3] [29]). Για παράδειγμα, η σαπωνίνη που βασίζεται ανοσοενισχυτικό ISCOMATRIX [30] και το λιπόσωμα-πολυκατιονικό-DNA (LPD) ανοσοενισχυτικό [31] έχουν δείξει να βελτιώσουν CTL αποκρίσεις των εμβολίων που βασίζονται σε πρωτεΐνη HPV. HPV-16 Ε7 έχει συντηχθεί σε ένα θραύσμα του

Haemophilus influenzae

πρωτεΐνη D τυποποιούνται σε ένα σύστημα που περιέχει ανοσοενισχυτικό μονοφωσφορυλολιπίδιο Α και QS-21 έκδοχο σαπωνίνης [32]. Πρόσφατα, Nventa Biopharmaceuticals (αγοράστηκε από Ακέλα Pharma) ανέφεραν ότι η αποτελεσματικότητα της HspE7 ενισχύθηκε περαιτέρω από την επικουρική Po1y-ICLC, και το εύρημα αυτό χρησίμευσε ως βάση για τις δοκιμές φάσης 1 clinica1 [3]. Παρά το γεγονός ότι οι πρόσφατες εξελίξεις στον επικουρικό τομέα έχουν δώσει αρκετά ισχυρό και χρήσιμο επικουρικό υποψηφίων, την ανάπτυξη αποτελεσματικών και ασφαλών βοηθητικά για ανθρώπινη χρήση εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση [33]. Η προσέγγισή μας αποφεύγει το εμπόδιο της χρησιμοποιώντας ανοσοενισχυτικό, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να παρέχει μια νέα μέθοδο για να συνεχίσει την ανάπτυξη θεραπευτικών εμβολίων.

Εν κατακλείδι, έχουμε αποδείξει ότι βιολογικά σύντηξη ενός αντιγόνου όγκου με ένα βακτηριακό τμήμα λιπιδίων κατέστησε αυτό αντιγόνο ικανό να διεγείρει το BM-DCs μέσω TLR2, προκαλεί μια Th1 ανοσοαπόκριση, επάγοντας αντιγόνο ειδικές αποκρίσεις CTL, και δημιουργώντας όγκο προστατευτικής ανοσίας σε ένα μοντέλο όγκου ποντικού. rLiPO-E7m μπορεί έτσι να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική υποψήφιο εμβόλιο εναντίον όγκων του HPV που σχετίζονται. Επιπλέον,

Ε. coli

έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα σταθερό σύστημα παραγωγής για βιολογικών, και αυτή η τεχνολογία λιπιδίωση μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα σε άλλα ογκο-αντιγόνα συγγενή με λίγους περιορισμούς. Αυτή η στρατηγική μπορεί να παρέχει μία μέθοδο για την ανάπτυξη επιτυχημένων ανοσοθεραπείες που χρησιμοποιούν οι υποψήφιοι με βάση πρωτεΐνη και θα αποφέρει ελπίζουμε τα εμβόλια ασφάλεια και αποτελεσματικά για ανθρώπινη χρήση.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Όλα τα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) και Merck (Darmstadt, Γερμανία). Τα ένζυμα περιορισμού και λιγάση αγοράστηκαν από την New England Biolabs, Inc. (Beverly, ΜΑ). Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση αγοράστηκαν από την αποστολή Biotech, Inc. (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Η θρυψίνη και η μήτρα που χρησιμοποιείται για την ανάλυση φασματομετρίας μάζας αγοράστηκαν από Promega Co. (Madison, WI).

Γραμμές κυττάρων και μεσαίες

TC-1, μία κυτταρική σειρά επιθηλιακών ποντικού μετασχηματισμένα με τα ογκογονίδια Ras, HPV16 Ε6 και Ε7, ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ TC Wu (Johns Hopkins University). TC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (GIBCO-BRL, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, Logan, Utah), πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml ). Πλήρεις ΚΡΜΙ-10 μέσο περιείχε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση, 25 mM HEPES, 4 mM Ε-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml θειική στρεπτομυκίνη και 50 μΜ . β-μερκαπτοαιθανόλης

το σκεπτικό για τη Μελέτη της Ανενεργό HPV Ε7 (E7m)

το HPV Ε7 περιέχει ογκοπρωτεΐνη τρεις συντηρημένες περιοχές: περιοχές CR1, CR2 και CR3 [34].