Αφηρημένο

Τα νανοσωματίδια χρυσού (ΑΕΠ) έχουν δείξει ελπιδοφόρα ιατρικές εφαρμογές στη θεραπεία του καρκίνου που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής ισορροπίας οξειδοαναγωγής. Προηγουμένως, έχουμε αναφέρει ότι ΑΕΠ μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και νέκρωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Α549) όταν L-μπουθειονίνης-σουλφοξιμίνη (BSO) χρησιμοποιήθηκε για να μειώσουν την έκφραση της ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης (GSH). Στο παρόν, ερευνήσαμε την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ έναντι του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων κάτω από το γλουταμινικό κυστεΐνη λιγάση καταλυτική υπομονάδα (GCLC) σίγησε με siRNA. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΑΕΠ προκαλέσει απόπτωση και νέκρωση σε κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA ανυψώνοντας ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Τα ευρήματα έδειξαν ότι η ρύθμιση της σύνθεσης της γλουταθειόνης από GCLC siRNA σε κύτταρα Α549 μπορεί να κινήσει τη νανοσωματίδια χρυσού που προκαλείται κυτταροτοξικότητα

Παράθεση:. Liu Μ, Zhao Υ, Ζανγκ Χ (2015) Νοκ ντάουν της Γλουταμινικό κυστεΐνη Λιγάσης καταλυτική υπομονάδα με siRNA Προκαλεί το νανοσωματίδια χρυσού-Induced κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10.1371 /journal.pone.0118870

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Πορτογαλία

Ελήφθη: 25η Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 11 Ιαν 2015? Δημοσιεύθηκε: 19, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81102468 με το Υ Zhao). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατα, το ενδιαφέρον για νανοσωματίδια χρυσού (ΑΕΠ) για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου, όπως φορείς χορήγησης φαρμάκων [1], με στόχο κυττάρων φορείς [2], απεικόνισης [3], ραδιοευαισθητοποίηση [4-7], και μη επεμβατικές θεραπείες εκτομή [8, 9], έχει αυξηθεί σημαντικά. ΑΕΠ προσφέρει πλεονεκτήματα σε αυτές τις εφαρμογές, λόγω της εξαιρετική βιοσυμβατότητα τους [10], ισχυρή απορρόφηση φωτός και σκέδασης αποτέλεσμα [11], το ποσοστό μετατροπής υψηλής φωτοθερμικών και photostability [12-14], εύκολη βιοσύζευξης και βιοτροποποίηση [15]. Επιπλέον, η χρήση του ΑΕΠ ως αντικαρκινικών παραγόντων έχει μελετηθεί εκτενώς. Διάφορες προσπάθειες να ενσωματώσει ΑΕΠ σε θεραπείες για τον καρκίνο έχουν γίνει.

Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), το πιο άφθονο ενδοκυτταρική θειόλη, είναι σημαντική για τη διατήρηση της ενδο-κυτταρική ισορροπία οξειδοαναγωγής και εμπλέκεται στην αποτοξίνωση των εξωγενών και ενδογενών ουσιών όπως ξενοβιοτικών, ιονίζουσα ακτινοβολία, οργανικά υπεροξείδια και τα βαρέα μέταλλα [16,17]. Έχει αποδειχθεί ότι μια επιθετική όγκου μπορεί να είναι ευαίσθητη σε φάρμακα με τη χρήση ενός θεραπεία βασίζεται στη διαμόρφωση των επιπέδων GSH σε καρκινικά κύτταρα [18]. Είναι καλά γνωστό ότι η γλουταθειόνη συντίθεται από τα συστατικά αμινοξέα του σε δύο διαδοχικές, που καταλύεται από συνθετάση glutamylcysteine ​​(GCL) και GSH συνθάσης. GCL αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα (GCLC) και μια ρυθμιστική υπομονάδα (GCLM), το οποίο καταλύει το πρώτο και περιοριστικό του ρυθμού στάδιο και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ομοιόσταση της γλουταθειόνης [19]. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH μπορούν να εξαντληθούν μέσα από την ειδική αναστολή του GCL. L-μπουθειονίνης-σουλφοξιμίνη (BSO), ένας αναστολέας της GCL, είναι γνωστό ότι καταστρέφουν την ενδοκυτταρική δεξαμενή γλουταθειόνης και έτσι να προκαλέσει οξειδωτικό στρες [20]. Μεταβολές στις ειδικές δραστηριότητες των ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό GSH στα καρκινικά κύτταρα έχουν ενοχοποιηθεί σε οξειδωτικό στρες και η εξάντληση σε GSH μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε άλλα επιβλαβή γεγονότα [21-23]. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι ΑΕΠ οθόνη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα όταν L-μπουθειονίνης-σουλφοξιμίνη (BSO) χρησιμοποιήθηκε για να μειώσουν την έκφραση της ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης [24]. Έτσι, τα νανοσωματίδια χρυσού μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες με τη ρύθμιση των επιπέδων της γλουταθειόνης σε καρκινικά κύτταρα. Ενώ, BSO είναι ένα είδος εξωγενών ενώσεων. Η επίδραση του BSO επί κυττάρων λειτουργία είναι απρόβλεπτη. Στην παρούσα εργασία, εκτιμήσαμε την επίδραση της GCLC siRNA για ΑΕΠ-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχει καμία μελέτη για την αξιολόγηση των ρόλων των GCLC siRNA στο ΑΕΠ που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης είναι να χαρακτηρίζουν την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, όταν GCLC χτυπήθηκε κάτω από siRNA.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

κύτταρα Α549 (Shanghai Τράπεζας κυττάρων, Type Culture Collection επιτροπή, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, αριθμός γάτα: TCHu150) διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 4,5 g /L γλυκόζη, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 10% θερμικά απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

Η επιμόλυνση του siRNA σε Α549 κυτταρική γραμμή

γονιδιακή σίγηση του GCLC διεξήχθη χρησιμοποιώντας siRNA knockdown σύστημα . Ένα μη ειδικό έλεγχο siRNA duplex [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘], GCLC siRNA-1 duplex [5′-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (dTdT) -3′], GCLC siRNA-2 duplex [5’-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (dTdT) – 3 ‘] και GCLC siRNA-3 duplex [5′-GUAGUAUUCUGAACUACCU (dTdT) -3’] αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 ανά φρεάτιο. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα (~ 60-70% συρροή) σε κάθε φρεάτιο μορφομετατράπηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα, GCLC siRNA (75pmol σε ελεύθερο από FBS RPMI1640) χρησιμοποιώντας Thermo Scientific DharmaFECT Μορφομετατροπή Αντιδραστήρια (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια μέρα αργότερα, το μέσο αλλάχθηκε σε κανονικό μέσο ανάπτυξης και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 48 ώρες. Τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέγονται και χρησιμοποιούνται για PCR, ανάλυση στυπώματος western, και GSH μέτρηση των επιπέδων [25-27].

παρασκεύασμα RNA και ημιποσοτική RT-PCR

ποσοτικαί RT-PCR με β- ακτίνης ως ένας εσωτερικός έλεγχος διεξήχθη για να εξεταστεί η μεταβολή στην έκφραση του mRNA της GCLC σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με siRNAs. Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [28]. Το απομονωμένο RNA (2 μα) από siRNAs επεξεργασμένα κύτταρα μεταγράφηκε αντίστροφα σε μονόκλωνο cDNA σε ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει: 10 mmol /L dNTP, 1 μg ολίγο (dT) εκκινητή, 20 ΙU ΚΝασίνη και 200IU M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση. PCR ενίσχυση διεξήχθη με cDNA 0,4 μg σε έναν όγκο αντίδρασης που περιέχει 3pmol κάθε ειδικής ολιγονουκλεοτιδικού εκκινητή, 10 mmol /L dNTP, και 1.5IU Taq DNA πολυμεράση. Για όλες τις αντιδράσεις, προκαταρκτικά πειράματα για να προσδιοριστεί ο αριθμός των κύκλων PCR κατά την οποία πραγματοποιήθηκε κορεσμός, και τα πειράματα που αναφέρονται έγιναν με έναν αριθμό κύκλων που προηγούνται κορεσμό. Οι αλληλουχίες των εκκινητών για GCLC και έκφραση β-ακτίνης αναλύσεις ήταν: GCLC, προς τα εμπρός εκκινητής: 5′-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 ‘. Η μονάδα θερμικού κυκλοποιητή προγραμματίστηκε για 36 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. β-ακτίνη, εμπρόσθιος εναρκτήρας: 5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ‘. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2% (Sigma-Aldrich) και οπτικοποιήθηκαν μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο επί υπεριώδες φως [29].

κηλίδωση Western

Για την ανίχνευση GCLC, κύτταρα που αναπτύσσονται σε έξι -Καλά πλάκες επωάστηκαν με αρνητικό duplex ελέγχου και GCLC siRNA διπλής όψης για 24 ώρες, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με κανονικό μέσο ανάπτυξης για επιπλέον 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Μια ποσότητα πρωτεΐνης 30 μg εκάστου δείγματος αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό φόρτωσης, επωάστηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά και διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE. Στη συνέχεια, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μία PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) μεμβράνη και δεσμεύτηκαν με 5% (w /v) αποβουτυρωμένο γάλα διαλυμένο σε TBS + 0,05% (ν /ν) Tween-20 (TBST) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύθηκαν με GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), ή β-ακτίνη (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology) σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα (1: 4000 αντι-κουνελιού, Cell Signaling Technology) για μία ώρα, πλύθηκαν 3 φορές με TBST και οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ECL (Thermo Scientific) [30]

.

Σύνολο επίπεδα ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης (GSH)

περιεχόμενο Cellular GSH αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας γλουταθειόνη Ποσοτικοποίηση Kit (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας). 5, 5′-διθειοδις (2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB) και GSH αντιδρούν για να δημιουργήσει 2-νιτρο-5-θειοβενζοϊκό οξύ και δισουλφίδιο γλουταθειόνης (GSSG). Επειδή 2-νιτρο-5-θειοβενζοϊκό οξύ είναι ένα κίτρινου χρώματος προϊόν, η συγκέντρωση GSH σε δείγματα μπορεί να μετρηθεί στα 412 nm απορρόφηση με αναγνώστη πλακός με πολλές εκβαθύνσεις. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αρνητικό μάρτυρα ή τρεις duplex GCLC siRNA για 24 ώρες, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης για επιπλέον 48 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση σε 1000 rpm για 5 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 0.2% Triton Χ-100. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 13.000 στροφές για 10 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συνολικής συγκεντρώσεων γλουταθειόνης. εξάντληση της γλουταθειόνης στα κύτταρα αντιμετωπίζονται GCLC siRNA αναφέρθηκε [31].

Η κυτταροτοξικότητα μέτρηση

Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε μέσω μέτρησης κυττάρων. Παρατηρήσαμε ότι η αναστολή της GCLC siRNA-1duplex είναι η πιο σημαντική μεταξύ των τριών GCLC siRNA διπλής όψης. Έτσι, τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC-ειδικό siRNA-1, και στη συνέχεια εκτίθενται σε διαφορετικές δόσεις του ΑΕΠ για επιπλέον 72 ώρες. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη με διάλυμα θρυψίνης /ΕϋΤΑ και επαναιωρήθηκαν σε τελικό όγκο ένα μέσο κυτταρικής 2 mL για περαιτέρω μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Οι αριθμοί των κυττάρων σε κάθε δείγμα μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας ένα σύνολο Μετρώντας Επιμελητήριο (Qiujing Inc) [32].

Η ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου

μέτρησης

Η παραγωγή των ROS μετρήθηκε με τη χρήση 2, 7-dichlorodihydro φθορισμού διοξικής (DCFH-DA, Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας). DCFH-DA εισέρχεται παθητικά τα κύτταρα, κυτταρικά εστεράσες δρουν επί του μορίου για να σχηματίσουν το μη-φθορίζουσα ομάδα DCFH, η οποία είναι ιοντικής φύσεως και, ως εκ τούτου, παγιδεύεται μέσα στα κύτταρα. Μία αντίδραση με ROS οδηγεί σε οξείδωση του DCFH της εξαιρετικά φθορίζουσα ένωση dichloroflourescein (DCF). Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα, GCLC siRNA-1 χρησιμοποιώντας Thermo Scientific Ντάρμα fect Επιμόλυνση Αντιδραστήρια. Μία ημέρα αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΕΠ (20μΜ), ΑΕΠ (20μΜ) και εξωγενείς GSH (1 mM) ή ΑΕΠ (20μΜ) και ROS καθαριστής Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC, 1 mM) για επιπλέον 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ DCFH-DA. Μετά επωάστηκε για 30 λεπτά, τα κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη, συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων (50 000) από κάθε φρέαρ μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο φθορισμού (Thermo Scientific), με διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 488 και 525 nm, αντίστοιχα [33].

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης και νέκρωση

αποτέλεσμα την καταμέτρηση των κυττάρων έδειξαν ότι ΑΕΠ είχε ανασταλτική λειτουργία στην επιμολυσμένα επιβίωση των κυττάρων. Ερευνήσαμε κατά πόσο ο λόγος αυτής της αναστολής είναι είτε πρώιμη απόπτωση ή αργά απόπτωση /νέκρωση. Αυτά τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου Αηηβχίην και χρώση ΡΙ (Invitrogen) με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΑΕΠ, ΑΕΠ και GSH, ΑΕΠ και NAC. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επωάστηκαν με AnnexinV-FITC και ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τουλάχιστον 1 × 10

4 κύτταρα αναλύθηκαν ανά δείγμα, και οι ρυθμίσεις τεταρτημόριο βασίστηκαν στα δείγματα ελέγχου. Ζωντανά κύτταρα είναι αρνητικά τόσο για ιωδιούχου προπιδίου (PI) και Annexin V, πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων είναι PI αρνητικά, αλλά Αηηβχίην θετική, ενώ αργά αποπτωτικών νεκρωτική κύτταρα /είναι θετικά τόσο για PI και Αηηβχίην. Όλα αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμου λογισμικού Cell Quest (BD Bioscience).

μεμβράνη μιτοχονδριακού δυναμικού και ενδοκυτταρική διασπασμένη κασπάση 3

δοκιμασία

JC-1 (5, 50, 6, 60-τετραχλωρο-1, 10, 3, 30-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin ιωδίδιο, Beyotime Institute Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της μεταβολής του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Α549 κύτταρα στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης απλώθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6-πηγαδιών και επωάζονται για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC-ειδικό siRNA-1. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΑΕΠ (20μΜ) για 72 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με JC-1 για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 37 ° C. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής [34].

Για ενδοκυτταρική διασπασμένη κασπάση 3, τα επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς ΑΕΠ συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Μετά από επεξεργασία με 0.1% Triton Χ-100 και δεσμεύτηκαν με 1% BSA, τα κύτταρα επωάστηκαν με διασπασμένης κασπάσης-3 (Asp175) αντίσωμα (Alexa fluor 488 συζυγούς, Cell Signaling Technology) για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής [24].

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές διαφορές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και έλεγχος τ με το λογισμικό Prism (GraphPad Software, Inc.). P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική, και τα δεδομένα σημάνθηκαν με (*) για την P & lt? 0.05, (**) για την P & lt? 0,01, και (***) για την P & lt? 0.001, αντίστοιχα. Κάθε ομάδα εξετάστηκε εις τριπλούν, και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Αποτελεσματικότητα των siRNAs έναντι των καταλυτικών υπομονάδων GCL

Για να διερευνηθεί η επίδραση της knockdown τρεις αλληλουχίες 19-νουκλεοτιδίων για καταλυτικές υπομονάδες GCL, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC siRNA επί 24 ώρες, ακολουθούμενη από καλλιεργούνται για επιπλέον 48 ώρες σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση GCLC mRNA. Τα επίπεδα mRNA του GCLC μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με GCLC siRNA. Αντίθετα, αρνητικός έλεγχος-siRNA ήταν λιγότερο ισχυρή (Εικ. 1Α). Σε όλα τα κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA, τα επίπεδα mRNA του GCLC ομοιογενές χωρίς σημαντική απόκλιση. Εν τω μεταξύ, εκτιμήσαμε την αποτελεσματικότητα του GCLC siRNA αναλύοντας την ικανότητα τους να παρεμβαίνουν με τις εκφρασμένες πρωτεΐνες με στύπωμα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, GCLC siRNA ανέστειλε σημαντικά την έκφραση των GCLC πρωτεΐνης σε κύτταρα Α549. Τα τρία διαφορετικά siRNA για την καταλυτική GCL υπομονάδες διαφορικά διαταραχθεί η έκφραση του GCLC σύγκριση με αρνητικό έλεγχο siRNA και τη GCLC siRNA-1 ήταν μεταξύ των πιο αποτελεσματική.

(α) Επίπεδα GCLC mRNA σε κύτταρα Α549 επόμενες 24 ώρες επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 και GCLC siRNA-3. GCLC siRNA μείωσε σημαντικά τα επίπεδα GCLC mRNA σε κύτταρα Α549. (Β) Αντιπρόσωπος Western blot έγγραφα gel για GCLC και συνοπτικά στοιχεία που δείχνουν ότι η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής αποσιώπησης της GCLC με siRNA. Κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών απομονώθηκαν από τα επιμολυσμένα κύτταρα. επίπεδα πρωτεΐνης GCLC σε κυτταρικά εκχυλίσματα μετρήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western και ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα έκφρασης. *** P & lt?. 0.001, σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα

Η

Επίδραση των GCLC siRNA σε ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH σε Α549 κύτταρα

GCLC είναι απαραίτητη για την βιοσύνθεση της γλουταθειόνης, η οποία διατηρεί τις συγκεντρώσεις γλουταθειόνης στο ακέραια κύτταρα. Έχουμε δείξει ότι το siRNA που στοχεύουν ενάντια καταλυτικές υπομονάδες GCL μειώνουν τα επίπεδα mRNA του GCLC και αναστέλλουν την έκφραση του GCLC πρωτεΐνης σε κύτταρα Α549. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η εξειδίκευση και η αποτελεσματικότητα του GCLC siRNA, με την επίδραση των GCLC siRNA σε ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH μετρήθηκε [32]. Όπως αναμένεται, σε σύγκριση με ομάδα αρνητικού ελέγχου, GCLC siRNA μείωσε προφανώς τα επίπεδα GSH και η GCLC siRNA-1 είναι η πιο σημαντική (Σχ. 2), η οποία είναι η αλληλογραφία με τα αποτελέσματα που έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως. Εν όψει αυτών των αποτελεσμάτων, GCLC siRNA-1 χρησιμοποιήθηκε στα επόμενα πειράματα. Knock-down πειράματα έδειξαν ότι GCLC siRNA επηρεάσει την έκφραση του GCLC και οδήγησε σε μια σημαντική μείωση της παραγωγής GSH.

κυτοσόλιο απομονώθηκε από κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 και GCLC siRNA-3. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH προσδιορίστηκαν στα 412 nm απορρόφηση με αναγνώστη πλακός με πολλές εκβαθύνσεις. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ποσοστό αρνητικού ελέγχου (n = 3) ± SD για 4 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα

Η

Η GCLC siRNA ρυθμίζει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από ΑΕΠ

περιεχόμενο Σύνολο GSH μειώθηκε σε σημαντικό βαθμό στην κύτταρα Α549 επιμολυσμένα με GCLC siRNA. Όταν BSO χρησιμοποιήθηκε για να μειώσουν την έκφραση της γλουταθειόνης στα κύτταρα Α549, ΑΕΠ έδειξε εμφανή κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα [32]. Ωστόσο, η επίδραση του GCLC siRNA για την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ είναι ακόμα άγνωστη. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν ΑΕΠ τροποποιημένων κυττάρων Α549 επιβίωσης κατά siRNA μεσολάβηση διακοπή της δραστηριότητας GCLC. Με βάση τα αποτελέσματα του knock-down πειράματα, τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με αρνητικό μάρτυρα-siRNA ή GCLC siRNA-1, και στη συνέχεια εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις του ΑΕΠ. Ως πείραμα ελέγχου, GCLC siRNA δεν προκάλεσε αξιοσημείωτη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα Α549 (S1 Εικ.). Ενώ, παρατηρήσαμε ότι ΑΕΠ δοσοεξαρτώμενο ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 προκατεργάστηκαν με GCLC siRNA-1. Σε σύγκριση με ομάδα αρνητικού ελέγχου, η επεξεργασία των Α549 κυττάρων με 50 μΜ ΑΕΠ οδήγησε σε μειωμένα σημαντικά τον πληθυσμό των βιώσιμων κυττάρων μετά καταστρέφουν ενδοκυτταρική GSH (Εικ. 3).

Τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC siRNA- 1 για 24 ώρες, ακολουθούμενη από καλλιεργούνται για επιπλέον 3 ημέρες απουσία του ΑΕΠ, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD = 4) τριπλών προσδιορισμών. * P & lt?. 0,05 έναντι αρνητικού ελέγχου

Η

ΑΕΠ επαγόμενη κυτταροτοξικότητα συνδέεται με αύξηση της ενδοκυτταρικής ROS στα κύτταρα αντιμετωπίζονται GCLC siRNA

Από ROS έχει προταθεί ως κρίσιμος παράγοντας στην προσδιορισμός του τρόπου θανάτου των κυττάρων. Ερευνήσαμε περαιτέρω εάν ROS συμμετέχουν στη ρύθμιση του ΑΕΠ κυτταρικό θάνατο που επάγεται όταν τα κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, μετά την φίμωση έκφραση GCLC με siRNA-1, ΑΕΠ οδήγησε σε περίπου 7-πλάσια αύξηση των επιπέδων των ROS σε σύγκριση με εκείνη σε ομάδα αρνητικού ελέγχου. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA GCLC μόνο, η επίδραση της παραγωγής ROS δεν παρατηρήθηκε σε απουσία ΑΕΠ (S2 Εικ.). Εξωγενείς GSH και NAC κατέστειλε σημαντικά ΑΕΠ που προκαλείται από την παραγωγή ROS, το οποίο θα μπορούσε να προστατεύσει GCLC siRNA αντιμετωπίζονται τα κύτταρα από την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ. Αυτά τα αποτελέσματα σημαίνουν ότι η κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ είναι τουλάχιστον εν μέρει συνδέονται με την αύξηση των επιπέδων ROS σε GCLC siRNA 1 προεπεξεργασμένων κύτταρα (Σχ. 4).

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο και GCLC siRNA- 1 για 24 ώρες, μετά από αγωγή με ΑΕΠ (20μΜ), ΑΕΠ (20μΜ) και GSH (1mm), ΑΕΠ (20μΜ) και NAC (1mm). Μετρήθηκαν τα επίπεδα ROS. Γραφήματα δείχνουν ROS (όπως προσδιορίζεται με DCF) επίπεδα (%) σε σύγκριση με κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD = 4) τριπλών προσδιορισμών. ** P & lt? 0,01

Η

ΑΕΠ ξεκινήσει απόπτωσης και νέκρωσης στα κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA

Τα στοιχεία που ΑΕΠ προκαλεί κυτταρικό θάνατο και να ενισχύσει την παραγωγή της ενδοκυτταρικής ROS μας ώθησε να εξετάσει περαιτέρω αν ΑΕΠ να προκαλέσει απόπτωση και νέκρωση στα κύτταρα επεξεργασμένα GCLC siRNA. Διπλή χρώση των κυττάρων με Annexin V-FITC και ΡΙ χρησιμοποιούνται για να διακρίνουν αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων από τα φυσιολογικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, ΑΕΠ αυξήθηκε το ποσοστό των κυττάρων Αηηβχίην-βάφονται όταν τα επίπεδα γλουταθειόνης μειώθηκαν κατά φίμωση της έκφρασης GCLC. Ο πληθυσμός του συνόλου των PI θετικών κυττάρων, η οποία περιλαμβάνει την απόπτωση και νέκρωση, ήταν επίσης σημαντικά αυξημένο σε GCLC siRNA και ΑΕΠ επεξεργασμένα κύτταρα. Η θεραπεία με GCLC siRNA μόνο δεν αύξησε τον πληθυσμό της απόπτωσης και νέκρωσης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (S3 Εικ.). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι ΑΕΠ επηρεάζει σχετικώς Annexin V-ΡΙ αριθμός χρώση των κυττάρων σε κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA. Για να εξεταστεί εάν η απόπτωση ή νέκρωση ενεργοποιήθηκε με ROS, χρησιμοποιήσαμε το εξωγενές GSH και NAC. Η θεραπεία με GSH και NAC τόσο κατέστειλε σημαντικά την εμφάνιση της αννεξίνης V και ΡΙ θετικών κυττάρων που επάγεται από ΑΕΠ σε κύτταρα κατεργασμένα GCLC siRNA (Εικ. 5). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΑΕΠ κινήσει απόπτωση και νέκρωση με την ανύψωση των επιπέδων ενδοκυτταρικής ROS στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα προκατεργάστηκαν με GCLC siRNA.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο είτε μη στόχους siRNA ή GCLC-ειδικό siRNA-1. Μία ημέρα αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΕΠ (20μΜ), ΑΕΠ (20μΜ) + GSH (1 mM) και ΑΕΠ (20μΜ) + NAC (1 mM) για επιπλέον 72 ώρες. Αηηβχίην-FITC και ΡΙ τα κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α) Το μοτίβο του φθορισμού Αηηβχίην-FITC και ΡΙ-χρώση κυττάρων Α549 μετά την επεξεργασία. (Β) Ποσοστό Αννεξίνη V θετική ή ΡΙ θετικών κυττάρων για διάφορες θεραπείες. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD n = 3). ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001, έναντι του ελέγχου

Η

ΑΕΠ προκαλέσει η εκπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε GCLC siRNA επεξεργασμένα κύτταρα

Επειδή αποπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στην απόπτωση [35], εξετάσαμε αν ΑΕΠ μεταβάλλεται το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA-1. Το φθορίζον ανιχνευτής JC-1 βαφής χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η μεταβολή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη μετατόπιση φθορισμού (κόκκινο σε πράσινο) των δειγμάτων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Παρατηρήσαμε ότι η ΑΕΠ προκάλεσε αύξηση σε πράσινο /κόκκινο ένταση φθορισμού στα κύτταρα αντιμετωπίζονται GCLC siRNA (Εικ. 6). Ενώ, κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA απουσία ΑΕΠ δεν έδειξαν μεταβολή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, όπως σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (S4 Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επαγωγή της απόπτωσης και νέκρωσης με ΑΕΠ σε GCLC siRNA προεπεξεργασία κυττάρων είναι στενά συνδεδεμένο με το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης.

Μετά επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα siRNA ή GCLC siRNA-1, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΕΠ (20μΜ ) για επιπλέον 72 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται και χρωματίζονται με JC-1 στο σκοτάδι στους 37 ° C, ξεπλένονται με PBS. Η μετατόπιση φθορισμού (κόκκινο σε πράσινο) των δειγμάτων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD = 4) τριπλών προσδιορισμών. *

σ

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου

Η

ΑΕΠ επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε κύτταρα επιμολυσμένα με GCLC siRNA

μιτοχονδριακού-εξαρτώμενη απόπτωση ξεκινά με την πρόσληψη και την ενεργοποίηση της κασπάσης [36]. Έτσι, ζητάμε περαιτέρω εάν κασπάσης-3 ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια ΑΕΠ επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα επεξεργασμένα GCLC siRNA. Όταν η ασταθής κυτοσολικό πισίνα GSH ήταν εξαντλημένο από GCLC siRNA, κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ΑΕΠ. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα που αναγνωρίζουν τον ιδιαίτερα διασπασμένο και ενεργοποιημένη μορφή με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, ΑΕΠ αυξήθηκε σημαντικά κασπάσης-3 δραστηριότητες σε κύτταρα επεξεργασμένα GCLC siRNA. GCLC siRNA μόνη επηρεάστηκε ελάχιστα τη δραστηριότητα της cascase-3 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (S5 Εικ.). Ως εκ τούτου, ΑΕΠ απόπτωση που επάγεται κυρίως μέσω της μιτοχονδριακής οδού που εξαρτάται κασπάσης.

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα με κυτταρομετρία ροής. Η ενδοκυτταρική GSH ήταν εξαντλημένο από GCLC siRNA-1, μετά από περίπου 72 ώρες επεξεργασίας ΑΕΠ, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,1% Triton Χ-100 και δεσμεύτηκαν με 1% BSA, στη συνέχεια επωάζεται με διασπασμένης κασπάσης-3 αντίσωμα (Asp175) ( Alexa φθορίου 488 συζευγμένο) για 30 λεπτά. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD = 4) τριπλών προσδιορισμών. *

σ

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου

Η

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, η επαγωγή της απόπτωσης λόγω μεταβολών στην ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση ορισμένων οξειδωτική ή μη-οξειδωτική ερεθίσματα έχει γίνει το επίκεντρο της εκτεταμένης έρευνας [23, 25, 37, 38]. ROS και GSH είναι οι δύο μεγάλες καθοριστικούς παράγοντες της ισορροπίας κυτταρικής οξειδοαναγωγής. ROS συχνά προκαλούν κυτταρική βλάβη και να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο, ειδικά σε υψηλή συγκέντρωση. Φαρμακολογικές εξάντληση της GSH με BSO ευαισθητοποιεί ιδιαίτερα τα καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση που επάγεται από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ως εκ τούτου, ο χειρισμός της κατάστασης της κυτταρικής οξειδοαναγωγής αντιπροσωπεύει μια βιώσιμη στρατηγική για την επαγωγή απόπτωσης με αντικαρκινικούς παράγοντες. Εν τω μεταξύ, νανοσωματίδια χρυσού στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου έχουν γίνει η διεθνής έρευνα hot spot. Προηγουμένως, βρήκαμε ότι η GSH μεταβολικό μονοπάτι εμπλέκεται άμεσα στην αποτοξίνωση του ΑΕΠ [24]. Όταν η ενδοκυτταρική έκφραση GSH ανεστάλη με BSO, η κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ ήταν προφανής. ΑΕΠ επάγουν κυτταρικό θάνατο από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε κύτταρα Α549 με χαμηλή ενδοκυτταρική γλουταθειόνη [24, 32]. Geng F και συνεργάτες ανέφεραν ότι η αλληλεπίδραση της ακτινοβολίας ακτίνων Χ με ΑΕΠ επαγόμενη αυξημένα επίπεδα παραγωγής ROS είναι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους μπορεί να ενισχύσει ΑΕΠ ακτινοθεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών [39]. Το οξειδωτικό στρες συμβάλλει σε νανοσωματίδια χρυσού επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινα λευχαιμίας (HL-60) και κύτταρα ηπατώματος (HepG2) [40]. Αυτά τα αποτελέσματα έδωσαν σαφείς ενδείξεις που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ΑΕΠ όχι μόνο ως φορείς οι ίδιοι, αλλά και ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες με την αξιοποίηση ικανότητα τους να μειώνουν την ενδοκυτταρική έκφραση GSH και δημιουργούν κυτταροτοξικά αποκρίσεις. Σε αυτή τη μελέτη, υιοθετούμε GCLC ειδικό siRNA να αναστέλλουν την έκφραση του GCLC και να οδηγήσει σε σημαντική μείωση της παραγωγής GSH, και κατόπιν ανιχνεύεται την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ. Μετά τη θεραπεία με GCLC siRNA, ROS ανιχνεύθηκε με την παρουσία του ΑΕΠ σε κύτταρα Α549. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ΑΕΠ μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα ROS σε κύτταρα κατεργασμένα GCLC siRNA. GSH και NAC μπορεί να εξαλείψει την ROS για να εξουδετερώσει την κυτταροτοξικότητα του ΑΕΠ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα επιμολύνθηκαν με GCLC siRNA. Τα αποτελέσματα αυτά κατηγορούνται ότι μετά από να χτυπήσει κάτω των GCLC από siRNA, ROS αποδίδεται στο θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από ΑΕΠ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Είναι γνωστό ότι οι αποκλίνουσες πορείες κυτταρικού θανάτου συνυπάρχουν σε κύτταρα θηλαστικών και ενεργοποίησή τους εξαρτάται από το είδος και την ένταση του ερεθίσματος. Μια μεγάλη σημασία έχει δοθεί στην αποπτωτικών και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε θεραπεία κατά του όγκου [41-44]. Πολλαπλούς τρόπους κυτταρικού θανάτου είναι ταυτόχρονα προκαλείται σε ΑΕΠ-εκτεθειμένες πνεύμονα καρκινικά κύτταρα με χαμηλή ενδοκυτταρική GSH, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης και νέκρωσης. Παρατηρήσαμε ότι η ΑΕΠ μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και νέκρωση ταυτόχρονα όταν η GCLC σίγησε από siRNA στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τόσο απόπτωσης και νέκρωσης είναι σημαντικό μηχανισμό του ΑΕΠ που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο.

Για να ολοκληρώσω, νανοσωματίδια χρυσού παίζουν όλο και πιο σημαντικό ρόλο στην εφαρμογή της έρευνας κατά των όγκων. Τα νανοσωματίδια χρυσού φορά συζευγμένο με GCLC ειδικό siRNA μπορεί να προκαλέσει αποτελεσματικά τον θάνατο καρκινικών κυττάρων. Οι Ωστόσο, πιο εκτεταμένη και μελέτες σε ζώα με διαφορετικά είδη ζώων που απαιτούνται για να λάβουν τα ευρήματα αυτής της έρευνας σε κλινικές δοκιμές.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Επίδραση της GCLC siRNA για την επιβίωση των κυττάρων σε κύτταρα Α549.

Κύτταρα σπάρθηκαν πριν επιμολύνθηκαν με GCLC siRNA, και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν σε διαστήματα 48 ωρών για τα κύτταρα βιωσιμότητα. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή (± SD n = 3) των προσδιορισμών εις τριπλούν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. παραγωγή ROS σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με GCLC siRNA.

κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα ή GCLC siRNA. Μία ημέρα αργότερα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης για επιπλέον 48 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με 10 μΜ DCFH-DA. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο φθορισμού. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή (± SD n = 3) των προσδιορισμών εις τριπλούν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Τα αποπτωτικά και νεκρωτικά απόκριση των κυττάρων Α549 επιμολύνονται με GCLC siRNA.

Μετά knockdown έκφρασης GCLC, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα κυτταρομετρίας ροής εμφανίζεται ως κουκίδα οικόπεδο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. Επίδραση της GCLC siRNA σχετικά με το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) σε κύτταρα Α549.

Τα κύτταρα κατεργάζονται με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC siRNA βάφτηκαν με JC-1 για 20 λεπτά στους 37 ° C. Η μετατόπιση φθορισμού (κόκκινο σε πράσινο) των δειγμάτων στη συνέχεια ανιχνεύεται με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SD n = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s004

(ΔΕΘ)

S5 Εικ. Επίδραση της GCLC knockdown στην δραστικότητα της κασπάσης-3 σε κύτταρα Α549.

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση με αρνητικό μάρτυρα ή GCLC siRNA, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης για επιπλέον 48 ώρες. Caspase-3 δραστηριότητες σε δείγματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας διασπασμένη κασπάση-3 (Asp175) αντίσωμα (Alexa fluor 488 συζυγούς) με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s005

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Ο Δρ Xiaohu Gu και ο καθηγητής Yi Ding από Shandong University School of Χημείας και Χημικών Μηχανικών, για την υποστήριξη των νανοσωματίδια χρυσού.