Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για τον εντοπισμό και την επικύρωση των υπογραφών γονίδιο που μπορεί να προβλέψει τη νόσο επιβίωση χωρίς (DFS) σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική εκτομή του παχέος ηπατικές μεταστάσεις τους (CRLM).

Μέθοδοι

προφίλ γονιδιακής έκφρασης των όγκων συλλέχθηκαν από 119 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για την CRLM τους σε η Brousse Νοσοκομείο Παύλου (Γαλλία) και το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Ουτρέχτης (Ολλανδία). Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες υψηλού και χαμηλού κινδύνου. Μια τυχαία επιλεγμένο σύνολο εκπαίδευσης χρησιμοποιείται για να βρούμε την έξυπνη υπογραφές γονίδιο. Η ικανότητα αυτών των υπογραφών γονίδιο να προβλέψουμε DFS δοκιμάστηκε σε ένα ανεξάρτητο σύνολο επικύρωσης, το οποίο τους υπόλοιπους ασθενείς. Επιπλέον, 5 γνωστά τα αποτελέσματα κλινικού κινδύνου ελέγχθηκαν σε πλήρη ομάδα των ασθενών μας.

Αποτέλεσμα

Δεν γονίδιο υπογραφή διαπιστώθηκε ότι προέβλεψε σημαντικά DFS στο σύνολο επικύρωσης. Σε αντίθεση, τα τρία από τα πέντε αποτελέσματα κλινικού κινδύνου ήταν σε θέση να προβλέψει DFS στην ομάδα μας ασθενή.

Συμπεράσματα

Δεν γονίδιο υπογραφή βρέθηκε που θα μπορούσε να προβλέψει DFS σε ασθενείς που υποβάλλονται CRLM εκτομή. Τρία από τα πέντε αποτελέσματα κλινικού κινδύνου ήταν σε θέση να προβλέψει DFS στην ομάδα μας ασθενή. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για την επικύρωση βαθμολογιών κινδύνου σε ανεξάρτητες ομάδες ασθενών και να προτείνει βελτιωμένες σχέδια για μελλοντικές μελέτες

Παράθεση:. Snoeren Ν, van Hooff SR, Adam R, van Hillegersberg R, Voest EE, Guettier C, et al. (2012) Διερεύνηση Υπογραφές γονιδιακής έκφρασης για την πρόβλεψη ελεύθερη νόσου επιβίωση μετά από εκτομή καρκίνου του παχέος εντέρου ηπατικές μεταστάσεις. PLoS ONE 7 (11): e49442. doi: 10.1371 /journal.pone.0049442

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Μάη 2012? Δεκτές: 7 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Νοέμβρη του 2012

Copyright: © 2012 Snoeren et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χορήγηση ολλανδικής Cancer Society 2007 έως 3923. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας περίπου 608.000 θανάτους παγκοσμίως [1]. Το ήπαρ είναι το πιο κοινό και συχνά μόνο τοποθεσία της μεταστατικής νόσου. Η ανάπτυξη των ηπατικών μεταστάσεων σε περίπου 50% των ασθενών είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Η χειρουργική εκτομή είναι η καλύτερη θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς με ορθοκολικό μετάσταση στο ήπαρ προσφέροντας μια μέση επιβίωση πάνω από 40 μήνες μετά την εκτομή σε σύγκριση με ένα διάμεση επιβίωση των 18 μηνών όταν υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία και 6 έως 12 μήνες, αν οι ασθενείς παραμένουν χωρίς αγωγή [2]. Δυστυχώς, το 60% -80% των ασθενών θα αναπτύξουν τοπική ή απομακρυσμένη υποτροπές μετά R0 εκτομή του παχέος μετάσταση στο ήπαρ [2] – [5]. Οι ασθενείς με υποτροπή είναι πιθανό να επωφεληθούν από επικουρική χημειοθεραπεία. Ωστόσο, 20-40% των ασθενών δεν αναπτύσσουν υποτροπή και πιθανότατα καλύτερα να αφεθεί χωρίς θεραπεία μετά εκτομή ήπατος. Δεδομένου ότι η χημειοθεραπεία συσχετίζεται με σοβαρή νοσηρότητα και θνησιμότητα, ο κίνδυνος της θεραπείας που σχετίζονται πρέπει να δικαιολογείται από μια σημαντική βελτίωση στην επιβίωση των ασθενών αυτών.

Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν προσπαθήσει να καθορίσουν τους παράγοντες πρόβλεψης επιβίωσης χωρίς νόσο και τη συνολική επιβίωση (OS) μετά από εκτομή ηπατικών μεταστάσεων [5], [6]. Πρόσφατα, πέντε δημοσίευσε τα αποτελέσματα κλινικού κινδύνου, συνδυάζοντας διαφορετικές κλινικούς παράγοντες, επικυρώθηκαν σε μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών που αποδεικνύουν ότι δύο αποτελέσματα κλινικού κινδύνου ήταν σε θέση να προβλέψει τη συνολική επιβίωση σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των ασθενών [7]. Πρόβλεψη (ελεύθερη νόσου) επιβίωση θα μπορούσε να βελτιωθεί με τη χρήση της γονιδιακής έκφρασης που θα μπορούσε να συλλάβει ιδιότητες όγκου δεν αντικατοπτρίζεται από κλινικοπαθολογικών μεταβλητές.

Genome ευρύ προφίλ έκφρασης γονιδίου έχει χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει την πορεία της νόσου ή την ανταπόκριση στη θεραπεία σε πολλούς διαφορετικούς τύπους όγκων [8], [9] έχει επίσης δειχθεί ότι χαρακτηριστικών έκφρασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό όγκων παχέος εντέρου με διαφορετικές επιθετικότητα και μεταστατική πιθανότητα [10] – [13]. Καμία μελέτη, ωστόσο, έχει δημοσιευθεί στα οποία η έκφραση του γονιδίου χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της νόσου επιβίωση χωρίς μετά εκτομή του παχέος μετάσταση στο ήπαρ. Αναγνώριση της υπογραφής γονιδίου σε θέση να προσδιορίσει την επανάληψη επιρρεπείς παχέος ηπατικές μεταστάσεις κατά τη στιγμή της εκτομής, θα ανοίξει το δρόμο για την επιλογή των ασθενών που είναι πιθανό να ωφεληθούν από την επιθετική θεραπεία μετά από εκτομή, ενώ παρακράτηση άλλοι περιττή θεραπεία.

Η

Αποτελέσματα

ασθενείς και δείγματα όγκων

Εκατό σαράντα οκτώ ασθενείς συνάντησε τον εντός και κριτήρια αποκλεισμού έκφρασης. Προφίλ ελήφθησαν με επιτυχία για 119 ασθενείς. Τα χαρακτηριστικά βασικής γραμμής του περιελάμβανε ασθενείς τους 119, που φαίνονται στον Πίνακα 1, δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των υψηλά έναντι χαμηλών ομάδα κινδύνου, με την εξαίρεση της χορήγησης χημειοθεραπείας. ασθενείς υψηλού κινδύνου έλαβαν εισαγωγική χημειοθεραπεία πιο συχνά και επικουρική χημειοθεραπεία λιγότερο συχνά από ό, τι οι ασθενείς χαμηλού κινδύνου. δείγματα ασθενών είχαν μέσο ποσοστό των κυττάρων του όγκου του 45% (95% CI 40,75 – 49,60), νέκρωση 19% (95% CI 16,19 – 22,47) και ίνωση 20% (95% CI 16,44 – 22,71). Η μέση παρακολούθηση ήταν 26,7 μήνες. Μια σύγκριση των αρχικών χαρακτηριστικών του 119 περιλαμβάνονται και 29 αποκλείονται οι ασθενείς φαίνεται στον Πίνακα S1.

Είναι

Οι ασθενείς χωρίζονται σε υψηλή και χαμηλή ομάδα πρόβλεψης κινδύνου με βάση την πρόβλεψη του κινδύνου των διαφόρων υπογραφών γονιδίων. υπογραφές γονιδίου ανακαλύφθηκαν καθορισμό υψηλού κινδύνου, όπως DFS ≤1 χρόνο και χαμηλού ρίσκου όπως DFS έχουν δυσκολίες στην πρόβλεψη (νόσος δωρεάν) επιβίωσης με προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχουν αναφερθεί πρόσφατα. Lauss et al αξιολόγησε την απόδοση των 8 δημοσιευθεί υπογραφών γονιδίων στην πρόγνωση της υποτροπής στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης από τις οποίες καμία δεν επέζησε από την επικύρωση [19]. Μια ανασκόπηση αξιολόγηση υπογραφές γονίδιο που αναπτύχθηκε για την πρόβλεψη της επιβίωσης στον καρκίνο του πνεύμονα σε 16 μελέτες βρέθηκαν όλα ακατάλληλες για χρήση στην κλινική πράξη λόγω της έλλειψης ή ανεπαρκούς επικύρωσης. Σε αυτές τις μελέτες, είτε η υπογραφή δεν ξεπερνούν κλινικούς παράγοντες ή οι συγγραφείς δεν εξέτασε την επίδραση οποιουδήποτε από τους κλινικούς παράγοντες [20].

Πιστεύουμε ότι ο σχεδιασμός της μελέτης μας ήταν επαρκούς ποιότητας για την να είναι σε θέση να βρει ένα γονίδιο υπογραφή για την πρόβλεψη DFS. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι υπάρχει ένα χρησιμοποιήσιμο γονίδιο υπογραφή αλλά δεν βρέθηκε λόγω περιοριστικοί παράγοντες στη μελέτη μας. Αυτοί οι πιθανοί παράγοντες περιλαμβάνουν τον ορισμό μας για ασθενείς υψηλού και χαμηλού κινδύνου στην ανακάλυψη της υπογραφής, ο αριθμός των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, ιδίως υπό το φως της ετερογένειας της ομάδας των ασθενών, την ένταξη των ασθενών από μόνο δύο ιατρικά κέντρα, η ύπαρξη ενός πριν επίδραση της θεραπείας και τα όρια της ευαισθησίας των μικροσυστοιχιών.

μεταστάσεις ήπατος είναι από τη φύση τους έκλινε προς μια πιο επιθετική υποομάδα της CRC. Συνεπώς, θα μπορούσε να σκεφτεί ότι τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που χαρακτηρίζουν ταχέως επαναλαμβανόμενες μεταστάσεις ήπατος είναι πολύ λεπτές για να αποκαλυφθεί χρησιμοποιώντας το μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη. Επιπλέον, επανάληψη μετά εκτομή ηπατικών μεταστάσεων μπορεί να μην είναι εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της ίδιας της μετάστασης ήπατος, αλλά στην παρουσία του μικρομεταστάσεων κατά τη στιγμή της εκτομή ήπατος.

Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την ύπαρξη μιας έξυπνης γονιδίου υπογραφή, ήταν δυνατό να καθοριστεί πρόσθετο πλεονέκτημα των υπογραφών γονιδιακής έκφρασης για την πρόγνωση της νόσου επιβίωση χωρίς μεταστατικό ορθοκολικό ασθένεια με βάση τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης. Τέλος, ο Fong βαθμολογία κλινικού κινδύνου, έχει ήδη επικυρωθεί από Reissfelder et al [7], είναι το πιο ισχυρό βαθμολογία κινδύνου για την πρόβλεψη της DFS των ασθενών με εκτομή CRLM από τα πέντε αποτελέσματα δοκιμαστεί κινδύνου στη μελέτη μας. Αυτή η κλινική βαθμολογία κινδύνου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για τη διαστρωμάτωση σε προοπτικές κλινικές μελέτες που εξετάζουν τα πιθανά οφέλη της επικουρική θεραπεία σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για CRLM.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα Ασθενών

κατεψυγμένα δείγματα όγκου από 148 ασθενείς ελήφθησαν από τον Paul Brousse Νοσοκομείο Villejuif, της Γαλλίας και της UMC Ουτρέχτης στην Ολλανδία μεταξύ Νοεμβρίου 2000 και τον Αύγουστο του 2010. το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ιατρική (MEC) του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου της Ουτρέχτης όπως αναγνωρίζεται από το άρθρο 16 του WMO (ολλανδικού νόμου περί ιατρικής έρευνας με ανθρώπινα υποκείμενα). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται ασθενών ηλικίας 18 ετών και άνω οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή για ιστολογικά επιβεβαιωμένη ηπατικές μεταστάσεις από CRC. Οι ασθενείς με ιστορικό μη ορθοκολικού κακοήθειες, εξωηπατική ασθένεια ή μακροσκοπική υπολειμματική νόσο (R2) μετά από χειρουργική επέμβαση αποκλείστηκαν. Οι ασθενείς που έλαβαν τοπική θεραπεία εκτομής ή μόνο του ή σε συνδυασμό με εκτομή χημειοεμβολισμός αποκλείστηκαν. Μόνο συμπεριλήφθηκαν υπόδειγμα που καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο εντός 30 λεπτών μετά την εκτομή και αποθηκεύτηκαν σε -80 ° C. Η ποσότητα του στρώματος, όγκου, καλοήθων ηπατικών κυττάρων και νέκρωση προσδιορίστηκε από τους δύο παθολόγους μελέτη (Ο.Θ. και P.J.vD). Ασθενείς των οποίων τα δείγματα περιείχαν καλοήθη ιστό ήπατος ή ανεπαρκή κύτταρα όγκου αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Διεγχειρητική υπερηχογράφημα του ήπατος διεξήχθη σε όλους τους ασθενείς για την αξιολόγηση του μεγέθους και της θέσης των μεταστάσεων ήπατος. Το μέγεθος του συνόλου δεδομένων προσδιορίστηκε με βάση τα διαθέσιμα δείγματα όγκων των ασθενών στις δύο συμμετέχοντα ιδρύματα που πληρούσαν όλα τα κριτήρια συμμετοχής και αποκλεισμού. Τον ασθενή, από όγκο και χειρουργικές χαρακτηριστικά εξήχθησαν από προοπτικά συλλέγονται βάσεις δεδομένων μας. Ο ορισμός της σύγχρονης μετάσταση στο ήπαρ (διάγνωση, εντός δύο μηνών μετά την αρχική διάγνωση) βασίστηκε σε εκείνη που προβλέπεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ.

Συνέχεια

Όλοι οι ασθενείς έλαβαν την καθιερωμένη παρακολούθηση με σπιράλ CT της κοιλιάς και του στήθους κάθε 3 μήνες για την παρακολούθηση της υποτροπές. Επιβίωσης ελεύθερης νόσου ορίστηκε ως ο χρόνος από εκτομή με τον χρόνο το πρώτο σημάδι της υποτροπής σε αξονική τομογραφία. Όλοι οι ασθενείς περικόπηκαν κατά τον χρόνο του θανάτου ή την τελευταία παρακολούθηση. χρόνος επιβίωσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη λειτουργία επιβίωσης Kaplan-Meier.

γονιδιακής έκφρασης

RNA απομόνωση.

Ολικό RNA απομονώθηκε από δείγματα ιστού άτομο χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy μίνι κιτ (Qiagen) και υποβλήθηκε σε κατεργασία με ϋΝάση χρησιμοποιώντας το Qiagen DNA-free κιτ. Η απόδοση και η ποιότητα του ολικού RNA ελέγχθηκε με φασματοφωτομετρία και η Agilent Bioanalyzer (Agilent). Δεκατρία δείγματα εξαιρέθηκαν με βάση την απόδοση του RNA και την απόδοση cRNA (αριθμός ακεραιότητα του RNA [RIN] & lt? 6). Οκτώ δείγματα αποκλείστηκαν λόγω βλαβών ενίσχυσης, και 8 περισσότερα δείγματα δεν πληρούν τα κριτήρια επισήμανσης, με αποτέλεσμα τα δεδομένα από 119 δείγματα.

σύνθεση cRNA και φθορίζουσα επισήμανση.

Όλες οι διαδικασίες ενίσχυσης και επισήμανση εκτελέστηκαν σε πλάκες 96 πηγαδιών (4titude, Bioke) επί μια προσαρμοσμένη SciClone ALH 3000 Workstation (δαγκάνα LifeSciences), με PCR PTC-200 (Bio-Rad Laboratories), SpectraMax 190 φασματοφωτόμετρο (Molecular Devices), και μία μαγνητική χάντρα-εντοπιστής (Beckman). προϊόντα cRNA καθαρίστηκαν και συμπυκνώθηκαν με RNAClean (Agencourt, Beckman) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. mRNA ενισχύθηκε με in vitro μεταγραφή χρησιμοποιώντας ένα αγκυρωμένο εκκινητή και πολυμεράση RNA Τ7 σε 1 μα συνολικού RNA. Πρώτον, ένα δίκλωνης μήτρας cDNA παρήχθη συμπεριλαμβανομένου του υποκινητή Τ7. Στη συνέχεια, αυτό το πρότυπο χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή με το κιτ Τ7 MEGAscript (Ambion) για τη δημιουργία cRNA. Κατά τη διάρκεια της in vitro μεταγραφής, 5- (3-αμινοαλλυλο) -UTP (Ambion) ενσωματώθηκε στο λανθάνον cRNA μόνο. Δείγματα με απόδοση μικρότερη από 2000 ng ή με μικρά θραύσματα cRNA (διάμεσος λιγότερο από 500 nt) δεν χρησιμοποιήθηκαν. Cy3 ή Cy5 φθοροφόρα (GE Healthcare) συνδέθηκαν με cRNA. Εφαρμόσαμε συνολική κριτήρια RNA και cRNA ποιοτικού ελέγχου σύμφωνα με τον όγκο Ομάδα Εργασίας Βέλτιστων Πρακτικών ανάλυση [21]. Η ενσωμάτωση απόδοση και την ετικέτα του cy-σημασμένο cRNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία. συμπεριλήφθηκαν μόνο δείγματα με μεταξύ 1,5% και 3% Cy-ενσωμάτωσης. Πριν από τον υβριδισμό, 300-1000 ng του Cy-επισημασμένου cRNA από μία βιοψία αναμίχθηκε με ίση ποσότητα της αντίστροφης χρώματος Cy-επισημασμένο υλικό από το δείγμα αναφοράς.

υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών.

Για κάθε δείγματος, δύο προφίλ έκφρασης σε πειράματα βαφής-ανταλλαγής δημιουργήθηκαν. Τα δείγματα συγκρίθηκαν έναντι εμπορικού αναφοράς (κατάλογος Παγκόσμιο Ανθρώπινο RNA Αναφορά # 740000, Stratagene). Η Ανθρώπινη Array-Ready Ολίγο που (έκδοση 2.0) αγοράστηκε από Qiagen και στίγματα στο Codelink διαφάνειες (GE Healthcare) σε μια φιλτραρισμένη σκόνη και την υγρασία ελεγχόμενη καθαρό δωμάτιο. Οι μικροσυστοιχίες περιείχε 70-μερές ολιγο-νουκλεοτίδια που αντιπροσωπεύουν 21.329 ανθρώπινα γονίδια και εκφράζονται ετικέτες αλληλουχίας (ESTs), καθώς και 3.871 επιπλέον σημεία για σκοπούς ελέγχου. επισημειώσεις Gene ενημερώθηκαν με ανάλυση BLAST όλων των ακολουθιών χαρακτηριστικό χρησιμοποιώντας Ensembl χτίσει 55. Arrays υβριδοποιήθηκαν σε ένα σταθμό υβριδοποίησης Tecan HS4800PRO, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Σε υβριδισμό διαφάνειες σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή Agilent (G2565BA) στο 100% της ισχύος λέιζερ και 60-90% PMT. Μετά την αυτόματη εξαγωγή δεδομένων με τη χρήση ImaGene 8.0.1 (BioDiscovery), printtip Loess κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε μέση σημείο εντάσεων [23]. Βαφή προκατάληψη διορθώθηκε με βάση ένα πλαίσιο-set εκτίμηση [24].

Δεδομένα προσβασιμότητα.

Σύμφωνα με το προτεινόμενο MIAME (Ελάχιστες πληροφορίες για ένα πείραμα μικροσυστοιχιών) πρότυπα, πρωτογενών και επεξεργασμένων δεδομένων, όπως καθώς και τα πρωτόκολλα είχαν κατατεθεί σε Array Express (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer) υπό τον αριθμό πρόσβασης E-TABM-1112.

Αναγνώριση επανάληψης Υπογραφή

Η ομάδα χωρίστηκε τυχαία σε ένα σύνολο εκπαίδευσης (n = 75) και ένα σύνολο επικύρωσης (n = 44). Η τελευταία δεν συμμετείχε στην επιλογή του γονιδίου για να αποφευχθεί η μεροληψία της επιλογής. Για τους σκοπούς του την ανακάλυψη του γονιδίου της υπογραφής, οι ασθενείς διαιρέθηκαν αρχικά σε υψηλό κίνδυνο και χαμηλή ομάδα κινδύνου. ασθενείς υψηλού κινδύνου ορίστηκαν ως αυτά με υποτροπή μέσα σε 1 χρόνο (Σχήμα 2). Αυτό το όριο βασίστηκε στην παρατήρηση ότι ένας DFS & lt? 1 έτος είναι προγνωστική δυσμενών συνολική επιβίωση όπως περιγράφεται από τους Fong et al [14]. Μια διαίρεση με βάση την DFS ≤6 μήνες (υψηλού κινδύνου) και DFS & gt? 2 έτη (χαμηλού κινδύνου) εφαρμόστηκε επίσης (Σχήμα 2Β). Χρησιμοποιώντας το σύνολο εκπαίδευσης, τα γονίδια κατατάχθηκαν με βάση τρεις διαφορετικές μετρήσεις (σήματος προς θόρυβο αναλογία, στατιστική t-test και ο δείκτης αναλογικών κινδύνων Cox). Η κατάταξη αυτή έγινε χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση πολλαπλών δειγματοληψία επιλέγοντας 2/3 των δειγμάτων σε κάθε επανάληψη. Τα 75 κορυφαία γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη της κατηγορίας κινδύνου των δειγμάτων στο υπόλοιπο 1/3 των δειγμάτων χρησιμοποιώντας πλησιέστερο μέση κατάταξη [9] και αφήστε-one-out cross επικύρωσης (LOOCV). Χρησιμοποιώντας αυτές τις προβλέψεις μια συνδυασμένη περιοχή κάτω από την καμπύλη για 1000 επαναλήψεις υπολογίστηκε δίνοντας μια ένδειξη της συγκεντρωτικής προβλεπτική ικανότητα των 75 γονιδίων υπογραφές, όπου μια τιμή σημαντικά μεγαλύτερη από 0,5 μονάδες στην αληθινή προφητική δύναμη. Η κατάταξη των γονιδίων κατά μέσο όρο πάνω από όλα από 1000 επαναλήψεις [25]. Από το προκύπτον πίνακα κατάταξης, το γονίδιο υπογραφή με το ισχυρότερο προγνωστικό δύναμη (μετρούμενη ως συνολική ακρίβεια της πρόβλεψης) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πλησιέστερο μέση ταξινόμηση και LOOCV ξεκινώντας από την καλύτερη κατάταξη γονίδιο και ακολούθως την προσθήκη του επόμενου στη σειρά κατάταξης γονιδίου σε κάθε επανάληψη (προς τα εμπρός επιλογή ) [9]. Ένα ανεξάρτητο μέτρο της προβλεπτική ισχύ ελήφθη με τη χρήση του προκύπτοντος γονίδιο υπογραφή για να προβλέψει την κατηγορία κινδύνου των δειγμάτων στο σύνολο επικύρωσης (πλησιέστερο μέση, LOOCV). Kaplan-Meier αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση καμπύλες DFS και την επιβίωση για τις δύο κατηγορίες προβλέψει τον κίνδυνο συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank Mantel-Cox. Μια ανάλυση δύναμη για τη δοκιμασία log-rank έγινε με τη χρήση του προγράμματος PS [26]. Ανάλυση λειτουργικό γονίδιο σύνολο εμπλουτισμός διεξήχθη με τη χρήση του Babelomics 4.2 web-based σουίτα ανάλυση που περιλαμβάνει όλες τις διαθέσιμες για την ανάλυση εμπλουτισμού [27] βάσεις δεδομένων.

Ανάλυση του διαφορικού Gene Expression

Η γονιδιακή έκφραση σε ασθενείς αντιμετωπίζονται με εισαγωγική χημειοθεραπεία σε σύγκριση με την έκφραση σε ανεπεξέργαστα ασθενείς χρησιμοποιώντας ANOVA [28]. Σε μια ανάλυση σταθερό φαινόμενο, δείγμα, πίνακας και τα αποτελέσματα βαφής ήταν πρότυπο. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με μετάθεση F2-δοκιμασία στην οποία κατάλοιπα είχαν ανακατεύονται 5000 φορές σε παγκόσμιο επίπεδο.

κλινικές βαθμολογίες Κίνδυνος

Ένα μονομεταβλητό μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου του Cox χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των δεικτών επικινδυνότητας των πέντε βαθμολογίες κλινικής κινδύνου που υπολογίστηκαν για κάθε ασθενή [14] – [18]. Μια πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης την εισαγωγή των παραγόντων με ρ τιμές κάτω από 0,1 στην μονοπαραγοντική ανάλυση

Στατιστική Δοκιμές και το λογισμικό

Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν αμφίπλευρες και η στατιστική σημαντικότητα υποτέθηκε για τιμές ρ μικρότερες από 0.05. Ενδεχομένως, σ τιμές προσαρμόστηκαν για ψευδή ρυθμό ανακάλυψή τους χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini-Hochberg [29]. Στατιστικές αναλύσεις έγιναν σε R 2.7.0 με επιπρόσθετα πακέτα Bioconductor και SPSS για Windows, έκδοση 15.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Δύναμη του τεστ log-rank. Η στατιστική δύναμη του τεστ log-rank ως συνάρτηση του λόγου κινδύνου της πρόβλεψης γονιδίου υπογραφή στο σύνολο επικύρωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακας S1.

τον ασθενή και τα χαρακτηριστικά του όγκου των εντός και αποκλείστηκαν οι ασθενείς

α

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s002

(DOC)

Πίνακας S2. ανάλυση παλινδρόμησης

μονοπαραγοντική Cox για τα γονίδια υπογραφής

α

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s003

(DOC)

Πίνακα S3.