Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ραγδαία αναπτυσσόμενο τομέα της στοχευμένης θεραπείας όγκων χρησιμοποιεί συχνά ένα αντίσωμα, μερικές φορές με ετικέτα ενός όγκου -ablating υλικό όπως ραδιοϊσότοπο, στρέφεται κατά ενός συγκεκριμένου μορίου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η παρούσα έκθεση περιγράφει την ανακάλυψη των εννέα νέων δεκαπεπτίδια τα οποία μπορούν να σημανθούν με ραδιενέργεια, συνδέονται με, και να παραδώσει

32Ρ σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Τα δεκαπεπτίδια ποικίλλουν από το ένα το άλλο με έναν έως τρεις αμινοξέα και επιδεικνύουν πολύ διαφορετικές ικανότητες σύνδεσης. Το δεκαπεπτίδιο πιο αχόρταγα δέσμευσης μπορεί μόνιμα να παραδώσει πολύ υψηλά επίπεδα ραδιοϊσότοπο στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του αδενοκαρκινώματος με απόδοση 35 προς 150 φορές μεγαλύτερη από ό, τι σε μια ποικιλία από άλλους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από άλλους τύπους καρκίνου ή από φυσιολογικό ιστό.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η πειραματική προσέγγιση αποτελεί ένα νέο παράδειγμα της στρατηγικής, που ονομάζεται θεραπεία δέσμευσης πεπτιδίων, για την πιθανή θεραπεία του παχέος εντέρου και άλλων αδενοκαρκινώματα

Παράθεση:. Αβραάμ JM, Sato F, Cheng Υ, Paun Β, Kan Τ, Ολαρού A, et al. (2007) Μυθιστόρημα δεκαπεπτιδίων που δεσμεύονται με μεγάλη προσοχή και Παράδοση ραδιοϊσοτόπων για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10.1371 /journal.pone.0000964

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μιχαήλ Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιούλ, 2007? Αποδεκτές: 12 Σεπ, 2007? Δημοσιεύθηκε: 3 Οκτωβρίου, 2007

Copyright: © 2007 Abraham et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 και 7R21 /R33CA106763 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

η αρρώστια και ο θάνατος οφείλεται σε παχέος εντέρου και καρκίνο του οισοφάγου αποτελούν μια ιστορική πρόκληση της υγειονομικής περίθαλψης στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Οι τρέχουσες θεραπείες περιλαμβάνουν την ακτινοθεραπεία, χειρουργική επέμβαση, και χημειοθεραπεία. Υπάρχει ένας αριθμός από ανοσοθεραπείες έχουν εγκριθεί για χρήση στην αγωγή διαφόρων τύπων καρκίνων (

π.χ.,

Herceptin, Rituxin, Avastin, και άλλοι.) [3] – [6]. Όλες αυτές οι ανοσοθεραπείες χρησιμοποιούν ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται ενάντια σε ένα συγκεκριμένο κυτταρικό μόριο [7], [8]. Καταστρεπτική δράση κατά των κυττάρων του όγκου πιστεύεται ότι περιλαμβάνει ADCC (εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα), κυτταρική λύση μέσω της οδού του συμπληρώματος, ή την επαγωγή της απόπτωσης [9], [10]. Avastin είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι VEGF (αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας) και έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου [11] – [13].

Επιπλέον, μη Hodgkins λέμφωμα (NHL) επί του παρόντος υποβάλλεται σε επεξεργασία με δύο εγκεκριμένες αγωγές ραδιοανοσοθεραπευτικές: Bexxar και Zevalin. Και οι δύο χρησιμοποιούν ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στρέφεται κατά του CD20 δείκτη Β-κυττάρων και μπορεί να παραδώσει είτε

131I (Bexxar) ή

90Y (Zevalin) ισότοπα για τη στόχευση κυττάρων λεμφώματος [14], [15]. Βήτα-σωματίδια (ηλεκτρόνια) που παράγεται από αυτά τα ισότοπα μπορεί να διεισδύσει βαθιά κυττάρων και βλάβη του DNA, οδηγώντας σε κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, δεν υπάρχουν σήμερα radioimmunotherapies εγκριθεί για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Τα δεκαπεπτίδια περιγράφονται εδώ δεσμεύονται και μεταφορά ισότοπο (

32Ρ) για κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορες ορθοκολικά καρκινώματα. Υπό πανομοιότυπες πειραματικές συνθήκες, πολύ λίγο (

δηλ.,

Λιγότερο από το 1% των ποσοστών των καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ‘) του πλέον αποτελεσματικό

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτίδια δεσμεύονται σε κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν από μία ποικιλία άλλους καρκίνους ή στην κανονική του παχέος εντέρου, του νεφρού, του οισοφάγου ή κυττάρων.

Αποτελέσματα

Έχουμε εντοπίσει εννέα δεκαπεπτίδια, που διαφέρουν μεταξύ τους από μόνο λίγα αμινοξέα, ότι όταν επισημανθούν με

32Ρ μπορεί να συνδεθεί με έναν αριθμό κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος. Όλα τα δεκαπεπτίδια να περιέχουν μια πρωτεΐνη κινάσης Α αλληλουχία υπόστρωμα και ορίζονται ως μητροπολιτικές (τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό). Σχήμα 1 είναι μια σχηματική αναπαράσταση της παραγωγής των

32Ρ-επισημασμένων πεπτιδίων και του πειραματικού σχεδιασμού δοκιμασιών για τη μέτρηση της πρόσδεσης των πεπτιδίων σε κυτταρικές σειρές.

Ένα βακτηριακό ανασυνδυασμένο σύστημα έκφρασης που παράγονται διάφορα γλουταθειόνης-S- πρωτεΐνες σύντηξης τρανσφεράσης δεκαπεπτίδιο που συνδέεται με γλουταθειόνη και επισημαίνονται με

32Ρ χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη κινάση Α μετά την πλύση, τα επισημασμένα δεκαπεπτίδια ανακτήθηκαν μετά από την πέψη με θρομβίνη και επωάστηκαν σε διάφορους χρόνους με αρκετές διαφορετικές κυτταρικές σειρές.

η

Εικόνα 2 εμφανίζεται ο αριθμός των

32Ρ μετρήσεις ανά λεπτό (cpm) που παραμένει δεσμευμένο σε δεκαοκτώ διαφορετικές κυτταρικές σειρές και κενό φρεάτια μετά δύο ώρες επώασης με MA5, τον πιο αποτελεσματικό δεκαπεπτίδιο δέσμευσης (βλέπε παρακάτω). Το αδενοκαρκίνωμα του κόλου κυτταρική σειρά Caco-2 διατήρησε το μεγαλύτερο αριθμό των ραδιενεργών μετρήσεων μετά από επώαση δύο ωρών και μετέπειτα πλύσεις με πλήρες μέσο, ​​η μέση τιμή των φρεατίων εις τριπλούν που ισούται με 298.639 cpm ανά 10.000 κύτταρα. κύτταρα αδενοκαρκινώματος κόλου HCT116 διατηρείται μια μέση τιμή των 131.998 cpm ανά 10.000 κύτταρα. Λευκά φρεάτια και nonbinding κυτταρικές σειρές είχαν μέσες τιμές μικρότερες από 550 cpm? μπάρες αντιπροσωπεύουν αυτές τις τιμές δεν είναι ορατά στην κλίμακα που χρησιμοποιείται στο Σχήμα 2. Για παράδειγμα, HeLa S3 κύτταρα καρκίνου του τραχήλου διατηρούνται μόνο έναν μέσο όρο 534 cpm ανά 10.000, κύτταρα ΗΤ1080 ινοσαρκώματος διατηρούνται 367 cpm, και η ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή 293H διατηρούνται 429 cpm ανά 10.000 κύτταρα.

Ο

32Ρ σημασμένο δεκαπεπτίδιο MA5 επωάστηκε για δύο ώρες με 10000 κύτταρα, πλύθηκαν τρεις φορές, και τα ραδιενεργά μετρήσεις των κυττάρων προσδιορίστηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού. Επτά κυτταρικές γραμμές καταδεικνύεται μανιώδεις πρόσδεσης του MA5 και δείχνονται ως ράβδος γραφήματα της μέσης και μία τυπική απόκλιση σε φρεάτια εις τριπλούν. Τα υπόλοιπα έντεκα κυτταρικές γραμμές, μαζί με ένα κενό και ο μέσος όρος μόνο 365 cpm. Αυτές οι τιμές είναι τόσο μικρή ώστε να μην είναι ορατά στην κλίμακα που χρησιμοποιείται σε αυτό το σχήμα. Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις μεμονωμένες γραμμές κυττάρων παρέχεται στις συμπληρωματικές πληροφορίες.

Η

Επτά από τις κυτταρικές σειρές δεκαοχτώ αποδειχθεί πολύ ισχυρή συγκράτηση της ραδιενέργειας όταν επωάζονται με MA5 (τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό ραδιενεργό πεπτίδιο) με πέντε από αυτά είναι αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές κόλου (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, ΗΤ29), ο ένας να είναι ένα οισοφαγικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρική γραμμή (SEG1), και ο ένας να είναι οισοφάγου κυτταρική γραμμή ενός Barrett (QHTRT). Σε αντίθεση, οι έντεκα μη δεσμευτικό κυτταρικές γραμμές ήταν ως επί το πλείστον πλακωδών κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας (HeLa S3), κόλον (ΚΚΟ), του πνεύμονα (1271, Α549), του οισοφάγου (KYSE-70), ένα fibrosacroma (ΗΤ1080) ή κύτταρα που καλλιεργήθηκαν από το φυσιολογικό νεφρό (293H), του παχέος εντέρου (1459), ή του οισοφάγου (HEEpiC). Μη δεσμευόμενα κυτταρικές σειρές περιλαμβάνονται Τ84, που προέρχεται από ένα μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του κόλου στον πνεύμονα, και SK-BR-3, που απομονώνονται από ένα αδενοκαρκίνωμα μαστού. Η αναλογία cpm συγκρατείται από Caco-2 (298.639) προς το μέσο όρο των έντεκα μη δεσμευτικό κυτταρικές γραμμές (365) ήταν 818:1. κύτταρα Caco-2 διατηρείται περίπου 18% του συνόλου των ραδιενεργών μετρήσεων που υπάρχει στο επώαση καλά μετά από δύο ώρες επώασης.

Εννέα παραλλαγές ΜΑ προσδιορίστηκαν για προσκόλληση σε κύτταρα Caco-2 μετά από επώαση δύο ωρών. Η σχετική συνδετική σύνθεση επίπεδο και αμινοξέων της κάθε παραλλαγής ΜΑ εμφανίζεται στο σχήμα 3Α. Μεταβολή μόνη τρία αμινοξέα εντός του πεπτιδίου είχε ως αποτέλεσμα διαφορές συγκράτηση τόσο μεγάλη όσο 70 φορές,

π.χ.,

σε παραλλαγή MA2

vs.

Παραλλαγή MA5.

(Α) Εννέα

32Ρ-επισημασμένο διαφορετικά δεκαπεπτίδια, που ποικίλουν από το ένα το άλλο με μία μόνο προς τρία αμινοξέα, επωάστηκαν με κύτταρα Caco-2 για δύο ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές, και ο αριθμός υπόλοιπα συνδέονται προς τα κύτταρα είναι εμφανίζεται ως ποσοστό του συνολικού ποσού των μετρήσεων για κάθε δεκαπεπτίδιο που χρησιμοποιείται. Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων για κάθε παραλλαγή (σε σχέση με MA1) υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα. (Β) Οι παραλλαγές, MA1, MA4, και MA5 επωάστηκαν με κύτταρα Caco-2 για διαστήματα ποικίλλει από πέντε λεπτά έως δύο ώρες, πλύθηκαν, τα προσκολλημένα κύτταρα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό φόρτωσης γέλης και ένα τρέξιμο σε ένα υποπολλαπλάσιο 10% -20% κλίση πολυακρυλαμιδίου-SDS γέλη. Οι τρεις λωρίδες που σημειώνονται «24h» (λωρίδες 5, 10, και 15) επωάστηκαν με τα αντίστοιχα επισημασμένα δεκαπεπτίδια (ΜΑ1, MA4, MA5) για δύο ώρες, πλύθηκαν, και τα κύτταρα επωάζονται με πλήρες μέσο για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται για τις άλλες λωρίδες αυτού του αριθμού.

Η

Για να διερευνηθεί πόσο γρήγορα

32Ρ ισότοπο θα μπορούσαν να μεταφερθούν από τις παραλλαγές του πεπτιδίου και ενσωματώνονται σε κυτταρικές πρωτεΐνες, οι τρεις πιο αχόρταγα δεσμευτική προστέθηκαν μητροπολιτικές (βλέπε Σχήμα 3Α) για την αναπαραγωγή φρεάτια που περιέχουν κύτταρα Caco-2, στη συνέχεια πλύθηκε μακριά σε διάφορα χρονικά διαστήματα και τα κύτταρα και το υπερκείμενο αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ουσιαστική ποσοστά αυτών των

32Ρ-επισημασμένο παραλλαγή δεκαπεπτίδια δεσμευμένη στα κύτταρα μέσα σε λίγες μόνο λεπτά, με μεγάλες ποσότητες ραδιοεπισημασμένων κυτταρικών πρωτεϊνών που εμφανίζονται σε δύο ώρες μετά την έκθεση των κυττάρων στα σημασμένα πεπτίδια. Συγκεκριμένα, ένα παράλληλο πείραμα στο οποίο συνθήκες που περιγράφονται στο Σχήμα 3 επαναλήφθηκαν, αλλά πλυμένα κύτταρα επωάστηκαν

όλη τη νύκτα

σε πλήρες μέσο (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ακόμη αποκάλυψε παρόμοια επίπεδα

32Ρ-δεκαπεπτιδίου αποδέσμευσης και συγκράτησης για όλους τους εννέα μητροπολιτικές, όπως περιγράφεται για MA5 στο Σχήμα 2.

Το πεπτίδιο δέσμευσης, πλύση και ανίχνευση πείραμα που περιγράφεται για το Σχήμα 2 επαναλήφθηκε στη συνέχεια στις επτά πιο αχόρταγα δεσμευτικός κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας MA5, εκτός από το ότι μετά από τρεις πλύσεις του μέσου, 200 μΐ πλήρους μέσου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν

όλη τη νύκτα

στους 37 ° C. Το Σχήμα 4Α δείχνει το cpm που διατηρούνται από τα κύτταρα ή απελευθερώνονται εντός του μέσου μετά από αυτή την ολονύκτια επώαση. Περίπου το 88% των MA5 απαριθμήσεις ραδιενέργειας αρχικά συγκρατείται από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου απελευθερώθηκε εντός του μέσου, ενώ περίπου το 12% του αρχικώς απαριθμήσεις ραδιενέργειας διατηρήθηκαν από κύτταρα. Οι δύο οισοφάγου κυτταρικές σειρές που αρχικά συγκρατείται μεγάλες ποσότητες ραδιενεργών μετρήσεων, QH-TRT και SEG1, διατήρησε 39% και 37% του αρχικού τους μετράει, αντίστοιχα, μετά από ολονύκτια επώαση. κύτταρα Caco-2 διατήρησε το μεγαλύτερο αριθμό των μετρήσεων, με μέσο όρο 58.305 cpm σε φρεάτια εις τριπλούν που περιέχουν 10.000 κύτταρα το καθένα. Ο αριθμός αυτός αντιπροσωπεύει περίπου 5,8 cpm, ή 348 μετρήσεις ανά ώρα, ανά κύτταρο (

δηλαδή,

όταν παρέκταση πάνω από μια πιθανή περίοδο έκθεσης 2 εβδομάδων, που ισοδυναμεί με πάνω από 87.000 μετρήσεις ανά κύτταρο).

(Α) Η

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτιδίου MA5 επωάστηκε για δύο ώρες με επτά διαφορετικές κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα πλύθηκαν, και προστέθηκε πλήρες μέσο. Μετά από 24 ώρες επώασης, ο αριθμός των μετρήσεων ανά λεπτό που απελευθερώνεται εντός του μέσου (R), καθώς και τον αριθμό των μετρήσεων που παραμένει δεσμευμένη στα κύτταρα (Β) προσδιορίστηκαν. Κάθε ράβδος απεικονίζει το μέσο όρο και μία τυπική απόκλιση τριπλών φρεατίων. (Β) Χρονική πορεία για την απελευθέρωση και τη διατήρηση του

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτιδίου MA5. MA5 επωάστηκε για δύο ώρες με κύτταρα Caco-2, τα κύτταρα πλένονται, και η cpm που απελευθερώνεται (διακεκομμένη γραμμή), καθώς και υπόλοιπα δεσμευμένου (συνεχής γραμμή) στα κύτταρα προσδιορίστηκε για χρονικά διαστήματα μετά το πλύσιμο. Κάθε σημείο δείχνει τη μέση τιμή μείον /συν μία τυπική απόκλιση των τριπλών προσδιορισμών. C) Τα ραδιενεργά περιεχόμενα περιγράφονται καλά ότι δεσμεύεται (συνεχής γραμμή) στο σχήμα 4Β έτρεξαν σε 16,5% πολυακρυλαμιδίου-SDS γέλη και εκτέθηκαν σε φιλμ. Αμέσως μετά το πλύσιμο (

δηλ.,

Στις 0 ώρες), η πλειοψηφία των μετρήσεων απεικονίστηκαν ως

32Ρ-πεπτιδίου. Κατά τη διάρκεια των επόμενων 48 ωρών, το πεπτίδιο μετράει πολύ μειωμένη, με την πλειονότητα των δεσμευμένης ραδιενέργειας ενσωματώθηκε κυτταρικές πρωτεΐνες. (D) Δείγματα μέσου που περιέχει το απελευθερωμένο (διακεκομμένη γραμμή)

32Ρ-πεπτιδίου MA5 αναλύθηκαν σε χρονικά διαστήματα μετά την πλύση, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 4Β. Καθώς ο χρόνος προχώρησε, περισσότερο από το

32Ρ-πεπτίδιο απελευθερώθηκε, φθάνοντας ένα πλατώ κατά 24 ώρες μετά το πλύσιμο.

Η

Το Σχήμα 4Β δείχνει τη χρονική πορεία της απελευθέρωσης από το MA5 Caco-2 κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος σε χρονική περίοδο 48 ωρών. Η πλειοψηφία των συνολικών μετρήσεων που απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου 48 ώρα απελευθερωθούν από εννέα ώρες επώασης. Τα σχήματα 4C και 4D αποτελούνται από δύο αυτοραδιογραφημάτων που δείχνει τις θέσεις των ραδιενεργών μορίων που περιγράφονται στην Εικόνα 4Β σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου-SDS. Τα μεγέθη των κυτταρικών ραδιενεργών πρωτεΐνες στα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 4C?

32Ρ-επισημασμένο MA5 απελευθερώθηκε εντός του μέσου φαίνεται στο Σχήμα 4D. Υπάρχει εμφανής συμφωνία σχετικά με το συνολικό επίπεδο ραδιενέργειας διανομή και στη σύγκριση Εικόνα 4Β και Σχήματα 4C και 4D. Μόλις δύο ώρες μετά την εισαγωγή του ραδιενεργού πεπτιδίου, ένα σημαντικό μέρος του ισοτόπου φαίνεται να έχουν μεταφερθεί σε υψηλότερες πρωτεΐνες μοριακού βάρους.

Συζήτηση

Η παρούσα έκθεση περιγράφει την ανακάλυψη των δεκαπεπτιδίων ότι μπορεί να σημανθεί με μια υψηλής ενέργειας (1,7 Mev) βήτα εκπομπός (

32Ρ) και μπορεί να δεσμεύεται ισχυρά σε αρκετές διαφορετικές κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος, αποτελεσματικά παρέχοντας αυτό το δυναμικό υλικό όγκου-εκτομής στα κύτταρα. Τα δεκαπεπτίδια, ονομάζονται ΜΑ για τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό, είναι υποστρώματα κινάσης πρωτεΐνης. Προηγουμένως, είχε ποτέ αποδειχθεί ή υπάρχει υποψία ότι αυτό το υπόστρωμα, όταν επισημαίνονται με ένα υλικό με όγκο εκτομής όπως

32Ρ, θα μπορούσαν να συνδέονται και να μεταφέρουν το ραδιοϊσότοπο σε μία κυτταρική γραμμή μετά από μία έως δύο ώρες επώασης. Επιπλέον, έχουμε δείξει για πρώτη φορά ότι η μεταφορά των ισοτόπων από αυτά τα δεκαπεπτίδια περιορίζεται σε κυτταρικό τύποι προέρχονται από πρωτογενή κόλον και του οισοφάγου αδενοκαρκινώματα. Για παράδειγμα, η έκθεση ορισμένων καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές

(π.χ.

. Caco-2) με την πιο μεγάλη προσοχή πρόσδεσης σημασμένου πεπτιδίου, MA5, για μία περίοδο δύο ωρών είχε ως αποτέλεσμα τη μεταφορά μιας ραδιενεργού δόσης πάνω από 29 μετρήσεις ανά λεπτό ανά κύτταρο μετά δύο ώρες επώασης, πλένουμε, και άμεση προσδιορισμός των συγκρατούμενων ραδιενέργειας.

Η επώαση του

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτίδιο με ορισμένες κυτταρικές γραμμές είχε σαν αποτέλεσμα μεγάλες ποσότητες πεπτιδίου που διατηρείται μετά μια επώαση δύο ωρών, αλλά ένα σημαντικό μέρος αυτού του δεσμευμένου πεπτιδίου απελευθερώθηκε μετά από ολονύκτια επώαση. Για παράδειγμα, μετά την επώαση του επισημασμένου παραλλαγής MA5 με κύτταρα Caco2 για δύο ώρες, τρία βήματα έκπλυσης, και ολονύκτια επώαση σε μέσο, ​​το 88% του αρχικά διατηρείται

32Ρ ισότοπο απελευθερώθηκε. Ωστόσο, το 12% που παρακρατήθηκε από τα κύτταρα εκπροσωπούνται ακόμα 5,8 cpm ανά κύτταρο, παρέκταση σε πάνω από 8.300 μετρήσεις ανά κύτταρο ανά ημέρα. Επιπλέον, η ραδιενέργεια που είχε ακόμη διατηρείται από κύτταρα μετά από ολονύκτια επώαση μέσο μόνιμα ενσωματώνεται σε μία ποικιλία κυτταρικών πρωτεϊνών, όπως αποδεικνύεται από ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου των κυτταρικών προϊόντων λύσης μετά την έκθεση

Μεταξύ 18 κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν για την ικανότητά τους να δεσμεύει τα δεκαπεπτίδια, επτά απέδειξαν πολύ υψηλή κατακράτηση του ισοτόπου μετά από δύο ώρες επώασης. Παρά το γεγονός ότι και οι επτά από αυτές τις γραμμές που απελευθερώνεται από 63% έως 88% αυτής της ραδιενέργειας μετά από ολονύκτια επώαση, η ποσότητα του ισοτόπου που διατηρήθηκε για όλη τη νύχτα ήταν ακόμη σημαντικές. Από αυτές τις επτά κυτταρικές γραμμές, πέντε προήλθαν από ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα, ένας από αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου, και ένα από δείγμα μεταπλασία ενός του Barrett. Οι 11 κυτταρικές σειρές που δεν δεσμεύουν το ραδιενεργά σημασμένο δεκαπεπτιδίου MA5 προήλθαν από μια ποικιλία προελεύσεων ιστού. Αυτές περιελάμβαναν πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας, του πνεύμονα, του μαστού, καθώς και ένα ινοσάρκωμα, καθώς και φυσιολογικό νεφρό, κόλον και του οισοφάγου ιστούς.

Η πλειοψηφία των εγκεκριμένων ανοσοθεραπευτικών σχήματα για τον καρκίνο περιλαμβάνουν ένα αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον ενός ειδικού κυτταρικό μόριο [16]. Αυτοί οι παράγοντες μπορούν να λειτουργήσουν με σύνδεση προς την επιφάνεια του κυττάρου και μπορεί να χρησιμοποιεί ADCC, ενεργοποίηση συμπληρώματος, ή κυτταρική απόπτωση. Τα αντισώματα μπορούν επίσης να συζευχθούν με έναν παράγοντα όγκου-εκτομής, όπως τοξίνες ή ραδιοϊσότοπα [17] – [21]. Η προσθήκη του ισοτόπου στα πεπτίδια, και τη χρήση τους για διαγνωστικούς και για θεραπευτικούς σκοπούς, είναι ένα ενεργό τομέα της βιοϊατρικής έρευνας [22] – [25]. Η δουλειά μας χρησιμοποιεί υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης Α σημαίνεται με

ισότοπο 32Ρ. Ένα υψηλής ενέργειας βήτα-εκπομπής αποτελέσματα ραδιοϊσοτόπων σε μια σειρά ηλεκτρονίων μήκος διαδρομής της έως 5 mm, που επιτρέπει την ουσιαστική διείσδυση των συμπαγών όγκων. Λόγω της προβλεπόμενης αποτέλεσμα «γειτνιάσεως», ένα σωματίδιο βήτα θα διεισδύσει εκατοντάδες ή χιλιάδες κυττάρων εντός του όγκου, ακόμη και εκείνων που δεν δεσμεύει απευθείας το δεκαπεπτίδιο. Επιπλέον, δεδομένου ότι τα μοριακά βάρη αυτών των μικροσκοπική δεκαπεπτιδίων πρωτεΐνες είναι πολύ χαμηλότερο από το όριο αποκλεισμού μοριακού βάρους των νεφρών φιλτραρίσματος, τα πεπτίδια αυτά πρέπει να εξαλειφθούν ταχέως από τα ούρα, οδηγώντας σε μειωμένη συστημική τοξικότητα. Έτσι, θα πρέπει να είναι εφικτό και για τις δύο ραδιενεργό δόση και μη δεσμευμένη ραδιενέργεια να εξαλειφθεί εύκολα και σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα. Αναμένουμε ότι επιπλέον γνωστά υποστρώματα ενζύμου μπορεί τελικά να αναγνωριστούν ως πιθανά οχήματα για την ειδική χορήγηση παραγόντων κατά του όγκου σε καρκινικά κύτταρα και ότι το δυναμικό του καρκίνου θεραπευτικές αγωγές που χρησιμοποιούν αυτό το πεπτίδιο ή άλλες παρόμοιες ουσίες μπορεί να είναι η πιο πρόσφατη στρατηγική για θεραπεία σύνδεσης πεπτιδίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Η παραγωγή των

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτιδίων: Διαφορετικές ολιγομερή DNA κλωνοποιήθηκαν σε pGEX-4Τ-1 (GE Healthcare) τα οποία δίδουν διάφορες δεκαπεπτιδίων μετά τη διάσπαση της θρομβίνης ορίζονται MA1 μέσω MA9 (τροποποιημένο ανοσοενισχυτικό). Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες είναι: MA1, GSRRASVGSA? MA2, GSRGASVGGA? MA3, GSRRGSVGSA? MA4, GSRRGSVASA? MA5, GSRRASVASA? MA6, GSRRASVGSG? MA7, GSRGGSVGSA? MA8, GSRGGSVASA? MA9, GSRGGSVGSG. DH5-α βακτήρια που περιέχουν αυτά τα κλώνοι αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα σε LB (που περιέχει 100 μg /ml αμπικιλλίνη), αραιωμένο 1/10 σε LB-Amp και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C για δύο ώρες. IPTG προστέθηκε σε 1 mM και η καλλιέργεια αναπτύχθηκε στους 37 ° C για πέντε ώρες. Δέκα ml από κάθε καλλιέργεια φυγοκεντρήθηκαν και το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 Χ TBS που περιέχει 100 μg /ml λυσοζύμη. Μετά από δύο κύκλους ψύξης-απόψυξης, το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο αναμίχθηκε με 100 μΙ Sepharose-γλουταθειόνης για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κάθε σφαιρίδιο πλύθηκε τρεις φορές με 1 Χ TBS, και οι συνδεδεμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης σημάνθηκαν με

32Ρ χρησιμοποιώντας πρωτεϊνική κινάση Α και

32Ρ-γ-ΑΤΡ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma, St. Louis, Μο .). . Το σφαιρίδιο πλύθηκε τέσσερις φορές με 1 Χ PBS και το επισημασμένο δεκαπεπτίδιο διασπάται και απελευθερώνονται στο υπερκείμενο με θρομβίνη (GE Healthcare)

Δοκιμασία πρόσδεσης του

32Ρ-επισημασμένο δεκαπεπτίδια σε κυτταρικές σειρές: οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει 10% ορό βόειου εμβρύου (θερμοαπενεργοποιημένο). Σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων, 10.000 κύτταρα από διάφορες κυτταρικές σειρές αυξήθηκαν για μία νύχτα σε πλήρες μέσο. Δέκα μΙ του επισημασμένου πεπτιδίου σε 1 Χ PBS και 90 μΐ πλήρους μέσου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C σε διάφορα χρονικά διαστήματα μέχρι και δύο ώρες. Το πεπτίδιο-μέσο απομακρύνθηκε και ένας μΐ προστέθηκαν σε ρυθμιστικό φόρτωσης γέλης 100 ul και μετρήθηκαν με μέτρηση σπινθηρισμού για τον έλεγχο ανιχνευτή ή να τρέξει σε μια πολυακρυλαμιδίου-SDS γέλη (Biorad) .Τα προσκολλημένα κύτταρα ήταν εν συντομία και απαλά πλένεται με πλήρες μέσο τρεις φορές και μερικά φρεάτια προσδιορίστηκαν αμέσως με την προσθήκη 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πηκτώματος σε κάθε φρεάτιο και να τρέξει σε μια γέλη ή μετρήθηκαν σε μετρητή σπινθηρισμού. Άλλα φρεάτια είχε 100 μλ πλήρους μέσου και επωάστηκαν για περαιτέρω χρονικό διάστημα. Δείγματα είτε μετρώνται σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού ή να τρέξει σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου-SDS, εκτίθενται σε φιλμ ακτίνων Χ, και η ταινία που αναπτύχθηκε.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Dr. Yutaka Shimada (Hyogo College of Medicine, Ιαπωνία) για το δώρο της κυτταρικής σειράς KYSE-70.