Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

Τα κυριότερα εμπόδια για την θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος είναι η εξαιρετικά επεμβατική ικανότητα και αντοχή σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία. Το γλυκογόνο 3β συνθάσης κινάσης (ΟδΚ3β) ρυθμίζει πολλαπλές κυτταρικές οδούς και εμπλέκεται σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Εδώ ερευνούμε ένα παθολογικό ρόλο για ΟδΚ3β στην επεμβατική και θεραπεία ανθεκτικό φαινότυπο του καρκίνου του παγκρέατος.

Μέθοδοι

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα εξετάστηκαν για έκφραση της ΟδΚ3β, φωσφορυλίωση και τη δραστηριότητα χρησιμοποιώντας Western και

in vitro

δοκιμασία κινάσης. Οι επιδράσεις της αναστολής της ΟδΚ3β στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, επεμβατική ικανότητα και την ευαισθησία σε gemcitabine και ακτινοβολία εξετάστηκαν μετά από θεραπεία με φαρμακολογική αναστολέα ή με παρεμβολή RNA. Εξετάστηκαν επίσης επιδράσεις της αναστολής της GSΚ3β σε καρκινικό κύτταρο ξενομοσχευμάτων.

Αποτελέσματα

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα έδειξαν υψηλότερη έκφραση και τη δραστηριότητα της ΟδΚ3β από μη νεοπλασματικά κύτταρα, τα οποία συνδέονται με τις αλλαγές στην διαφορική φωσφορυλίωση της . Η αναστολή της ΟδΚ3β μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τα ευαισθητοποιημένα να με γεμσιταβίνη και ιονίζουσα ακτινοβολία, και εξασθενημένα τη μετανάστευση και εισβολή τους. Οι επιδράσεις αυτές που σχετίζονται με μειώσεις στην έκφραση κυκλίνης D1 και φωσφορυλίωση Rb. Η αναστολή της ΟδΚ3β μεταβάλλεται επίσης ο υποκυτταρικός εντοπισμός της Rac1 και F-ακτίνης και την κυτταρική μικροαρχιτεκτονική, συμπεριλαμβανομένων ελασματοπόδια. Συμπίπτει με αυτές τις αλλαγές ήταν η μειωμένη έκκριση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ-2) και μειωμένη φωσφορυλίωση κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ). Οι επιδράσεις της αναστολής της ΟδΚ3β για εισβολή όγκου, την ευαισθησία σε γεμσιταβίνη, η έκφραση ΜΜΡ-2 και την φωσφορυλίωση της FAK παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα όγκου.

Συμπέρασμα

Η στόχευση των ΟδΚ3β αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική στρατηγική για να ξεπεραστεί η διπλή πρόκληση της εισβολής και της αντίστασης θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Kitano Α, Shimasaki Τ, Chikano Υ, Nakada Μ, Hirose Μ, Higashi T, et al. (2013) Η ανώμαλη κινάση συνθετάσης γλυκογόνου 3β εμπλέκεται σε καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων εισβολή και η αντίσταση στη θεραπεία. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10.1371 /journal.pone.0055289

Επιμέλεια: Sharmila Shankar, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Αύγ 2012? Αποδεκτές: 20 του Δεκέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Kitano et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού, Τεχνολογίας και Πολιτισμού ιαπωνικά? η Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (στην ΚΚ, TM)? η Ιαπωνία Εταιρεία Τεχνολογίας (στην ΚΚ, TM)? η Εκτός των τειχών Collaborative Research Grant του Πανεπιστημίου Kanazawa Cancer Research Institute. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ένα σημαντικό πρόβλημα υγείας που οφείλονται σε ένα συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών λιγότερο από το 10% [1]. Χαρακτηρίζεται από το ιδιαίτερα πολλαπλασιαστική και διηθητική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων και μια ισχυρή προδιάθεση για μετάσταση [2] – [4]. Η επιθετική φύση του καρκίνου του παγκρέατος δυσχεραίνει την έγκαιρη διάγνωση και θεραπευτική χειρουργική παρέμβαση και την καθιστά ανθεκτική σε χημειοθεραπεία και ακτινοβολία [3], [4]. Η ευρέως χρησιμοποιούμενη θεραπεία είναι εγχεόμενο γεμσιταβίνη, αν και λιγότερο από το 20% των ασθενών που ανταποκρίνονται σε αυτή τη θεραπεία [3], [4]. Οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές που ενισχύουν τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης και θα μετριάσει τις επεμβατικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος που απαιτούνται. Μοριακή θεραπεία στόχου κατευθυνόμενη έχει προκύψει και περιλαμβάνει τη στόχευση των μεταλλοπρωτεϊνασών υποδοχέων αυξητικού παράγοντα, αγγειογόνο παράγοντα /υποδοχέα και μήτρας, δεδομένου ότι αυτές εκφράζονται ανώμαλα σε καρκίνο του παγκρέατος [2] – [4]. Αρκετές κλινικές μελέτες του καρκίνου του παγκρέατος έχουν ήδη στοχευμένη αυτών των αυξητικών παραγόντων, είτε ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, αλλά οι περισσότεροι έχουν δείξει μικρή ή καθόλου θεραπευτικό όφελος [5]. Ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων που θα μπορούσαν να ενισχύσουν τα θεραπευτικά αποτελέσματα της γεμσιταβίνης και ακτινοβολίας είναι επομένως υψηλή προτεραιότητα [6].

Η κινάση συνθετάσης γλυκογόνου 3β (ΟδΚ3β) είναι μια σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση που ρυθμίζει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης [ ,,,0],7]. Βασισμένο σε γνωστές λειτουργίες και τη συμμετοχή στην πρωτογενή παθολογίες του, ΟδΚ3β έχει ενοχοποιηθεί ως θεραπευτικός στόχος για δυσανεξία στη γλυκόζη, νευροεκφυλιστικές διαταραχές και φλεγμονή [8]. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι απορυθμισμένη έκφραση, τη δραστηριότητα και φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β είναι διακριτά χαρακτηριστικά των γαστρεντερικών καρκίνων και γλοιοβλαστώματος και ότι η ΟδΚ3β συντηρεί την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων όγκου. Ένας ρόλος για παρεκκλίνουσα ΟδΚ3β σε αυτούς τους τύπους όγκου υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι φαρμακολογική αναστολή της δραστηριότητας του μειώνει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και να τα προδιαθέτει σε απόπτωση

in vitro

και σε ξενομοσχεύματα όγκου [9] – [ ,,,0],12]. Αν και ο ρόλος της στον καρκίνο συζητείται ακόμα [13], τα συνολικά αποτελέσματα μέχρι σήμερα δεικνύουν ότι παρεκκλίνουσα έκφραση και δραστικότητα του ΟδΚ3β είναι ένα κοινό και βασικό χαρακτηριστικό σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων (που επισκοπείται στο [14]).

με βάση προηγούμενες μελέτες που κατέδειξαν εμπλοκή ΟδΚ3β σε ΝΡ-κΒ-διαμεσολαβούμενη κυτταρική επιβίωση [15], ΟδΚ3β βρέθηκε να υποστηρίζει την επιβίωση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων μέσω αυτής της οδού [16], [17]. Παρά το γεγονός ότι η ΟδΚ3β είναι ένας βασικός ρυθμιστής της κυτταρικής πόλωσης και της μετανάστευσης κατά τη διάρκεια φυσιολογικών διεργασιών, όπως η ανάπτυξη των ιστών και την επούλωση του τραύματος [18], πολύ λίγα είναι γνωστά για το ρόλο της στην μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Εδώ ερευνήσαμε την πιθανή συμμετοχή της ΟδΚ3β στην επεμβατική φύση του καρκίνου του παγκρέατος και την αντοχή του στο γκεμσιταμπίνης και ιονίζουσα ακτινοβολία, τα δύο σημαντικά εμπόδια για πιο αποτελεσματική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος πριν από την επέμβαση. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Ηθικής του Πανεπιστημίου Kanazawa.

Τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου σε Καναζάβα Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές για τη χρήση των ζώων στην έρευνα στην Ιαπωνία (https://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή για τα πειράματα σε ζώα του Kanazawa Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Γραμμές κυττάρων και ιστών Δείγματα

ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ-293) και του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα (PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, BxPC-3, Capan-1) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Αυτές οι κυτταρικές σειρές χαρακτηρίστηκαν με DNA προφίλ σε ΑΤ, και περάστηκαν για λιγότερα από 6 μήνα μετά ανάνηψη. Αυτά διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε ϋΜΕΜ (ΗΕΚ-293, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, Capan-1) και RPMI 1640 (BxPC-3) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και αντιβιοτικά (πενικιλλίνη G και στρεπτομυκίνη) (GIBCO). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης για την εξαγωγή του RNA και των πρωτεϊνών.

Αυτή η μελέτη συμπεριέλαβε 15 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα Χειρουργικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Kanazawa (Πίνακας S1). Τα χειρουργικά δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερη ρυθμισμένου 10% φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ιστοπαθολογικές διάγνωση και ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις.

Western Blotting

Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (CelLytic -Mt, Sigma-Aldrich) που περιέχει ένα μίγμα από αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Sigma-Aldrich). Οι συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης μετρήθηκαν με Coomassie Protein Assay Αντιδραστήρια (Pierce). Ένα 30 μg υποπολλαπλάσιο πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για τις πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν και φωσφορυλίωση τους [9], [11], [12] με τη χρήση των αντίστοιχων πρωτογενή αντισώματα (Πίνακας S2). Ηλεκτροστυπώθηκαν μεμβράνες (Amersham) μπλοκαρίστηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού πριν από την ανίχνευση φωσφορυλιωμένου κλασμάτων πρωτεΐνης. Η ποσότητα της πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα παρακολουθήθηκε με την έκφραση του β-ακτίνης. Σήματα αναπτύχθηκαν με χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL).

In vitro

κινάσης Δοκιμασία για ΟδΚ3β Δραστηριότητα

Ένα nonradioisotopic

in vitro

δοκιμασία κινάσης (NRIKA) [19] χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η δραστικότητα του ΟδΚ3β που προέρχονται από κύτταρα. Η NRIKA χρησιμοποιεί ένα διαδοχικό συνδυασμό ανοσοκαταβυθίσεις για την απομόνωση της ΟδΚ3β στην κυτταρική δείγματα πρωτεΐνης, ένα

in vitro

αντίδραση κινάσης που χρησιμοποιεί ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη β-κατενίνης (υπόστρωμα) και μη-ραδιοϊσοτοπικές τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ), που ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση της β-κατενίνης φωσφορυλιωμένο στη σερίνη (S) 33, S37 και /ή θρεονίνη (Τ) 41 υπολείμματα (ρ-β-κατενίνης

S33 /37 /T41) [19]. Ως αρνητικός έλεγχος, το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού προς ΟδΚ3β αντικαταστάθηκε από μία ίση ποσότητα μη-άνοση IgG ποντικού (Sigma-Aldrich) στο στάδιο ανοσοκαθίζησης. δραστηριότητα της ΟδΚ3β αποδεικνύεται από την παρουσία του ρ-β-κατενίνης

S33 /37 /Τ41 στην αντίδραση δοκιμής και από την απουσία του στην αρνητική αντίδραση ελέγχου. Η ποσότητα άνοσο ΟδΚ3β και η παρουσία ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης β-κατενίνης στην αντίδραση της κινάσης παρακολουθήθηκαν με ανοσοστύπωση

Ανοσοϊστοχημεία

έκφραση και /ή φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β, μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ). – 2 και κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) σε όγκο και των παρακείμενων μη νεοπλασματικά ιστούς των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος εξετάστηκαν από το αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης μέθοδο [11], [12]. Μετά αποπαραφίνωση, αποκάλυψη αντιγόνου με μικροκύματα και μπλοκάρισμα της μη ειδικής ανοσοαντιδράσεις, οι τομές παραφίνης επωάστηκαν με αντίσωμα για ΟδΚ3β, τυροσίνη (Υ) 216-φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β (ρ-ΟδΚ3β

Y216), ΜΜΡ-2, FAK, Y397 φωσφορυλιωμένο ή Y861-φωσφορυλιωμένη FAK (p-ΡΑΚ

Y397, π-ΡΑΚ

Y861) και ρ-β-κατενίνης

S33 /37 /Τ41, αντίστοιχα. Πηγές και αραιώσεις εργασίας των εν λόγω αντισώματα φαίνονται στον Πίνακα S2. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο κατσίκα IgG αντι-κουνελιού ή αλόγου αντι-ποντικού IgG (αραιωμένο 1:200? Vector). Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε με χρήση του κιτ ABComplex /HRP (DakoCytomation). Για τον αρνητικό έλεγχο, πρωτογενή αντισώματα αντικαταστάθηκαν από μη-ανοσο κουνελιού ή ποντικού IgG (DakoCytomation). Η υπερέκφραση ή υψηλότερη φωσφορυλίωση των αντίστοιχων μορίων σε όγκους ορίστηκε ως ισχυρότερη έκφραση ή φωσφορυλίωση είτε πρωτεΐνης στα κύτταρα όγκου σε σύγκριση με μη νεοπλαστικά παγκρεατικών αγωγών στον ίδιο ασθενή.

Επιδράσεις της ΟδΚ3β αναστολής επί Κυττάρων Επιβίωση και Ο πολλαπλασιασμός

κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Sigma-Aldrich) ή έναν αναστολέα της ΟδΚ3β (AR-A014418? Calbiochem) διαλύθηκε σε DMSO στις υποδεικνυόμενες τελικές συγκεντρώσεις στο μέσο. Αξιοσημείωτα, AR-A014418 δεν αναστέλλει τη δραστηριότητα του 26 που συνδέονται στενά με κινάσες και θεωρείται εξαιρετικά ειδικό για ΟδΚ3β [20]. Κατά ορισθεί χρονικά σημεία, οι σχετικοί αριθμοί των βιώσιμων και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα προσδιορίστηκαν με χρήση WST-8 (4- [3- (4-ιωδοφαινυλ) -2- (4-νιτροφαινυλ) -2Η-5-τετραζολιο] -1,3 βενζένιο δισουλφονικό) κιτ δοκιμασίας (καταμέτρηση κυττάρων kit-8?. Wako) και κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA BrdU Kit (Roche), αντίστοιχα

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ειδικά για την ανθρώπινη ΟδΚ3β (ΟδΚ3β Επικυρώθηκε Stealth RNAi) και αρνητικός έλεγχος siRNA (Stealth RNAi αρνητικού ελέγχου duplex χαμηλό GC) αγοράστηκαν από την Invitrogen. Η ΟδΚ3β ειδικό siRNA στοχεύει την αλληλουχία 5′-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 ‘. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ siRNA είτε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen). Η επίδραση της παρεμβολής του RNA επί της εκφράσεως της ΟδΚ3β προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι τόσο GSK3α και β (Πίνακας S2). Η ειδικότητα της ΟδΚ3β ειδικών siRNA επιβεβαιώθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας [11], [12]. Για να εξεταστεί η επίδραση της ΟδΚ3β RNA παρεμβολής στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 10 ηΜ ελέγχου ή ΟδΚ3β ειδικό siRNA. Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, οι σχετικοί αριθμοί των βιώσιμων και πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων προσδιορίστηκαν με τις μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω.

Επιδράσεις της ΟδΚ3β Αναστολής με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να γεμσιταβίνη και σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (3-6 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε αγωγή με κλιμακούμενη συγκεντρώσεις είτε gemcitabine (Eli Lily) ή AR-A014418. Μετά την κατεργασία για 72 ώρες, ο σχετικός αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε με WST-8 δοκιμασία για να προσδιοριστεί IC

50 (50% επιβίωση των κυττάρων ανασταλτική συγκέντρωση) για γεμσιταβίνης και AR-A014418 και να δημιουργήσει ισοβολογράμματα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία δόση γεμσιταβίνης κοντά στο IC

50 με την παρουσία DMSO ή μια χαμηλή δόση (5 ή 10 μΜ) του AR-A014418. Η μέθοδος ισοβολόγραμμα [21] χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί κατά πόσο η επίδραση του αναστολέα της ΟδΚ3β επί παγκρεατικού καρκίνου επιδεκτικότητα των κυττάρων στη γεμσιταβίνη ήταν προσθετική, συνεργιστική ή ανταγωνιστική.

Η επίδραση του αναστολέα ΟδΚ3β στην ευαισθησία του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία ήταν εξετάσθηκε με ανίχνευση κυτταρικής επιβίωσης που σχηματίζουν αποικίες. Σε κάθε φρεάτιο πλακών των 6 φρεατίων, 1000 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν και κατεργάστηκε διαδοχικά με είτε DMSO είτε μια χαμηλή δόση (5 ή 10 μΜ) του AR-A014418 για 24 ώρες και με ιονίζουσα ακτινοβολία σε δόσεις των 0, 4 και 8 Gy. Σε 6 ημέρες μετά την ακτινοβολία, ο συνολικός αριθμός των αποικιών χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Wako) βαθμολογήθηκε σε κάθε φρεάτιο. Ο μέσος αριθμός των αποικιών σε τρία ξεχωριστά πειράματα υπολογίστηκε με τυπικές αποκλίσεις.

Δοκιμασίες για κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

μετανάστευση κυττάρων του καρκίνου και την εισβολή εξετάστηκαν με δοκιμασία και transwell επούλωση πληγών μονοστιβάδας που βασίζονται χημική δοκιμή. Συρρέουσες μονοστιβάδες των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων με την παρουσία DMSO ή AR-A014418 σε δόση 5 ή 10 μΜ χαραχθεί με μια άκρη 20 μι-μικροπιπέττα για να δημιουργήσει ένα κύτταρο-ελεύθερη ζώνη (πληγή). Σε κάθε κατάσταση, η απόσταση διάκενο μεταξύ των άκρων της πληγής παρακολουθήθηκε στα τρία σταθερά σημεία αναφοράς για 6 έως 24 ώρες με μία κάμερα CCD (AxioCam MRM, Zeiss) συνδεδεμένη με ένα μικροσκόπιο φάσης-αντίθεσης (Axiovert 40 CFL, Zeiss). Η μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο υπολογίστηκε ως η μέση απόσταση του τραύματος μετρήθηκε στα τρία σημεία και συγκρίθηκαν μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO και AR-A014418.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή εξετάστηκαν με τους προσδιορισμούς transwell χρησιμοποιώντας μη επικαλυμμένα και Matrigel επικαλυμμένο με 24-καλά το σύστημα διπλού θαλάμου (BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ επώασης Επιμελητήριο, BD Bioscience). Τα καρκινικά κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού που περιέχει DMSO ή AR-A014418 (5 ή 10 μΜ), και 2 χ 10

4 κύτταρα εφαρμόσθηκαν στο άνω αντιστοίχιση θαλάμου με το κατώτερο θάλαμο γεμάτο με μέσο που περιέχει 10% FBS ( ως χημειο-προσέλκυσης) και DMSO ή AR-A014418 (5 ή 10 μΜ). Σε 22 ώρες μετά επιτρέποντας στα κύτταρα να μεταναστεύουν και εισβάλλουν, τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του θαλάμου μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Diff-Quick Kit (Symex). Σε κάθε δοκιμασία, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων ανά υψηλής ισχύος μικροσκοπικό πεδίο στην κάτω πλευρά του μη επικαλυμμένου ή επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμου μετρήθηκε και βαθμολογήθηκαν για μεταναστεύει ή εισβάλλοντα κύτταρα. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων σε πέντε υψηλής ισχύος μικροσκοπικά πεδία υπολογίστηκε με τυπικές αποκλίσεις.

Κυτταρική μορφολογία και ανοσοφθορισμού Cytochemistry

Τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται σε μία καλυπτρίδα υπέστησαν αγωγή είτε με DMSO ή AR- A014418 (5 ή 10 μΜ) για 12 ώρες και στη συνέχεια γδαρμένο όπως περιγράφεται παραπάνω. Στις 12 ώρες μετά το ξύσιμο, τα κύτταρα κατά μήκος των άκρων της πληγής παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton-X (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα επωάστηκαν σειριακά με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού προς Rac1 (BD Bioscience? Αραιωμένο 1:200) στους 4 ° C όλη τη νύχτα και με Alexa Flour® 488-επισημασμένο αντι-ποντικού IgG (Invitrogen? Αραιωμένο 1:1,000) σε θερμοκρασία δωματίου για 40 min στο σκοτάδι. Μετά την έκπλυση της περίσσειας αντισώματος, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για νηματοειδή (F-) ακτίνης με Alexa Flour® 546-σημασμένο φαλλοειδίνη (Invitrogen? Αραιωμένη σε 1:40) για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst 33342 (Molecular Probes) και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Keyence) για έκφραση και υποκυτταρικός εντοπισμός της Rac1 και F-ακτίνης.

Rac1 Δραστηριότητα

Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή 10 μΜ AR-A014418 για 24 ώρες σε 25 mM ρυθμιστικό Tris-HCl (ρΗ 7.5) που περιέχει 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1% ΝΡ-40, 1 mM διθειοθρεϊτόλης και 5% γλυκερόλη. Ενεργό Rac1 απομονώθηκε από το δείγμα πρωτεΐνης με τη μέθοδο pull-down χρησιμοποιώντας GST-ανθρώπινο ΡΑΚ1-PBD (Θέρμο) και ρητίνες (Γλουταθειόνης Sepharose 4 Fast Flow? GE Healthcare). Το κλάσμα της Rac1 συνδεδεμένο με τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP) (Rac1-GTP, ένας ενεργός μορφή) εκλούσθηκε από τις ρητίνες και ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού για Rac1 (αραιωμένο 1:1,000? Θέρμο). Ξεχωριστά, ολόκληρο κυτταρική πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε για ολική Rac1 χρησιμοποιώντας το ίδιο αντίσωμα.

έκφραση και την έκκριση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ-2)

Η έκφραση του ΜΜΡ-2 mRNA εξετάστηκε με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR). Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας ISOGEN (Wako). Συμπληρωματικό DNA (cDNA) παράχθηκε χρησιμοποιώντας μια αντίστροφη Kit μεταγραφής (Promega). qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Premix Ex Taq

TMII (Takara Bio) με τα αντίστοιχα σύνολα των με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες για ενίσχυση της ΜΜΡ-2 και β-ακτίνης (Πίνακας S2) [11].

έκφραση ΜΜΡ-2 αναλύθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης [22]. Τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή AR-A01418 (10 ή 25 μΜ) για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Το εμπλουτισμένο μέσο ή επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE που περιείχε 0,005% Alexa Fluor 680-σημασμένο ζελατίνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα πλύθηκαν σε 2.5% Triton Χ-100 για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος επί μία νύκτα στους 37 ° C. Η γέλη σαρώθηκε από το σύστημα απεικόνισης LI-COR Odyssey IR (Lincoln).

ξενομοσχεύματος όγκου Μελέτη

Είμαστε προετοιμασμένοι υποδόρια ξενομοσχεύματα PANC-1 σε ποντίκια, όπως περιγράφεται [23]. Αυτοί οι ποντικοί χωρίστηκαν σε 4 ομάδες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (δύο φορές την εβδομάδα για 10 εβδομάδες) DMSO (διαλύτης), γεμσιταβίνη (20 mg /kg σωματικού βάρους) και AR-A014418 (2 mg /kg σωματικού βάρους, που ισοδυναμεί με 10 μΜ σε μέσο καλλιέργειας όπως προσδιορίζεται και να βελτιστοποιηθούν σε προηγούμενες μελέτες μας [10], [12]) μόνο ή σε συνδυασμό, αντίστοιχα. τερματίστηκαν Όλοι οι ποντικοί μετά τη θεραπεία και οι όγκοι ξενομοσχεύματος απομακρύνθηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για ιστολογική εξέταση και ανοσοϊστοχημεία για έκφραση του ΜΜΡ-2 και FAK και φωσφορυλίωση της FAK στα κύτταρα όγκου, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική Ανάλυση

Μεταξύ-ομάδα στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Student

t

τεστ. Στη μελέτη ξενομοσχεύματος όγκου, οι όγκοι του όγκου σε κάθε ομάδα θεραπείας εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των δεδομένων προσδιορίσθηκε με Kruskal Wallis H-δοκιμή που ακολουθείται από Mann-Whitney U-test με διόρθωση Bonferroni. Ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Έκφραση, φωσφορυλίωση και τη δραστηριότητα των ΟδΚ3β σε καρκινικά κύτταρα

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα. έδειξαν υψηλότερα βασικά επίπεδα της ΟδΚ3β και την Υ216-φωσφορυλιωμένη δραστική μορφή (ρ-ΟδΚ3β

Y216) και χαμηλότερα επίπεδα του S9-φωσφορυλιωμένη αδρανή μορφή (ρ-ΟδΚ3β

S9) σε σύγκριση με ΗΕΚ 293 κύτταρα (Σχ. 1Α ). Καρκίνος που προέρχεται από κύτταρα της ΟδΚ3β ήταν ενεργός για φωσφορυλίωση του υποστρώματος της, β-κατενίνης (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν δραστικές ΟδΚ3β που δεν ρυθμίζεται με διαφορική φωσφορυλίωση στο S9 και Y216. Ανοσοϊστοχημεία για τις σειριακές τομές έδειξαν ότι η ΟδΚ3β και ρ-ΟδΚ3β

Y216 ήταν εκφράζονταν διάχυτα και colocalized στα κύτταρα του όγκου και υπερεκφράζεται στα επεμβατική κύτταρα όγκου του 8/15 ασθενείς (53%) του καρκίνου του παγκρέατος (Εικ. 1 C). Η υπερέκφραση ήταν συχνότερη σε ασθενείς με Τ3 /Τ4 πρωτογενούς όγκου ή με λεμφαδένα και μακρινή μετάσταση κατά τον χρόνο της χειρουργικής επέμβασης (Πίνακας S1).

(Α) πρωτεϊνικό εκχύλισμα από κάθε κυτταρική γραμμή αναλύθηκε με Western ανοσοαποτύπωση για η έκφραση της ΟδΚ3β και τη φωσφορυλίωση της (π-ΟδΚ3β

S9, π-ΟδΚ3β

Y216). έκφραση β-ακτίνης παρακολουθήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. δραστηριότητα (Β) της ΟδΚ3β ανιχνεύθηκε με NRIKA [19] στα αντίστοιχα κύτταρα. Όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, δραστηριότητα της ΟδΚ3β αποδεικνύεται από την παρουσία του ρ-β-κατενίνης

S33 /37 /Τ41 στην αντίδραση δοκιμής (Τ) και δια της απουσίας της στην αντίδραση αρνητικό έλεγχο (NC). Η ποσότητα άνοσο ΟδΚ3β και η παρουσία του υποστρώματος (β-κατενίνης) στην αντίδραση της κινάσης παρακολουθήθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (C, D) διαδοχικές τομές παραφίνης ενός πρωτογενούς καρκίνου του παγκρέατος και των παρακείμενων μη νεοπλασματικό ιστό της (Νο ασθενής 5 του πίνακα S1) ανοσοχρωματίστηκαν για ΟδΚ3β και ρ-ΟδΚ3β

Y216 (C), και για το ΜΜΡ-2 , ΡΑΚ, π-ΡΑΚ

Y397 και π-ΡΑΚ

Y861 (D). Η κλίμακα μπαρ σε κάθε πίνακα δείχνει 100-μm σε μήκος.

Η

Επιδράσεις της ΟδΚ3β αναστολέα στο τηλέφωνο επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό

Ερευνήσαμε αν ΟδΚ3β συμβάλλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Τα επίπεδα συνθάσης γλυκογόνου (GS) φωσφορυλιωμένο στο Y641 (ρ-GS

S641) και ρ-β-κατενίνης

S33 /37 /Τ41 μειώθηκε σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με AR-A014418 (Εικ. S1 Α, Β ), υποδεικνύοντας τη δραστηριότητά της κατά της ΟδΚ3β σε καρκινικά κύτταρα. αναστολή της ΟδΚ3β εξασθένησε την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (σχ. 2Α, C). Η εξάντληση των ΟδΚ3β με παρεμβολή RNA εξασθενημένα βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Β, D). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες [16], [17] προτείνοντας ότι παρεκκλίνουσα επιπτώσεις ΟδΚ3β με την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

(Α) σχετικό αριθμό των βιώσιμων κυττάρων στα καθορισμένα χρονικά σημεία ήταν μετράται από WST-8 προσδιορισμού για τα αντίστοιχα κύτταρα σε παρουσία DMSO ή AR-A014418 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. (Β) μετρήθηκαν σχετικοί αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων για τα αντίστοιχα κύτταρα μετά την επιμόλυνση των μη ειδικών (NS) ή της ΟδΚ3β ειδικό siRNA. (C, D) Ο σχετικός αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της ποσότητας της ενσωμάτωσης BrdU. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα βαθμολογήθηκαν στις 48 ώρες μετά την αγωγή με DMSO ή AR-A014418 (10 μΜ, 20 μΜ) (C), ή μετά από επιμόλυνση με μη-ειδική (NS) ή της ΟδΚ3β ειδικό siRNA (D). Οι τιμές που παρουσιάζονται στο (Α-Δ) είναι το μέσο ± SD από πέντε ξεχωριστά πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή AR-A014418 και μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με μη ειδικά και ΟδΚ3β ειδικό siRNA

Η

Επιπτώσεις της ΟδΚ3β. αναστολέας συνδυασμό με γεμσιταβίνη ή ακτινοβολία κατά των καρκινικών κυττάρων

τα παραπάνω αποτελέσματα μας οδήγησαν να αντιμετωπιστούν αν η αναστολή της ΟδΚ3β θα μπορούσε να ενισχύσει τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης και ιονίζουσας ακτινοβολίας. Υψηλές δόσεις (25 ή 50 μΜ) του AR-A014418 μόνο είχε ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα ενάντια στα καρκινικά κύτταρα (Σχ. 2Α, C). Ως εκ τούτου, οι συνέπειες της σχετικά χαμηλές δόσεις (5 ή 10 μΜ) εξετάστηκαν σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ή ιονίζουσα ακτινοβολία. Πρώτον, εξετάσαμε δοσοεξαρτώμενη επιδράσεις του AR-A014418 και gemcitabine στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και προσδιορίζεται IC

50 τιμές (Σχ. 2Α, η Εικ. S2) τους. IC

50 τιμές για AR-A014418 ήταν παρόμοια σε PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα, ενώ εκείνες για γεμσιταβίνη ποικίλλει (Πίνακας S3). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της AR-A014418 στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε γεμσιταβίνη. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κλιμακούμενες δόσεις (1 ng /ml έως 10 μg /mL) του gemcitabine, συνδυασμό με χαμηλή δόση AR-A014418 μείωσε σημαντικά την IC

50 γεμσιταβίνης (Εικ. S2, Πίνακας S4). ανάλυση Ισοβολόγραμμα [21] των στοιχείων αποκάλυψε ότι χαμηλή δόση AR-A014418 σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ήταν προσθετική εναντίον κυττάρων PANC-1 και συνεργιστική εναντίον κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 (Σχ. 3Α). Επιβεβαιώσαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με AR-A014418 ενίσχυσε σημαντικά την επίδραση της γεμσιταβίνης εναντίον καρκινικών κυττάρων ξενομοσχευμάτων (Σχ. 3C) σε τρωκτικά χωρίς αρνητικές συνέπειες από το αντιδραστήριο.

(Α) Η επίδραση του AR-A014418 σχετικά με την επίδραση της γεμσιταβίνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την ισοβολόγραμμα [21] με γραφική παράσταση της IC

50 της συνδυασμένης θεραπείας (Εικ. S2, Πίνακας S4). (Β) Το συνδυασμένο αποτέλεσμα ιονίζουσας ακτινοβολίας και AR-A014418 ελέγχθηκε σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. *

σ

& lt? 0,05, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή AR-A014418. (Γ) Το συνδυασμένο αποτέλεσμα της γεμσιταβίνης και AR-A014418 ελέγχθηκε σε PANC-1 ξενομοσχευμάτων. Αθυμικά ποντίκια με PANC-1 ξενομόσχευμα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες για θεραπεία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (δύο φορές την εβδομάδα) DMSO (έλεγχος? 8 ποντίκια), γεμσιταβίνη (GEM? 20 mg /kg σωματικού βάρους? 9 ποντίκια) και AR-A014418 ( AR? 2 mg /kg βάρους σώματος? 8 ποντίκια), μόνα τους ή σε συνδυασμό (GEM + AR? 9 ποντίκια). Κατά το χρόνο μετά τη θεραπεία για 10 εβδομάδες, ο όγκος του όγκου (cm

3) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο 0,5 × S

2 χ L, όπου S είναι η μικρότερη διάμετρος όγκου (cm) και το L είναι το μεγαλύτερο (cm ) [10], [12]. Ο μέσος όγκος του όγκου συγκρίθηκε μεταξύ των 4 ομάδων. *

σ

& lt? 0,05, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δεδομένων

Η

Η επίδραση του AR-A014418 σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία δοκιμάστηκε σε καρκινικά κύτταρα.. Στην δοκιμασία κυτταρικής επιβίωσης σχηματισμού αποικιών, παρουσία 10 μΜ AR-A014418 μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με ιοντίζουσα ακτινοβολία μόνο (Σχ. 3Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με αναστολέα ΟδΚ3β ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να γεμσιταβίνη και σε ιοντίζουσα ακτινοβολία.

μοριακές αλλαγές συνδεδεμένες με ΟδΚ3β αναστολή σε καρκινικά κύτταρα

Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό που κρύβεται πίσω από τη συμμετοχή της ΟδΚ3β στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου και αντίσταση στην θεραπεία, διερευνήσαμε την επίδραση της αναστολής της ΟδΚ3β στην έκφραση και την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιασμό. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (που επισκοπείται στο [2]), παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έδειξαν φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Rb (ρ-Rb

S780, ρ-Rb

S807 /811? Εικ. 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι η σύνδεση με το E2F μεταγραφικός παράγοντας ήταν μειωμένη [24]. Η θεραπεία είτε με AR-A014418 ή της ΟδΚ3β ειδικό siRNA μείωσε τα επίπεδα της Rb φωσφορυλίωσης και της έκφρασης D1 κυκλίνης (Σχ. 4), ωστόσο δεν συνάδει βρέθηκαν αλλαγές για CDK4 ή CDK6 έκφραση.

(Α) ανάλυση ανοσοαποτύπωσης συγκρίνει την έκφραση του Rb, CDK4, CDK6 και κυκλίνη D1, και τη φωσφορυλίωση της Rb στο S780 και S807 /811 κατάλοιπα (p-Rb

S780, π-Rb

S807 /811) μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO ( DM) ή 10 μΜ AR-A014418 (AR) για 24 ώρες. (Β) Μεταβολές στα επίπεδα του p-Rb

S780 και ρ-Rb

S807 /811 και έκφραση του Rb και κυκλίνης D1 εξετάστηκαν σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία με 10 μΜ AR -A014418. (Γ) έκφραση του Rb, κυκλίνη D1, πρωτεΐνες και τα επίπεδα του Rb φωσφορυλίωσης (ρ-Rb

S780) GSK3α και ΟδΚ3β εξετάστηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ των ίδιων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA (NS) ή GSK3β- ειδικό siRNA (S) (10 ηΜ το καθένα). (Α-Γ) έκφραση της β-ακτίνης παρακολουθήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Επιδράσεις της ΟδΚ3β Αναστολή για τη Μετανάστευση Cancer Cell και εισβολή

Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής έδειξαν ότι η μετανάστευση καρκινικά κύτταρα μειώθηκε σημαντικά με κατεργασία με 5 μΜ και 10 μΜ AR-A014418 (Εικ. 5Α, το Σχ. S3). Σημαντικά, αυτές οι συγκεντρώσεις δεν επαρκούσαν για να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 24 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 2Α). Στην δοκιμασία transwell, 5 μΜ και 10 μΜ AR-A014418 ανέστειλαν μετανάστευση χημειοτακτικού των καρκινικών κυττάρων και εισβολή τους εξωκυτταρικό συστατικό μήτρας (Σχ. 5Β).

(Α) Άνω πάνελ δείχνουν την χρονική πορεία για PANC- 1 κύτταρο μετανάστευση σε προσδιορισμό επούλωσης πληγών σε παρουσία DMSO ή AR-A014418 (AR). Το κατώτερο πάνελ δείχνει τα σχετικά πλάτη των τραυμάτων μετρήθηκε ως ποσοστό της αρχικής χάσμα στο χρόνο μηδέν. *

σ

& lt? 0,05, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή AR-A014418. (Β) κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω της μη επικαλυμμένα φρεατίων και εισβάλλοντας κύτταρα μέσω Matrigel επικαλυμμένα φρεατίων βαθμολογήθηκαν για τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή AR-A014418 (AR) για 22 ώρες PANC-1 και. Τα αντιπροσωπευτικά photomicroscopic ευρήματα σε κάθε δοκιμασία φαίνεται παρακάτω στήλες. *

σ

& lt?. 0.05, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή AR-A014418

Η

Αλλαγές στην Επεμβατική Φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων Μετά ΟδΚ3β Αναστολή

Τα παραπάνω αποτελέσματα μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι η ΟδΚ3β έχει ένα ρόλο στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Αυτό μπορεί να αποδοθεί σε επιθηλιακό-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), ένα φαινότυπο υπεύθυνο για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση [25]. Ερευνήσαμε την έκφραση των μορίων ΕΜΤ σχετίζονται Ε-καδερίνης, Ν-καδερίνης και βιμεντίνη σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με AR-A04418 και ΟδΚ3β ειδικό siRNA. Δεν παρατηρήθηκε σταθερή παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης αυτών των μορίων (Σχ. S1c, D), υποδηλώνοντας ότι ΕΜΤ είναι απίθανο να είναι ο μηχανισμός με τον οποίο η αναστολή της ΟδΚ3β εξασθενεί μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Μια πιθανή εξήγηση μπορεί να είναι ότι ιδρύθηκε καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν ήδη αποκτήσει το φαινότυπο EMT.

επόμενο επικεντρώθηκε στην κυτταρική μικροαρχιτεκτονική και ιδίως σχετικά με ελασματοπόδια που παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων κατά τη διάρκεια των φυσιολογικών διεργασιών και στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [26]. Ένα μέλος της οικογένειας των Rho-ΟΤΡάσης, Rac1, συμμετέχει στο σχηματισμό ελασματοπόδια και στον καρκίνο εξέλιξης [27]. Πληγή δοκιμασία επούλωσης έδειξαν ότι μεταναστεύουν καρκινικά κύτταρα σχηματίζουν ελασματοπόδια στο χώρο της Rac1 εντοπισμού, με νημάτια ακτίνης την οργάνωση της δομής έλασμα. Η θεραπεία με AR-A014418 μειωμένο σχηματισμό ελασματοπόδια σε καρκινικά κύτταρα στο χείλος της πληγής και οδήγησαν σε διάχυτη κυτταροπλασματική διανομή των Rac1 και F-ακτίνης (Εικ. 6Α).