Αφηρημένο

Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας 9 (ΜΜΡ9) είναι αυξημένη σε μια ποικιλία φλεγμονωδών και ογκολογία ενδείξεις, συμπεριλαμβανομένων της ελκώδους κολίτιδα και του παχέος εντέρου. ΜΜΡ9 είναι ένας καθοδικός τελεστής και ένα ανάντη μεσολαβητής των οδών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την φλεγμονή, και έχει από καιρό θεωρηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικό στόχο. Ωστόσο, προηγούμενες προσπάθειες για στόχευση μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ9, έχουν χρησιμοποιήσει ευρέως φάσματος ή ημι-εκλεκτικούς αναστολείς. Ενώ μερικά από αυτά τα φάρμακα έδειξαν σημάδια αποτελεσματικότητας σε ασθενείς, όλα τα ΜΜΡ-στοχευμένες αναστολείς έχουν παρεμποδιστεί από την τοξικότητα που περιορίζει τη δόση ή ανεπαρκή κλινικό όφελος, πιθανώς λόγω της έλλειψης ειδικότητας. Εδώ, δείχνουμε ότι η επιλεκτική αναστολή της ΜΜΡ9 δεν προκάλεσε μυοσκελετικό σύνδρομο (χαρακτηριστικό τοξικότητα των αναστολέων παν-ΜΜΡ) σε ένα μοντέλο αρουραίου, αλλά δεν μειώνουν τη σοβαρότητα της νόσου σε ένα θειικό άλας που προκαλείται μοντέλο ποντικού νάτριο δεξτράνης της ελκώδους κολίτιδας. Βρήκαμε επίσης ότι η παρεμπόδιση ΜΜΡ9 μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων συχνότητα σε ένα χειρουργικό ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος του ορθοκολικού καρκινώματος, και ότι η αναστολή της είτε από όγκο ή στρώμα προερχόμενο ΜΜΡ9 ήταν αρκετή για να μειώσει πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η εκλεκτική αναστολή της ΜΜΡ9 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία φλεγμονωδών και ογκολογίας ενδείξεων στις οποίες ΜΜΡ9 απορυθμίζεται και συνδέεται με την παθολογία της νόσου, όπως η ελκώδης κολίτιδα και του παχέος εντέρου. Επιπλέον, αναφέρουμε την ανάπτυξη μιας ισχυρός και υψηλά εκλεκτικός αναστολέας αλλοστερική ΜΜΡ9, το εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα GS-5745, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αξιολογηθεί το θεραπευτικό δυναμικό της αναστολής ΜΜΡ9 σε ασθενείς

Παράθεση:. Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, M Κοβαλένκο, Spangler R, Liu C, et al. (2015) Επιλεκτική Αλλοστερική Αναστολή της ΜΜΡ9 είναι αποτελεσματική σε προκλινικά μοντέλα της ελκώδους κολίτιδας και ορθοκολικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10.1371 /journal.pone.0127063

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Fabio Cominelli, CWRU /UH Πεπτικό Ινστιτούτο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23 Δεκ 2014? Αποδεκτές: 11, Απριλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Marshall et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Όλοι οι συγγραφείς και αναγνώρισε τα πρόσωπα είναι νυν ή πρώην υπαλλήλους της Gilead Sciences. Gilead Sciences χρηματοδοτείται όλες τις ερευνητικές εργασίες που αναφέρονται στην παρούσα μελέτη και συμμετείχε αποκλειστικά στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Όλοι οι συγγραφείς είναι νυν ή πρώην υπαλλήλους της Gilead Sciences. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Gilead Sciences. Gilead Sciences κατέχει το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας «Αντισώματα σε μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 9 ‘(US8501916 Β2) και την αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας« Αντισώματα σε μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 9’ (US20130281676 Α1), και αξιολογεί το ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα GS-5745 σε κλινικές δοκιμές φάσης 1 (ClinicalTrials .gov αναγνωριστικά NCT01831427, NCT02077465 και NCT01803282). Κανένα από αυτά τα αντικρουόμενα συμφέροντα επηρεάζουν την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών που σχετίζονται με την υποβληθείσα χειρόγραφο.

Εισαγωγή

Matrix μεταλλοπρωτεϊνασών (MMP) μεσολάβηση πρωτεόλυση παίζει βασικό ρόλο στην ρύθμιση της κυτταρικής ομοιόστασης: MMPs μπορεί να κινήσει, εξειδικεύουν, ή ρυθμίζουν προς τα κάτω καταρράκτες που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την φλεγμονή, με την ενεργοποίηση των κυτοκινών και απελευθερώνοντας απομονωμένο αυξητικούς παράγοντες σηματοδότησης, και μπορεί να τροποποιήσει την αρχιτεκτονική ιστού, υποβαθμίζοντας δομικά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) [1 -6]. Από τα μέλη της οικογένειας των ΜΜΡ 23, ΜΜΡ9 (επίσης γνωστή ως ζελατινάση Β) δείχνει ιδιαίτερη υπόσχεση ως ένας θεραπευτικός στόχος, δεδομένης το σώμα της στοιχεία που να αποδεικνύουν τη συμμετοχή της σε παθολογικές διαδικασίες που συμβάλλουν σε χρόνια φλεγμονή, την ογκογένεση, τη μετάσταση και [5-7].

Η κακή ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ9 και δραστηριότητας που σχετίζεται με αρκετές φλεγμονώδεις διαταραχές, συμπεριλαμβανομένης της ελκώδους κολίτιδας (UC) [1, 7-12]. UC είναι μία υποτροπιάζουσα /διαλείπουσα αυτοάνοση φλεγμονή του παχέος εντέρου [13-16] που διαθέτει επαγωγή των επιπέδων της πρωτεΐνης ΜΜΡ9 και πρωτεολυτική δραστηριότητα σε περιοχές του ενεργού νόσου [10, 11, 17]. δραστηριότητα ΜΜΡ9 σε UC εμπλέκεται τόσο στην παραγωγή και διαιώνιση μιας φλεγμονώδους state-αυτό επάγεται από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως ΤΝΡ-α και IL1- α [18-20] και μπορεί να βοηθήσουν στη διατήρηση των προ-φλεγμονωδών διεργασιών με την απελευθέρωση TNF -α και ΤΟΡ-β, με ενίσχυση IL-8, και με την ενεργοποίηση IL1-β [4, 21-26]. ΜΜΡ9 επίσης μπορούν να συνεισφέρουν στην φλεγμονώδη περιβάλλον μέσω πρωτεόλυσης της βασικής μεμβράνης (ΒΜ) συστατικά κολλαγόνο IV και λαμινίνη [7]. Καταστροφή των επιθηλιακών BM, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της UC [13, 14, 16, 18], μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων [27], η οποία συμβάλλει στην απώλεια της ακεραιότητας του κολονικού βλεννογόνου επιθηλιακού φραγμού, επιδεινώνοντας περαιτέρω φλεγμονή. Παρομοίως, η διατάραξη του ενδοθηλιακού ΒΜ μπορεί να διευκολύνει λεμφοκυττάρων και ουδετερόφιλων μετανάστευση προς την θέση της φλεγμονής [28-30].

Χρόνια έκφραση UC andMMP9 σε UC είναι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη ορθοκολικού καρκινώματος (CRC) [15 , 31-33], και παρόλο που η ακριβής διαδρομή από χρόνια φλεγμονή σε δυσπλασία σε νεόπλασμα δεν είναι σαφής, η συμμετοχή της ΜΜΡ9 σε διαδικασίες που επιτρέπουν τη δημιουργία και διάδοση των δύο αυτών ασθενειών [1, 6, 7, 34, 35] δείχνει ότι μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην εξέλιξη της UC σε καρκίνο. έκφραση ΜΜΡ9 ανυψωμένη και συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ένα ευρύ φάσμα όγκων, συμπεριλαμβανομένων CRC [5, 6, 35-47], και αυτό παίζει πολλαπλούς ρόλους στη διαδικασία της ογκογένεσης: ΜΜΡ9 παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και από στρωματικά φλεγμονώδη κύτταρα όπως τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) και ουδετερόφιλα, και αποτελεί βασικό μεσολαβητής της στιχομυθία όγκο στρώματος που οδηγεί σε αμοιβαία ενεργοποίηση των προ-ογκογόνο σηματοδότηση σε αυτούς τους δύο διαμερίσματα [48-52]. ΜΜΡ9 προωθεί μετάσταση διευκολύνοντας την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μέσω διάσπασης του ΒΜ και άλλων συστατικών ECM [53], και αυτό έχει επίσης εμπλακεί στην πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου λόγω της θέσης του, τόσο ως προς τα κάτω στόχος [54-63] και ένα ανάντι ρυθμιστής των βασικών οδών ογκογόνο σηματοδότηση. Στην τελευταία αυτή ιδιότητα, ΜΜΡ9 μπορεί να επιτρέψει προ-ογκογόνο σηματοδότηση μέσω της ικανότητάς του να απελευθερώσει παράγοντες ανάπτυξης όπως EGF, FGF-2, και VEGF [64-67], και να διαμορφώνουν ιντεγκρίνης και τυροσίνης υποδοχέα λειτουργία κινάσης [54, 68, 69, ]. Τελικά, αυτές οι διαφορετικές πτυχές της ΜΜΡ9 εργασίες λειτουργίας σε συνεννόηση για να πραγματοποιηθεί η απορύθμιση της σηματοδότησης και πρωτεόλυση μήτρας που συμβάλλουν στην ανάπτυξη και εξάπλωση των όγκων [53, 64, 70-73].

Η σημασία της ΜΜΡ9 στο παθολογία ορισμένων φλεγμονωδών και ογκολογία ενδείξεις έχει καταδειχθεί από τις εκθέσεις που δείχνουν ότι

ΜΜΡ9 – /- ποντίκια

εμφάνισε μειωμένη σοβαρότητα της νόσου σε προκλινικά μοντέλα κολίτιδας και ρευματοειδούς αρθρίτιδας, και εμφανίζεται επίσης μειωμένη ανάπτυξη του όγκου ή /και μειωμένη μεταστάσεων σε διάφορα μοντέλα καρκίνου [1, 66, 74-81]. Παρά το γεγονός ότι αυτοί και άλλοι δημοσιευμένες παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ΜΜΡ9 είναι ένα συναρπαστικό θεραπευτικός στόχος, προηγούμενες προσπάθειες για στόχευση ΜΜΡ (συμπεριλαμβανομένης της ΜΜΡ9) που χρησιμοποιούνται παν-ειδικές ή ημι-εκλεκτικούς αναστολείς, και ήταν ανεπιτυχείς λόγω των παρενεργειών που περιορίζει τη δόση, όπως μυοσκελετικές σύνδρομο (MSS ) και /ή σε μια γενική έλλειψη κλινικό όφελος [1, 17, 39, 82-84]. Εκ των υστέρων, η έλλειψη ενός θεραπευτικού παραθύρου με αυτές τις ΜΜΡ αναστολείς ευρύτερου φάσματος είναι κατανοητό, δεδομένου οι ρόλοι που μπορούν να διαδραματίσουν MMPs σε κρίσιμες ομοιοστατική διαδικασίες [22, 85].

Εδώ, αναφέρουμε την ανάπτυξη ενός εξαιρετικά εκλεκτικός και ισχυρός αναστολέας αλλοστερική αντίσωμα της ΜΜΡ9: δείχνουμε ότι η αναστολή της ΜΜΡ9 είναι αποτελεσματική σε μοντέλα ποντικών της UC και του παχέος εντέρου, και ότι αυτή η θεραπεία δεν επάγει MSS σε ένα μοντέλο αρουραίου. Προτείνουμε ότι η επιλεκτική αναστολή της ΜΜΡ9 μεσολάβηση παθολογική σηματοδότηση και πρωτεόλυση μήτρας είναι μια νέα θεραπευτική ευκαιρία σε φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως η UC, και καρκίνους όπως CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ιστοί

Φρέσκο-κατεψυγμένα (FF) και φορμόλη σταθερά και ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) ανθρώπινους ιστούς ελήφθησαν από Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, ΜΙ), ή Folio Βιοεπιστημών (Powell, ΟΗ) .

Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΜΜΡ9 και ανοσοποίηση

Ανθρώπινο πρωτεΐνη ΜΜΡ9 παράχθηκε με κλωνοποίηση του cDNA πλήρους μήκους εντός του φορέα pSecTag2hygro (Β) (Life Technologies, Carlsbad, CA) και παροδικής επιμόλυνσης του σε ΗΕΚ293 κύτταρα (ATCC, Manassas, VA). Το ρυθμισμένο μέσο καθαρίστηκε με Ni-Sepharose Fast Flow 16/20 στήλη ΧΚ (GE Life Sciences, Pittsburgh, ΡΑ). Αυτή η πρωτεΐνη και ανοσοενισχυτικό Ribi χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοποίηση ποντικών BALB /c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) μέσω του πέλμα. Τα ποντίκια με τίτλους αντισώματος ορού έναντι ΜΜΡ9 είχαν χρησιμοποιηθεί για να κάνει τις βιβλιοθήκες υβριδώματος μέσω σύντηξης των Β-κυττάρων που απομονώθηκαν από λεμφαδένες. Αυτές οι βιβλιοθήκες υποκλωνοποιήθηκαν με ενιαία κυτταρικό διαχωρισμό για την παραγωγή κλωνικών πληθυσμών από το οποίο αντίσωμα αντι-ανθρώπινης ΜΜΡ9 ταυτοποιήθηκε AB0041. Οι ανοσοποιήσεις, δημιουργία βιβλιοθήκης υβριδώματος, και η κλωνοποίηση αντισωμάτων διεξήχθησαν στους Antibody Solutions (Sunnyvale, CA). Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού ΜΜΡ9 AB0046 παρομοίως παράγονται, με τις εξαιρέσεις ότι χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια knockout ΜΜΡ9 (Jackson Laboratories) και ότι μια πρωτεΐνη ΜΜΡ9 ποντίκι αποτελείται μόνο από τα pro και καταλυτικές περιοχές (αα 1-445) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση. Για την ανάλυση ειδικότητα, πλήρους μήκους πρωτεΐνες της οικογένειας ΜΜΡ αγοράστηκαν από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ)

AB0041 και AB0046 παραγωγή αντισωμάτων και καθαρισμού

Κύτταρα υβριδώματος που εκφράζουν AB0046 ή AB0041 καλλιεργήθηκαν σε. ΙΜΕΜ, 10% ορό εμβρύου μόσχου (χαμηλή IgG), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (1Χ), 5% Hybridoma Cloning Factor, και συμπλήρωμα ΗΤ μέσο (1Χ) (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Υγρό ασκίτη παρήχθη, καθαρίστηκε με ασυνεχή τρόπο επί MabSelect σίγουρος ρητίνη (GE Healthcare, Piscataway, NJ), και διαμορφώθηκε σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS? 10 mM φωσφορικό νάτριο, 140 mM χλωριούχο νάτριο). Αντίσωμα καθαρότητα αξιολογήθηκε με την επίλυση των αναχθέντων και μη αναχθέντων δειγμάτων με SDS-PAGE 4-12% πηκτώματα Βίδ-Τπδ και χρώση με απλό μπλε Safe κηλίδα (Invitrogen). Τα καθαρισμένα αντισώματα έδειξαν να περιέχουν λιγότερο από 5% συσσωματώματα με SEC-HPLC χρησιμοποιώντας στήλη ΤδΚαβΙ G3000SWXL από την Tosoh (King of Prussia, ΡΑ). LAL δοκιμή (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, SC) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί παρασκευάσματα αντισωμάτων περιείχε λιγότερο από 5 EU /mg ενδοτοξίνης.

ΜΜΡ9 άμεση δέσμευση ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Άμεση σύνδεσης αντιγόνου-down δοκιμασίες ELISA με καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΜΜΡ9 αναπτύχθηκαν για να μετρηθεί η φαινόμενη συγγένεια σύνδεσης του AB0046, AB0041, και GS-5745. Όλες οι πλύσεις έγιναν με PBS + 0.05% Tween-20 (PBST). πρωτεΐνες ΜΜΡ9 πλήρους μήκους επικαλύφθηκαν πάνω σε πλάκες Maxisorp (NUNC, Rochester, ΝΥ), και ακολούθησε αποκλεισμός με PBS + 5% (w /v) λευκωματίνη βόειου ορού (BSA? EMD Millipore). Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και προστέθηκαν σειριακές αραιώσεις των αντισωμάτων αντι-ΜΜΡ9 σε PBS. Μετά την πλύση, οι πλάκες επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) αραιωμένο 1: 10,000 σε PBS + 0.5% (w /v) BSA στη συνέχεια πλύθηκε και αναπτύχθηκε με χρήση 3,3 ‘, 5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ? Sigma, St.Louis, ΜΟ) για 1 λεπτό. Η αντίδραση σβήστηκε με την προσθήκη 1 Μ υδροχλωρικού οξέος. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) σε κατάσταση απορρόφηση σε μήκος κύματος 450 nm. Η φαινομενική σταθερές διάστασης (Κ

D (ELISA)) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Pro SoftMax (Molecular Devices) με γραφική παράσταση των τιμών απορρόφησης ως προς τη συγκέντρωση του αντισώματος και προσαρμογή των δεδομένων σε μία λογιστική εξίσωση 4 παραμέτρων, με το «C «εξίσωση παράμετρος ορίζεται ως η φαινομενική Κ

Δ.

χαρτογράφηση επιτόπου των AB0041 και AB0046

Όλα τα μεταλλαγμένα κατασκευάσματα ΜΜΡ9 που χρησιμοποιούνται στη χαρτογράφηση επιτόπου παρήχθησαν από τη μετάλλαξή του ποντικιού και φορείς έκφρασης ΜΜΡ9 ανθρώπινη χρήση ένα QuikChange II τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Ξεχωριστοί κλώνοι επαληθεύτηκαν με ανάλυση αλληλουχίας DNA, και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ΜΜΡ9 παράχθηκαν με παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα ΗΕΚ293. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε μετά από 24 έως 48 ώρες και χρησιμοποιήθηκαν για την επικάλυψη ενός His-Select Hi-Capacity Νί2

+ επικαλυμμένη πλάκα (Sigma), όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι ακόλουθες πλάκες ημέρες πλύθηκαν σε PBST και αποκλείστηκαν με 5% BSA σε PBS για μία έως δύο ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, που ακολουθείται από επώαση είτε με 10 ηΜ ή 1 ηΜ αντίσωμα αραιωμένο σε PBST. Οι πλάκες πλύθηκαν και επωάστηκαν με ένα αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG- HRP-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ,) αραιωμένο 1: 10.000 σε 0,5% BSA σε PBS. Οι πλάκες πλύθηκαν, αναπτύχθηκαν, και διαβάστε όπως περιγράφεται παραπάνω

δοκιμασίες δραστηριότητας ΜΜΡ9

δραστικότητα ΜΜΡ9 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας αποσβέστηκε φθορισμογόνα υποστρώματα.? διάσπαση παράγει φθορισμού που είναι ανάλογη με την ποσότητα της δραστικότητας του ενζύμου [86]. δοκιμασίες ανθρώπου και ποντικού που χρησιμοποιούνται QXL 520-γ-Αbu-P-Cha-Abu-SMC-HA-Dab (5-ΡΑΜ) -al-NH2, όπου Smc = S-μεθυλ- L-κυστεΐνη, Abu = 2-αμινοβουτυρικό οξύ και Cha = β-κυκλοεξυλαλανίνη (AnaSpec Inc., Fremont, CA), και την δοκιμασία αρουραίου που χρησιμοποιείται Mca-PLGL-Dpa AR-ΝΗ2? (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). Καθαρισμένα ανασυνδυασμένα ΜΜΡ9 από κύτταρα ΗΕΚ293 ενεργοποιήθηκε με ολονύκτια επώαση στους 37 ° C με 4-αμινοφαινυλυδραργυρικό οξικό (ΑΡΜΑ) σε 50 mM Tris ρΗ 7.5, 10 mM χλωριούχο ασβέστιο, 150 mM χλωριούχο νάτριο και 0,05% Brij-35 ρυθμιστικό [87]. πρωτεΐνη ΜΜΡ9 (63 ρΜ άνθρωπο, 125-150 ρΜ ποντίκι, ή 1 ηΜ αρουραίο) μεταφέρθηκε σε ένα 96-φρεατίων μαύρη πλάκα (Costar) και αναμειγνύεται με σειριακά αραιωμένο αντίσωμα. Μετά τον σχηματισμό συμπλόκου ΜΜΡ9-αντισώματος, προστέθηκε υπόστρωμα (20 μΜ για δοκιμασίες ανθρώπου και ποντικού, 10 μΜ για αρουραίο) και ο φθορισμός παρακολουθήθηκε σε κινητικό τρόπο στους 37 ° C είτε σε έναν αναγνώστη πλάκας SpectraMax Μ2 ή M5 (διέγερση 320 nm, εκπομπή 405 nm) ή μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας Άπειρο M1000 (Tecan, Ελβετία) χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος διέγερσης 494 nm και μήκος κύματος εκπομπής 521 nm. Η κλίση της καμπύλης (σχετικές μονάδες φθορισμού [RFU] ανά λεπτό) προσδιορίσθηκε στη γραμμική περιοχή και, στη συνέχεια παρίσταται γραφικώς έναντι συγκέντρωσης του αντισώματος χρησιμοποιώντας ένα αλγόριθμο προσαρμογής καμπύλης 4 παραμέτρων για τον προσδιορισμό ενός IC

50 τιμή. Για τον προσδιορισμό της λειτουργίας αναστολής ΜΜΡ9, η δοκιμασία δραστικότητας διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις του επισημασμένου πεπτιδίου υποστρώματος QXL-FAM. Προσδιορισμοί

DQ-κολλαγόνο IV και DQ-ζελατίνης

Ανθρώπινη DQ-κολλαγόνο IV και χοίρου DQ-ζελατίνης (Life Technologies) είναι σβήστηκε φλουορεσκεΐνη συζευγμένο πρωτεΐνες που φθορίζουν κατά την πέψη. Ανθρώπου ή ποντικού πλήρους μήκους πρωτεΐνες ανασυνδυασμένου ΜΜΡ9 ενεργοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Ανθρώπινα ΜΜΡ9 σε 1 ηΜ ή 0,25 ηΜ (κολλαγόνο IV ή δοκιμασία ζελατίνη, αντίστοιχα) ή ΜΜΡ9 ποντικού σε 1 ηΜ προστέθηκε σε ένα 96-φρεατίων μαύρα μικροπλάκα που περιέχει σειριακές αραιώσεις αντισώματος. Μετά τον σχηματισμό συμπλόκου ΜΜΡ9-αντισώματος, 25 μg /ml προστέθηκε υπόστρωμα και ο φθορισμός παρακολουθήθηκε με ένα μετρητή πλακιδίων SpectraMax M5 (Molecular Devices) ρυθμισμένο στους 37 ° C με μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής 495/515 nm για 3 ώρες (κολλαγόνο IV) ή σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας PHERAstar FS (BMG Labtech) με μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής 485/520 nm για 30 λεπτά (ζελατίνη). Τα δεδομένα διορθώθηκαν με αφαίρεση των αντίστοιχων αρνητικών τους (χωρίς ένζυμο) φρεάτια ελέγχου, και σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) μετατράπηκαν σε ποσοστιαία αναστολή, το οποίο στη συνέχεια παρίσταται γραφικώς έναντι της συγκέντρωσης του αντισώματος? μια καμπύλης 4 παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ένα IC

50.

ΤΝΡ-α πρωτεΐνη σύντηξης δοκιμασία διάσπασης

Η ανασυνδυασμένη δοκιμασία διάσπασης πρωτεΐνη σύντηξης ανθρώπινης προ-ΤΝΡ-α (R & ? D Systems, 1012-PS-010) εκτελέσθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ενεργός ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ΜΜΡ9 (Millipore, PF024) ή ADAM17 (R &? D Systems, 903-ADB) αναμίχθηκε με 10 υΜ AB0041 ή 10 υΜ ΒΒ-94 (Σέλεκ Chemicals, S7155) και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. ΤΝΡ-α υπόστρωμα πρωτεΐνη σύντηξης στη συνέχεια προστέθηκε και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε με ένα αντίσωμα ΤΝΡ-α πολυκλωνικό κουνελιού (Cell Signaling, 3707). Ανασυνδυασμένος ανθρώπινος ΤΝΡ-α (R &? D Systems, 201-ΤΑ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος

Rat MSS μοντέλο

Τριάντα αρσενικοί αρουραίοι Lewis ελήφθησαν από τα εργαστήρια Harlan (Livermore, CA. ) και εγκλιματίστηκαν επί πέντε έως επτά ημέρες πριν από την έναρξη της μελέτης. Οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ομάδες (3 ελέγχου? 2 πειραματική) 6 αρουραίων /ομάδα με βάση το σωματικό τους βάρος. Οι αρουραίοι στεγάζονται σε ατομικά κλουβιά σε ένα ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωμάτιο με ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός, και είχαν κατά βούληση πρόσβαση σε πόσιμο νερό και τροφή των ζώων σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. AB0041 (50 mg /kg) ή φορέα (PBS ρΗ 6,5, 0,01% Tween-20) χορηγήθηκε σε 6 αρουραίοι δύο φορές την εβδομάδα μέσω ενδοφλέβιας ένεσης στην ουραία φλέβα. Ως θετικός έλεγχος για MSS, 6 αρουραίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με marimastat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) μέσω ενός χειρουργικά εμφυτευμένη αντλία Alzet SubQ (Alzet, Cupertino, CA). Κάθε αντλία περιείχε συνολικά 60 mg marimastat, το οποίο παραδόθηκε σε ένα ρυθμό 2,5 μΐ /ώρα για μια περίοδο 28 ημερών. Μια τέταρτη ομάδα από 6 αρουραίους έλαβε το όχημα που χρησιμοποιείται για την αραίωση marimastat (50% DMSO /50% νερό) μέσω μιας αντλίας Alzet SubQ. Marimastat ρυθμός απελευθέρωσης ήταν μεταξύ 6,8 mg /kg /ημέρα (κατά την έναρξη της μελέτης) και 5,7 mg /kg /ημέρα (κατά τον τερματισμό της μελέτης). Τα ζώα παρατηρούνται και βαθμολογούνται καθημερινά για συμπτώματα MSS σύμφωνα με τα κριτήρια που παρατίθενται στη Renkiewicz et al. [88]. Ανάπαυση στάση του σώματος, το βάδισμα και την προθυμία να μετακινηθούν: ανάπαυση στάση βαθμολογήθηκε ως 0 (κανονικό), 1 (που στηρίζεται στο ένα πόδι) ή 2 (που στηρίζεται πάνω ούτε το ένα πόδι, ούτε δύο πόδια). Gait βαθμολογήθηκε ως είτε 0 (φυσιολογικός), 1 (αποφεύγει τη χρήση ενός πίσω ποδιού) ή 2 (αποφεύγει τη χρήση και των δύο οπίσθιων ποδιών). Προθυμία να μετακινηθούν κατά τη διέγερση βαθμολογήθηκε ως είτε 0 (κανονική κίνηση), 1 (κάπως απρόθυμοι να κινηθούν), 2 (μέτρια διστάζουν να κινηθούν) ή 3 (πολύ απρόθυμοι να κινηθούν). Κατά τον τερματισμό της μελέτης (ημέρα 28), τα άκρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για ιστοπαθολογική ανάλυση. Σκέλη απασβεστωμένες και μετά κόβονται, επεξεργάζονται, ενσωματωμένο σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν, κηλιδώθηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) και εξετάστηκαν μικροσκοπικά. Η μελέτη MSS διεξήχθη σε Aragen Biosciences Inc. (Morgan Hill, CA).

DSS που προκαλείται από κολίτιδα μοντέλο

Εβδομήντα-πέντε αρσενικά C57BL /6 ποντίκια ελήφθησαν από Charles River Laboratories (Wilmington , ΜΑ) και εγκλιματίστηκαν για 5 ημέρες πριν τη μελέτη έναρξη και να παρακολουθείται για να επιβεβαιώσετε την υγεία. Η μελέτη διεξήχθη σε δωμάτια των ζώων που παρέχονται με φιλτραρισμένο αέρα ΗΕΡΑ σε θερμοκρασία 70 ° F +/- 5 ° F και 50% +/- 20% σχετική υγρασία. Το δωμάτιο ήταν σε ένα αυτόματο χρονοδιακόπτη για ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ώρες και 12 ώρες εκτός χωρίς λυκόφως. Στείρα Bed-O-στάχυα κλινοσκεπάσματα άλλαξε τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα. Τα ζώα τρέφονταν με αποστειρωμένη Purina Labdiet δίαιτα 5053 τρωκτικών, και αποστειρωμένο νερό παρεσχέθη κατά βούληση.

Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν με βάση το σωματικό βάρος σε 5 ομάδες των 14 ζώων και 1 ομάδα 5 ζώων πριν από την έναρξη της μελέτη. Κολίτιδα προκλήθηκε με χορήγηση 3% β /ο δεξτράνη θειικού νατρίου (DSS) (ΜΡ Biomedicals? MW 36,000-50,000?. Προϊόν δεν 160.110?. Παρτίδας αριθ 5237K) στο πόσιμο νερό επί ημέρες μελέτης 0 έως 5. διάλυμα DSS ήταν αντικαθίσταται με ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα την ημέρα 3. μία ομάδα ποντικών (η = 5) δεν έλαβαν DSS και χρησίμευσαν ως ομάδα κανένας έλεγχος της νόσου. Την ημέρα μελέτης 6, 14 ζώα ανά ομάδα χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς είτε PBST όχημα, αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), ή etanercept (10 mg /kg, Clayworth Healthcare, Castro Valley, CA) . Οχήματος και αντισώματα δοσολογήθηκαν τις ημέρες 6, 9, και 12, και etanercept δοσολογήθηκε τις ημέρες 6, 8, 10, και 12. Όλα τα ζώα ζυγίστηκαν και αξιολογήθηκαν οπτικά για την παρουσία της διάρροιας και αιματηρά κόπρανα καθημερινά. Κατά τον τερματισμό της μελέτης (ημέρα 14), όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε βίντεο ενδοσκόπηση του κάτω κόλου με ένα μικρό ζώο ενδοσκόπιο (Karl Storz Endoskope, Germany). Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και κολίτιδα βαθμολογήθηκε οπτικά με την ακόλουθη κλίμακα [89]: 0 (για κανονική), 1 (για την απώλεια του αγγείωση), 2 (για απώλεια αγγείωση και απόδειξη της ευθρυπτότητας), 3 (για ευθρυπτότητα και διαβρώσεις ), και 4 (για σοβαρή εξέλκωση). Κάθε ποντικός τοποθετήθηκε ένα μόνο βαθμολογία (που ονομάζεται όρος ενδοσκόπηση) που αντιστοιχούσε στην πιο σοβαρή βλάβη παρατηρείται σε όλο το μήκος του παχέος εντέρου. Κατά τον τερματισμό της μελέτης, τα ζώα θανατώθηκαν με έκθεση σε C0

2. Για την αξιολόγηση ιστολογικά σοβαρότητα κολίτιδα, μια πίνακας-επικυρωμένο κτηνιατρική GI παθολόγος, τυφλωμένοι σε σχέση με ομάδες μελέτης, αξιολογήθηκε H & amp? E-τομές βήμα FFPE του ιστού του παχέος εντέρου. Πέντε έως οκτώ ξεχωριστές 5 μm πάχους τομές που λαμβάνονται από διαφορετικές περιοχές των κατώτερων 5 cm από κάθε κόλου βαθμολογήθηκαν για μορφολογικές αλλαγές ή /και τραυματισμό του επιθηλίου, του συνδετικού ιστού, και υποβλεννογόνο χρησιμοποιώντας ένα 4-σημείων κλίμακα [89]. Η βαθμολόγηση της φλεγμονής και του οιδήματος ήταν ως εξής: 0 (καμία παρόν), 1 (σπάνια εστίες /ελάχιστη), 2 (διάσπαρτα περιοχές ή ήπια /διάχυτο), 3 (πολλές περιοχές ή μέτρια διάχυτη), 4 (σήμανση). Βαθμολόγησης του βλεννογόνου νέκρωσης ήταν ως εξής: 0 (καμία), 1 (& lt? 25% επηρεάζονται), 2 (26-50% επηρεάζονται), 3 (51-75% επηρεάζονται) και 4 (& gt? 76% επηρεάζονται). Αυτές οι βαθμολογίες υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για να ληφθεί ένα ενιαίο μέση βαθμολογία ανά ποντικό ανά παράμετρο. Αυτή η μελέτη και η σχετική ιστοπαθολογική ανάλυση (συμπεριλαμβανομένης της επιλογής των αντιπροσωπευτικών εικόνων) διεξήχθη από Biomodels, LLC.

HCT116 χειρουργική ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος

Όλες οι προκλινικές μελέτες τρεις HCT116 διεξήχθησαν από αντικαρκινικούς Inc. (San Diego, CA). Θηλυκά NCr ηυ /ηυ ελήφθησαν από την Charles River (Wilmington, ΜΑ) και εκτράφηκαν από αντικαρκινικούς Inc. να παράγουν τη μελέτη τα ζώα. Τα πειραματόζωα διατηρήθηκαν σε ένα από ΗΕΡΑ φιλτραρισμένο περιβάλλον με /σκότους 14 ωρών φωτός 10 ωρών για το πείραμα. Κλουβιά, τα τρόφιμα και τα κλινοσκεπάσματα ήταν αυτόκαυστο? LabDiet τροφή ποντικών ελήφθη από ΡΜΙ Nutrition International Inc. (Brentwood, ΜΟ) και παρεσχέθη κατά βούληση, όπως το πόσιμο νερό. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν με βάση το σωματικό βάρος σε 4 ομάδες (ομάδα ελέγχου ένας? 3 πειραματικές ομάδες) 15 ζώων. αποθέματα προ-εμφύτευση του όγκου του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή HCT116 που εκφράζουν GFP (AntiCancer Inc.) παρασκευάστηκαν με υποδόρια έγχυση των κυττάρων HCT116-GFP σε συγκέντρωση 5 χ 10

6 κύτταρα /100 μλ στο πλευρό γυμνών ποντίκια. Μετά την επέκταση, ιστούς όγκων συλλέχθηκαν από ποντικούς και κόβεται σε τεμάχια περίπου 1 mm

3. Δύο τέτοια θραύσματα όγκου στη συνέχεια χειρουργικά εμφυτεύονται ορθοτοπικά (SOI) δίπλα στο κόλον κάθε ζώου μελέτη, υπό κεταμίνη /Acepromazine /ξυλαζίνη αναισθησία.

Όταν οι εμφυτεύεται χειρουργικά όγκοι έφθασαν έναν μέσο όγκο περίπου 70-100 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε ομάδες θεραπείας. Η αγωγή άρχισε 16 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου για Μελέτη 1 και Μελέτη 3, και 17 ημέρες μετά την εμφύτευση για τη Μελέτη 2. Όλοι οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με κοκτέιλ AB0041 /AB0046 έλαβε μια δόση φόρτισης AB0046 στα 50 mg /kg την πρώτη ημέρα της θεραπεία. AB0041 και AB0046 έγιναν στη συνέχεια δοσολογήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση δύο φορές την εβδομάδα στα 15 mg /kg, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό (στην ομάδα συνδυασμού, κάθε αντίσωμα ήταν παρούσα σε 15 mg /kg). Τα ποντίκια ελέγχου δοσολογήθηκαν με όχημα (PBS, 0,01% Tween-20). Πρωτογενής μεγέθη όγκων και τα βάρη σώματος μετρήθηκαν (με παχύμετρο ή με ηλεκτρονική κλίμακα, αντίστοιχα) δύο φορές την εβδομάδα για Μελέτη 2 και Μελέτη 3, και μία φορά την εβδομάδα για τις εκτιμήσεις του μεγέθους Μελέτης 1. δαγκάνας που βασίζεται λήφθηκαν με μέτρηση της καθέτου μικρότερη διάσταση ( W) και κύρια διάσταση (L) της ψηλαφείται όγκου. Κατά προσέγγιση όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίσθηκε από τον τύπο (W

2χ L) /2.

τερματίστηκαν ποντικούς σε 20 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας (Μελέτη 3), 18 ημέρες μετά την αγωγή έναρξης (μελέτη 2), ή 28 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας (Μελέτη 1). Εναύσματα για ευθανασία ήταν: ο όγκος του όγκου & gt? 2.000 χιλιοστά

3, & gt? 20% απώλειας βάρους, που παρατηρείται παρεμβολή με ένα ζωτικής σημασίας φυσιολογική λειτουργία, ή εξέλκωση ή νέκρωση του όγκου. Του πρωτογενούς όγκου κόλου και κάθε όργανο με μετάσταση συλλέχθηκαν στο τέλος της μελέτης, και το πρωτογενούς όγκου ζυγίστηκε μετά την εκτομή. Οι όγκοι διχοτομείται, και κατά το ήμισυ μονιμοποιήθηκε σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένου διαλύματος φορμαλίνης για ανάλυση ιστολογία. Το άλλο μισό και όλα GFP-θετικά μεταστατικούς όγκους από άλλα όργανα τοποθετήθηκαν σε κασέτες ιστό και καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο. Το σύστημα απεικόνισης FluorVivo (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση όλου του σώματος. Κατά την νεκροψία, ανοικτή απεικόνιση διεξήχθη στη θωρακική κοιλότητα και κοιλιακή περιοχή για επιθεώρηση της μετάστασης στους λεμφαδένες, τους πνεύμονες και σε άλλους τομείς. Η παρουσία των νεκρωτικό ιστό στην H & amp? E-τομές όγκου αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο πίνακας-επικυρωμένο

Η ανοσοϊστοχημεία

Κατεψυγμένα ιστοί ενσωματωμένα σε βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT-Tissue Tek, VWR. , Brisbane, CA) ένωση με εμβάπτιση σε ισοπεντάνιο λουτρό ξηρού πάγου (-70 ° C). Οι ιστοί ανακτήθηκαν και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C. Tissue περιέχουν μπλοκ των ΥΧΕ τεμαχίστηκαν σε κρυοστάτη (Leica CM1850UV,), και κόβεται σε 5 μm πάχους κρυοτομές, τα οποία τοποθετήθηκαν επάνω σε SuperFrost θετικά φορτισμένη διαφάνειες (VWR). Για (FFPE) τμήματα ιστού μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη, 5 μm πάχους τομές κόπηκαν, τοποθετήθηκαν σε SuperFrost διαφάνειες, και ψήνεται στους 60 ° C για περίπου 20 λεπτά.

Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα αντιδραστήρια IHC και ο εξοπλισμός ήταν από Biocare Ιατρική (Concord, CA), οι διαδικασίες IHC διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου, και όλα τα πλακίδια σημάνθηκαν σύμφωνα με τη Nemesis 3600 από Biocare Medical. Προ-στερέωσης (κατεψυγμένες τομές ιστού): πλάκες μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (VWR) και στη συνέχεια ξεπλένεται σε PBS που περιέχει 0.02% Tween-20 (PBST) σε προετοιμασία για IHC. Αποπαραφίνωση /αντιγόνου Ανάκτηση (FFPE ιστούς): πλακίδια βυθίστηκαν σε 1χ καθολική Decloaker Solution και θερμαίνεται στους 90 ° C για 45 λεπτά στο θάλαμο decloaking, τότε βυθίζεται σε ζεστό Rinse 20 φορές, και εξισορροπήθηκε με αποσταγμένο νερό. Autostainer: πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Peroxidazed και αποκλείστηκαν με Ιστορικό σκοπευτής πριν από την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα σε Da Vinci Πράσινο Αραιωτικό για 30 λεπτά. Το αντι-ΜΜΡ9 (ab76003), αντι-κολλαγόνο IV (ab6586), και αντι-PM2K (ab58822) αντισώματα ελήφθησαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Το αντι-μυελοπεροξειδάσης (ΜΡΟ, A0398) ελήφθη από την Dako (Carpinteria, CA). Οι πλάκες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε TBS-Autowash. Το κιτ πολυμερές Mach 2 χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του αντιγόνου με την προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος αντι-κουνελιού (συζευγμένο με ραφανιδική υπεροξειδάση) για 30 λεπτά. DAB (3, 3 ‘διαμινοβενζιδίνη) χρωμογόνο προστέθηκε στα πλακίδια για 1 λεπτό που ακολουθείται από μια ενιαία έκπλυση σε TBS-Autowash και μία έκπλυση σε αποσταγμένο νερό. Τα πλακίδια στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη CAT, που ακολουθείται από αφυδάτωση εγχειρίδιο με κλιμακούμενες αλκοόλ, στη συνέχεια τοποθετείται με Entellan μέσα στερέωσης. Όλα τα πλακίδια έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο Leica DFC500.

Η ευημερία των ζώων

Όλες οι μελέτες που έγιναν σε ποντίκια ή αρουραίους διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση εργαστήριο ζώα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας και εγκρίθηκαν από την τοπική IACUC επιβλέπει κάθε εγκατάσταση όπου διεξήχθησαν μελέτες: Biomodels Instituional φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής (αριθμός έγκρισης IACUC 09-1215-03)? Aragen επιτροπή για τη φροντίδα των ζώων και τη χρήση (αριθμός έγκρισης IACUC SA-003-Α)? Φροντίδα των ζώων και Χρήση Επιτροπή σε AntiCancer (IACUC αριθμός έγκρισης 14-090).

Graphing και στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism (GraphPad, v5.01). Για τις κλινικές, ιστοπαθολογικές, και ανοσοϊστοχημεία εκτιμήσεις, η σημασία της ρύθμισης των ομάδων θεραπείας έναντι της ομάδας του οχήματος αξιολογήθηκε ως εξής: Ο D’Agostino & amp? Pearson γενικής χρήσεως τεστ κανονικότητας χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν τα δεδομένα έχουν κανονική κατανομή. Δεδομένα που είχαν κανονική κατανομή αξιολογήθηκαν από μια μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές Σύγκριση μετα-τεστ του Dunnett. Μη κανονικά κατανεμημένα δεδομένα αξιολογήθηκαν είτε ένα τεστ Mann Whitney (για ζεύγη ανάλυση) ή με δοκιμή Kruskal-Wallis με πολλαπλή σύγκριση post-test του Dunn. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων μεταστάσεων. ονομασίες τιμή P είναι οι εξής: * & lt? 0,05, ** & lt? 0,01, *** & lt? 0.001, **** & lt? 0,0001. Αποτελέσματα αναζήτησης

αντισώματα

Δημιουργία και χαρακτηρισμός αντισωμάτων αντι-ΜΜΡ9

μονοκλωνικά αντισώματα ΜΜΡ9 στοχευμένες δημιουργήθηκαν με ανοσοποίηση ποντικών με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ανθρώπινης ή ΜΜΡ9 ποντικού, και υποψήφιος

ταυτοποιήθηκαν με

in vitro

διαλογής για δεσμευτικός στόχος, η αναστολή της πρωτεόλυσης του υποστρώματος, και την επιλεκτικότητα έναντι άλλων μελών της οικογένειας των ΜΜΡ. Η διαδικασία επιλογής απέδωσε AB0041, η οποία αναστέλλει τόσο την ανθρώπινη ΜΜΡ9 (hMMP9) και ΜΜΡ9 αρουραίου (rMMP9), αλλά δεν δεσμεύεται με ΜΜΡ9 ποντικού (mMMP9)? και AB0046, η οποία αναστέλλει αντιστρόφως mMMP9, ενώ δεν είναι δεσμευτικές για rMMP9 ή hMMP9 (Πίνακας 1). Αμφότερα τα αντισώματα είχαν υψηλή συγγένεια και εξαιρετική ισχύ: για AB0041 στόχευση hMMP9, Κ

D (app) = 0,133 ± 0,030 nM και IC

50 = 0,172 ± 0,007 nM, και για AB0046 στόχευση mMMP9, Κ

D (app) = 0,218 ± 0,097 nM και IC

50 = 0,029 ± 0,005 nM (Πίνακας 1). AB0041 και AB0046 ήταν άκρως επιλεκτικός, με περισσότερο από 500 φορές μεγαλύτερη εκλεκτικότητα για ΜΜΡ9 έναντι άλλων μελών της οικογένειας των ΜΜΡ (συμπεριλαμβανομένου του πολύ ομόλογες ΜΜΡ2) (Πίνακας 1 και Πίνακας 2). Αμφότερα τα αντισώματα συμπεριφέρθηκε ως αναστολείς μη-ανταγωνιστικές, καθώς οι IC

50 τιμές που παράγονται κατά την ενζυμική δραστηριότητα σε ένα υπόστρωμα πεπτίδιο δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από συγκεντρώσεις υποστρώματος που κυμαίνονται από 1-20 μΜ (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, και τα δύο αντισώματα ανέστειλαν ΜΜΡ9 μεσολάβηση διάσπαση του φυσιολογικώς σχετικά υποστρώματα ζελατίνης και βασικής μεμβράνης κολλαγόνου IV, με ισχείς παρόμοια με εκείνα που δημιουργούνται στη δοκιμασία πεπτιδικού υποστρώματος. Το IC

50 AB0041 ήταν 0,34 ± 0,061 ηΜ για διάσπαση ζελατίνης (Σχήμα 1Β) και 0.30 ± 0.025 ηΜ για διάσπαση του κολλαγόνου IV (Σχήμα 1 C), και το IC

50 AB0046 για διάσπαση ζελατίνης ήταν 0,26 ± 0,018 ηΜ (Σχήμα 1Β). Mouse ΜΜΡ9 δεν χωνέψει ανθρώπινο κολλαγόνο IV, έτσι AB0046 δεν αξιολογήθηκαν σε αυτή τη δοκιμασία.