Αφηρημένο

Ιστορικό

Το ΚΚΕ νησί methylator φαινότυπο (CIMP) είναι μια ξεχωριστή φαινότυπο που συνδέονται με μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI) και

BRAF

μετάλλαξη στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Πρόσφατες έρευνες έχουν επιλεγεί 5 προωθητές (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

) ως υποκατάστατων δεικτών για CIMP-υψηλή. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει αξιολογηθεί πλήρως ένα εκτεταμένο σύνολο δεικτών μεθυλίωσης (συμπεριλαμβανομένων αυτών των 5 δεικτών) χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο αριθμό όγκων, ή αποκρυπτογραφηθεί των σύνθετων κλινικών και μοριακών ενώσεων με CIMP-υψηλή καθορίζεται από την επικυρωμένη πίνακα δείκτη.

Metholodology /Κύρια Ευρήματα

μεθυλίωσης του DNA σε 16 νησίδες CpG [η παραπάνω 5 συν

CDKN2A

(p16),

CHFR

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, p14 (

CDKN2A

/ΤΑΠ) και

WRN

] προσδιορίστηκε ποσοτικά σε 904 παχέος εντέρου με πραγματικού χρόνου PCR (MethyLight). Σε ανεξέλεγκτους ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης, οι 5 δείκτες (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

) ,

CDKN2A

,

CRABP1

, MINT31,

MLH1

, Ρ14 και

WRN

γενικά συγκεντρωμένα μεταξύ τους και με MSI και

BRAF

μετάλλαξη.

KRAS

μετάλλαξη δεν ήταν συγκεντρωμένα με οποιοδήποτε δείκτη μεθυλίωση, γεγονός που υποδηλώνει τη σχέση της με ένα τυχαίο μοτίβο μεθυλίωσης σε CIMP-χαμηλή όγκους. Αξιοποιώντας την επικυρωμένη πίνακα δείκτη CIMP (συμπεριλαμβανομένων των 5 δεικτών), πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση έδειξε ότι CIMP-υψηλής συσχετίστηκε ανεξάρτητα με την ηλικία, εγγύς θέση, η κακή διαφοροποίηση, MSI-υψηλή,

BRAF

μετάλλαξη, και αντιστρόφως ανάλογα με LINE-1 υπομεθυλίωσης και β-κατενίνης ενεργοποίησης (

CTNNB1

). Βλεννώδες χαρακτηριστικό, κύτταρα σφραγιστικό δαχτυλίδι, και p53-αρνητικότητα συνδέθηκαν με CIMP υψηλή μόνο σε μονοπαραγοντική ανάλυση. Σε στρωματοποιημένη αναλύσεις, οι σχέσεις της CIMP-υψηλή με κακή διαφοροποίηση,

KRAS

μετάλλαξη και LINE-1 υπομεθυλίωση διέφερε σημαντικά ανάλογα με την κατάσταση MSI.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας παρέχει πολύτιμα δεδομένα για την τυποποίηση της χρήσης των CIMP-υψηλής ειδικούς δείκτες μεθυλίωση. CIMP-υψηλής ανεξάρτητα συνδέεται με κλινικά και βασικά μοριακά χαρακτηριστικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα στοιχεία μας δείχνουν επίσης ότι

KRAS

μετάλλαξη σχετίζεται με ένα τυχαίο CpG μοτίβο νησί μεθυλίωσης η οποία μπορεί να οδηγήσει σε CIMP-χαμηλή όγκους

Παράθεση:. Nosho K, Irahara Ν, Σίμα Κ, Kure S , Kirkner GJ, Schernhammer ES, et al. (2008) Περιεκτική βιοστατιστική ανάλυση των CpG νησί Methylator Φαινότυπος στον καρκίνο του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας μια μεγάλη βασισμένη στον πληθυσμό του δείγματος. PLoS ONE 3 (11): e3698. doi: 10.1371 /journal.pone.0003698

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: ενδέκατης, Ιουνίου 2008? Αποδεκτές: 24 του Οκτωβρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοέμβρη του 2008

Copyright: © 2008 Nosho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) χορηγεί P01 CA87969, P01 CA55075, Ρ50 CA127003 και Κ07 CA122826 (σε SO), και εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Ταμείο Bennett Οικογένεια και από το Entertainment Industry Foundation (ΕΤΕ), μέσω της ΕΤΕ εθνικό παχέος Cancer Research Alliance (NCCRA). Κ.Ν. υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση υποτροφία από την Ιαπωνική Εταιρεία για την Προώθηση της Επιστήμης. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του NCI ή ΝΙΗ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιγενετική εκτροπές αποτελούν σημαντικούς μηχανισμούς στην ανθρώπινη καρκινογένεση [1], [2]. Ένας αριθμός των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι σιγήσει από υποκινητή νησί CpG μεθυλίωση [3], [4]. Ένα υποσύνολο του παχέος εντέρου παρουσιάζουν εκτεταμένη μεθυλίωση προαγωγού, το οποίο αναφέρεται ως το φαινότυπο νησί methylator CpG (CIMP) [4] – [7]. έχουν CIMP-υψηλής παχέος όγκους έχουν συσχετιστεί με την ηλικία, το γυναικείο φύλο, εγγύς θέση, βλεννώδες και την κακή διαφοροποίηση, μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI),

BRAF

μετάλλαξη, υψηλής LINE-1 επίπεδο μεθυλίωσης, άγριου τύπου

TP53

, σταθερή χρωμοσώματα, και ανενεργών WNT /β-κατενίνης [8] – [23]. Ωστόσο, πολλά από αυτά τα χαρακτηριστικά είναι αλληλένδετα, και ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αναλύσει ένα μεγάλο αριθμό όγκων από πολυπαραγοντική ανάλυση για να αποκρυπτογραφήσει τις περίπλοκες σχέσεις μεταξύ CIMP-υψηλής και αυτές οι κλινικές /όγκων μεταβλητές.

Υπάρχει σημαντική ετερογένεια των όγκων σε σχέση με CpG νησί μεθυλίωση, και δεν είναι όλα τα νησιά CpG μεθυλιωθεί με παρόμοιο τρόπο σε καρκίνο του παχέος εντέρου [15]. Έτσι, η επιλογή των CpG νησίδων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τα χαρακτηριστικά της CIMP. Στην πραγματικότητα, διαφορετικά πάνελ CIMP χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μελέτες έχουν προκαλέσει μεγάλη σύγχυση [7]. Weisenberger et al. [15] έχουν προβληθεί 195 νησίδες CpG, και επιλεγμένες 5 loci (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

), το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως υποκατάστατο δείκτες για CIMP-υψηλή. Έχουμε ακόμη επικυρωθεί η χρήση των 8 δείκτες (παραπάνω 5 συν

CDKN2A

(p16),

CRABP1

και

MLH1

) ως CIMP-υψηλή διαγνωστική πίνακα [24 ]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει πλήρως έναντι αυτών CIMP-υψηλής συγκεκριμένες νησίδες CpG και άλλα νησιά CpG χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο αριθμό όγκων.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε 16 νησίδες CpG, συμπεριλαμβανομένων των νέων 5 CIMP δείκτες, καθώς και η μέντα (μεθυλιωμένο σε όγκο) δείκτες και άλλα νησιά CpG, χρησιμοποιώντας ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης σε ένα μεγάλο αριθμό των καρκίνων του παχέος εντέρου. Έχουμε, επίσης, αξιολόγησε τα χαρακτηριστικά της CIMP-υψηλών όγκων προσδιορίζεται με επικυρωμένη πίνακα δείκτη, και τις αλληλεπιδράσεις των διαφόρων κλινικών και των όγκων παράγοντες με πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης. Η μελέτη αυτή παρέχει τη λογική για την τυποποίηση των CIMP-υψηλής ειδικούς δείκτες μεθυλίωση

Μέθοδοι

Ομάδα Μελέτης

Αξιοποιήσαμε τις βάσεις δεδομένων των δύο μεγάλων προοπτικές μελέτες κοόρτης.? Μελέτη Nurses ‘Health (NHS, Ν = 121.700 γυναίκες που ακολουθείται από το 1976) [25], [26], και οι επαγγελματίες υγείας Συνέχεια Μελέτη (HPFS, Ν = 51.500 άνδρες που ακολουθείται από το 1986) [26]. Ένα υποσύνολο των συμμετεχόντων ομάδα εμφάνισαν καρκίνο του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια υποψήφιους παρακολούθησης. Έτσι, αυτές οι καρκίνοι του παχέος αντιπροσώπευαν βάσει πληθυσμού, σχετικά αμερόληπτη δείγμα (σε σύγκριση με ένα δείγμα ενός ή μερικών νοσοκομειακής-based). Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τις ομάδες έχουν περιγράψει τα αρχικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων της ομάδας και το περιστατικό του παχέος περιπτώσεις καρκίνου, και επιβεβαίωσε ότι του παχέος εντέρου μας ήταν αντιπροσωπευτικές ως δείγμα με βάση τον πληθυσμό [25], [26]. Οι κλινικές πληροφορίες που λαμβάνονται μέσω ανασκόπηση διαγραμμάτων από τους γιατρούς. Συλλέξαμε μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από τα νοσοκομεία όπου οι συμμετέχοντες είχαν υποβληθεί σε εκτομές των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου. Με βάση τη διαθεσιμότητα των κατάλληλων δειγμάτων ιστού, συμπεριλήφθηκαν συνολικά 904 παχέος περιπτώσεων καρκίνου (406 από ομάδα των ανδρών και 498 από ομάδα των γυναικών). Τα κλινικά χαρακτηριστικά των περιπτώσεων που περιγράφονται στον Πίνακα 1 (στα αριστερά, κάτω από τον τίτλο «Όλες οι περιπτώσεις» στήλη). Μεταξύ των μελετών κοόρτης μας, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα δημογραφικά χαρακτηριστικά μεταξύ των περιπτώσεων με τον ιστό διατίθενται και αυτές χωρίς διάθεση των ιστών [26]. Οι περισσότεροι όγκοι έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί για καταστάσεις της MSI, CIMP,

KRAS

,

BRAF

, p53, β-κατενίνης, LINE-1 μεθυλίωση και 14 από τους 16 δείκτες της μεθυλίωσης [19], [21], [24], [27]. Ωστόσο, καμία από τις προηγούμενες μελέτες μας έχουν εκτενώς αναλύσει τις 16 δείκτες μεθυλίωσης σε σχέση με κάθε άλλο, ανεξάρτητο ενώσεις CIMP με διάφορες κλινικές, παθολογικές ή όγκων μοριακά χαρακτηριστικά, ή αλληλεπιδράσεις των διαφόρων παραγόντων στη ενώσεων με CIMP-υψηλή από ολοκληρωμένη βιοστατιστικών μεθόδους . Η μελέτη αυτή αποτελεί ένα μοναδικό νέα μελέτη σε διάρκεια 1) ένα μεγάλο μέγεθος δείγματος? 2) η επικυρωμένη σύνολο CIMP-ειδικούς δείκτες μεθυλίωση? 3) τον αριθμό των άλλων μοριακών γεγονότων που αναλύθηκαν, περιλαμβανομένων 8 νησίδες CpG εκτός από την CIMP-ειδικούς δείκτες, MSI,

KRAS

,

BRAF

, ρ53, LINE-1 μεθυλίωση και β-κατενίνης ? και 4) περιεκτική στατιστικές αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση, λείανση σφήνες για την αξιολόγηση μη γραμμικότητα, πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση, και στρωματοποιημένη λογιστικής παλινδρόμησης. Έτσι, αυτή η μελέτη ελήφθη νέα δεδομένα από τα υπάρχοντα υλικά και τη βάση δεδομένων, ανάλογο με τα νέα μελέτες χρησιμοποιώντας τα καλά περιγραφείσες κυτταρικές γραμμές ή τα μοντέλα ποντικού. Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. συλλογή και ανάλυση των ιστών εγκρίθηκαν από το Χάρβαρντ Σχολή Δημόσιας Υγείας και Νοσοκομείου Brigham and Women της Institutional Review Boards.

Η

Παθολογική εξέταση, DNA Εξόρυξη και αλληλουχίας του

KRAS

και

BRAF

η

Για όλες τις περιπτώσεις, παθολογική χαρακτηριστικά, όπως η διαφοροποίηση του όγκου, βλεννώδες χαρακτηριστικά και τα κύτταρα σφραγιστικό δαχτυλίδι εξετάστηκαν από έναν παθολόγο (SO). Κακή διαφοροποίηση ορίστηκε ως η παρουσία ρ53 με S.O.) αγνοούν άλλα δεδομένα. Τυχαία δείγματα των 402 και 118 όγκους επανεξετάστηκαν για β-κατενίνης και p53, αντίστοιχα, από ένα δεύτερο παρατηρητή (β-κατενίνης από ΑΑ, p53 από KN) αγνοούν άλλα δεδομένα, και οι concordances μεταξύ των δύο παρατηρητών ήταν 0,83 για την β-κατενίνης (κ = 0,65, p & lt? 0,0001), και 0,87 για το p53 (κ = 0,75, p & lt? 0,0001)., δείχνοντας ουσιαστική συμφωνία

Στατιστική ανάλυση

για την ανάλυση διασποράς των βιοδεικτών συμπεριλαμβανομένων των 16 δεικτών μεθυλίωσης, MSI,

KRAS

και

BRAF

, χρησιμοποιήσαμε μέσο σύνδεσης ιεραρχική συσταδοποίηση με Ευκλείδεια μετρική απόστασης όπως εφαρμόζεται σε MeV (https://www.tm4.org) [36]. Η chi square test χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τη σύνδεση μεταξύ CIMP και άλλες κατηγορικές μεταβλητές ενδιαφέροντος. Το t-test υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις εκτελέστηκε για σύγκριση με μέσο όρο ηλικίας και μέση LINE-1 επίπεδο μεθυλίωσης. Ο συντελεστής κ υπολογίστηκε για την αξιολόγηση συμφωνία μεταξύ κάθε ένα από τα 16 δείκτες (θετικά έναντι αρνητικών) και το 16-δείκτη CIMP πίνακα (CIMP-υψηλής θετικά έναντι αρνητικών).

Για να εξετάσει τις σχέσεις μιας δεδομένης μεταβλητή και CIMP-υψηλή, χρησιμοποιήσαμε άνευ όρων μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης για τον υπολογισμό των λόγων πιθανοτήτων (OR) για CIMP-υψηλές, ανάλογα με την κατάσταση της δεδομένης μεταβλητής, αδιόρθωτη και προσαρμοσμένο για την ηλικία, το φύλο, τη θέση του όγκου, το στάδιο, διαφοροποίηση, LINE- επίπεδο 1 μεθυλίωση, και την κατάσταση της MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53 και β-κατενίνης. Για να ρυθμίσετε για ενδεχόμενους δημιουργούν σύγχυση, την ηλικία και το επίπεδο μεθυλίωσης LINE-1 χρησιμοποιήθηκαν ως συνεχείς μεταβλητές, και όλα τα άλλα μεταβλητές χρησιμοποιήθηκαν ως κατηγορικές μεταβλητές.

Για την ηλικία και LINE-1, αξιολογήσαμε μη γραμμικότητα με η δοκιμή αναλογία πιθανότητα ότι σε σύγκριση με ένα μοντέλο παλινδρόμησης που περιλαμβάνει ένα τετραγωνικό (ή κυβικά) διάρκειας με ένα μοντέλο εκτός από αυτό. Η δοκιμή αναλογία πιθανότητα προέκυψε ότι η συμπερίληψη του τετραγωνικού όρου δεν μετέβαλε σημαντικά μοντέλο ταιριάζει (p = 0,86 για την ηλικία, p = 0,078 για το LINE-1), και ότι η συμπερίληψη της κυβικό όρος δεν μετέβαλε σημαντικά μοντέλο ταιριάζει (p = 0,87 για την ηλικία , p = 0,084 για το LINE-1). Εξετάσαμε, επίσης, τη δυνατότητα ενός μη-γραμμική σχέση μεταξύ της ηλικίας (ή LINE-1 μεθυλίωση) και CIMP-υψηλής, μη παραμετρικά με περιορισμένη κυβικών splines [37].

διχοτομήθηκε θέση του όγκου (εγγύς vs. άπω), η διαφοροποίηση του όγκου (φτωχοί εναντίον και /μέτρια), κύτταρα σφραγιστικό δαχτυλίδι (παρούσα εναντίον απούσα), MSI (υψηλή έναντι μη-MSI-υψηλή), p53 (θετικά έναντι αρνητικών),

KRAS

(μεταλλαγμένο εναντίον άγριου τύπου),

BRAF

(μεταλλαγμένο εναντίον άγριου τύπου) και β-κατενίνης (ενεργές εναντίον ανενεργό). Υπήρχαν 3 κατηγορίες για βλεννώδες χαρακτηριστικό (0%, 1-49%, και ≥50%) στην αρχική κύρια ανάλυση (Πίνακας 2). Εμείς διχοτομήθηκε βλεννώδες χαρακτηριστικό (παρούσα εναντίον απούσα) στη δευτεροβάθμια στρωματοποιημένη αναλύσεις και αναλύσεις των αλληλεπιδράσεων, επειδή πολυπαραγοντική OR για CIMP-υψηλή ήταν παρόμοια σε όλη την 1-49% βλεννώδες και ≥50% βλεννώδες κατηγορίες (σε σχέση με την μη βλεννώδες κατηγορία ). Υπήρχαν 4 κατηγορίες για το στάδιο (Ι, II, III και IV) στην αρχική κύρια ανάλυση (Πίνακας 2). Εμείς διχοτομήθηκε το στάδιο του όγκου (Ι εναντίον II-IV) στη δευτεροβάθμια στρωματοποιημένη αναλύσεις και αναλύσεις των αλληλεπιδράσεων, επειδή πολυπαραγοντική OR για CIMP-υψηλή ήταν παρόμοια σε όλη σταδίου ΙΙ-IV (σε σχέση με το στάδιο Ι).

Η

Όταν υπήρχε λείπουν πληροφορίες σχετικά με το στάδιο του όγκου (12%), LINE-1 (3,9% που λείπει), MSI (3,2% που λείπει), ρ53 (1,3% που λείπει),

KRAS

(2,3% που λείπει) ή

BRAF

(4,7% που λείπει), βάλαμε ένα ξεχωριστό ( «λείπει») μεταβλητή δείκτη και περιλαμβάνονται εκείνες τις περιπτώσεις στα μοντέλα πολυπαραγοντική ανάλυση. Επιβεβαιώσαμε ότι εκτός από περιπτώσεις με λείπει μεταβλητή δεν μετέβαλε σημαντικά αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν υπήρχε πληροφορίες που λείπουν σε άλλες μεταβλητές

Μια ένωση της κάθε μεταβλητής με CIMP-υψηλής αξιολογήθηκε επίσης σε στρώματα των σημαντικών κλινικών ή μοριακά χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία (& lt?. 65 χρόνια παλιά εναντίον ≥65 ετών ), το φύλο, τη θέση του όγκου (εγγύς εναντίον περιφερική), κατάσταση MSI, και

BRAF

κατάσταση. Για στρωματοποιημένη ανάλυση, κάθε πολυπαραγοντικό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης περιλαμβάνεται μια μεταβλητή ενδιαφέροντος που διαστρωματώθηκε από ένα δεδομένο διαστρωμάτωση μεταβλητή (π.χ., ηλικία) και ρυθμίζεται για όλες τις υπόλοιπες μεταβλητές (κωδικοί SAS διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος).

Ένα αλληλεπίδραση αξιολογήθηκε με τη συμπερίληψη του όρου σταυρό προϊόν μιας δεδομένης μεταβλητής (π.χ., MSI) και μια άλλη μεταβλητή που μας ενδιαφέρει σε ένα μοντέλο παλινδρόμησης, και η δοκιμή του λόγου πιθανοφάνειας σύγκριση ένα μοντέλο που περιέχουν τον όρο εγκάρσια προϊόν με ότι με εξαίρεση. Εκτός από τις αλληλεπιδράσεις του κάθε δεδομένη μεταβλητή με MSI, τοποθεσία, την ηλικία, το φύλο και

BRAF

, εξετάσαμε όλα τα πιθανά υπόλοιπα αμφίδρομη αλληλεπιδράσεις, και δεν βρέθηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις εκτός για ανάλυση ομαδοποίησης που χρησιμοποιούνται SAS έκδοση 9.1 (SAS Institute, Cary, NC). Όλες οι τιμές ρ ήταν δύο όψεων, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p ≤ 0,05. Παρ ‘όλα αυτά, τον έλεγχο πολλαπλές υποθέσεις θεωρήθηκε κατά την ερμηνεία των δεδομένων, ιδίως κατά την εξέταση πολλαπλών αμφίδρομη αλληλεπίδραση.

Αποτελέσματα

Η αξιολόγηση των 16 δεικτών μεθυλίωσης

Έχουμε λάβει 904 καρκίνου του παχέος εντέρου δείγματα και ποσοτικοί μεθυλίωση του DNA στους 16 τόπους [

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

MLH1

,

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, p14 (

CDKN2A

/ΤΑΠ), και

WRN

] με PCR πραγματικού χρόνου (MethyLight [30]) προσδιορισμούς. Το πρώτο 5 θέσεις (μέχρι

SOCS1

) επιλέχθηκαν ως καλή πρόβλεψης της CIMP (CpG φαινότυπο νησί methylator) με διαλογή των 195 CpG νησίδων [15]. Η χρήση της πρώτης 8 θέσεις (μέχρι

MLH1

) ως CIMP-υψηλή διαγνωστική ομάδα έχει ήδη επικυρωθεί [24].

Για την αξιολόγηση 16 δείκτες μεθυλίωση σε μια αμερόληπτη μόδας, εμείς διεξήγαγε μια ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης των 16 δεικτών μεθυλίωσης και την κατάσταση της MSI (μικροδορυφόρων αστάθεια), και

KRAS

και

BRAF

ογκογονίδια, χρησιμοποιώντας 860 όγκους με όλα αυτά τα διαθέσιμα αποτελέσματα (Σχήμα 1 ). Οι 8 CIMP-υψηλών δεικτών (

CACNA1G

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

) ήταν γενικά συγκεντρωμένα μαζί, δείχνοντας καλή συμφωνία των προτύπων μεθυλίωσης σε αυτούς τους δείκτες και την υποστήριξη αυτών των 8 δείκτες τόσο καλή CIMP-υψηλής δείκτες. Επιπλέον, Ρ14, MINT31 και

WRN

επίσης συγκεντρωμένα με τα 8 δείκτες. Τα άλλα 5 δείκτες μεθυλίωσης (

MGMT

,

HIC1

,

CHFR

, MINT1 και

IGFBP3

) δεν ήταν συγκεντρωμένα στενά μεταξύ τους ή με το 8 δείκτες. Η

BRAF

και μεταβλητές MSI, οι οποίες είναι γνωστό ότι σχετίζονται με CIMP-υψηλή [15], [18], [24], επίσης συγκεντρωμένα μαζί με αυτά τα 8 δείκτες, δείχνει σφιχτό ενώσεις με CIMP- ψηλά. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

KRAS

μετάλλαξη δεν ήταν συγκεντρωμένα με οποιονδήποτε από τους δείκτες μεθυλίωσης, γεγονός που υποδηλώνει τη σύνδεσή της με ένα τυχαίο σχέδιο μεθυλίωσης (ιδιαίτερα σε CIMP-χαμηλό όγκων που έχουν συσχετιστεί με το

KRAS

μετάλλαξη [29 ]? βλέπε επίσης Συμπληρωματικό σχήμα S1). Χρησιμοποιήσαμε ομαδοποίηση ανάλυση μόνο για την εξέταση της ομαδοποίησης δείκτη, αλλά όχι για την ταξινόμηση των όγκων. Αυτό ήταν επειδή η ομαδοποίηση των δεικτών ήταν πολύ σταθερή με το μεγάλο αριθμό των όγκων (δηλαδή, εκτός από μερικές όγκοι δεν επηρέασε σημαντικά τα αποτελέσματα), ενώ η ταξινόμηση των όγκων από ομαδοποίηση ανάλυση με βάση τα 16 δείκτες δεν ήταν σταθερή.

Οριζόντια και των κάθετων αξόνων αντιπροσωπεύουν δείκτες και περιπτώσεις, αντίστοιχα. Η διευρυμένη άποψη του δέντρου ομαδοποίησης για τους δείκτες παρουσιάζεται στα δεξιά. Οι 8 δείκτες σε CIMP-υψηλή διαγνωστική οθόνη μας (

CACNA1G

,

IGF2

,

RUNX3

,

MLH1

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

και

NEUROG1

) είναι συγκεντρωμένα στενά, υποστηρίζοντας ότι αυτοί οι δείκτες είναι καλοί CIMP-υψηλής δείκτες. Επίσης, σημειώστε τη στενή σχέση μεταξύ της MSI,

BRAF

και τα 8 CIMP-υψηλής δείκτες.

KRAS

μετάλλαξη δεν είναι συγκεντρωμένα με οποιονδήποτε από τους δείκτες μεθυλίωσης αναλύεται, γεγονός που υποδηλώνει ότι

KRAS

μετάλλαξη (η οποία συνδέεται με CIMP-χαμηλή [24], [29]? Δείτε Συμπληρωματικό σχήμα) είναι πιθανώς σχετίζεται με ένα τυχαίο μοτίβο μεθυλίωσης.

Η

για να περιγράψει την απόδοση του καθενός από τα 16 δείκτες με αμερόληπτο τρόπο, υπολογίσαμε κ συντελεστή (για τις στατιστικές συμφωνίας), ευαισθησία και ειδικότητα του κάθε κατασκευαστή για CIMP- υψηλή διάγνωση καθορίζεται από τους 16 δείκτες (Συμπληρωματικό Πίνακας S1). Η οριακή τιμή για CIMP-υψηλής ορίστηκε ως ≥11 /16 ή ≥10 /16 μετουσιωμένο δείκτες με βάση την κατανομή του

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις (Συμπληρωματικό σχήμα), και στην προηγούμενη ευρήματα που CIMP-υψηλή συνδέεται με

BRAF

μετάλλαξη και CIMP-χαμηλό συνδέεται με

KRAS

μετάλλαξη [24], [29]. Η ευαισθησία και η ειδικότητα του κάθε δείκτη αντανακλάται συνολική συμφωνία ενός προτύπου μεθυλίωσης με τις υπόλοιπες 15 δείκτες. Ήταν φανερό ότι οι επιδόσεις των δεικτών CIMP πίνακα 8 (

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

) ήταν γενικά καλή. Ο συντελεστής κ ήταν μεγαλύτερη από 0,5 για όλες αυτές τις 8 δεικτών.

RUNX3

ήταν το ενιαίο καλύτερο δείκτη για CIMP-υψηλής διάγνωση. Μεταξύ των άλλων 8 δείκτες (

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, Ρ14 και

WRN

), μόνο MINT31 και Ρ14 έδειξε με συνέπεια τον συντελεστή κ μεγαλύτερη από 0,5, και καλή ευαισθησία /ειδικότητα. Αυτό ήταν σε συμφωνία με την ανάλυση ομαδοποίησης, η οποία έδειξε ότι MINT31 και p14 σε σύμπλεγμα με τους δείκτες CIMP πίνακα 8.

Συγκρίναμε επίσης τον πίνακα all-16-δείκτη με την 8-δείκτη CIMP πίνακα. Χρησιμοποιώντας τον πίνακα 8-maker, ή το πλαίσιο της 16-maker, CIMP-υψηλής ορίστηκε ως ≥6 /8 ή ≥11 /16 μετουσιωμένο δείκτες, αντίστοιχα. Μεταξύ των 904 περιπτώσεων, 879 περιπτώσεις (97,2%) παρουσίασαν σύμφωνη διάγνωση της κατάστασης CIMP μεταξύ του πίνακα 16-δείκτη και τον πίνακα 8-δείκτη (κ = 0,89, p & lt? 0,0001). Όταν χρησιμοποιήθηκε το 16-δείκτη CIMP πίνακα, οι ενώσεις CIMP-υψηλή με κλινικά και μοριακά χαρακτηριστικά ήταν πολύ παρόμοια με τα CIMP υψηλή ενώσεις από την 8-δείκτη CIMP πίνακα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιβεβαιώσαμε επίσης ένα υψηλό βαθμό συμφωνίας (98,6% συμφωνούν? Κ = 0,94) μεταξύ του πίνακα 8-δείκτη και τον πίνακα 5-δείκτη που περιγράφεται από Weisenberger et al. [15]. Έτσι, στις επόμενες αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε την 8-δείκτη CIMP πίνακα που είχαμε εκτενώς επικυρωθεί [24].

CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Εμείς αξιολογούνται κλινική, παθολογική και μοριακά χαρακτηριστικά του CIMP-υψηλής ορθοκολικού καρκίνου (Πίνακας 1). Με μονοπαραγοντική ανάλυση, CIMP υψηλής συνδέθηκε με το γυναικείο φύλο, ηλικία, εγγύς θέση, η κακή διαφοροποίηση, βλεννίνη, τα κύτταρα σφραγιστικό δαχτυλίδι, MSI-υψηλής και

BRAF

μετάλλαξη, και αντιστρόφως ανάλογα με το στάδιο Ι,

KRAS

μετάλλαξη, LINE-1 υπομεθυλίωση, θετική p53, και ενεργά β-κατενίνης (όλα τα p & lt? 0.004).

η ηλικία ήταν γραμμικά σχετίζεται με CIMP-υψηλή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (σ για τάση & lt? 0.0001). Εμείς δεν έδειξε σημαντική μη γραμμικότητα από τη δοκιμή λόγου πιθανότητα ότι σε σύγκριση με ένα μοντέλο που περιλαμβάνει ένα τετραγωνικό (ή κυβικά) διάρκειας με ένα μοντέλο εκτός από αυτό (p & gt? 0,85). Ομοίως, LINE-1 υπομεθυλίωση αντίστροφα γραμμικά σχετίζεται με CIMP-υψηλή (σ για τάση & lt? 0,0001), και δεν υπήρχε σημαντική μη γραμμικότητα από τη δοκιμασία του λόγου πιθανοτήτων, χρησιμοποιώντας μια τετραγωνική (ή κυβικά) όρος (p≥0.078) . περιορίζεται μη-παραμετρικές κυβικών splines υποστήριξε επίσης μια γραμμική σχέση μεταξύ της ηλικίας και CIMP-υψηλή (Εικόνα 2) και μια αντίστροφη γραμμική σχέση μεταξύ LINE-1 υπομεθυλίωσης και CIMP-υψηλή (Σχήμα 3).

Σύνδεση

e (OR για CIMP-υψηλή) (y άξονας) ανάλογα με την ηλικία (άξονας x) παρουσιάζεται (με το νεαρό της ηλικίας ως αντικείμενο αναφοράς). Διακεκομμένες γραμμές δείχνουν διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Σημειώστε τη γραμμική σχέση μεταξύ της ηλικίας και CIMP-υψηλής. CIMP, CpG φαινότυπο νησί methylator? Ή, λόγος πιθανοτήτων.

Η

Σύνδεση

ε (OR για CIMP-υψηλή) (άξονας y) σύμφωνα με LINE-1 μεθυλίωσης (άξονας x) παρουσιάζεται (με υψηλού επιπέδου LINE-1 μεθυλίωση ως αντικείμενο αναφοράς). Διακεκομμένες γραμμές δείχνουν διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Σημειώστε την αντίστροφη γραμμική σχέση μεταξύ LINE-1 υπομεθυλίωσης και CIMP-υψηλής. CIMP, CpG φαινότυπο νησί methylator? LINE-1, μακράς διάσπαρτες νουκλεοτίδιο στοιχείο-1? Ή, λόγος πιθανοτήτων.

Η

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, CIMP-υψηλής συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία, εγγύς θέση, η κακή διαφοροποίηση, MSI-υψηλής και

BRAF

μετάλλαξη, και αντιστρόφως με ενεργή β-κατενίνης και LINE-1 υπομεθυλίωσης (Πίνακας 2). Ωστόσο, όλα τα άλλα χαρακτηριστικά (θηλυκό, το στάδιο, βλεννίνη, τα κύτταρα σφραγιστικό δαχτυλίδι,

KRAS

και p53) δεν ήταν πλέον σημαντικά που συνδέονται με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε πολυπαραγοντική ανάλυση. Εξετάσαμε περαιτέρω για πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες στην ένωση της κάθε μεταβλητής με CIMP-υψηλή. Εκτός από το φύλο, όλες οι άλλες μεταβλητές παρουσίασαν ουσιαστικές μεταβολές στην αναλογία πιθανοτήτων (OR) για τη σύνδεση με CIMP-υψηλή μετά την προσαρμογή για το MSI,

BRAF

ή /και τη θέση του όγκου (ή άλλων μεταβλητών) (Πίνακας 2 ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν την ύπαρξη πολύπλοκων σχέσεων μεταξύ της κλινικής και μοριακής χαρακτηριστικά (συμπεριλαμβανομένων CIMP) σε καρκίνο του παχέος εντέρου, οι οποίες συνοψίζονται στο Σχήμα 4.

Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει την σχετικά αδύναμη συσχέτιση.

Η

Σύλλογοι με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε στρώματα της MSI

Μοριακή ταξινόμηση με βάση την κατάσταση MSI είναι ολοένα και πιο σημαντικό σε καρκίνο του παχέος εντέρου [38] – [40]. Έτσι, εξετάστηκαν οι σχέσεις των κλινικών και όγκων μεταβλητές με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε MSI-υψηλής όγκους και μη-MSI-υψηλής όγκους (Πίνακας 3). Μεγαλύτερη ηλικία, εγγύς θέση και

BRAF

μετάλλαξη συσχετίστηκε σημαντικά με τον CIMP-υψηλή και στις δύο MSI-υψηλής και μη-MSI-υψηλών όγκων. Σε αντίθεση, οι σχέσεις της CIMP-υψηλή με κακή διαφοροποίηση,

KRAS

μετάλλαξη και LINE-1 υπομεθυλίωση φάνηκε να είναι διαφορετική ανάλογα με την κατάσταση MSI (σ για την αλληλεπίδραση & lt? 0.005). CIMP υψηλής συσχετίστηκε με κακή διαφοροποίηση και αντίστροφα με

KRAS

μετάλλαξη σε MSI-υψηλής όγκους, αλλά όχι σε μη MSI-υψηλής όγκους. LINE-1 υπομεθυλίωση συσχετίστηκε αντίστροφα με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε μη-MSI-υψηλών όγκων, αλλά όχι σε MSI-υψηλών όγκων.

Η

Σύλλογοι με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε στρώματα της θέσης του όγκου

υπάρχουν συσσωρεύει ενδείξεις για μοριακή διαφορά μεταξύ εγγύς και άπω του παχέος εντέρου [38], [41]. Επομένως, εξετάσαμε τις σχέσεις των κλινικών και όγκων μεταβλητές με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε εγγύς και άπω όγκους όγκους (Πίνακας 4). Οι σχέσεις της CIMP-υψηλό με τις μεταβλητές δεν φαίνεται να διαφέρουν ανάλογα με την τοποθεσία του όγκου (όλα σ για την αλληλεπίδραση & gt? 0,23).

Η

Σύλλογοι με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε άλλα στρωματοποιημένη ανάλυση

Εξετάσαμε τις σχέσεις των κλινικών και των όγκων μεταβλητές με CIMP-υψηλή περιεκτικότητα σε στρώματα του φύλου, της ηλικίας (& lt? 65χρονος εναντίον ≥65 ετών) και

BRAF

κατάσταση. Λαμβάνοντας υπόψη πολλαπλές δοκιμές υποθέσεων (δοκιμή 12-υποθέσεις το καθένα), η επίδραση των μεταβλητών δεν φαίνεται να διαφέρουν σημαντικά ανάλογα με την ηλικία (όλα σ για την αλληλεπίδραση & gt? 0,03) και το φύλο (όλα σ για την αλληλεπίδραση & gt? 0,02). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επίδραση της LINE-1 υπομεθυλίωση φάνηκε να διαφέρουν ανάλογα με το

BRAF

κατάσταση (p αλληλεπίδρασης = 0,001) (Πίνακας 5). Μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση της LINE-1 υπομεθυλίωσης με CIMP-υψηλό ήταν παρούσα σε

BRAF

-mutated όγκους [προσαρμογή OR = 0.022? 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI), 0,003 – 0,17], αλλά όχι σε

BRAF

όγκους -wild τύπου (προσαρμογή OR = 0,87? 95% CI, 0,25 έως 3,06)

Η

Εξετάσαμε επίσης όλες τις υπόλοιπες πιθανές αμφίδρομη αλληλεπιδράσεις με τα διαθέσιμα κλινικά και όγκων μεταβλητές, και δεν διαπίστωσε σημαντικές αλληλεπιδράσεις σε σχέση με τις ενώσεις με CIMP-υψηλή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο μέγεθος δείγματος, αξιολογήσαμε 16 ιθύνοντες μεθυλίωση σε μια αμερόληπτη μόδας. Οι 16 δείκτες μεθυλίωσης περιλαμβάνονται οι 5 δείκτες (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

και

SOCS1

) ότι επιλέχθηκαν με διαλογή των 195 CpG νησίδων [15] και την περαιτέρω επικυρώνονται να συμπεριληφθούν στο CIMP-υψηλή διαγνωστική πίνακα (τα παραπάνω 5 συν

CDKN2A

,

CRABP1

και

MLH1

) [24]. Από ανεξέλεγκτους ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης, οι 5 δείκτες μεθυλίωση ήταν συγκεντρωμένα μεταξύ τους καθώς και με MSI (μικροδορυφόρων αστάθεια) και

BRAF

μετάλλαξη. Ανάλυση κ συντελεστή, ευαισθησία και ειδικότητα έδειξαν επίσης καλές επιδόσεις από τους 5 δείκτες μεθυλίωση με γενικά συγκλίνουσες πρότυπο μεθυλίωσης. Αξιοποιώντας την επικυρωμένη πίνακα CIMP, έχουμε αποκρυπτογραφήσει τις περίπλοκες σχέσεις της CIMP-υψηλή με διάφορες κλινικές, παθολογικές και μοριακά χαρακτηριστικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα μας παρέχει μια λογική για το του επικυρωμένου CIMP ειδικό πίνακα δείκτη μεθυλίωσης.

Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη εκτεταμένη έρευνα για να συγκρίνουν τα 5 νέα CIMP-υψηλής δείκτες [15] με MINT1, MINT31 και άλλα νησιά CpG , χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο μέγεθος δείγματος. Απόδοση των 5 νέων δεικτών (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

, και

SOCS1

), <