Αφηρημένο

Ιστορικό

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η έκφραση της CBX7 μειώνεται δραστικά σε διάφορα ανθρώπινα καρκινώματα και ότι η έκφραση της προοδευτικά μειώνεται με την εμφάνιση ενός εξαιρετικά κακοήθους φαινοτύπου. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η απώλεια της έκφρασης CBX7 μπορεί να συμβάλει στην ανάδειξη μιας πιο κακοήθη φαινότυπο.

Μέθοδοι

Εμείς ανέλυσε το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης ενός θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή καρκινώματος μετά την αποκατάσταση της CBX7 και, τότε, ανέλυσε την μεταγραφική ρύθμιση των ταυτοποιημένων γονιδίων. Τέλος, αξιολογήσαμε την έκφραση CBX7 και ρυθμιζόμενων γονιδίων σε ένα πάνελ του θυρεοειδούς και πνεύμονα καρκίνωμα.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι CBX7 αρνητικά ή θετικά ρυθμίζει την έκφραση αρκετών γονιδίων (όπως SPP1 , SPINK1, STEAP1, και FOS, Fos Β, EGR1, αντίστοιχα) που σχετίζονται με την πρόοδο του καρκίνου, αλληλεπιδρώντας με τις περιοχές υποκινητή τους και ρυθμίζοντας την μεταγραφική δραστικότητα τους. αναλύσεις ποσοτικής RT-PCR σε ανθρώπινο θυρεοειδή και καρκίνωμα πνεύμονα ιστών έδειξε αρνητική συσχέτιση μεταξύ CBX7 και γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω του, ενώ θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε με up-ρυθμιζόμενων γονιδίων.

Συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, η απώλεια της έκφρασης CBX7 μπορεί να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο σε προχωρημένα στάδια της καρκινογένεσης από την απορύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων τελεστή

Παράθεση:. Pallante P, Sepe R, Federico Α, Forzati F, Bianco Μ, Fusco Α (2014) CBX7 ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων κρίσιμων για τον καρκίνο εξέλιξη. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10.1371 /journal.pone.0098295

Επιμέλεια: Τάνια Β Kalin, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 30 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2014

Copyright: © 2014 Pallante et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica-MIUR (ΠΡΙΝ 2008), «Progetto di Interesse strategico Invecchiamento (PNR-CNR Γήρανση Πρόγραμμα) PNR-CNR 2012-2014 »και Progetto PON01-02782:» Nuove Strategie nanotecnologiche per la Μέσα σε punto di farmaci e presidi diagnostici diretti verso κύτταρο cancerose circolanti «. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι Pierlorenzo Pallante και Alfredo Fusco είναι Ακαδημαϊκό Συντάκτες του PLoS ONE. Pierlorenzo Pallante και την κατάσταση Alfredo Fusco ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσήλωσή τους στις PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

CBX7 είναι Polycomb μέλος πρωτεΐνη του Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 1 (PRC1), ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα που μαζί με την Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2), διατηρεί σημαντικό αναπτυξιακό γονίδια σε μεταγραφικά καταπιεσμένη κατάσταση [1] – [3]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι το γονίδιο CBX7 είναι δραστικά προς τα κάτω ρυθμισμένη σε καρκινώματα του θυρεοειδούς και η έκφρασή του μειώνεται προοδευτικά με κακοήθεις βαθμού και νεοπλασματικών στάδιο [4]. Επιπλέον, περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι η συσχέτιση της απώλειας CBX7 με μια ιδιαίτερα κακοήθη φαινότυπο και τη συνακόλουθη κακή πρόγνωση είναι μια γενική εκδήλωση στην ογκολογία. Στην πραγματικότητα, η απώλεια της έκφρασης CBX7 έχει δειχθεί πρόσφατα ότι σχετίζεται με την αύξηση της ποιότητας κακοήθειας στο παχύ έντερο [5], της ουροδόχου κύστης [6], παγκρεατικό [7], του μαστού [8], γαστρικό [9] και του καρκινώματος του πνεύμονα [10] , ενώ η διατήρηση της έκφρασης CBX7 συσχετίζεται με μεγαλύτερη επιβίωση του παχέος εντέρου και οι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [5], [7]. Η αποκατάσταση της έκφρασης CBX7 σε θυρεοειδούς, του στομάχου και του καρκινώματος κόλου κυτταρικές σειρές αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη με τη συσσώρευση του κυτταρικού πληθυσμού στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, γεγονός που υποδηλώνει αρνητικό ρόλο του CBX7 στον έλεγχο του G1 /S μετάβαση της κυτταρικού κύκλου.

έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι CBX7 είναι σε θέση να ρυθμίζει θετικά την έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την Ε-καδερίνη [11] η οποία είναι γνωστό ότι παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής επιθηλιακά κυτταρική μορφολογία, και του οποίου η απώλεια έκφρασης αντιπροσωπεύει ένα γενικό χαρακτηριστικό της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος [12], [13]. Στην πραγματικότητα, έχει δειχθεί ότι CBX7 είναι σε θέση να διατηρήσει την έκφραση της Ε-καδερίνης με την αλληλεπίδραση με ιστόνης αποακετυλάσης 2 και αναστέλλοντας τη δράση του στον υποκινητή Cdh1 [11]. Σταθερά, μια άμεση συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της Ε-καδερίνης και έκφραση CBX7 έχει αναφερθεί σε θυρεοειδούς και του παγκρέατος [7], [11]. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα θα υποδεικνύουν ότι η απώλεια της έκφρασης του γονιδίου CBX7 μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στα τελευταία στάδια της εξέλιξης ανθρώπινου καρκινώματος.

Ο ογκοκατασταλτικό ρόλος του CBX7 έχει επιβεβαιωθεί πολύ πρόσφατα από το φαινότυπο του cbx7 knockout ποντικών. Πράγματι, αυτοί οι ποντικοί αναπτύσσουν ήπατος και των πνευμόνων αδενωμάτων και καρκινωμάτων, και κατά συνέπεια, εμβρυϊκές ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) που προέρχεται από τα ποντίκια knockout cbx7 έχουν υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης και μειωμένη επιδεκτικότητα σε γήρανση από τους ομολόγους τους άγριου τύπου [10]. Κυκλίνης E υπερέκφραση, λόγω της έλλειψης των cbx7 που ρυθμίζει αρνητικά την έκφρασή του, πιθανόν αντιπροσωπεύει το φαινότυπο των ποντικών cbx7 νοκ-άουτ. Ένας παρόμοιος μηχανισμός πιθανόν εμπλέκονται στην ανθρώπινη καρκινογένεση του πνεύμονα αφού Κυκλίνη Ε πάνω ρύθμιση, που συνδέεται με την απώλεια της έκφρασης CBX7, έχει παρατηρηθεί στα περισσότερα από τα καρκινώματα ανθρώπινου πνεύμονα αναλύθηκαν [10].

Ο στόχος της παρούσα μελέτη ήταν να διερευνήσει άλλους μηχανισμούς με τους οποίους η απώλεια της έκφρασης CBX7 μπορεί να συμβάλει στην εμφάνιση ενός εξαιρετικά κακοήθους φαινοτύπου. Εμείς παράγεται πρώτα κλώνους κυττάρων καρκίνωμα έξι θυρεοειδούς στην οποία η έκφραση του CBX7 έχει αποκατασταθεί, τότε, χρησιμοποιώντας την ισχυρή τεχνική υβριδισμού ολιγονουκλεοτιδίου μικροσυστοιχιών, αναλύσαμε το προφίλ γονιδιακής έκφρασης του FRO κυτταρικής σειράς στην οποία αποκαταστάθηκε η έκφραση του CBX7, σε σύγκριση στην ίδια κυτταρική γραμμή δεν εκφράζει CBX7.

Βρήκαμε ότι CBX7 ήταν σε θέση να ρυθμίζουν θετικά 120 γονιδίων και ρυθμίζουν αρνητικά 196 γονίδια. Μεταξύ αυτών, έχουμε προσδιορίσει διάφορους ειδικά γονίδια τελεστή, όπως SPP1 (που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη οστεοποντίνη), η λειτουργία των οποίων είναι γνωστό ότι είναι απαραίτητη για την απόκτηση ενός πλήρως κακοήθη φαινότυπο. πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι CBX7 πρωτεΐνη συνδέεται άμεσα με τους υποστηρικτές αυτών των γονιδίων που ρυθμίζονται και λειτουργικές μελέτες επιβεβαίωσαν ότι η έκφραση CBX7 ήταν σε θέση να ρυθμίζουν τους υποκινητές των γονιδίων CBX7-ρυθμίζονται. Τέλος, ποσοτική RT-PCR αναλύσεις έδειξαν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ CBX7 και γονιδίων ρυθμισμένα προς τα κάτω του και μια θετική συσχέτιση με πάνω ρυθμισμένα εκείνες της στην ανθρώπινη θυρεοειδούς και του καρκινώματος του πνεύμονα δειγμάτων σε διαφορετικό βαθμό κακοήθειας.

Στο σύνολό τους , τα στοιχεία που αναφέρονται εδώ δείχνουν ότι CBX7 αρνητικά ή θετικά ελέγχει την έκφραση αρκετών γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που έχουν ένα κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

ανάλυση μικροσυστοιχιών

GeneChip Human Gene 1,0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), που αποτελείται από 764.885 σύνολα ανιχνευτή που καλύπτουν πάνω από 28.869 γονίδια, χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά. Η όλη διαδικασία υβριδισμός διεξήχθη ακολουθώντας τις οδηγίες Affymetrix. Οι διαδικασίες ενίσχυσης και την επισήμανση επαληθεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ GeneChip ευκαρυωτικοί Πολυ-Α RNA ελέγχου (Affymetrix) με εξωγενή θετικοί έλεγχοι. 15 μg από κάθε βιοτινυλιωμένου προετοιμασίας cRNA ήταν κατακερματισμένη και τοποθετούνται σε μείγμα υβριδισμού που περιέχει βιοτινυλιωμένο ελέγχους υβριδισμού (ελέγχει την έκφραση GeneChip υβριδισμός, Affymetrix). Τα δείγματα στη συνέχεια υβριδοποιούνται επί ενός GeneChip Human Gene 1,0 ST Array στους 45 ° C για 16 ώρες σε σταθερή περιστροφή (60 σ.α.λ.) σε ένα Hybridization Κλίβανος (Affymetrix). Μικροσυστοιχιών σαρωμένες εικόνες ελήφθησαν με ένα σαρωτή GeneChip (Affymetrix) χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Οι εικόνες αναλύθηκαν με Affymetrix Gene Expression Λογισμικό Ανάλυσης (Affymetrix). Οι συγκρίσεις έγιναν μεταξύ FRO-EV-1 πέρα ​​δώθε-CBX7-1 δείγματα, θεωρώντας FRO-EV-1 ως βασική γραμμή. Οι φορές τιμές μεταβολής, αναφέροντας την σχετική μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ FRO-EV-1 πέρα ​​δώθε-CBX7-1, χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά.

είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων ArrayExpress δεδομένων μικροσυστοιχιών (www .ebi.ac.uk /ArrayExpress) υπό τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-2420.

δείγματα ανθρώπινων ιστών

Οι ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του θυρεοειδούς, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς ή φυσιολογικό ετερόπλευρο λοβούς, που προέρχονται από χειρουργικές δείγματα, συλλέχθηκαν στην Υπηρεσία d’Ανατομο-Pathologie, νοσοκομειακό κέντρο Lyon Sud, Pierre Bénite, τη Γαλλία, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της επιτροπής δεοντολογίας του ινστιτούτου, και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για να εκτελέσει στη συνέχεια την εξαγωγή του RNA.

«TissueScan Real-Time καρκίνο του πνεύμονα Νόσος Πίνακας ΙΙΙ» των cDNA αγοράστηκε από ΟηΟεηε (ΟηΟεηε Technologies Inc., Rockville, MD). Αυτό το πάνελ cDNA καρκίνο του πνεύμονα (HLRT103) περιέχει 8 δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα και 40 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα διαφορετικού histotype, του οποίου η κλινική παθολογικά χαρακτηριστικά είναι ελεύθερα διαθέσιμα στην ακόλουθη διεύθυνση: https://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.

εκχύλιση RNA, ποσοτικός Real Time PCR (qRT-PCR) και ανάλυση μικροσυστοιχιών

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς χρησιμοποιώντας το RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης. Για τη δημιουργία cDNA, QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή 1 μα ολικού RNA από κάθε δείγμα. Μια βελτιστοποιημένη μείγμα ολιγο-dT και τυχαία αρχικά τεμάχια χρησιμοποιήθηκαν.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR διεξήχθη με τη CFX 96 θερμοκυκλοποιητή (Bio-Rad, Hercules, CA) σε πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας ένα τελικό όγκο 20 μΐ. Για την PCR χρησιμοποιήθηκαν 10 μΐ 2 χ SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 ηΜ του κάθε εκκινητή, και cDNA που παράγεται από 20 ng ολικού RNA. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται στη δέσμη στοιχείων S1. Θερμική πρωτόκολλο ήταν ως εξής: 2 λεπτά 95 ° C? τότε 45 κύκλους 20 δευτ 95 ° C και 1 λεπτό 60 ° C. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις διπλούν και η -ΔΔCT μέθοδος 2

χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης [14]. G6PD χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς.

Κυτταροκαλλιέργειες και επιμολύνσεις

κύτταρα καρκινώματος του θυρεοειδούς FRO [15] διαθέσιμα στο εργαστήριο μας και ΗΕΚ 293 κύτταρα (American Type Culture Collection, LGC Πρότυπα Srl, Sesto San Giovanni, Ιταλία) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Life Technologies), 1% γλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies) σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. FRO και ΗΕΚ 293 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας είτε αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) και Νέον Electroporation System (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την παραγωγή CBX7 σταθερή εκφράζοντα κύτταρα, επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε μέσο που περιέχει γενετικίνη (Life Technologies), αρκετοί κλώνοι επιλέχθηκαν και επεκτάθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις. Rat φυσιολογικά κύτταρα Cl3 θυρεοειδούς PC [16] καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο F12 συμπληρωμένο με 5% ορό μόσχου (Life Technologies) και έξι παράγοντες ανάπτυξης (θυροτροπική ορμόνη, υδροκορτιζόνη, ινσουλίνη, τρανσφερίνη, η σωματοστατίνη και γλυκυλ-ιστιδυλο-λυσίνη? Sigma, St . Louis, ΜΟ). κύτταρα PC Cl3 επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA και siRNA κατά cbx7 αρουραίου όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11]. καθιερώθηκαν, αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν (δίοδος Ρ3 και Ρ4) όπως περιγράφεται αλλού Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών (ΠΜΑ) από ποντίκια knockout cbx7 [10].

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blot

εκχύλιση πρωτεϊνών και διαδικασία στυπώματος Western διεξήχθησαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11]. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι διαδικασίες και κηλίδωση, οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης επωάστηκαν για μία νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα σε ένα ψυχρό δωμάτιο (4 ° C). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα (συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας, 1:3000) για 60 λεπτά (σε θερμοκρασία δωματίου) και η αντίδραση ανιχνεύθηκε με ένα δυτικό σύστημα blot ανίχνευση (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ΗΑ (Roche Applied Science, Mannheim, Γερμανία), αντι-CBX7 (SC-70232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), αντι-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, UK) , αντι-His-ανιχνευτή (SC-804, Santa Cruz Biotechnology), αντι-Egr1 (SC-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), αντι-c-Fos (sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), αντι-Fos Β (sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), αντι-τουμπουλίνης γ (SC-17787, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) και αντι-β-ακτίνης (κλώνος AC-15 A5441, Sigma-Aldrich Co ., St. Louis, ΜΟ).

δοκιμασία

δραστικότητα λουσιφεράσης

δοκιμασία λουσιφεράσης μετενεργοποίησης διεξήχθη όπως αναφέρθηκε αλλού [11]. Μια περιοχή που εκτείνεται 1000 bp ανοδικά της θέσης tanscriptional έναρξης (TSS) των γονιδίων CBX7-ρυθμιζόμενη (εκκινητές αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στη δέσμη στοιχείων S1) ενισχύθηκε με PCR και εισήχθη ανοδικά με το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου λουσιφεράσης που περιέχεται στο pGL3 (Promega, Fitchburg, WI). Όλα τα κατασκευάσματα αναφοράς που δημιουργείται ελέγχθηκαν για τις μεταλλάξεις με άμεση αλληλούχιση. φορέα έκφρασης CMV-β-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την ενεργότητα επιμόλυνσης σύμφωνα με την δραστηριότητα γαλακτοσιδάσης. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ελήφθησαν 36 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ 293 και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε για κάθε σημείο με τη χρήση ενός φωτόμετρο Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) και το κιτ διπλής Light System (Life Technologies). Ολες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν και τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (μάρκας)

δείγματα χρωματίνης που λαμβάνονται από τα κύτταρα και τους ιστούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρωματίνη ανοσοκαθίζηση όπως αναφέρθηκε αλλού [ ,,,0],10], [11]. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντισώματα αντι-CBX7 (ab21873, Abcam). Μη σχετίζονται IgG χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος της ανοσοκαθίζησης. Για qPCR 3 μΐ 150 μΐ ΙΡ DNA χρησιμοποιήθηκε και οι τιμές του DNA εισόδου χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των τιμών από δείγματα ποσοτικά chip. Ποσοστό εισόδου υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο 2

ΔΟΙ × 3, όπου ΔCt είναι η διαφορά μεταξύ της Ct

εισόδου και Ct

IP [10]. Όλα τα ποσοτικά δεδομένα προήλθαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα, και για κάθε πείραμα qPCR διεξήχθη εις τριπλούν. Οι αλληλουχίες των χρησιμοποιηθέντων εκκινητές που αναφέρθηκαν στη δέσμη στοιχείων S1. Ο υποκινητής της ανθρώπινης και GAPDH ποντικού γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας της αλληλεπίδρασης CBX7 χρωματίνης [4].

Ηθική

Η επιτροπή δεοντολογίας της ιατρικής σχολής και η κατάσταση του ιατρικού συμβουλίου του Κέντρου hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, τη Γαλλία, συμφώνησε σε αυτές τις έρευνες, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη αυτή.

Στατιστικές αναλύσεις

Στατιστική αξιολόγηση διεξήχθησαν με τη χρήση Graph Pad Prism. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD και οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές εάν ρ & lt? 0.05. Κατανομή των qRT-PCR φορές αλλαγή τιμές σε σχέση με κάθε γονιδίου στο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς και καρκινώματα του πνεύμονα ελήφθησαν και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας το κουτί και μουστάκια (min έως max) και εκατοστιαία μέθοδο. Για την ανάλυση συσχέτισης, Fold Αλλαγή τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή διαγραμμάτων διασποράς, για να αποκτήσετε μια γραμμή τάσης και για τον υπολογισμό της αξίας r του Pearson.

Αποτελέσματα

προφίλ γονιδιακής έκφρασης των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς μετά από εκ νέου έκφραση του CBX7

για να ερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η απώλεια της έκφρασης CBX7 μπορεί να συμβάλλει στην απόκτηση ενός κακοήθους φαινοτύπου, αναλύσαμε το προφίλ γονιδιακής έκφρασης ενός κυττάρου καρκινώματος θυρεοειδούς γραμμή (FRO) στο οποίο η έκφραση του CBX7 αποκαταστάθηκε (FRO-CBX7, Σχήμα 1Α). RNAs που εξάγονται από FRO-EV-1 (ένας κλώνος σταθερά επιμολυσμένα με τον κενό φορέα) και FRO-CBX7-1 κλώνος, υβριδοποιήθηκαν σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο συστοιχία Affymetrix περιέχουν πολλές χιλιάδες μεταγραφές. Το προφίλ έκφρασης των κυττάρων FRO-CBX7-1 συγκρίθηκε στη συνέχεια με εκείνη του FRO-EV-1. Αρκετές μεταγραφές προέκυψε άλλαξε στο επίπεδο έκφρασης τους μεταξύ FRO-CBX7-1 και FRO-EV-1 (Πίνακας 1 και 2, Πίνακας S1 και S2). 53 μεταγραφές (17 επάνω ρυθμισμένη και 36 ρυθμισμένα προς τα κάτω) είχαν μια απόλυτη τιμή μεταβολής φορές περισσότερο από 2,0 (Πίνακας 1 και 2), ενώ 263 μεταγραφές (103 επάνω ρυθμισμένη και 160 ρυθμισμένα προς τα κάτω) δείχνουν μια απόλυτη τιμή μεταβολής φορές αποτελούνται από 1,5 έως 2,0 (Πίνακας S1 και S2). Ως έλεγχος της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών, παρατηρήσαμε ότι CBX7 ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται στο FRO-CBX7-1 (Πίνακας 1).

Α) CBX7 έκφραση αξιολογήθηκε με ανάλυση qRT-PCR σε FRO (wt), και αρκετοί κλώνοι κυττάρων FRO-EV (κενός φορέας) και FRO-CBX7. Οι τιμές εκφράζονται ως σχετική έκφραση σε σχέση με το FRO δείγμα που ορίστηκε ίση με 1. B, C) Τα επιλεγμένα γονίδια CBX7 ρυθμιζόμενων αναλύθηκαν με ανάλυση qRT-PCR σε FRO (wt), και αρκετές FRO-EV εμπρόσθιες και ανάστροφες κυτταρικοί κλώνοι CBX7. FOS, Fos Β και γονιδιακή έκφραση EGR1 ήταν πιο άφθονο σε κλώνους κυττάρων FRO-CBX7 από ότι στα κύτταρα FRO-EV, αντιστρόφως, SPP1, SPINK1 και έκφραση STEAP1 ήταν λιγότερο έντονη σε κύτταρα FRO-CBX7 σε σύγκριση με την FRO-EV και FRO (wt ) κύτταρα. Οι τιμές εκφράζονται ως σχετική έκφραση σε σχέση με το FRO δείγμα που ορίστηκε ίσος με 1. Δ) την έκφραση των FOS, Fos Β και EGR1 αξιολογήθηκε σε ένα κλώνο FRO-CBX7 κυττάρου (FRO-CBX7-1), ένα FRO-EV (FRO-EV-1) FRO κύτταρα αγρίου τύπου και. β-ακτίνης αξιολογήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα βέλη δείχνουν τις ζώνες που αντιστοιχούν σε FOS και EGR1.

Η

Η

Μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίζονται από CBX7 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος του θυρεοειδούς έχουμε επικεντρώσει την προσοχή μας στην FOS, fosB και EGR1 (Πίνακας 1) που ήταν θετικά ρυθμίζονται και SPP1, SPINK1 και STEAP1 (Πίνακας 2) που, αντιθέτως, αρνητικά ρυθμίζεται από CBX7, δεδομένου ότι αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόκτηση ενός πλήρως κακοήθη φαινότυπο. Στην πραγματικότητα, FOS, Fos Β και EGR1 είναι πρωτεΐνες που έχουν αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορα ανθρώπινα καρκινώματα υποδηλώνοντας έναν κρίσιμο ρόλο αυτών των πρωτεϊνών σε πρόοδο του καρκίνου [17] – [19]. Από την άλλη πλευρά, SPP1, SPINK1 και STEAP1 είναι πρωτεΐνες που βρίσκονται πάνω ρυθμισμένα σε πολλά ανθρώπινα καρκινώματα και υπερέκφραση τους συνδέεται επίσης να εξέλιξης του καρκίνου [20] – [22]. Αξιολογήσαμε την έκφραση αυτών των μεταγραφημάτων από qRT-PCR σε αρκετές FRO κλώνους CBX7 εκφράζουν (Εικόνα 1Β και Γ) σε σύγκριση με FRO-EV κλώνους και με τα κύτταρα FRO (κ.β.). Για όλα αυτά, η ανάλυση qRT-PCR επιβεβαίωσε την διαφορική έκφραση που σχετίζεται με την έκφραση της πρωτεΐνης CBX7 (Εικόνα 1Β και Γ). Επιπλέον, τα πειράματα κηλιδώσεως Western επιβεβαίωσε την αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών FOS, Fos Β και EGR1 σε μία FRO κυτταρικό κλώνο που εκφράζει σταθερά CBX7 (FRO-CBX7-1) σε σύγκριση με FRO-EV (FRO-EV-1) και τα κύτταρα FRO wt ( Εικόνα 1D).

Ανάλυση των cBX7 ρυθμιζόμενων γονιδίων στα κύτταρα του θυρεοειδούς αρουραίου και ΥΠΟΙΟ εκφράζουν ή όχι το γονίδιο cbx7

επόμενο εξακριβώσει εάν τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά στα κύτταρα FRO-cBX7 έδειξε μια διαφορική έκφραση επίσης σε ΠΜΑ που απομονώθηκαν από cbx7 knockout ποντικούς [10]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η ανάλυση qRT-PCR επιβεβαίωσε την διαμόρφωση των επιλεγμένων γονιδίων CBX7 ρυθμίζονται επίσης σε αυτό το κυτταρικό σύστημα, στην πραγματικότητα, τα γονίδια θετικά ρυθμίζονται από cbx7 βρέθηκαν κάτω-ρυθμίζονται σε cbx7

– /- MEFs (Εικόνα 2Α), ενώ τα γονίδια που ρυθμίζονται από αρνητικά cbx7, βρέθηκαν πάνω ρυθμισμένα στο cbx7

– /- ΠΜΑ, σε σύγκριση με cbx7

+ /+ οι MEF (Σχήμα 2Β). πειραμάτων Western Blot που έδειξαν ότι η έκφραση του fos και πρωτεϊνών EGR1 μειώσεις στην cbx7

– /-. MEFs, εάν συγκριθεί με cbx7

+ /+ Οι MEF (Σχήμα 2D)

ποσοτική ανάλυση RT-PCR διεξήχθη για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του cBX7 ρυθμιζόμενων γονιδίων σε cbx7

+ /+ και cbx7

– /- ΠΜΑ. Οι τιμές εκφράζονται ως σχετική έκφραση σε σχέση με το cbx7

+ /+, ότι ορίστηκε ίσος με 1. Α) Fos, Fos Β και EGR1 ήταν λιγότερο εκφράζονται σε cbx7

– /- Οι MEF σε σύγκριση με την cbx7

+ /+ ΠΜΑ. Β) Από τα γονίδια Αντίθετα, spp1, spink1 και steap1 ήταν πιο εκφράζονται σε ΠΜΑ cbx7

– /- σε σύγκριση με τα ΠΜΑ cbx7

+ /+. Γ) Cbx7

– /- MEFs επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα φορέα που εκφράζει θηλαστικού cbx7 ποντικού (myc-His-tagged) mRNA (cbx7

– /- R). Αποκατάσταση της έκφρασης cbx7 είναι σε θέση να επανέλθει το φαινότυπο του cbx7

– /- MEFs (Α, Β). Οι τιμές εκφράζονται ως Σχετική έκφραση σε σχέση με το cbx7

/+, που είχε οριστεί ίσο με 1. Δ) Η έκφραση των fos και πρωτεϊνών EGR1 αξιολογήθηκε με κηλίδα western σε ΠΜΑ που λαμβάνονται από cbx7 +

– /- ποντίκια σε σύγκριση με cbx7

+ /+ ΠΜΑ. β-ακτίνη έκφραση αξιολογήθηκε για την εξομάλυνση των πρωτεϊνών φόρτωσης

Η

Η αποκατάσταση της γονιδιακής έκφρασης cbx7 στο cbx7

-. /- ΠΜΑ (Σχήμα 2C) οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της fos, Fos Β και EGR1 (Εικόνα 2Α) και μειωμένη έκφραση της spink1, spp1 και steap1 (Σχήμα 2Β), επιβεβαιώνοντας τη ρύθμιση αυτών των γονιδίων με την έκφραση CBX7.

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω ο ρόλος της CBX7 στη διαμόρφωση αυτών των γονιδίων, που αξιολογήθηκε έκφραση τους στην κανονική κυτταρική γραμμή θυρεοειδούς αρουραίου PC Cl3 στην οποία η σύνθεση του cbx7 καταστάλθηκε από παρεμβολή RNA. Η σίγηση του γονιδίου cbx7 επαληθευθεί σε αρκετές ώρες μετά τη θεραπεία siRNA (Σχήμα 3Α), είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του CBX7 θετικά ρυθμιζόμενων γονιδίων (Σχήμα 3Β) και σε αυξημένη έκφραση του CBX7 αρνητικά ρυθμιζόμενα γονίδια (Σχήμα 3C), σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με το μη φίμωση ελέγχου siRNA (κωδικοποιημένο).

Α) κύτταρα PC Cl3 επιμολύνθηκαν παροδικά με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) έναντι του mRNA cbx7 αρουραίου. Μετά την επιμόλυνση μπορούμε να παρατηρήσουμε μια αποτελεσματική νοκ ντάουν των επιπέδων mRNA cbx7, όπως αξιολογήθηκε με ανάλυση qRT-PCR. Β, η έκφραση Γ) CBX7 ρυθμιζόμενα γονίδια αξιολογήθηκε με qRT-PCR σε κύτταρα PC Cl3 αρουραίου μετά από επιμόλυνση με cbx7 αρουραίου siRNA. Η έκφραση αξιολογήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές εκφράζονται ως σχετική έκφραση σε σχέση με τα κύτταρα PC Cl3 επιμολυνθεί με ένα μη ελέγχου αποσιώπησης siRNA (κωδικοποιημένο), που είχαν οριστεί ίση με 1.

Η

CBX7 δεσμεύεται με υποκινητές των ρυθμιζόμενων γονιδίων και ρυθμίζει τους δραστηριότητα

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον CBX7 συμμετείχε άμεσα στη διαφορική έκφραση αυτών των γονιδίων

in vivo

, πραγματοποιήσαμε μια χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) δοκιμασία. Στη συνέχεια, FRO-EV-1 και FRO-CBX7-1 κύτταρα ήταν διασταυρωμένες και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CBX7 ή IgG αντισώματα. Ανοσοκαταβύθιση χρωματίνη στη συνέχεια αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που καλύπτει την περιοχή του προαγωγού αυτών των γονιδίων (Σύνολο δεδομένων S1). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Α καταδεικνύουν ότι CBX7 ήταν σε θέση να δεσμεύονται σε αυτούς τους προαγωγείς. Στην πραγματικότητα, τα αντισώματα αντι-CBX7 καταβυθίστηκε περιοχή από τον προαγωγό των γονιδίων αυτών σε κύτταρα FRO-CBX7-1, σε σύγκριση με FRO-EV-1 κύτταρα (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε εμπλουτισμός σε δείγματα ανοσοκαταβυθίζονται με φυσιολογική IgG κουνελιού και όταν χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές για τον υποκινητή ελέγχου GAPDH άνθρωπο, υποδεικνύοντας ότι η σύνδεση είναι ειδική για αυτούς τους προαγωγούς (Σχήμα 4Α). Το ίδιο αποτέλεσμα επιτεύχθηκε με τη χρήση της χρωματίνης που λαμβάνονται από κύτταρα ΗΕΚ 293 παροδικά επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης CBX7 (Σχήμα S1).

Α) FRO-EV-1 και FRO-CBX7-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία με τη χρήση ChIP αντισώματα έναντι CBX7. Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιήθηκαν μη συνδεδεμένων IgG αντισώματα. Η συνδεδεμένη DNA ενισχύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το αντίστοιχο γονίδιο υποκινητή και, ως έλεγχος της εξειδίκευσης ChIP, αστάρια αναγνωρίζοντας το γονίδιο GAPDH προαγωγό άνθρωπο. Β) Οι MEF προέρχονται από cbx7

+ /+ και cbx7

– /- αναλύθηκαν για την σύνδεση της πρωτεΐνης cbx7 στους υποστηρικτές των ρυθμιζόμενων γονιδίων του. Ως αρνητικοί έλεγχοι, μη συνδεδεμένων IgG αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν και, ως έλεγχος της εξειδίκευσης ChIP, χρησιμοποιήθηκαν εναρκτήρες αναγνωρίζοντας το γονίδιο υποκινητή ποντικού GAPDH. Τα δεδομένα αναφέρονται ως είσοδο τοις εκατό και υπολογίστηκαν με βάση τον ακόλουθο τύπο: 2

ΔΟΙ × 3, όπου ΔCt είναι η διαφορά μεταξύ της Ct

εισόδου και Ct

IP

Η

. Για να επιβεβαιώσετε τη σύνδεση της ενδογενούς πρωτεΐνης CBX7 στους υποκινητές αυτών των γονιδίων, πήραμε επίσης να επωφεληθούν από ΠΜΑ και τους ιστούς που λαμβάνονται από το ποντίκι cbx7 νοκ-άουτ [10]. Πειράματα ChIP πραγματοποιήθηκαν σε ΠΜΑ, νεφρού και σπλήνα ιστούς που λαμβάνονται από cbx7

+ /+ και cbx7

– /- ποντίκια. Τα αντισώματα αντι-CBX7 ήταν σε θέση να αναγνωρίσει ενδογενή cbx7 και να καθιζάνει χρωματίνη από cbx7

+ /+ αλλά όχι από cbx7

– /- MEFs (Σχήμα 4Β) και ιστούς (Εικόνα S2), επιβεβαιώνοντας τη δέσμευση του ενδογενούς cbx7 να αυτές οι περιοχές υποκινητή. Αυτά τα πειράματα ChIP, ως εκ τούτου, ανέφερε ότι CBX7 αλληλεπιδρά φυσικά με τις περιοχές υποκινητή των γονιδίων αυτών

in vivo

, ως εκ τούτου άμεσα ρύθμιση έκφρασης τους.

Στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί η επίδραση της έκφρασης CBX7 για την μεταγραφή αυτών των γονιδίων που ρυθμίζονται, τα κύτταρα ΗΕΚ 293 ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με την κωδικοποίηση CBX7 φορέα έκφρασης και με ένα φορέα ρεπόρτερ που φέρει το γονίδιο της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο μιας περιοχής προαγωγέα 1000 bp που βρίσκεται ανοδικά του TSS του κάθε ενός από αυτά τα γονίδια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, CBX7 αύξησε τη μεταγραφική δραστικότητα του FOS, Fos Β και προαγωγοί EGR1 (Σχήμα 5Α), ενώ καταστέλλεται η μεταγραφική δραστικότητα του SPP1, SPINK1 και προαγωγοί STEAP1 (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα της CBX7 στις ακόλουθες προαγωγούς ήταν δοσοεξαρτώμενη. Ως εκ τούτου, τα πειράματα προσδιορισμού chip και λουσιφεράσης δείχνουν ότι CBX7 είναι σε θέση να ρυθμίζουν άμεσα την μεταγραφή των επιλεγμένων γονιδίων CBX7 ρυθμίζονται με σύνδεση προς προαγωγούς τους.

Κύτταρα

ΗΕΚ 293 ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με αυξανόμενες ποσότητες της έκφρασης CBX7 φορέα και μία σταθερή ποσότητα φορέα που περιέχει το γονίδιο της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των υποκινητών του CBX7 ρυθμιζόμενα γονίδια. Αυξανόμενες ποσότητες CBX7 επέβαλε την έκφραση του γονιδίου αναφοράς υπό τον έλεγχο των FOS, περιοχές προαγωγού Fos Β και EGR1 (Α), ενώ καταπιεσμένη τη δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς υπό τον έλεγχο του SPP1, προαγωγοί SPINK1 και STEAP1 (Β). Η σχετική δραστικότητα της έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας τυποποιήθηκε σε έλεγχος επιμόλυνσης, με τη χρήση β-γαλακτοσιδάσης. Οι μπάρες κλίμακας αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

Η έκφραση των γονιδίων CBX7 ρυθμιζόμενων συσχετίζεται με CBX7 έκφραση και σε ανθρώπινα καρκινώματα

Από τα προηγούμενα ευρήματα έδειξαν ότι έκφραση CBX7 μειώθηκε σε θυρεοειδούς, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα καρκινώματα [4], [5], [10], με τα επίπεδα έκφρασης σχεδόν εντελώς μη ανιχνεύσιμο στους περισσότερους προχωρημένους καρκίνους του θυρεοειδούς, υποθέσαμε ότι η απώλεια του γονιδίου CBX7 θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε προχωρημένα στάδια θυρεοειδούς καρκινογένεση από την επακόλουθη διαμόρφωση αυτών των γονιδίων. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε CBX7 και τα επιλεγμένα γονίδια CBX7 ρυθμίζονται σε ανθρώπινο θυρεοειδή και πνεύμονα καρκίνωμα από qRT-PCR. Όσον αφορά τα θηλώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς, FOS, Fos Β και τα γονίδια EGR1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, όπως CBX7, ενώ SPP1, SPINK1 και STEAP1 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Σχήμα 6Α). Ομοίως, η ανάλυση της έκφρασης αυτών των γονιδίων σε καρκινώματα του πνεύμονα έδειξε την ίδια συμπεριφορά (Σχήμα 6Β). Η ανάλυση συσχέτισης στην PTC και καρκινώματα του πνεύμονα (Pearson r) έδειξε την συσχέτιση μεταξύ CBX7 και τις ρυθμιζόμενες γονίδια του (PTC: FOS, p = 0,0438? Καρκινώματα του πνεύμονα: ΦΩΣ, σ & lt? 0,0001? FosB, σ & lt? 0,0001? EGR1, σ & lt? 0,0021 Σχήμα S3 και S4).

Αναλύσαμε την έκφραση της CBX7, FOS, fosB, EGR1, SPP1, SPINK1 και STEAP1 από qRT-PCR στο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (PTC) (Α) και δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος πνεύμονα (ΣΙ). Η έκφραση του FOS, Fos Β και EGR1 είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω, όπως συμβαίνει για CBX7, στις νεοπλαστικούς ιστούς σε σχέση με τις κανονικές τους ομολόγους. Αντιστρόφως, η έκφραση του SPP1, SPINK1 και STEAP1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω στα νεοπλασματικά δείγματα σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς, που παρουσιάζει μια αντίθετη τάση σε σύγκριση με εκείνη των CBX7. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως φορές μεταβολής (για PTC) ή σχετική έκφραση (για καρκινώματα του πνεύμονα) σε σχέση με ένα σύνολο κανονικών δειγμάτων τα οποία τίθεται ίση με 1. Το εύρος διακύμανσης της CBX7 και CBX7 ρυθμιζόμενη γονιδιακή έκφραση σε φυσιολογικό θυρεοειδή και στους πνεύμονες ιστούς ήταν μικρότερη από 10%.

η

Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η απώλεια της έκφρασης του γονιδίου CBX7 μπορούσαν να συμβάλουν στην εμφάνιση ενός κακοήθους φαινοτύπου με διαμόρφωση ενός συνόλου γονιδίων κρίσιμων για το στάδιο προόδου της καρκινογένεση.

Συζήτηση

έχει προηγουμένως παρατηρηθεί ότι η μειωμένη έκφραση CBX7 συνδέεται με πολλά ανθρώπινα καρκινώματα, και η πλήρης απώλεια της έκφρασης της συσχετίζεται με τα πιο προηγμένα στάδια κακοηθειών [5] – [10]. Ως εκ τούτου, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι η απώλεια της έκφρασης του CBX7 μπορεί να παίζει ένα ρόλο κλειδί στην εξέλιξη του καρκίνου. Σταθερά, CBX7 είναι σε θέση να αντισταθμίσει την μειωμένη έκφραση του γονιδίου Ε-καδερίνης οποίου η απώλεια της έκφρασης αντιπροσωπεύει ένα χαρακτηριστικό της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος [11], παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής επιθηλιακών κυττάρων μορφολογία [12], [13] .

για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο της απώλειας της γονιδιακής έκφρασης CBX7 στην εξέλιξη του καρκίνου έργο μας με στόχο να εντοπίσει τα γονίδια που ρυθμίζονται από CBX7. Στη συνέχεια, με τη χρήση ενός μικροσυστοιχιών Affymetrix cDNA, αναλύσαμε το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς κατά την οποία αποκαταστάθηκε η έκφραση CBX7, και εντοπίστηκαν διάφορα γονίδια πάνω και κάτω-ρυθμίζονται. Μεταξύ των γονιδίων up-ρυθμίζεται από CBX7 έχουμε επικεντρώσει την προσοχή μας στην FOS, fosB και EGR1.

FOS και fosB είναι μέλη του AP-1 (Ενεργοποίηση Protein 1) περίπλοκη και είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με τα μέλη του οικογένεια Ιούνιο [23]. FOS έχει ενοχοποιηθεί κυρίως στη μεταγωγή σήματος, τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων [24]. Πολλές μελέτες ανέφεραν ότι FOS διαμορφωμένα αρκετά σημαντικά γονίδια για ογκογένεση, προκαλώντας την προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων καταστολής όγκων [25] και οδηγεί σε διεισδυτική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [26]. Ωστόσο, ορισμένες πιο πρόσφατες μελέτες πρότειναν ότι FOS μπορούν επίσης να έχουν δραστικότητα καταστολής όγκων και μπορεί να έχει μια λειτουργία στην απόπτωση [17], [27].

Εκτός από FOS, Fos Β έχει επίσης δειχθεί ότι έχουν μια λειτουργία σε εξέλιξη των διαφόρων τύπων όγκου που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα του μαστού [18]. Αντιστρόφως, FOSL-1 και FOSL-2, των οποίων η υπερέκφραση οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και εισβολή στον καρκίνο του μαστού, καρκίνο του παχέος εντέρου και το μεσοθηλίωμα [28], δεν ρυθμίζεται από CBX7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).