Αφηρημένο

παράγοντα νέκρωσης όγκου-όπως ασθενής επαγωγέας της απόπτωσης (τννΈΑΚ, TNFSF12) είναι μέλος του παράγοντα νέκρωσης των όγκων υπεροικογένεια. TWEAK ενεργοποιεί τον υποδοχέα Fn14, και μπορεί να ρυθμίζει τον κυτταρικό θάνατο, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα όγκου. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία και τη ρύθμιση αυτού του συστήματος στον καρκίνο του προστάτη. Fn14 έκφρασης και τννΈΑΚ δράσεις μελετήθηκαν σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη, το ανδρογόνο-ανεξάρτητες PC-3 κυτταρική γραμμή και τα κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-κεφαλαίων. Επιπλέον, η έκφραση του Fn14 αναλύθηκε σε ανθρώπινο βιοψίες καρκίνου του προστάτη. Fn14 έκφραση είναι αυξημένη σε ιστολογικές τομές του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη εκφράζουν ιδιοσυστατικά Fn14, αλλά, το ανδρογόνο-ανεξάρτητες κυτταρική γραμμή PC-3 έδειξε υψηλότερα επίπεδα Fn14 ότι τα κύτταρα LNCaP. έκφραση Fn14 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε παρουσία των φλεγμονωδών κυτοκινών (ΤΝΡ-α /ΙΡΝγ), καθώς και με την παρουσία βόειου εμβρυϊκού ορού. ΤννΈΑΚ επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα PC-3, αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP. Επιπλέον, σε κύτταρα PC-3, συν-διέγερση με ΤΝΡα /ΙΡΝγ /TWEAK επάγεται ένα υψηλότερο ποσοστό της απόπτωσης. Ωστόσο, το τσίμπημα ή TWEAK /ΤΝΡα /ΙΡΝγ δεν επήγαγε απόπτωση παρουσία βόειου εμβρυϊκού ορού. ΤννΈΑΚ επάγεται κυτταρικό θάνατο μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα Fn14. Η απόπτωση σχετίζεται με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, η απελευθέρωση του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος C και μία αυξημένη αναλογία Βαχ /BclxL. ενεργοποίηση μονοπατιού TWEAK /Fn14 προάγει απόπτωση σε κύτταρα PC-3 ανεξάρτητου από ανδρογόνο υπό ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας. Περαιτέρω χαρακτηρισμός των θεραπευτικών δυνατοτήτων στόχο της TWEAK /Fn14 για την ανθρώπινη καρκίνο του προστάτη είναι δικαιολογημένη

Παράθεση:. Sanz AB, Sanchez-Νίνιο MD, Carrasco S, Manzarbeitia F, Ruiz-Andres O, Selgas R, et al . (2012) φλεγμονώδεις κυτοκίνες και επιβίωσης Παράγοντες από ορό Modulate Tweak απόπτωση σε κύτταρα PC-3 καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (10): e47440. doi: 10.1371 /journal.pone.0047440

Επιμέλεια: Daniel Sanchis, Universitat de Lleida – IRBLLEIDA, Ισπανία

Ελήφθη: 20 του Ιούνη του 2012? Αποδεκτές: 17 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Sanz et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης από Fondo de Investigacion Sanitaria (FIS) PS09 /00447, Instituto de Salud Carlos III-Redes temáticas de Investigación Cooperativa en Salud (ISCIII-ΔΕΚ) REDinREN /RD06 /0016. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [1]. Οι περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη υπάρχουν ως εντοπισμένη ασθένεια και μπορεί να θεραπευτεί με χειρουργική επέμβαση και ακτινοβολία. Ωστόσο, όπως συμβαίνει με τα περισσότερα στερεά κακοήθειες, η ανάπτυξη της μεταστατικής νόσου είναι τελικά θανατηφόρα. Παρά ενεργός συστηματικές θεραπείες, ο μεταστατικός φαινότυπος θα οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας και εξέλιξης της νόσου. Επιπλέον, συστηματικές θεραπείες του καρκίνου του προστάτη είναι περιορισμένες. Μέχρι πρόσφατα, υπήρχαν μόνο τρεις FDA-εγκριθεί χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για χρήση σε ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (εστραμουστίνη, μιτοξαντρόνη, και ντοσεταξέλη) και δύο επιπλέον παράγοντες εγκρίθηκαν το 2010 (sipuleucel-T και καμπαζιταξέλης [2]. Ωστόσο, δεν υπάρχει ακόμη μια σαφής ανάγκη να αναπτυχθούν επιπλέον συστηματικές θεραπείες. Η ανάπτυξη του φυσιολογικού προστάτη επιθηλιακών κυττάρων είναι υπό τον αυστηρό έλεγχο των διαφόρων παραγόντων ανάπτυξης, κυρίως ανδρογόνα, ο ευνουχισμός οδηγεί σε απόπτωση του πληθυσμού αυτού του κυττάρου. ανδρογόνων-εξάντληση έχει παρόμοια επίδραση επί των καρκίνων του προστάτη . Ωστόσο, μετά την αρχική όγκους παλινδρόμησης συχνά επιστρέφουν σε μια ανεξάρτητη μορφή ανδρογόνων-εξάντληση που είναι συχνά θανατηφόρα. Έτσι, είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον να ψάξετε μέσα σε θέση να σκοτώσει ανδρογόνα-ανεξάρτητους καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

νέκρωσης όγκων παράγοντα (TNF) περιγράφηκε αρχικά ως παράγοντας τοξικό για όγκους [3], [4]. αργότερα αποδείχθηκε ότι ανήκουν στην TNF υπεροικογένειας (TNFSF) των κυτοκινών [5], [6]. Πολλές κυτοκίνες TNFSF ρυθμίζουν τον κυτταρικό θάνατο και πολλαπλασιασμό, όπως επίσης και η φλεγμονή και μπορεί να έχει ένα ρόλο στη βιολογία του όγκου, συμπεριλαμβανομένων της βιολογίας του καρκίνου του προστάτη [7] – [9]. Ως παράδειγμα, η πρόσφατη προσοχή εστιάστηκε στην αντικαρκινική δραστικότητα του TNF που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) [10], [11]. Ωστόσο, in vivo καρκίνους του προστάτη εκφράζουν οστεοπροτεγερίνη, ένα δόλωμα υποδοχέα τόσο για TRAIL και ενεργοποιητής της συμπλοκοποιητού πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANKL) [12]. κυτοκίνες TNFSF ενεργοποιήσετε μια οικογένεια υποδοχέων (TNFRSF) πολλά από τα οποία φέρουν περιοχής θανάτου (DD) και λειτουργούν ως υποδοχείς θανάτου. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων θανάτου σε καρκινικά κύτταρα από κύτταρα του ανοσοποιητικού κυτταροτοξικά είναι ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο το ανοσοποιητικό σύστημα εξαλείφει τα κακοήθη κύτταρα [13].

νέκρωσης όγκου παράγοντα σαν ασθενής επαγωγέας απόπτωσης (TWEAK, Apo3L, TNFSF12) είναι ένα από τα πιο πρόσφατα μέλη του TNFSF να εντοπιστούν [14], [15]. TWEAK αρχικά περιγραφεί ως επαγωγέας απόπτωσης σε κύτταρα όγκου. Επιπλέον, το τσίμπημα μπορεί να ρυθμίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, κυτταρικός θάνατος, κυτταρική μετανάστευση, κυτταρική διαφοροποίηση, την αναγέννηση των ιστών, νεοαγγειογένεσης και φλεγμονή [16] – [24]. TWEAK ενεργοποιεί έναν ενιαίο υποδοχέα, αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-διεγέρσιμο-14 (Fn14, το τσίμπημα του υποδοχέα, TNFRSF12A, CD266). ενεργοποίηση TWEAK των αποτελεσμάτων υποδοχέα Fn14 σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των πολλαπλών κυτταρικών γραμμών όγκου [22], [25] – [29]. Πράγματι, μια φάση Ι κλινική δοκιμή ενός εξανθρωπισμένου αντι-TWEAK μονοκλωνικό αντίσωμα υποδοχέα σε ασθενείς με προχωρημένους συμπαγείς όγκους ολοκληρώθηκε πρόσφατα [30]. Ωστόσο, το τσίμπημα-Fn14 up-ρυθμίζει την έκφραση του VEGF για την προώθηση των καρκινικών κυττάρων της μετάστασης των ωοθηκών [31] και προωθεί μαστού επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων [32]. Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι διαφορετικές, ακόμη και σε αντίθεση, οι δράσεις του TWEAK μπορούσε να προσδιοριστεί από το μικροπεριβάλλον. Από αυτή την άποψη, το τσίμπημα προκαλεί απόπτωση σε νεφρικά σωληνοειδή κύτταρα σε ένα προ-φλεγμονώδη περιβάλλον, ενώ, προωθεί τον πολλαπλασιασμό σε παρουσία βόειου εμβρυϊκού ορού [33], [34]. έχουν καρκίνο του προστάτη κύτταρα έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν Fn14 και υψηλή έκφραση του Fn14 συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλότερο ποσοστό υποτροπής αντιγόνο ειδικού προστατικού σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή [35]. Fn14 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, DU145 και PC-3, ενώ η έκφραση ήταν ασθενής σε κύτταρα LNCaP ευαίσθητο σε ανδρογόνο. Ένας ρόλος για Fn14 στη μετανάστευση, εισβολή και πολλαπλασιασμός περιγράφονται στο PC-3 κύτταρα [35].

Ερευνούμε τώρα την χειραγώγηση των συνθηκών κυτταρικής καλλιέργειας ως ένα δυνητικό εργαλείο για να μετατρέψει το σύστημα /Fn14 TWEAK κατά το όγκος. Αναφέρουμε ότι οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες και παράγοντας επιβίωσης από ορό ρυθμίζουν την απόκριση του PC 3-κύτταρα στο τσίμπημα. Σε περίπτωση απουσίας ορού TWEAK /ενεργοποίησης οδού Fn14 προάγει απόπτωση σε κύτταρα PC-3 ανεξάρτητου από ανδρογόνα, αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP ευαίσθητο σε ανδρογόνο. Η καλύτερη κατανόηση του παρόντος κανονισμού μπορεί να μετατρέψει ένα δυνητικό πλεονέκτημα των καρκινικών κυττάρων σε μια θεραπευτική ευκαιρία.

προστάτη αδενοκαρκινώματος Gleason score 7 (3 + 4). Αρχική μεγέθυνση × 200. χρώση Fn14 είναι πολύ θετική σε βαθμό 3 αδενοκαρκίνωμα (μαύρα βέλη) και ήπια θετικά στην εστίαση PIN υψηλής ποιότητας (λευκό βέλος). Καθόλου ή λίγο χρώση παρατηρείται σε φυσιολογικά αδένα (αιχμές βελών). Β) Λεπτομέρεια των κυττάρων αδενοκαρκινώματος από την ίδια βιοψία. Αρχική μεγέθυνση × 400. Γ) του προστάτη αδενοκαρκινώματος Gleason σκοράρει 6 (3 + 3). Ήπια χρώση Fn14 σε υψηλής ποιότητας εστίασης PIN Βαθμός (λευκό βέλος), ενώ το φυσιολογικό ιστό είναι αρνητική (βέλος). Αρχική μεγέθυνση × 200. χρώση D) Fn14 είναι πολύ θετικό το αδενοκαρκίνωμα βαθμού 3 (μαύρα βέλη), ενώ το φυσιολογικό ιστό είναι αρνητική (αιχμές βελών). Αρχική μεγέθυνση χ 200

Η

Μέθοδοι

Κύτταρα και Αντιδραστήρια

Χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη:. Το ανδρογόνο-ανεξάρτητες PC-3 κυτταρική γραμμή και ανδρογόνων ευαίσθητου κύτταρα LNCaP (ATCC, Rockville, MD? CRL 1435 και 1740, αντίστοιχα) [36], [37]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM γλουταμίνη, και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης), σε 5% CO2 στους 37 ° C. RPMI-1640, πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, και τρυψίνη-ΕϋΤΑ ήταν από BioWhittaker (Waltham, ΜΑ) και από την Gibco FBS (Carlsbad, CA). Για τα πειράματα, τα κύτταρα ορό εξαντλημένο για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικά ερεθίσματα. Όπως χρησιμοποιήθηκαν θετικός έλεγχος της έκφρασης Fn14 ανθρώπινης εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά (HK-2) κύτταρα (ATCC, CRL 2190) [38].

Α) Ανάλυση της έκφρασης Fn14 και το τσίμπημα mRNA με ποσοτική RT-PCR. Η μέση (± SEM) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? * P & lt? 0,05 vs κύτταρα LNCaP. Β) Ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης Fn14 με western blot σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς 10% FBS για 24 ώρες. Η μέση (± SEM) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων * ρ & lt?. 0.02 vs LNCaP κύτταρα.

† p & lt? 0,05 έναντι 0% FBS κύτταρα PC-3. Τα HK2 κύτταρα εμφανίζονται ως θετικός μάρτυρας. Γ) Ανάλυση της κυτταρικής επιφάνειας έκφραση Fn14 με κυτταρομετρία ροής. Αντιπροσωπευτικό πείραμα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα ισότυπο (λευκή περιοχή) ή αντι-Fn14 αντίσωμα (μαύρη περιοχή).

Η

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TWEAK (Millipore, Billerica, ΜΑ), εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, χρησιμοποιήθηκε σε 100 ng /mL. ΘΕΜΑ-2 εξουδετερωτικών αντι-Fn14 αντίσωμα (eBioscience, San Diego, CA), εξουδετερωτικό αντίσωμα αντι-TWEAK (BioLegend, San Diego, CA) και εξουδετερωτικών αντι-ΤΝΡ αντίσωμα (BioLegend) προστέθηκαν 1 ώρα πριν από την ερεθίσματα. Ανθρώπινο ΤΝΡα (PrePotech, London, UK) στους 30 ng /mL, και ανθρώπινη ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝγ) (PrePotech) στους 30 U /ml, χρησιμοποιήθηκαν σε κάποια πειράματα. Όλες αυτές οι συγκεντρώσεις βασίζονται σε μελέτες προηγούμενης δόσης-απόκρισης πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο μας [33], [34]. Βενζυλοξυκαρβονυλ-Val-Ala-DL-Asp-φθορομεθυλοκετόνη (-ίτηκ) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) διαλύθηκε σε DMSO και προστέθηκε 1 ώρα πριν από την ερεθίσματα. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στην καλλιέργεια δεν ρυθμίζουν τον κυτταρικό θάνατο. Βαχ πεπτίδιο αναστολέα, Ρ5, διαλύθηκε σε νερό και προστέθηκε 1 ώρα πριν από την ερεθίσματα (Tocris, Bristol, UK) [38].

PC3 και LNCaP κύτταρα διεγέρθηκαν με 100 ng /mL TWEAK για την υποδεικνυόμενη σημεία, και τα επίπεδα Fn14 και MCP-1 mRNA μετρήθηκαν με RT-PCR. Και οι δύο κυτταρικές σειρές ανταποκρίνονται στο τσίμπημα, αλλά, η απάντηση PC-3 είναι πιο σταθερή σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Η μέση (± SEM) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων * p & lt?.. 0.05 vs έλεγχο

Η

Cell Surface Fn14 Έκφραση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 8 × 10

4 κυττάρων σε πλάκες δώδεκα φρεατίων. Μετά διέγερση είχαν αποσπαστεί με 2 mM EDTA /1% BSA σε PBS, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε PBS /1% BSA και αποκλείστηκαν για 4 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μg /ml αντι-Fn14 ITEM4 αντίσωμα (eBioscience, San Diego, CA) ή ένα αντίσωμα ελέγχου ταιριαστού ισότυπου για 30 λεπτά επί πάγου. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές, μπλοκάρεται για 4 λεπτά και επωάστηκαν με αντίσωμα Alexa488-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας IgG (1/300, Invitrogen, Carlsbad, CA) για 45 λεπτά επί πάγου στο σκοτάδι. Μετά από δύο επιπλέον πλύσεις με PBS /1% BSA, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη διηθήθηκε σε PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας BD CellQuest Software (BD Biosciences, San Jose, CA) [39].

PC -3 κύτταρα καρκίνου προστάτη καλλιεργήθηκαν με 0% ή 5% FBS για 3 ή 24 ώρες. έκφραση Fn14 mRNA μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR (Α) και η έκφραση πρωτεΐνης Fn14 μελετήθηκε με στύπωση Western (Β). Η μέση (± SEM) των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,03 έναντι 0% FBS 3 ώρες? # P & lt? 0.003 έναντι 0% FBS 24 ώρες. C, D) Ανάλυση της έκφρασης Fn14 mRNA (C), και η έκφραση πρωτεΐνης Fn14 (D) σε PC-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με TNFa (30 ng /mL) /ΙΡΝγ (30 U /ml) για 3 ή 24 ώρες. Η μέση (± SEM.) Από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. # P & lt? 0,03 vs ελέγχου 24 ώρες. Ε) Εκπρόσωπος κηλίδας Western των Fn14 σε PC-3 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με 0% FBS, 5% FBS ή TNFa /ΙΡΝγ για 3 και 24 ώρες.

Η

RNA Extraction και Real-Time Polymerase Chain Reaction

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα με την μέθοδο αντιδραστηρίου TRI (Sigma) και 1 μg του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με υψηλής χωρητικότητας cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Προ-αναπτυχθεί προσδιορισμοί εκκινητή και ανιχνευτή για Fn14, και GAPDH (ανθρώπινη) ήταν από την Applied (Applied Biosystems). Ποσοτική PCR διεξήχθη με 7500 Real Time PCR System με το Prism 7000 Σύστημα SDS Software (Applied Biosystems) και η έκφραση RNA διαφορετικών γονιδίων διορθώθηκε για GAPDH [40].

Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής του DNA περιεχόμενο. Υποδιπλοειδή κύτταρα θεωρήθηκαν αποπτωτικά. Α) κύτταρα PC-3, καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς 10% FBS, διεγέρθηκαν με TWEAK (100 ng /mL) μόνο του ή σε παρουσία του TNFa (30 ng /mL) /ΙΡΝγ (30 U /mL) για 24 ώρες. Μέση (± SD) των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.002 έναντι ελέγχου? # P & lt? 0.001 vs μόνη TWEAK? † p & lt? 0.002 έναντι 0% FBS με ερεθίσματα. Β) LNCaP κύτταρα, καλλιεργημένα χωρίς FBS, διεγέρθηκαν με μόνη ή σε συνδυασμό με ΤΝΡα /ΙΡΝγ επί 24 ώρες TWEAK. Μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ) TWEAK, μόνη ή σε συνδυασμό με ΤΝΡα /ΙΡΝγ, επάγει απόπτωση σε κύτταρα PC-3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.002 έναντι ελέγχου? # P & lt? 0,0001 έναντι του ελέγχου. Δ) χρονική πορεία της TWEAK επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC-3, μόνο του ή σε συνδυασμό με ΤΝΡα /ΙΡΝγ. Μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.002 έναντι ελέγχου? # Ρ & lt? 0,0001 έναντι ελέγχου

Η

Western Blot

Τα κυτταρικά δείγματα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,2%. Triton Χ-100, 0,3% ΝΡ-40, 0,1 mM PMSF και 1 μg /ml πεπστατίνη Α) και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS /0.5% ν /ν Tween 20 για 1 ώρα, πλύθηκαν με PBS /Tween και επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-Fn14 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-BclxL (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Βαχ (1:500, Santa Cruz Biotechnology), ή πολύκλωνα κουνελιού αντι- διασπασμένο ενεργό κασπάσης 3 (1:500, Cell Signaling). Αντι-Fn14 αραιώθηκε σε 5% BSA και οι άλλοι αντισώματα αραιώθηκαν σε 5% γάλα PBS /Tween. Οι κηλίδες πλύθηκαν με PBS /Tween και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κατάλληλο (1:2000, Amersham, Aylesbury, UK). Μετά την πλύση με PBS /Tween στυπώματα αναπτύχθηκαν με τη μέθοδο χημειοφωταύγειας (ECL) (Amersham). Τα στυπώματα στη συνέχεια διερευνήθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα (1:2000, Sigma) και τα επίπεδα έκφρασης διορθώθηκαν για μικρές διαφορές στη φόρτωση [41].

Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής του DNA περιεχόμενο. Α) PC-3 κύτταρα προεπεξεργασμένα με αντίσωμα αντι-TWEAK εξουδετέρωσης (10 μg /ml), ITEM2 αντίσωμα αντι-Fn14 (10 μg /ml), ή αντίσωμα εξουδετέρωσης αντι-ΤΝΡα (10 μg /ml), προστέθηκε 1 ώρα πριν TWEAK. Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε σε 24 ώρες. Μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,02 vs ελέγχου? # P & lt? 0,0001 vs μόνη TWEAK. Β), C) κύτταρα PC-3 προ-θεραπεία με αντι-TWEAK εξουδετέρωσης αντισώματος (Β) ή με ITEM2 αντίσωμα αντι-Fn14 (C), προστίθεται 1 ώρα πριν TWEAK /ΤΝΡα /ΙΡΝγ. Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε σε 24 ώρες. Μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,02 vs ελέγχου? # Ρ & lt?. 0.0001 vs TWEAK /ΤΝΡα /ΙΡΝγ μόνος

Η

Απόπτωση και θάνατο των κυττάρων

10000 κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων (Costar, Cambridge, ΜΑ) σε 10% FCS RPMI τη διάρκεια της νύχτας. Σε ορισμένες περιπτώσεις, είχαν αναπαυθεί σε μέσο άνευ ορού για 24 ώρα. Στη συνέχεια, ερεθίσματα προστέθηκαν σε υποσυρρέοντα κύτταρα. Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από μορφολογικές και λειτουργικά κριτήρια. Πυρήνες κυττάρων μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη βάφτηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma) για να παρατηρήσουν τα τυπικά μορφολογικές αλλαγές, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33], [42]. Για την αξιολόγηση της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής προσκολλημένα κύτταρα συγκεντρώθηκαν με αυθόρμητα αποκολλημένα κύτταρα, και επωάζονται σε 100 μg /mL ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), 0,05% ΝΡ-40, 10 μg /mL RNAse Α σε PBS στους 4 ° C για & gt? 1 h. Αυτή η δοκιμασία καθιστά διαπερατά τα κύτταρα, έτσι ΡΙ λεκέδες τόσο ζωντανά και νεκρά κύτταρα. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων με μειωμένη χρώση DNA (υποδιπλοειδή κύτταρα) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας BD CellQuest Software (BD Biosciences) [33], [34], [42].

κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA. Σημείωση υποδιπλοειδή, αποπτωτικά κύτταρα (