Αφηρημένο

Ιστορικό

Μη μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) έχει το υψηλότερο ποσοστό υποτροπής οποιασδήποτε κακοήθειας και όσο το 70% των ασθενών βιώνουν υποτροπή. Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA είναι παρούσα σε όλους τους όγκους της ουροδόχου κύστης και μπορεί να ανιχνευθεί σε δείγματα ούρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει δείκτες μεθυλίωσης του DNA που έδειξαν σημαντική διαγνωστική αξία. Αξιολογήσαμε τη σημασία των βιολογικών δεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση της υποτροπής του όγκου στα ούρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα επίπεδα μεθυλίωσης του

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

και

ZNF154

σε δείγματα ούρων μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (MethyLight). Αναλύσαμε 390 ιζήματα ούρων από 184 ασθενείς διαγνώστηκαν με NMIBC. Ούρα από 35 άτομα ελέγχου της ίδιας ηλικίας χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα μεθυλίωσης βασική γραμμή. Επανεμφάνιση διαγνώστηκε με κυστεοσκόπηση και επαληθεύεται από την ιστολογία. Αρχικά, σε σύγκριση με τα ούρα από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των υγιών ατόμων και ανιχνεύεται σημαντική υπερμεθυλίωση των έξι δεικτών (P & lt? 0.0001) επιτυγχάνοντας ευαισθησία στο εύρος 82% -89% και ειδικότητα της τάξεως 94% -100%. Μετά, θα επικυρωθούν το ουροποιητικό υπερμεθυλίωση για χρήση σε επιτήρηση επανάληψης και βρέθηκαν ευαισθησίες του 88-94% και τις ιδιαιτερότητες του 43-67%.

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

και

ZNF154

ήταν πιο συχνά μεθυλιώνονται στα ούρα από ασθενείς με υψηλότερα όγκους Βαθμός (P≤0.08). Μονοπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι πέντε δείκτες συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με υποτροπή της νόσου?

HOXA9

(HR = 7,8, P = 0,006),

POU4F2

(HR = 8,5, P = 0,001),

TWIST1

(HR = 12,0, P = 0,015) ,

VIM

(HR = 8,0, P = 0,001), και

ZNF154

(HR = 13,9, P & lt? 0.001). Είναι ενδιαφέρον, για μία ομάδα ασθενών (n = 15) βρήκαμε ότι υπερμεθυλίωση ήταν σταθερά παρούσα στα δείγματα ούρων, παρά την έλλειψη των υποτροπών όγκου, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός ελαττώματος πεδίου.

Συμπέρασμα /Σημασία

επίπεδα μεθυλίωσης του

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

και

ZNF154

σε δείγματα ούρων είναι ελπιδοφόρα διαγνωστική βιοδείκτες για την επιτήρηση καρκίνου της ουροδόχου κύστης επανεμφάνιση

Παράθεση:. Ρέινερτ T, Borre M, Christiansen Α, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) Διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης υποτροπή βασισμένο σε ουρικά επίπεδα του

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

και

ZNF154

υπερμεθυλίωση. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10.1371 /journal.pone.0046297

Επιμέλεια: Brock C. Christensen, Geisel της Ιατρικής Σχολής του Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιούνη, 2012? Αποδεκτές: 29 Αυγούστου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Reinert et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον John και Birthe Ίδρυμα Meyer, το Συμβούλιο της Δανίας για ανεξάρτητη έρευνα, το Ίδρυμα Lundbeck, το Ίδρυμα της Novo Nordisk, μια επιχορήγηση της ΕΕ για UROMOL κοινοπραξία όχι. 201.663, η Δανική Εταιρεία Καρκίνου, το Πανεπιστήμιο του Aarhus, και το Υπουργείο Εσωτερικών και Υγείας της Δανίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι η πέμπτη πιο κοινή νεοπλασία στις βιομηχανικές χώρες. Σε περίπου 75% του συνόλου των περιπτώσεων, οι ασθενείς θα παρουσιάσει με το στάδιο Ta ή Τ1 μη μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), ενώ το υπόλοιπο 25% των όγκων θα είναι μυϊκή επεμβατική στάδιο T2-4 καρκίνους (MIBC) [1] . Περίπου το 60% -70% των ασθενών με υποτροπές όγκου NMIBC εμπειρία εντός 3 ετών μετά την εκτομή του [2], [3] και οι ασθενείς μπορεί να αναπτύξουν υποτροπιάζοντες όγκοι ετησίως για πολλά χρόνια χωρίς εξέλιξη της νόσου. Ωστόσο, μέχρι 25% θα εξελιχθεί σε μυ διεισδυτική νόσο [4]. Το υψηλό ποσοστό υποτροπής και τον κίνδυνο εξέλιξης προτρέψει την ανάγκη για συχνή και μακροπρόθεσμη επιτήρηση, καθιστώντας καρκίνου της ουροδόχου κύστης το πιο ακριβό για τη θεραπεία του καρκίνου [5], [6]. Μετά εκτομή του πρωτογενούς όγκου, οι ασθενείς συχνά παρακολουθούνται από κυστεοσκόπηση και κυτταρολογία. Βιοψίες που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια κυστεοσκόπηση είναι το χρυσό πρότυπο για τη διάγνωση όγκων της ουροδόχου κύστης. Η ευαισθησία της κυστεοσκόπηση για NMIBC είναι κοντά στο 80% για το λευκό φως κυστεοσκόπηση, και 96% όταν χρησιμοποιείτε την πιο δαπανηρή, φθορίζουσα καθοδήγηση κυστεοσκόπηση χρησιμοποιώντας hexaminolevulinate (HAL). Για την ανίχνευση της δυσπλασίας και καρκινώματος in situ (CIS), η ευαισθησία του λευκού φωτός κυστεοσκόπηση μειώνεται σε 48% και 68%, αντίστοιχα? ενώ η ευαισθησία του κυστεοσκόπηση χρησιμοποιώντας HAL για αυτές τις βλάβες παραμένει στο εύρος από 93% -95% [7] – [9]. Κυτταρολογικό χρησιμοποιείται συχνά σε συνδυασμό με κυστεοσκόπηση, λόγω της υψηλής εξειδίκευσης του 99% (0,83 έως 0,997? 95% CI), αλλά με χαμηλή ευαισθησία 34% (0,20 έως 0,53? 95% CI). Η ευαισθησία της κυτταρολογίας αυξάνει για υψηλής στάδιο και υψηλής ποιότητας όγκων, ιδιαίτερα για πρωτογενείς όγκους [10]. Έχει προταθεί ότι ένα ελάττωμα πεδίο κύστη μπορεί να προκαλεί την υψηλή συχνότητα των υποτροπών όγκου σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [11]. Αρκετές μοριακές μεταβολές έχουν δειχθεί να είναι παρούσα σε φυσιολογικά εμφανίζονται περιοχές της ουροδόχου κύστης σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [12], [13], και πρόσφατα μια επιγενετική ελάττωμα τομέα ήταν περιγράφεται [14].

Επιγενετική είναι η μελέτη της μιτωτικώς ή /και μειωτικά κληρονομικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που δεν μπορεί να εξηγηθεί από τις αλλαγές στη αλληλουχία DNA [15]. Μεθυλίωση του DNA είναι ένα καλά μελετημένο επιγενετικό μηχανισμός που εμπλέκεται σε κανονικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, γονιδιωματική αποτύπωση και αδρανοποίηση X-χρωμόσωμα [16] – [18]. Μεταβολές στο DNA μεθυλίωση έχουν συσχετιστεί με διάφορες παθολογικές διαταραχές του ανθρώπου περιλαμβανομένου του καρκίνου [19], και μεταγραφική απενεργοποίηση από παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση είναι μια καθιερωμένη μηχανισμό για γονιδιακή σίγηση σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης [20] – [23]. Ταυτοποίηση των δεικτών μεθυλίωσης του DNA για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ήταν σε εξέλιξη εδώ και μερικά χρόνια. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει υψηλά ευαισθησίες και εξειδικεύσεις για αυτούς τους δείκτες, που τους καθιστά πιθανώς χρήσιμα ως διαγνωστικοί δείκτες για καρκίνο της ουροδόχου κύστης [24] – [31]. Σε προηγούμενη μελέτη μας εντόπισε μια σειρά δεικτών μεθυλίωσης του DNA (

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2,

και

ZNF154

) που έδειξε το δυναμικό διαγνωστικά αξία σε δείγματα ούρων από ασθενείς π.Χ. [26].

τώρα επικυρωθεί η διαγνωστική και προγνωστική αξία αυτών των βιοδεικτών, μαζί με προηγούμενες αναφερθεί

TWIST1

[25] και

VIM

[30] σε δείγματα ούρων. Αρχικά, για την επικύρωση της σημασίας των επιλεγμένων δεικτών μεθυλίωσης, και για τον προσδιορισμό των τιμών αποκοπής δείκτη, συγκρίναμε την πρώτο δείγμα ούρων από κάθε ασθενή με NMIBC στα δείγματα ούρων από υγιή άτομα. Μετά, αξιολογήσαμε τη διαγνωστική και προγνωστική αξία των δεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση της υποτροπής του όγκου χρησιμοποιώντας δείγματα ούρων που λαμβάνονται σε μεταγενέστερες επισκέψεις παρακολούθησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς, και ερευνητικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από τις κεντρικές Δανία Περιοχή επιτροπές Ιατροβιολογικών Ερευνών Δεοντολογίας.

ασθενών Υλικό

Ένα σύνολο 652 ακυρώνεται δείγματα ούρων συλλέχθηκαν στο Τμήμα Ουρολογίας στο Aarhus University Hospital από 390 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και 47 άτομα με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη ή της ουροδόχου κύστης πέτρες, αλλά χωρίς ιστορικό καρκίνου της ουροδόχου κύστης (άτομα ελέγχου). Από αυτές εμείς αποκλείονται 227 δείγματα, επειδή η ποσότητα του DNA ήταν κάτω από το όριο μας (Suppl. Πίνακας 1), η οποία άφησε 425 δείγματα (390 δείγματα από 184 ασθενείς π.Χ. και 35 από άτομα ελέγχου) (Πίνακας 1 και Suppl. Σχήμα 1). Δέκα έως πενήντα mL ούρων συλλέχθηκαν σε τακτικές επισκέψεις παρακολούθησης. δείγματα ούρων συλλέχθηκαν αμέσως πριν κυστεοσκόπηση? τα κύτταρα ιζηματοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, και καταψύχθηκαν στους -80 ° C. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ [32] και βαθμολογούνται σύμφωνα με Bergkvist [33]. Δεκαπέντε από τα άτομα ελέγχου ήταν Stix θετικά για τα νιτρώδη στα ούρα δείχνει βακτηριακή λοίμωξη. θεραπεία των ασθενών και την παρακολούθηση διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Ευρωπαϊκής Ουρολογικής [34].

Η

DNA Εξόρυξη και Τροποποίηση Bisulfite

DNA εκχυλίζεται με τον ιό QIAsymphony /Βακτήρια Midi κιτ (96) (Qiagen) χρησιμοποιώντας το εργαλείο QIAsymphony® SP και χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Complex800_V5_DSP. Πεντακόσια νανογραμμάρια DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιείται χρησιμοποιώντας EZ-96 DNA D5004 μεθυλίωση (Zymo Research) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και εκλούστηκε σε 60 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης και αποθηκεύεται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Σε πραγματικό χρόνου ποσοτική μεθυλίωση-ειδική αντίδραση Polymerase Chain (MethyLight)

ανάλυση μεθυλίωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας MethyLight [35]. Εκκινητές και ανιχνευτές για τα έξι γονίδια ενδιαφέροντος σχεδιάστηκαν για να συμπεριλάβει οκτώ έως δέκα CpG δινουκλεοτίδια (Suppl. Πίνακας 2). Για εξομάλυνση των υλικών εισόδου DNA, χρησιμοποιήσαμε την ακολουθία επανάληψης στοιχείο ALU-C4 [36]. qPCR πολλαπλασιασμοί εκτελέστηκαν με το TaqMan καθολική PCR Master Mix αριθ AmpErase (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε διπλότυπα με χρήση 2 μΐ (5 ng) όξινου θειώδους-τροποποιημένου DNA σε ένα τελικό όγκο 5 μΐ σε πλάκες 384-φρεατίων σε ένα ΑΒΙ 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Αν διπλότυπα ήταν ασυνεπής, ένα αντίγραφο που είναι θετικά για μεθυλίωση και ένα αρνητικό για μεθυλίωση, επαναλήφθηκε η ανάλυση. Το δείγμα είχε αποκλειστεί σε σχέση με το συγκεκριμένο δείκτη, αν λήφθηκε άλλη ασυνεπής αποτέλεσμα. Τα πρωτόκολλα ενίσχυσης που αναφέρονται στο συμπλ. Πίνακα 2. δεδομένα Amplification αναλύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (SDS 2.4, Applied Biosystems). Κάθε πλάκα περιλάμβανε διαδοχική αραίωση (25-0.04ng) πλήρως μεθυλιωμένων DNA: CpGenome ™ καθολική μεθυλιωμένο ϋΝΑ) (Millipore) με το γονίδιο που μας ενδιαφέρει και ALU-C4, αρκετές ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο (NTC) φρεάτια, 5 νανογραμμάρια ενός μεθυλιωμένου δείγμα ελέγχου [CpGenome ™ Οικουμενική Methylated DNA (Millipore)], και μη μεθυλιωμένη δείγμα που αποτελείται από ολόκληρο το γονιδίωμα του ενισχυμένου DNA από το DNA του περιφερικού αίματος. Το ποσοστό των μετουσιωμένο αναφοράς (PMR) υπολογίστηκε για κάθε δείγμα σύμφωνα με την εξίσωση: 100 × [(γονίδιο-x αξίας αντίγραφο) του δείγματος /(ALU-C4 αξία αντίγραφο) του δείγματος] /[(γονίδιο-x αξίας αντίγραφο) Οικουμενική Methylated DNA /(τιμή ALU-C4copy) Οικουμενική Methylated DNA].

στατιστική Ανάλυση

Stata 11 (StataCorp, Texas, USA) χρησιμοποιήθηκε για όλους τους στατιστικούς υπολογισμούς. Δίπλευρη εξετάσεις θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν Ρ & lt? 0,05. διαφορών μεθυλίωσης αξιολογήθηκαν με μη παραμετρική δοκιμή Wilcoxon-Mann-Whitney. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των διχοτομική μεταβλητές. Η ακριβής $ δοκιμασία x ^ 2 $ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση συσχετίσεων μεταξύ κλινική-παθολογική παραμέτρους με δύο ή περισσότερες κατηγορίες. Οι συσχετίσεις των επιπέδων μεθυλίωσης των δεικτών υπολογίστηκαν με συντελεστές συσχέτισης Spearman. Μια καμπύλη ROC έγινε για κάθε δείκτη και συνδυασμούς δεικτών με γραφική παράσταση της ευαισθησίας έναντι (1-εξειδίκευση) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε. τεστ Log-Rank εφαρμόστηκαν για την αξιολόγηση της ισότητας της επιβίωσης και οικόπεδα επιβίωσης Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση. ανάλυση παλινδρόμησης μονοπαραγοντική Cox χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των ενώσεων ηλικία, το φύλο, το στάδιο, το βαθμό, την πολλαπλότητα και CIS με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση

Αποτελέσματα

Η ανάλυσή μας χωρίστηκε σε δύο μέρη:. 1 ) για να καθοριστεί το επίπεδο αποκοπής των δεικτών μεθυλίωσης και να καταδείξει τη σημασία των επιλεγμένων δεικτών αναλύσαμε το πρώτο δείγμα ούρων από κάθε ασθενή και συγκρίθηκαν με τον έλεγχο δείγματα ούρων από υγιή άτομα? 2) χρησιμοποιώντας τα καθοριζόμενα επίπεδα αποκοπής δείκτη τότε να επικυρωθεί η διαγνωστική και προγνωστική αξία των δεικτών μεθυλίωσης σε δείγματα ούρων που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών.

Ίδρυση της δοκιμής επίπεδα Cut-off και αρχική επικύρωση Marker Σημασία

Αρχικά, ορίζονται τα επίπεδα αποκοπής από το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του κάθε δείκτη + 2x τυπική απόκλιση του επιπέδου μεθυλίωσης σε δείγματα ούρων από 35 άτομα ελέγχου (μόνο δείγματα με τιμές μεθυλίωση παραπάνω συμπεριλήφθηκαν μηδέν). Cut-off επίπεδα (τιμές PMR – βλέπε υλικά και μέθοδοι) που χρησιμοποιείται για να διχοτομήσει των δεικτών μεθυλίωσης ήταν:

EOMES

= 0,348,

HOXA9

= 0.077,

POU4F2

= 0,371 ,

TWIST1

= 0.405,

VIM =

0.368 και

ZNF154

= 1.51. Άλλα επίπεδα αποκοπής (μέσος όρος + 1xSD και + 3xSD) με βάση τα επίπεδα μεθυλίωσης σε δείγματα ούρων ελέγχου θεωρήθηκαν αρχικά (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Για την επικύρωση της σημασίας των δεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης συγκρίναμε την πρώτο δείγμα ούρων από 184 ασθενείς με διάγνωση NMIB σε δείγματα ούρων από 35 άτομα ελέγχου (Πίνακας 1). Όλα τα έξι δείκτες ήταν εξαιρετικά σημαντικά υπερ-μεθυλιωμένη στα ούρα από ασθενείς με NMIBC σύγκριση με ούρα από υγιή άτομα (Mann-Whitney, Ρ & lt? 0,0001) (Πίνακας 2). Καλύτερη ευαισθησίες των δεικτών παρατηρήθηκαν κατά την ανάλυση δειγμάτων ούρων από ασθενείς με ένα περιστατικό όγκου σε σύγκριση με τα ούρα από ασθενείς με υποτροπιάζοντα όγκου (Suppl. Πίνακας 3). Καμία σχέση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των επιμέρους δεικτών και το στάδιο του όγκου, αλλά

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

, και

ZNF154

ήταν πιο μετουσιωμένο σε βαθμό βλάβες III σε σύγκριση με βαθμού Ι αλλοιώσεις (ακριβής δοκιμασία του Fisher, P≤0.048) (Συμπλ. Πίνακας 4).

EOMES

,

POU4F2,

και

ZNF154

ήταν λιγότερο μετουσιωμένο σε όγκους με μέγεθος κάτω των 3 cm. (Ακριβής δοκιμασία του Fisher, P≤0.047) (Συμπλ. Πίνακα 4).

Η

Ανίχνευση υποτροπές από μεθυλίωση Μαρκαδόροι

Εμείς επικυρωθεί η κλινική χρησιμότητα των δεικτών για την παρακολούθηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Εμείς στρωματοποιημένη ανάλυση μας ώστε να περιλαμβάνει μόνο τους ασθενείς που εμφάνισαν αρχικά υπερμεθυλίωση ενός ή περισσοτέρων δεικτών μεθυλίωσης. Ανάλογα με το δείκτη που μελετήθηκαν, 11-18% των ασθενών που δεν παρουσίασαν μεθυλίωση στο πρώτο όγκο και ως εκ τούτου δεν είχε συμπεριληφθεί. Αυτό περιόρισε την ανάλυση σε 158 ασθενείς και 206 δείγματα ούρων από τις επισκέψεις παρακολούθησης? 139 δείγματα ούρων από ασθενείς με υποτροπιάζοντα όγκο της ουροδόχου κύστης και 67 δείγματα ούρων από ασθενείς χωρίς υποτροπή του όγκου (Πίνακας 1). Χρησιμοποιεί τα cut-σημείων που προσδιορίζονται αρχικά χρησιμοποιώντας τα ούρα από υγιή άτομα? πετύχαμε ευαισθησίες στην περιοχή από 87% έως 94%, και τις ιδιαιτερότητες στην περιοχή από 28% έως 47% (Πίνακας 3). Σε σύγκριση, η ευαισθησία της κυτταρολογίας ήταν 77% και η ειδικότητα ήταν 60%. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και κλινικοπαθολογική μεταβλητών για αυτήν την ομάδα ασθενών με υποτροπιάζουσα όγκους (Συμπλ. Πίνακα 5).

Η

Τα μοριακά τεστ μπορεί να έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με το χρυσό πρότυπο κυστεοσκόπηση. Για να αντιμετωπιστεί αυτό μπορούμε επομένως χρησιμοποιείται κυστεοσκόπηση αποτελέσματα από μια περίοδο 12 μηνών από την δειγματίστηκε τα ούρα. Βρήκαμε πολλά από τα δείγματα παλαιότερα ταξινομηθεί ως ψευδώς θετικά για να είναι αληθινό θετικά? απλά είχε μια θετική στιγμή, να οδηγήσει σε σύγκριση με κυστεοσκόπηση. Η ευαισθησία που λαμβάνεται κυμαινόταν από 88% έως 94%, και η ειδικότητα κυμάνθηκε από 43% έως 67% (Πίνακας 4). Συμπεριλαμβανομένων των όγκων διαγνωστεί κατά τη διάρκεια μιας περιόδου παρακολούθησης 12 μηνών και ο συνδυασμός δύο δεικτών με την προϋπόθεση ότι και οι δύο δείκτες ήταν θετικοί για ένα θετικό τεστ έχει ως αποτέλεσμα την ευαισθησία μειώθηκε (εύρος: 86-93%), ενώ η ειδικότητα αυξάνεται (εύρος: 50 έως 73 %). Εάν μόνο ένα από τα δύο δεικτών θα πρέπει να είναι θετική, η ευαισθησία αυξήθηκε (εύρος: 92-98%), ενώ η ειδικότητα μειώθηκαν (εύρος: 29 έως 60%) (.. Suppl Πίνακα 6 και Πίνακα 7 Suppl, αντίστοιχα). Συνολικά, οι συνδυασμοί των δεικτών δεν βελτίωσε τόσο την ευαισθησία και την εξειδίκευση των δοκιμών.

Η

προγνωστική αξία της μεθυλίωσης Μαρκαδόροι για την πρόβλεψη Αργότερα υποτροπές

Για να αντιμετωπιστεί η προγνωστική αξία των δεικτών μεθυλίωσης μας ανέλυσαν τα δείγματα ούρων από ασθενείς σε επισκέψεις όπου δεν όγκοι είχαν διαγνωστεί χρησιμοποιώντας κυστεοσκόπηση. Για όλους τους δείκτες διαπιστώσαμε ότι ένα θετικό δείκτη σε όγκο αρνητικό επίσκεψη συσχετίστηκε σημαντικά με μεταγενέστερη επανεμφάνιση του όγκου κατά τη διάρκεια της 24- και 60-μηνών περιόδους παρακολούθησης (δοκιμασία log-rank, P≤0.04) (Σχήμα 1 και Συμπλ. Εικόνα 3). Οι πιο σημαντικές διαφορές στην 24-μηνών χρονικό πλαίσιο παρατηρήθηκαν για

POU4F2

και

ZNF154

(δοκιμασία log-rank, P & lt? 0,0001), όπου μόνο το 12% (3/25) και 8% (2/26) χωρίς μεθυλίωση παρουσίασαν υποτροπή εντός 2 ετών, αντίστοιχα. Για τους μεθυλίωσης-θετικά δείγματα το ποσοστό των ασθενών με υποτροπή αργότερα ήταν 68% (21/31) για

POU4F2

και 63% (20/32) για

ZNF154

. Μονοπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι

HOXA9

(HR (95% CI) = 7,8 (1,8 έως 33,7)),

POU4F2

(HR (95% CI) = 8,5 (2,5 έως 28,5) ),

TWIST1

(HR (95% CI) = 12,0 (1,6 έως 88,6)),

VIM

(HR (95% CI) = 8,0 (2,4 έως 26,8)), και

ZNF154

(HR (95% CI) = 13,9 (3,3 έως 59,7)) ήταν σημαντικά σχετίζονται με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση. Την ηλικία, το φύλο, προηγούμενο στάδιο, προηγούμενο βαθμό, τα προηγούμενα πολλαπλότητα και η προηγούμενη ΚΑΚ δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (P & gt? 0,05). Κατά συνέπεια, η παρουσία μιας αλλαγμένης μεθυλίωση του DNA στα ούρα φάνηκε να σχετίζεται έντονα με την πρόγνωση.

μεθυλίωσης του DNA συνδέεται με επακόλουθη υποτροπή του όγκου εντός 24 μήνες για τους ασθενείς χωρίς όγκο, αλλά με μεθυλίωση θετικά δείγματα ούρων. Kaplan-Meier για της επιβίωσης χωρίς υποτροπή ως συνάρτηση της διχοτομήθηκε επίπεδα μεθυλίωσης για

EOMES

(P = 0.0397) (Α),

HOXA9

(P = 0.0009) (Β),

POU4F2

(P & lt? 0,0001) (C),

TWIST1

(P = 0.0017) (Δ),

VIM

(P = 0.0001) (Ε), και

ZNF154

(P & lt? 0,0001). (F)

η

ταυτοποίηση των ασθενών με πιθανή Επιγενετική πεδίο Ελάττωμα

Αν η μεθυλίωση των βιοδεικτών περιοριζόταν σε κακοήθη κύτταρα, θα πρέπει να ανιχνεύσει μόνο τους δείκτες στα ούρα όταν ένας όγκος ήταν παρούσα, ή που συμβαίνουν μέσα σε ένα ορατό μέλλον, ανάλογα με το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ακόμη και υψηλά επίπεδα ουρικής μεθυλίωσης θα μπορούσε να είναι παρούσα σε επισκέψεις χωρίς υποτροπές (Suppl Σχήμα 2, οι ασθενείς Γ και Δ?. Suppl. Σχήμα 3). Θα μπορούσαμε να προσδιορίσει μια ομάδα 15 ασθενείς (31%), στο οποίο μεθυλίωση ήταν παρούσα στα ούρα κατά την πρώτη επίσκεψη και συνέχισε να είναι παρούσα σε δείγματα ούρων που λαμβάνονται σε μετέπειτα επισκέψεις παρακολούθησης, αν και δεν προέκυψε όγκου. Ως παράδειγμα, ένας μεθυλίωση θετικό ασθενή με την πλέον παρατεταμένη παρακολούθηση διαγνώστηκε με CIS μετά 118 μήνες, αλλά δεν είχε αλλοιώσεις στο μεταξύ. Οι 15 ασθενείς με συγγενή τομέα, αλλά χωρίς υποτροπή, έχουν μια σημαντική μείωση του αριθμού των όγκων σε προηγούμενες επισκέψεις (P = 0,02) σε σύγκριση με τους ασθενείς με υποτροπή της νόσου.

Τροποποιημένο από τον Hermann GG et al. (https://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε μια ανεξάρτητη επικύρωση των

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM

, και

ZNF154

μεθυλίωσης για το ουροποιητικό διάγνωση στον τομέα της επιτήρησης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Έχουμε λάβει ευαισθησίες στην περιοχή 87% -93% και τις ιδιαιτερότητες της τάξης του 28% -47%. Όταν συμπεριλαμβανομένων των όγκων εκτομή σε μία περίοδο παρακολούθησης 12 μηνών που λαμβάνονται ευαισθησίες στην περιοχή 88% -94% και τις ιδιαιτερότητες της τάξης 43% -67%. ανάλυση παλινδρόμησης μονοπαραγοντική Cox έδειξε ότι οι δείκτες της μεθυλίωσης προβλεπόμενες μελλοντικές υποτροπές με αναλογίες κινδύνου στην περιοχή 7,8 – 13,9 (P≤0.015). Προηγούμενο στάδιο, τάξη, την πολλαπλότητα και την ΚΑΚ δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με την επανεμφάνιση του όγκου. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης ότι μερικοί ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης χωρίς υποτροπή εξακολουθούν να διατηρούνται παρεκκλίνουσα του ουροποιητικού μεθυλίωση που τους διέκρινε από τα άτομα ελέγχου. Πιστεύουμε ότι αυτό μπορεί να προκληθεί από μια γενική επιγενετικές βλεννογόνο ουροδόχου κύστης μεταβολή.

Οι έλεγχοι που εφαρμόζονται σε αυτή τη μελέτη ήταν από ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) ή πέτρες στην κύστη και το 43% των ελέγχων ήταν θετικοί νιτρώδες, υποδεικνύοντας λοιμώξεις της ουροδόχου κύστης. Ορισμένα από τα κύτταρα στα ούρα των ελέγχων μπορεί να προέρχεται από την υπερπλασία, ή μπορεί να είναι ανοσολογικά ή βακτηριακά κύτταρα. Παρόμοια δείγματα ελέγχου εφαρμόσθηκαν όταν οι δείκτες είχαν αρχικά διερευνήθηκαν ως δείκτες καρκίνου της ουροδόχου κύστης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συχνότητα μεθυλίωση των επιλεγμένων δεικτών είναι χαμηλή σε αυτούς τους τύπους κυττάρων [25], [26], [30]. Κύτταρα από τον προστάτη ή από μια μόλυνση της ουροδόχου κύστης μπορεί να εξακολουθούν να ωθούν τα επιτευχθέντα αποτελέσματα με αραίωση των κυττάρων του όγκου. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα δοκιμών. Βακτηριακές λοιμώξεις είναι πολύ λιγότερο συχνή και σε λοιμώξεις μελέτη μας δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με μεθυλίωση δείκτη, που δείχνει ότι οι λοιμώξεις δεν επηρεάζει την ευαισθησία δείκτη (Συμπλ. Πίνακα 4).

Αξίζει να σημειωθεί ότι μόνο το 9% των υποτροπές είναι βαθμού I. Ως εκ τούτου οι υπολογιζόμενες ευαισθησίες των δεικτών μπορεί να είναι υψηλότερη σε σύγκριση με ευαισθησίες που θα ληφθούν από μία διαδοχική σειρά ασθενών χαμηλού κινδύνου με ένα πολύ υψηλότερο αριθμό όγκων βαθμού Ι.

ένα από τα κύριες προκλήσεις χρήση του ουροποιητικού δείκτες είναι να πάρει επαρκή καρκινικά κύτταρα, και ενώ MethyLight είναι μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος είχαμε ακόμα να αποκλείσει 227 (35%) δείγματα από τη μελέτη λόγω ανεπαρκείς ποσότητες DNA. Παρατηρήσαμε ότι αν συμπεριληφθούν δείγματα με λιγότερα από 5 ng του DNA ως μήτρα στην ανάλυση, η ευαισθησία μειώθηκε, και για τους ασθενείς υπό επιτήρηση η εξειδίκευση αυξήθηκε. Με εξαίρεση των ασθενών με βάση την ποσότητα του DNA που εξάγεται από τις ακυρωθεί δείγματα ούρων, διατηρούμε την ακεραιότητα του προσδιορισμού MethyLight με το κόστος της εισαγωγής ενός προκατάληψη όπου αποκλείονται ειδικά ασθενείς με όγκους σταδίου Ta βαθμού Ι, όπως βαθμού αλλοιώσεις Ι απολέπιση το μικρότερο αριθμός κυττάρων [37] (ακριβής δοκιμασία του Fisher, Ρ & lt? 0,05) (Suppl. Πίνακας 1). Πρόσφατα, μια μελέτη από Zuiverloon et al. ανέφεραν αύξηση της ευαισθησίας του

FGFR3

μετάλλαξη ως δείκτης για επανεμφάνιση του όγκου από 75% έως 100%, όταν ο όγκος των ούρων που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή αυξήθηκε [38]. Με την αύξηση του όγκου των ούρων που συλλέγονται από τις τρέχουσες 10 έως 50 mL, λιγότερα δείγματα θα πρέπει να αποκλειστεί [39], [40]. Άλλες δυνατότητες για τη βελτίωση της ανάλυσης για την ανίχνευση μεθυλίωσης μπορεί να περιλαμβάνει την ανάλυση δύο ή περισσότερα δείγματα ξεχωριστά ή να χρησιμοποιήσετε μια άλλη τεχνολογία από MethyLight (π.χ. ένθετη PCR).

Η δοκιμή δείκτη μεθυλίωση μπορεί να συμπληρωθεί με

FGFR3

ανάλυση μετάλλαξης.

FGFR3

μεταλλάξεις είναι παρούσα σε περίπου 70% -80% του χαμηλού βαθμού NMIBC, και οι μεταλλάξεις στο

FGFR3

γονίδιο έχει δειχθεί ότι είναι ανιχνεύσιμη σε DNA από ακυρώνονται ούρα [41], [42]. Παρόμοια με την ανάλυση μεθυλίωσης, ο

FGFR3

ανάλυση βασίζεται σε DNA, και το πρωτογενές επίσκεψη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαστρωμάτωση για την παρουσία της μετάλλαξης. Πρόσφατες μελέτες με

FGFR3

μεταλλάξεις και μόνο για να ανιχνεύσει NMIBC υποτροπές αναφέρουν ευαισθησία 58% για ταυτόχρονη υποτροπές. Η ευαισθησία αυξήθηκε όταν συμπεριλήφθηκαν 12 μήνες παρακολούθησης [43]. Ο συνδυασμός του

FGFR3

μεταλλάξεων και των δεικτών μεθυλίωσης έχει δοκιμαστεί από Serizawa et al., Και παρατηρείται μια αύξηση στην ευαισθησία του DNA από ακυρωθούν τα ούρα κατά το συνδυασμό των δεικτών μεθυλίωσης και

FGFR3

μεταλλάξεις [44 ]. Είναι αξιοσημείωτο ότι παρατηρείται μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ υπερμεθυλίωσης και

FGFR3

μεταλλάξεις.

Το γεγονός ότι δεν βρίσκουν συσχετίσεις μεταξύ μεθυλίωσης και κλινικοπαθολογική μεταβλητές όταν χρησιμοποιούν μόνο τα ούρα από ασθενείς με υποτροπιάζουσα όγκων είναι ενδιαφέρουσα , αλλά μπορεί να είναι ότι η χαμηλότερη ευαισθησία που παρατηρείται σε όγκους χαμηλής κακοήθειας δεν προκαλείται μόνο από λίγα αποφλοιωμένα κύτταρα όγκου στα ούρα, αλλά μάλλον ότι η υπερμεθυλίωση δεν είναι παρόν στον όγκο ή στο περιβάλλον ουροθήλιο, και με διαστρωμάτωση για μεθυλίωση σε προγενέστερο επίσκεψη αυτοί οι ασθενείς αποκλείστηκαν. Είναι πιθανό ότι οι ασθενείς χωρίς μεθυλίωση πρέπει να θεωρηθούν ως ξεχωριστή ομάδα των όγκων της ουροδόχου κύστης. Τέλος, η έλλειψη σύνδεσης μεταξύ της μεθυλίωσης και κλινική-παθολογική μεταβλητές μπορεί επίσης να είναι συνέπεια της σχετικά μικρό σύνολο δεδομένων.

Οι δείκτες της μεθυλίωσης έχουν τιμές ειδικότητα στην κλίμακα 43% έως 67%, το οποίο είναι μικρό, ως ότι όλα έχουν μεταξύ 94% -100% ειδικότητα όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο των ατόμων. Ένα ισοδύναμο χαμηλή εξειδίκευση παρατηρήθηκε σε μια μελέτη που διερεύνησε τα επίπεδα του mRNA της hTERT, SENP1, PPP1CA, και MCM5 στα ούρα που λαμβάνονται από τους ασθενείς κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης της ασθένειας [45]. Χαμηλή εξειδίκευση παρατηρήθηκε επίσης με Zuiverloon et al. κατά τη μελέτη

FGFR3

μεταλλάξεις για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης υποτροπές [38]. Επιπλέον, η χαμηλή εξειδίκευση των δεικτών μεθυλίωσης είχε προηγουμένως αναφερθεί αλλού από δύο μελέτες που στοχεύουν στην ανίχνευση NMIBC υποτροπές [46], [47].

Η μεθυλίωση που παρατηρήθηκε σε δείγματα ούρων από κυστεοσκόπηση αρνητικά επισκέψεις μπορεί να έχει αρκετές πηγές, ( i) ένα μικρό όγκων δεν ανιχνεύεται με κυστεοσκόπηση, (ii) υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα στη θέση της εκτομής, ή (iii) μπορεί να είναι ένα σύμπτωμα της επιγενετικώς αλλαγμένο ουροθηλιακά κύτταρα που υπάρχουν στο ουροθήλιο που περιβάλλει τον όγκο ή σε άλλους χώρους (ελάττωμα πεδίο ) που δεν έχουν φαινότυπο για να τους διακρίνουν από τα φυσιολογικά κύτταρα ουροφόρων – μια επιγενετική ουροφόρων φαινότυπο methylator [14]. Μερικά από τα ψευδώς θετικών δειγμάτων με υποτροπή εντός 12 μηνών από την κυστεοσκόπηση προκαλούνται πιθανότατα από αποτυχημένη όγκους ή υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα, αλλά για το υπόλοιπο των ψευδώς θετικών δειγμάτων αυτή η εξήγηση δεν είναι πιθανό και τα αποτελέσματά μας αντιστοιχούν καλά με την παρουσία μιας κύστη πεδίο ελάττωμα. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι υπάρχει μια DNA υπερμεθυλίωση πεδίο ελάττωμα σε κύστες από ασθενείς π.Χ. όπου η κανονική-εμφανίζεται ιστός περιέχει διαδεδομένη μεθυλίωσης του DNA [14]. Wolff και συνεργάτες δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση δεν οφείλεται σε κλωνική επέκταση, αλλά αντ ‘αυτού προκαλείται από γενικευμένη επιγενετικές μεταβολές στο ουροθήλιο σε ολόκληρη την κύστη. Έχει προταθεί ότι αυτή η ευρέως διαδεδομένη στον τομέα της παρεκκλίνουσας μεθυλιωμένων κανονικής εμφανίζονται ουροθήλιο μπορεί να είναι η καταγωγή του υψηλού ποσοστού υποτροπής στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [14].

Με την ανακάλυψη των δεικτών μεθυλίωσης με πολύ υψηλή ευαισθησία, η εφαρμογή της δεικτών μεθυλίωσης στην επιτήρηση των ασθενών με χαμηλού βαθμού NMIBC φαίνεται πιθανό. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης, το επίπεδο μεθυλίωσης του κάθε δείκτη μεθυλίωσης πρέπει να καθοριστεί πριν ο δείκτης μπορεί να εφαρμοστεί για την επιτήρηση. Πριν από την επόμενη επίσκεψη ελέγχου, ο ασθενής μπορεί να παράσχει ένα δείγμα ούρων για ανάλυση, και υπάρχουν τρία πιθανά αποτελέσματα: i) εάν το τεστ είναι θετικό, ο ασθενής θα έχει μια κυστεοσκόπηση γίνεται και σε 67 ασθενείς από 100 υποτροπιάζοντα όγκο θα βρεθεί, ενώ οι υπόλοιποι 33 ασθενείς δεν θα έχουν υποτροπή του όγκου. Αυτό δεν είναι ένα σημαντικό πρόβλημα, καθώς τα ψευδώς θετικά ασθενείς θα είχε κυστεοσκόπηση γίνεται σε κάθε περίπτωση? ii) ένα αρνητικό τεστ θα επιτρέψει στους ασθενείς να παρακάμψετε την τρέχουσα κυστεοσκόπηση. Με την τρέχουσα απόδοση της ανάλυσης, οι 94 στους 100 ασθενείς π.Χ., με επανεμφάνιση του όγκου διαγνωστεί σωστά και έξι ασθενείς έχουν διαγνωστεί λανθασμένα ως μη έχοντα μια επανεμφάνιση του όγκου. Αυτό το ποσό των λανθασμένων αρνητικών είναι συγκρίσιμη με HAL-καθοδηγούμενη κυστεοσκόπηση και καλύτερα από το λευκό φως κυστεοσκόπηση, όπου μπορούν να αναμένονται 20 ασθενείς να διαγνωστεί λανθασμένα ότι δεν έχουν μια υποτροπή του όγκου [7] – [9]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη η

ZNF154

δείκτης δεν κατάφερε να διαγνώσει δύο μυς-διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης που προχώρησε από δύο όγκους βαθμού Τ1 III. Αυτό δεν θα ήταν αποδεκτό σε κλινικό περιβάλλον, και δείχνει ότι οι ασθενείς με υψηλό κίνδυνο εξέλιξης (π.χ. όλα τα Τ1, βαθμού ΙΙΙ όγκους, ή CIS) πρέπει να συνεχιστεί με την τακτική θεραπευτική αγωγή. Μια άλλη επιλογή θα μπορούσε να είναι να χρησιμοποιήσετε μια πιο συντηρητική cut-off. Με τον καθορισμό των τιμών αποκοπής ως η μέση τιμή συν 1x τυπική απόκλιση του επιπέδου μεθυλίωσης, οι δύο μυϊκή επιθετικοί όγκοι δεν θα έχουν χαθεί? iii) ένα δείγμα ούρων με ανεπαρκή DNA θα πρέπει να οδηγήσει στη συνέχιση του αρχικού θεραπευτικού σχήματος. Σε όλες τις τρεις περιπτώσεις ο ασθενής θα παράσχει ένα νέο δείγμα ούρων πριν από την επόμενη επίσκεψη ελέγχου που θα καθορίσει κατά πόσον ή όχι ο ασθενής πρέπει να έχει μια κυστεοσκόπηση εκτελείται. Οι δείκτες της μεθυλίωσης μπορεί επίσης να αυξήσει το ποσοστό ανίχνευσης του CIS βλάβες, όπως ένα θετικό τεστ με αρνητική κυστεοσκόπηση θα μπορούσε στη συνέχεια να ακολουθήσει άλλη κυστεοσκόπηση συμπεριλαμβανομένων των HAL.

Εν κατακλείδι, εφαρμόζοντας ένα πολύ ευαίσθητο και ημι-ποσοτική μεθοδολογία για την ανίχνευση υποτροπές του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και διαστρωμάτωση για την κατάσταση μεθυλίωσης του αρχικού όγκου, έχουμε δείξει ότι η χρήση ενός μόνο δείκτη (

ZNF154

) μπορούμε να διακρίνουμε μια ταυτόχρονη επανεμφάνιση του όγκου με ευαισθησία 94% και ειδικότητα 67 %. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της EAU για NMIBC, το σημερινό καθεστώς θεραπείας για NMIBC ασθενείς χαμηλού κινδύνου είναι κυστεοσκόπηση στους 3 και 12 μήνες μετά την TUR και στη συνέχεια κάθε χρόνο για 4 επιπλέον έτη [48]. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι δείκτες μεθυλίωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτες της υποτροπής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης για να μειωθεί ο αριθμός των κυστεοσκοπήσεων σε ασθενείς χαμηλού κινδύνου χωρίς ταυτόχρονη όγκου (Σχήμα 2) και κατά συνέπεια να βελτιώσει την ποιότητα ζωής για τους ασθενείς, καθώς και μείωση της υγειονομικής περίθαλψης δαπανών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

διάγραμμα ροής που απεικονίζει τη ροή των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της μελέτης.

doi: 10.1371 /journal.pone.0046297.s001

(EPS)

Εικόνα S2.

Παραδείγματα επίπεδα μεθυλίωσης κατά την πρώτη επίσκεψη και δύο επόμενες επισκέψεις για 5 ασθενείς με ή χωρίς υποτροπές. Οι ασθενείς με δύο διαδοχικές υποτροπές (Α και Β). Ασθενής χωρίς υποτροπές κατά την πρώτη επίσκεψη ελέγχου, αλλά υποτροπή σε ένα μεταγενέστερο επισκέψεις ελέγχου (C και D). Ένας ασθενής χωρίς μετέπειτα υποτροπές (Ε). PMR είναι το ποσοστό της σχετικής αναφοράς. Η τιμή 0% σημαίνει ότι δεν μεθυλίωση και μια αξίας 100% σημαίνει πλήρως μεθυλιωμένα. Μια σκοτεινή γραμμή αντιπροσωπεύει μια επίσκεψη με ταυτόχρονη όγκου και μια γκρίζα γραμμή αντιπροσωπεύει μια επίσκεψη χωρίς όγκου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046297.s002

(EPS)

Εικόνα S3.

Kaplan-Meier πλοκή του χρόνου μέχρι την υποτροπή. Η μεθυλίωση του DNA συνδέεται με επακόλουθη υποτροπή του όγκου μέσα σε 60 μήνες για τους ασθενείς χωρίς όγκο αλλά με μεθυλίωση θετικά δείγματα ούρων.