Αφηρημένο

Ο ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) απαιτείται για την επανεκκίνηση της κατέρρευσε πιρούνια αντιγραφής του DNA και χωρίς λάθη επιδιόρθωση του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα (ΟΕΔ). Ωστόσο, απρογραμμάτιστες ή υπερκινητικά HR μπορεί να οδηγήσει σε γενωμική αστάθεια και την προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου. Οι κυτταρικών παραγόντων που περιορίζουν διαδικασιών HR σε κύτταρα θηλαστικών είναι μόλις τώρα αρχίζουν να διευκρινιστεί. Το ογκοκατασταλτικό ρ53 έχει εμπλακεί στην καταστολή του ΥΕ αν και παρέμεινε ασαφές γιατί p53, ως θεματοφύλακας του γονιδιώματος, θα επηρεάσουν την διαδικασία επισκευής χωρίς λάθη. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η ρ53 ρυθμίζει προς τα κάτω εστιών σχηματισμού της ρεκομπινάσης RAD51 σε απόκριση αντιγραφικών στρες σε καρκινικά κύτταρα Η1299 πνεύμονα με έναν τρόπο που είναι ανεξάρτητο από το ρόλο της ως παράγοντας μεταγραφής. Θεωρούμε ότι αυτή η αρνητική ρύθμιση του HR δεν είναι μόνο εντελώς εξαρτάται από την θέση πρόσδεσης του ρ53 με την πρωτεΐνη αντιγραφής Α, αλλά επίσης και στην ιστοσελίδα ATR /ATM σερίνη 15 φωσφορυλίωση. Γενετική ανάλυση δείχνει ότι η ATR, αλλά δεν ΑΤΜ κινάσης ρυθμίζει τη λειτουργία p53 στο HR. Η καταστολή του HR από p53 μπορεί να παρακαμφθεί υπό πειραματικές συνθήκες που προκαλούν ΟΕΔ είτε άμεσα είτε έμμεσα, σύμφωνα με το ρόλο p53 ως φύλακας του γονιδιώματος. Ως αποτέλεσμα, διενεργοποίησης-ανενεργό ρ53 δεν θέτει σε κίνδυνο την αντίσταση των κυττάρων Η1299 με τον παράγοντα διασταυρούμενης σύνδεσης διακλαδική μιτομυκίνη C. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο το ρ53 παίζει ένα αντι-ανασυνδυαστικογενική ρόλο στην ATR-εξαρτώμενη οδοφράγματος αναδιπλασιασμού θηλαστικών αλλά κάνει δεν παρεμποδίζουν την ικανότητα του κυττάρου να χρησιμοποιήσετε ΥΕ για την απομάκρυνση των ΟΕΔ που προκαλείται από κυτταροτοξικών παραγόντων

Παράθεση:. Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wülfing V, Marten LM, Clarkson ΚΕ, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Περιορίζει ομόλογου ανασυνδυασμού σε απάντηση σε αναπαραγωγική άγχος, αλλά δεν περιορίζει DNA διακλαδική διασταυρώσεων Επισκευή σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10.1371 /journal.pone.0023053

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6η Μαΐου 2011? Αποδεκτές: 5 του Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Sirbu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από NCI χορηγεί R01 CA58985 (SNP) και R01 GM076388 (LZ), το NCI Dana-Farber /Harvard Κέντρο Καρκίνου SPORE στο Καρκίνο του πνεύμονα Ρ50 CA090578 (HW, LZ), Υπουργείο άμυνας W81XWH-06-1-0309 (HW ), Ομοσπονδιακή μερίδιο του εισοδήματος του προγράμματος κερδίσει από Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης για C06 CA059267, Proton Θεραπεία Κέντρο Έρευνας και Θεραπεία (HW), και η Deutsche Krebshilfe (γερμανικά Καρκίνο Aid) 10 έως 1.843-Da (JDD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι γενετικές ανταλλαγές που προκαλείται από ομόλογες αλληλουχίες DNA, πρέπει να ρυθμίζεται αυστηρά για να διατηρούν την γονιδιωματική σταθερότητα [1]. Ένα ενεργό ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) οδός είναι απαραίτητη για την επισκευή και την επανεκκίνηση της κατέρρευσε πιρούνια αντιγραφής του DNA [2]. Τα κύτταρα με ελαττώματα HR εξασθενημένη στην ικανότητά τους να αφαιρέσει σταυρωτές συνδέσεις διακλαδική DNA (ICL) όπως παράγεται για παράδειγμα με μιτομυκίνη C (MMC). Τα DNA διπλό σκέλος διαλείμματα (ΟΕΔ) που συμβαίνουν στην S-φάση μετά την αντιγραφή ή G2 επισκευαστεί από ΥΕ σε ένα τυπικά σφάλματα τρόπο επειδή ομόλογη αλληλουχία DNA για την αδελφή χρωματιδικού μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ακριβές πρότυπο για επισκευή. Σε αντίθεση, αυθόρμητες ανταλλαγές DNA μεταξύ ομόλογων αλληλουχιών σε μίτωση αναπτυσσόμενα κύτταρα πρέπει να είναι περιορισμένες και δραστηριότητες HR σε αδιέξοδο πιρούνια αντιγραφής δεν είναι πάντα επιθυμητό [1], [3], [4]. Οι αντι-ανασυνδυαστικογενική παράγοντες που περιορίζουν την ΥΕ σε κύτταρα θηλαστικών μόλις τώρα αρχίζουν να διευκρινιστεί.

Ο καταστολέας όγκου ρ53 παίζει κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας και της καταστολής του κυτταρικού μετασχηματισμού [1], [5] . Κατά συνέπεια, η λειτουργία ρ53 άγριου τύπου διαταράσσεται από γενετικές μεταλλάξεις ή άλλων μηχανισμών, στην πλειονότητα, αν όχι όλοι, ανθρώπινοι καρκίνοι [5]. p53 έχει αναδειχθεί ως πολυλειτουργικός ρυθμιστής, το οποίο βρίσκεται στο κέντρο πολλών οδών που εμπλέκονται στην απόπτωση, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, και την επιδιόρθωση του DNA. Πολλές λειτουργίες της ρ53 που προκαλούνται από μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων στόχων κατάντη [6]. Εμείς και άλλοι έχουν δημιουργήσει ένα επιπλέον μετενεργοποίηση-ανεξάρτητο ρόλο της ρ53 στην καταστολή των διαδικασιών HR σε μια ποικιλία συστημάτων κυττάρων και δοκιμασίες [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [13]. Για παράδειγμα, αρκετές μεταλλάξεις p53, όπως L22Q /W23S (p53QS), A138V, ή V143A, δυνατότητα η οποία p53 βλάπτουν να μετενεργοποιήσει γονίδια-στόχους, συμπεριλαμβανομένων p21, δεν θέτουν σε κίνδυνο την ικανότητα της ρ53 να ρυθμίζουν προς τα κάτω HR [10], [14]. p53 φαίνεται να επηρεάζει ΥΕ μέσω διαφόρων άμεσων πρωτεΐνες και το DNA αλληλεπιδράσεις [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. Μια άμεση αλληλεπίδραση με το μονόκλωνο (ss) δέσμευσης DNA-Protein Replication Α (RPA) φαίνεται να αναστέλλει HR σε πρώιμο στάδιο, και επιπλέον αλληλεπιδράσεις με BRCA2 και RAD51 μπορούν εξυπηρετούν τον ίδιο σκοπό [9], [10], [ ,,,0],24]. Προς τα κάτω ρύθμιση του HR εξαρτάται από άθικτο πυρήνα και tetramerization τομείς της ρ53 [7], [8], [12], ενώ εμφανίζεται το άκρο Ο-τερματικό περιττό [12], [13]. Οι ανάντη παράγοντες που ρυθμίζουν την p53 με τη μεσολάβηση της καταστολής HR παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες [25].

Πολλαπλές p53 παρατηρήσεις σύνδεσμο άμεσα με την αντιγραφή του DNA. p53 συνεντοπίζεται με θέσεις αναδιπλασιασμού [26], [27], εκφράζεται παράλληλα με τη σύνθεση του DNA όταν τα κύτταρα ξανά τον κυτταρικό κύκλο [28], και μεταναστεύει εντός του πυρήνα στη φάση S [29], [30] . Αντιγραφή του κατεστραμμένου DNA είναι αποκλεισμένη από p53

in-vitro

[31]. Μετά από αναστολή του αναδιπλασιασμού επιμήκυνση με υδροξυουρία (HU), μεταγραφικά ανενεργή ρ53 συσσωρεύεται στο S-φάσης [32]. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, ρ53 ρυθμίζει προς τα κάτω HR αν επιμήκυνση αναδιπλασιασμού είναι αποκλεισμένη [11], [33]. Τι έχει παραμείνει άγνωστο είναι αν δραστηριότητα διενεργοποίησης άγριου τύπου ρ53 που απαιτείται για την κατασταλτική της ρόλο στην αντιγραφή του που σχετίζονται με ΥΕ.

P53 φωσφορυλιώνεται άμεσα ή έμμεσα από το ΑΤΜ (αταξία Τελαγγειεκτασίας Μεταλλαγμένα) και ATR (ΑΤΜ και Rad3 -σχετικών) κινάσες [34], [35], αλλά οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των τροποποιήσεων όσον αφορά τη ρύθμιση HR δεν έχουν τεκμηριωθεί. ATM ανταποκρίνεται κυρίως σε DSBs και φωσφορυλιώνει ένα δίκτυο υποστρωμάτων [36]. ATM επηρεάζει τόσο ΥΕ, καθώς και επιρρεπής σε λάθη και σφάλματα μη-ομόλογο τέλος-που ενώνει [37], [38], [39]. Η κινάση ATR διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην απόκριση σε αντιγραφική στρες, και το φωσφορυλίωση υποστρωμάτων ATR αναστέλλει συλλογικά αναδιπλασιασμό και διατηρεί πιρούνια αντιγραφή, αποτρέποντας έτσι γενωμική αστάθεια [40], [41]. Είναι σημαντικό, HR χρησιμοποιείται για την εκ νέου έναρξη αντιγραφής, αλλά μπορεί επίσης να προκαλέσει ακατάλληλη εκδηλώσεις σκέλος ανταλλαγής σε αδιέξοδο πιρούνια, αν δεν ρυθμίζεται σωστά [40], [42]. Σε σύγκριση με ζύμη, τα αντι-ανασυνδυαστικογενική λειτουργίες του οδοφράγματος αντιγραφή σε κύτταρα θηλαστικού είναι ελάχιστα κατανοητές [40], [42].

Εδώ, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ότι διενεργοποίησης με ανεπάρκεια ρ53 ρυθμίζει προς τα κάτω σε απόκριση HR να αντιγραφική στρες. Έχουμε αποδείξει ότι η καταστολή HR από p53 συμβαίνει μέσα σε μόλις ώρες από την αντιγραφική άγχος και εξαρτάται τόσο η θέση πρόσδεσης RPA και ATR σερίνη θέση φωσφορυλίωσης 15, τοποθετώντας έτσι p53 στο σημείο ελέγχου αντιγραφής των θηλαστικών. Σε αντίθεση με το ρόλο p53 στην αντιγραφική αντίδραση στο στρες, η καταστολή της ομολογίας μεσολάβηση επισκευή άμεσα ή έμμεσα προκαλούμενη DSB φαίνεται χαλαρή, συνάδει με τον ρόλο p53 ως φύλακας του γονιδιώματος.

Αποτελέσματα

ρύθμιση διαφορικού του HR από διενεργοποιήσεως με προβλήματα p53

έχει ήδη αποδειχθεί ότι η p53 καταστέλλει ΥΕ μετά την επαγωγή της αντιγραφικής στρες [11], [33]. Ωστόσο, ήταν άγνωστο αν δραστηριότητα διενεργοποίησης του ρ53 είναι απαραίτητη για τη λειτουργία αυτή. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, θα χρησιμοποιηθεί p53-null κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένα παρελθόν που χαρακτηρίζεται τρανσενεργοποίηση μειωμένη μεταλλαγμένο p53, p53QS [10]. Εμείς επάγεται ο σχηματισμός subnuclear RAD51 εστιών με κατεργασία των κυττάρων με αναστολείς της επιμήκυνσης αντιγραφής, θυμιδίνη και HU (Σχήμα 1Α, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε απάντηση είτε φάρμακο, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική καταστολή του σχηματισμού RAD51 εστιών στα κύτταρα που εκφράζουν p53QS, σε σύγκριση με ρ53-ηυΙΙ ελέγχους (Σχήμα 1BC, Εικόνα S1 Α). Ως μάρτυρας, το μέγεθος αυτής της επίδρασης ήταν παρόμοιο με το HR καταστολή ικανότητα της ενδογενούς ρ53 άγριου τύπου, αν και αυτό το πείραμα διεξήχθη σε μία διαφορετική κυτταρική γραμμή, Α549 (Σχήμα S1B). Σε αντίθεση, το Σχήμα 1D δείχνει ότι p53QS δεν διαμορφώνει την επαγωγή εστίες RAD51 σε κύτταρα που εκτίθενται σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR), η οποία παράγει DSB σε όλο τον κυτταρικό κύκλο, με την αδελφή χρωματιδικές DSB που συμβαίνουν μετά την αντιγραφή και G2 επισκευαστεί από ΥΕ.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες σχηματισμού subnuclear RAD51 εστιών σε Η1299 κύτταρα εκφράζουν σταθερά p53QS ή ρ53-ηυΙΙ κύτταρα κατεργασμένα με 5 mM θυμιδίνης (TdR) για 24 ώρες. (Β) Επίδραση της κατάστασης ρ53 (null έναντι QS) επί του σχηματισμού RAD51 εστιών σε Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με 5 mM TdR για 24 ώρες. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή με τυπικό σφάλμα βασίζεται σε 3 ανεξάρτητες επαναλήψεις. (C) Επίδραση της κατάστασης ρ53 στο σχηματισμό RAD51 εστιών σε Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με 1 mM υδροξυουρία (HU) για 24 ώρες. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή με τυπικό σφάλμα βασίζεται σε 5 ανεξάρτητες επαναλήψεις. (D) Επιπτώσεις της κατάστασης p53 στο σχηματισμό RAD51 εστιών σε Η1299 κύτταρα 6 ή 16 ώρες (h) μετά από θεραπεία με 2 Gy ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή με τυπικό σφάλμα βασίζεται σε 2-5 ανεξάρτητες επαναλήψεις. Όλα y-άξονες δεικνύουν ποσοστό των κατεργασμένων κυττάρων με τουλάχιστον 10 RAD51 εστιών ανά πυρήνα μετά την αφαίρεση του ποσοστού των μη επεξεργασμένων κυττάρων με τα επίπεδα υποβάθρου του RAD51 εστιών. Οι Ρ-τιμές βασίζονται σε t-test του Student (two-tailed).

Η

Για να μοντελοποιήσουμε την επισκευή DSB σε υποστρώματα που μοιάζει να ευθυγραμμίζονται αδελφές χρωματίδες, τροποποιήσαμε μια δοκιμασία ανασυνδυασμού χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν που καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά σε μυκοφαινολικό οξύ μετά την επιτυχή ΥΕ. Η βακτηριακή

gpt

γονιδίου στο pDT219 υπόστρωμα ανασυνδυασμού αδρανοποιήθηκε με εισαγωγή ενός θέση αναγνώρισης I-δοβΙ εντός της θέσεως ΚρηΙ (Εικόνα 2Α). Προσαρμογή ένα προηγουμένως χαρακτηριζόμενη μοντέλο ποντικού για να μελετήσουν τις μετενεργοποίηση ανεξάρτητη ιδιότητες της ρ53 [13], εκφράσαμε μετενεργοποίηση-εξασθενημένη p53-A135V σε εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) που φέρει το υπόστρωμα pDT219 που φιλοξενεί μια θέση αναγνώρισης για το σπάνιο κοπή ιστότοπο- κατευθυνόμενη meganuclease I-δοβΙ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι αυτό το μεταλλαγμένο ρ53 είναι ικανό να καταστέλλει αυθόρμητες εκδηλώσεις HR, αναλόγως προς p53QS σε ανθρώπινα κύτταρα [10], [13]. Εκτιμήσαμε πρώτα το αποτέλεσμα αυτής της μεταλλαγμένης να καταστείλει DSB-επαγόμενη HR χρησιμοποιώντας την ομόλογη αλληλουχία δότη pΔ2, το οποίο είναι συν-επιμολύνθηκαν ένα φορέα έκφρασης meganuclease I-δοβΙ. Σε αυτό το σύστημα, η ομολογία μεσολάβηση επισκευή διαμεσολαβείται από τμήματα της αδιάλειπτης ομολογίας των 202 bp και 2333 bp ανοδικά και καθοδικά της θέσης Ι-δοβΙ, αντίστοιχα. Δεν ανιχνεύθηκαν στατιστικά σημαντική διαφορά στην DSB-επαγόμενη συχνότητες HR μεταξύ των κυττάρων με και χωρίς ρ53 A135V (Σχήμα 2Β). Δεν υπήρχε διαφορά στην αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης μεταξύ των διαφορετικών κλώνων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, τροποποίησε το πλασμίδιο δότη να μειώσει τη διάρκεια της κοινής ομολογίας αλληλουχίας με μόνο 188 – 250 bp (pKEB1). Με την τροποποίηση αυτή, η κατασταλτική δράση της ρ53 ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη έως 10-φορές (ρ Σε ένα παρελθόν που δημοσιεύθηκε το μοντέλο, την παγίδευση των RPA από ssDNA θα αναστέλλει την μετέπειτα φόρτωση του RAD51, και ως εκ τούτου είναι ένα μέσο με το οποίο p53 καταστέλλει HR [10]. Η ρ53 Ν-άκρο ανταγωνίζεται με ssDNA για την OB-πλάσια περιοχή του Ν-άκρου RPA1 του [55]. Έτσι, εικάζουν ότι οι μηχανισμοί μπορούν να υπάρχουν με την οποία Ν-τερματική φωσφορυλίωση της ρ53 προωθεί τη σύνδεση προς RPA1, επηρεάζοντας έτσι το ssDNA-συγγένεια δέσμευσης των τομέων δέσμευσης του DNA του RPA. Για παράδειγμα, αλλαγμένη ssDNA-ΚΡΑ δέσμευσης θα μπορούσε να οδηγήσει σε μη προγραμματισμένη απελευθέρωση των RPA από ssDNA αλλοίωσης με την κατάλληλη RAD51 φόρτωσης ή p53 μπορεί παγίδα RPA για ssDNA και να καθυστερήσει RAD51 φόρτωσης. Υπάρχουν ισχυρές αλληλεξαρτήσεις μεταξύ των Ν-τερματικών θέσεις φωσφορυλίωσης ρ53 [56], [57]. Σε Η1299 κύτταρα, τη μετάλλαξή του S15 οδηγεί σε μειωμένη φωσφορυλίωση S37 μετά από ακτινοβόληση [57]. Είναι ενδιαφέρον, Lowry et al. βρέθηκε πρόσφατα αποδείξεις μία αναδιπλωμένη περιοχή στον τομέα εγγενώς μη δομημένο ρ53 με μία δομή βρόχου επικεντρώνεται γύρω από τα κατάλοιπα 34-36 [58]. Οι συγγραφείς αυτοί πρότειναν ότι η φωσφορυλίωση S37 μπορεί να οδηγήσει σε μια ανοικτή διαμόρφωση αυτής της περιοχής και κατά συνέπεια προωθούν σύνδεση με RPA1. Έτσι, η μετάλλαξη της S15 θα έθιγε ΥΕ έμμεσα μέσω ενός ανασταλτική επίδραση στις παρακείμενες φωσφορυλίωση S37.

Η αντίληψη ότι η p53 μπορεί να καταστείλει την επισκευή DSB έχει προέλθει από μια σειρά από μελέτες που εξετάζουν την επίδραση της p53 στο χώρο-σκηνοθεσία DSB σε χρωμόσωμα ενσωματωμένο πλασμίδιο υποστρώματα [7], [12], [59]. Βρήκαμε ότι το μέγεθος της επίδρασης καταστολής p53 συσχετίζεται με το μήκος της ομολογίας αλληλουχίας παρούσης (Εικόνα 2, S2). Εμείς υποθέσουμε ότι το σύστημα pDT219 /pΔ2 (Σχήμα 2) είναι αντιπροσωπευτική της αδελφής επισκευής χρωματίδων λόγω της έκτασης των διαθέσιμων ομολογία αλληλουχίας είναι στην περιοχή κιλοβάσεων. Ενώ αναγνωρίζουμε ότι η σύγκριση μεταξύ των διαφόρων συστημάτων ανασυνδυασμού έχει επιφυλάξεις, η εξάρτηση της κατασταλτικής επίδρασης p53 σχετικά με το μήκος ομολογία είναι σε άριστη συμφωνία με μια προηγούμενη μελέτη από Wiesmuller et al. [12]. Αυτοί οι συγγραφείς, οι οποίοι χρησιμοποίησαν ένα πάνελ χρωμοσωμικό υποστρωμάτων EGFP-based, απέδειξε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των γεγονότων γονιδιακής μετατροπής από το ρ53 ήταν ιδιαίτερα έντονη όταν το μήκος της από κοινού ομολογία μειώθηκε σε 168-233 bp. Είναι πιθανό ότι η ρ53 δημιουργεί ένα όριο μεταξύ βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα ομολογίες, η οποία μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη επιρρεπής σε λάθη επισκευής και επιζήμια αναδιατάξεις με κακή ευθυγράμμιση των επαναλαμβανόμενων DNA. Ένα τέτοιο μοντέλο θα ήταν σύμφωνο με την παρατήρηση ότι η κατάσταση της κυτταρικής p53 δεν έχει άμεση επίδραση στη στόχευση γονιδίων και ανταλλαγές χρωματίδων αδελφή, που συνήθως προκαλούνται από μεγάλες ομολογίες της τάξης των χιλιάδων βάσεων [60]. Αυτό το μοντέλο προβλέπει επίσης ότι η p53 δεν θα επηρεάσει αρνητικά την επισκευή χρωματιδικές DSB που προκαλείται από ιονίζουσα ακτινοβολία ή άλλους παράγοντες, το οποίο είναι σύμφωνο με τα δεδομένα επιβίωσης των κυττάρων [61]. Τα στοιχεία μας δείχνουν επίσης ότι HR επάρκειας μετριέται με ένα πλασμίδιο σύστημα που βασίζεται Ι-δοβΙ όπως PDR-GFP (Εικόνα S2) δεν είναι πάντα μια καλή υποκατάστατος δείκτης για HR-εξαρτώμενη επισκευή των εξωγενών βλαβών του DNA. Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η επισκευή HR χρωμοσωμικών Ι-δοβΙ που προκαλείται DSB είναι κυτταρικού κύκλου εξαρτάται και υπόκειται στην μεταγραφική ρύθμιση από ρ53 (Rieckmann et al., Αδημοσίευτα 2011). Έτσι, είναι πιθανό ότι οι δραστηριότητες HR σε απόκριση προς αντιγραφή στρες ή ειλικρινής DSB ρυθμίζονται διαφορικά από αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων παραλλαγών ρ53. Μπορούμε επίσης δεν αποκλείει ότι οι ρυθμιστικές επιδράσεις μπορούν να ποικίλουν μεταξύ των κυτταρικών σειρών.

Τέλος, ρ53 δεν θέτουν σε κίνδυνο την απόκριση RAD51 εστίες και την επιβίωση των κυττάρων μετά την έκθεση στο MMC παράγοντα διασταύρωσης (Σχήμα 6). Αντίθετα, υπήρξε ακόμη και μια μικρή αύξηση στην επιβίωση των κυττάρων κατά την έκφραση του μετενεργοποίησης ελλειμματικών μεταλλακτών ρ53 (Σχήμα 6Ε, S6). Ο υποκείμενος μηχανισμός μένει να καθοριστεί, αλλά μπορεί να σχετίζεται με μια πιθανή σταθεροποίηση των συμπλόκων πολλαπλών πρωτεϊνών στη διχάλα αντιγραφής από p53 (ΙΜΜ, HW, αδημοσίευτα στοιχεία). Η παρατηρούμενη αύξηση στην αντοχή MMC είναι συνεπής με άλλες εκθέσεις που δείχνουν ότι, απουσία της απόπτωσης, η παρουσία του ρ53 σχετίζεται με την αντίσταση σισπλατίνη [62], [63], [64]. Αντίθετα, σε συστήματα κυττάρων ή προσδιορισμούς επιρρεπή σε απόπτωση, αντίσταση σε παράγοντες βλάβης του DNA συνήθως προκαλείται από την απώλεια του άγριου-τύπου ρ53 [65], [66]. Συνολικά, ο ρόλος της ρ53 σε προσδιορισμό επιβίωση κυττάρου σε απόκριση σε βλάβες του DNA είναι σαφώς περίπλοκη και μια αντανάκλαση της πολλαπλές λειτουργίες ρ53 σε απόπτωση, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, και DNA ανασυνδυασμού. Η μελέτη αυτών των ερωτήσεων σε καθορισμένα συστήματα κύτταρο είναι μια πολλά υποσχόμενη λεωφόρος της έρευνας με πιθανή κλινική σημασία για την αγωγή των κακοηθών όγκων περισσότερα από τα οποία έχουν χάσει την λειτουργία της πρωτεΐνης ρ53. Επιπλέον, η βιολογική σημασία της λειτουργίας του p53 στη ρύθμιση ΥΕ, ιδίως σε σχέση με το ρόλο της στην καταστολή των όγκων, μένει να αποδειχθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

καρκίνος NCI-Η1299 κύτταρα πνεύμονα (ρ53-ηυΙΙ) ελήφθησαν από την ATCC και η χρήση τους έχει δημοσιευτεί προηγουμένως [10]. Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα ελήφθησαν επίσης από την ATCC. Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών (BALB /c 3Τ3 10.1 κλώνος, ρ53-ηυΙΙ) ήταν ένα δώρο από τον Dr. Arnold Levine και η χρήση τους έχει δημοσιευθεί [14], [61]. Η1299 /FRT κλώνοι που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις ρ53 παρήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Flp-In, Invitrogen). Εν συντομία, κύτταρα Η1299 ήταν ηλεκτρο-επιμολύνθηκαν με pFRT /LacZ που ακολουθείται από Zeocin (100 μg /ml, Invitrogen) επιλογή για τη δημιουργία χρωμοσωμικών ενσωματώματα. Επελέγησαν προϊόντα ενσωμάτωσης με ένα μόνο αντίγραφο με χαμηλή μεταγραφική δραστηριότητα βασίζεται στη συν-ολοκληρωμένο β-γαλακτοσιδάση ανταποκριτού για επιμόλυνση με κατασκευάσματα διάφορα pcDNA5 /FRT-p53, ταυτόχρονα με pOG44 για στοχευόμενη ολοκλήρωση εντός της θέσης δέκτη FRT. Μετά από επιλογή με 400 μg /ml υγρομυκίνη (Invitrogen), αποικίες επεκτάθηκαν και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου που λαμβάνεται για την αξιολόγηση της έκφρασης πρωτεϊνών. Για ορισμένα πειράματα, τα κύτταρα Η1299 που μεταφέρουν ένα τυχαία ολοκληρωμένο p53QS κατασκευή (PRC /CMV-L22Q /W23S, παραχωρήθηκε ευγενικά από Anindya Dutta) χρησιμοποιήθηκαν. Οι MEF διαμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης για ρ53-A135V και επιλέγονται με 500 μg /ml G418 (Fisher Scientific), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Όλες οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν μυκόπλασμα-free.

RNA παρεμβολής

ATR είχε ως στόχο από ένα παρελθόν που χρησιμοποιείται και επικυρωθεί siRNA ολιγονουκλεοτιδίων, 5′-CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 ‘(Applied Biosystems) [67]. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα Η1299 καλλιεργήθηκαν 16 ώρες πριν από την επιμόλυνση. ATR siRNA ή με ένα ανακατωμένο έλεγχο αραιώθηκε σε 100 μι Ορίί-ΜΕΜ (Roche) για να δώσει μία τελική συγκέντρωση 100 ηΜ, και αναμίχθηκαν με 10 μL του αντιδραστηρίου διαμόλυνσης X-tremeGENE (Roche) σε 100 μL σε Opti-ΜΕΜ. Ο σχηματισμός συμπλέγματος αφέθηκε να προχωρήσει για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν την στάγδην προσθήκη στα κύτταρα. σύμπλοκα siRNA επωάστηκαν με κύτταρα για 4 ώρες, χρόνος κατά τον οποίο τα κύτταρα αλλάχθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Η διαμόλυνση διεξήχθη δύο φορές, 24 ώρες, για να επιτευχθεί η βέλτιστη knockdown. Λύματα ολόκληρων κυττάρων λήφθηκαν στις 24 και 48 ώρες. Προϊόντα λύσης μετουσιώνεται και ανάγεται, και στη συνέχεια εκτελούνται σε 3-8% Τπδ-Οξικό γέλης (Invitrogen) για 2,5 ώρες στους 150 V. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη PVDF με ένα ημι-ξηρό συσκευή (BioRad) για 1 ώρα στους 12