Αφηρημένο

Παρά την αυξημένη κατανόηση του καρκίνου του παχέος εντέρου και την εισαγωγή των στοχευμένων φαρμακευτική θεραπεία, η μεταστατική φάση της νόσου παραμένει ανθεκτική στη θεραπεία. Δεδομένου ότι η απορρύθμιση των κανονικών απόπτωσης συμβάλλει στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου, τα νέα νουκλεοσιδικά ανάλογα συντέθηκαν εδώ και αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να επάγουν την απόπτωση και να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο σε δύο κυτταρικές σειρές ορθοκολικού αδενο-καρκίνωμα, Caco-2 και ΗΤ-29. Τρία νέα νουκλεοσιδικά ανάλογα αξιολογείται εδώ έδειξε κυτταροτοξική δραστικότητα, όπως μετράται με την ΜΤΤ δοκιμασία έναντι αμφοτέρων των κυτταρικών σειρών: οι IC

50 τιμές κυμαίνονταν μεταξύ 3 και 37 μΜ, με κύτταρα Caco-2 είναι πιο ευαίσθητη από κύτταρα ΗΤ-29. Σε σύγκριση με την καμπτοθεκίνη, το θετικό μάρτυρα, τα νουκλεοσιδικά ανάλογα ήταν σημαντικά λιγότερο τοξική σε κανονικά μη διεγερμένα λευκοκύτταρα (

σ

& gt? 0,05). Επιπλέον, οι νουκλεοζίτες ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση όπως μετράται από την αύξηση της δραστηριότητας της κασπάσης 8 και κασπάσης 3 πάνω από εκείνη του μάρτυρα. Αυτό επιπλέον υποστηρίζεται από στοιχεία που προέρχονται από δοκιμασίες Annexin V-FITC. Παρά τις οριακές μεταβολές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, και οι τρεις νουκλεοζίτες προκάλεσε σημαντική αύξηση στο κυτοσολικό κυτοχρώματος c (

σ

& gt? 0,05), με αντίστοιχη μείωση της μιτοχονδριακής κυτοχρώματος c. Μορφολογική ανάλυση των δύο κυτταρικές σειρές έδειξε την ταχεία εμφάνιση κενοτοπίων μετά από έκθεση σε δύο από τα νουκλεοσίδια, ενώ μια τρίτη προκαλείται κυτταρική αποκόλληση, καθυστερημένη κυτταροπλασματική κενοτοπιώδη και πυρηνική ανωμαλίες. Προκαταρκτικές έρευνες, με τη χρήση της αυτοφαγικά monodansylcadaverine δείκτη και χλωροκίνη ως θετικός έλεγχος, έδειξε ότι δύο από τους νουκλεοζίτες που επάγεται ο σχηματισμός αυτοφαγικά κενοτόπια. Συνοπτικά, τα νέα νουκλεοσιδικά ανάλογα έδειξαν εκλεκτική κυτταροτοξικότητα προς τα δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές και είναι αποτελεσματικοί εκκινητές ενός ασυνήθιστου αποπτωτική απόκριση, καταδεικνύοντας το δυναμικό τους για να χρησιμεύσει ως δομική ικριώματα για περισσότερο ισχυρές ανάλογα

Παράθεση:. Harmse L, Dahan -Farkas Ν, Παναγίδης JL, van Otterlo W, Penny C (2015) Η ανώμαλη αποπτωτική απόκριση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου σε νέα νουκλεοσιδικά ανάλογα. PLoS ONE 10 (9): e0138607. doi: 10.1371 /journal.pone.0138607

Επιμέλεια: Ferenc Gallyas Jr., του Πανεπιστημίου Pecs Ιατρική Σχολή, ΟΥΓΓΑΡΙΑ

Ελήφθη: 28 Φλεβάρη 2015? Δεκτές: 1 Σεπ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτέμβρη 2015

Copyright: © 2015 Harmse et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα δεδομένα περιέχονται στο χειρόγραφο και δικαιολογητικά στοιχεία

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ερευνητικό θέσεων τομείς του προγράμματος του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών (NRF) της Νότιας Αφρικής και το Πανεπιστήμιο του Witwatersrand Σχολής Θετικών Επιστημών Επιτροπής Ερευνών Υγείας . JLP υποστηρίχθηκε από την εν ανεπαρκεία Πρόγραμμα Skill NRF για τις μελέτες προς ένα Ph.D. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

έχει υπάρξει σημαντική πρόοδος στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο, παρά την χρήση των στοχευμένων φαρμακευτικής θεραπείας, ορθοκολικό καρκίνο παραμένει συνδεδεμένη με κακή πρόγνωση. Ενώ φάρμακα όπως το bevacizumab έχουν βελτιώσει την περίοδο επιβίωσης για μεταστατική νόσο πέραν 20 μήνες, δεν ήταν σε θέση να επηρεάσει μια θεραπεία. Πρόσφατα, οι κλινικές δοκιμές έχουν δείξει την αποτυχία των αναστολέων της κινάσης της τυροσίνης, όπως sunitinib, που προκάλεσε αύξηση στη σοβαρότητα και τη συχνότητα των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών του φαρμάκου με ελάχιστη θεραπευτικό όφελος [1]. Ως εκ τούτου, η έρευνα για αποτελεσματικούς παράγοντες για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του παχέος εντέρου παραμένει προτεραιότητα.

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η κανονική αποπτωτική διεργασία είναι δυσλειτουργικό σε καρκίνο του παχέος εντέρου [2-5]. Δυσλειτουργία της απόπτωσης συμβάλλει στην ανάπτυξη της αντίστασης σε χημειοθεραπεία και κακή πρόγνωση [6]. Η απόπτωση, όπως περιγράφεται για πρώτη φορά από το 1972 Kerr [7], χαρακτηρίζεται από έναν αριθμό μορφολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων διόγκωση του πλάσματος της μεμβράνης, συμπύκνωση χρωματίνης, πυρηνική κατακερματισμό και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων. Σφραγίδες της απόπτωσης περιλαμβάνει την έκθεση της φωσφατιδυλσερίνης στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος [8, 9], οι αλλαγές σε διαπερατότητα μιτοχονδριακής μεμβράνης [10] και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από το μιτοχονδριακό διάστημα μεταξύ της μεμβράνης, με την επακόλουθη ενεργοποίηση των τελεστών κασπάσες [11].

η απόπτωση είναι ουσιώδης για τη ρύθμιση της φυσιολογικής ανανέωσης των κυττάρων του εντερικού επιθηλίου. Ωστόσο, σε καρκίνο του παχέος εντέρου, τόσο η εξωγενής και οι εγγενείς αποπτωτικών οδών διακυβεύονται ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, παρά έκφραση υποδοχέα FAS, τα κύτταρα είναι ανθεκτικά σε συνδέτη FAS απόπτωση υποδηλώνει ελάττωμα σε FAS μεσολάβηση σηματοδότηση [12]. TNF που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL) προκαλούμενη από υποδοχέα απόπτωσης κανονικά ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκινικά κύτταρα? Ωστόσο, σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αντοχή στον υποδοχέα TRAIL απόπτωση που διαμεσολαβείται έχει παρατηρηθεί [13]. Το προϊόν ογκοκατασταλτικού γονιδίου ρ53 είναι μεταλλαγμένο ή απουσιάζει στο 85% των καρκίνων του παχέος. Αυτός ο παράγοντας μεταγραφής είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού αποπτωτικό καθώς και την έκφραση του αναστολέα κυκλίνης ρ21 εξαρτώμενη από την κινάση

WAF1 /Cip1. Κύτταρα τα οποία είναι ελαττωματικά σε ρ53 έχουν μειωμένα επίπεδα αποπτωτικών πρωτεϊνών, ευνοώντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων [14].

Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες που είναι σε θέση να διεγείρει απόπτωση είναι επωφελείς, επειδή επιφέρουν τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων χωρίς προκαλώντας τη φλεγμονώδη απόκριση και την σύνδρομο λύσης όγκου που συνδέονται με νέκρωση. Τα νουκλεοσιδικά ανάλογα χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του καρκίνου και τη διαχείριση ιογενείς λοιμώξεις όπως ο έρπης και HIV. Φάρμακα που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε καρκίνους όπου αυτά είναι αποτελεσματικά [15].

Στην παρούσα μελέτη, τα νέα νουκλεοσιδικά ανάλογα ελέγχθηκαν έναντι καρκινικών κυτταρικών σειρών δύο κόλου, για τη διερεύνηση τόσο κυτταροτοξικά αποτελέσματα τους και το δυναμικό τους να επάγουν απόπτωση. Δείξαμε ότι παρά δείχνει σχετικά υψηλό IC

50 τιμές, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ, μερικοί νουκλεοσιδικά ανάλογα ήταν συγκρίσιμες με καμπτοθεκίνη σε σχέση με την ικανότητά τους να επάγουν απόπτωση. Επιπλέον, οι ενώσεις που προκαλείται από μια ασυνήθιστη μιτοχονδριακή απάντηση που μπορεί να παρέχει περαιτέρω ενδείξεις για τις υποκείμενες αποπτωτικών ανωμαλίες σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ΗΤ-29 (ΗΤΒ -38 ™) και Caco-2 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές που λαμβάνονται από την ATCC (ΗΤΒ-37 ™), καλλιεργήθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης ϋυΐββοοο Modified Eagle Medium του (DMEM) το οποίο περιείχε 5% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση. μέσο καλλιέργειας και ορό εμβρύου μόσχου ελήφθησαν από Highveld Biologicals, Νότια Αφρική. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας και επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές υποκαλλιεργήθηκαν όταν έφθασαν συρροή. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό 10 ml φωσφορικού ρυθμιστικού ακολουθούμενο από την προσθήκη 4 ml τρυψίνης και η επώαση στους 37 ° C για 10 λεπτά. Πωλείται κύτταρα επανασπάρθηκαν στην ίδια φιάλη. Η καμπτοθεκίνη (Sigma), ένα γνωστό επαγωγέα απόπτωσης, και ένας αναστολέας της τοποϊσομεράσης-1, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες.

Αξιολόγηση της κυτταρικής βιωσιμότητας

Αξιολόγηση της δοκιμής νουκλεοζίτη κυτταροτοξικότητα εκτελέστηκε από την 3- (2-υλ 4,5-διμεθυλθειαζολ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου, (ΜΤΤ), δοκιμασία (Sigma). Η δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων πριν από την επίστρωση κυττάρων για νουκλεοζίτη προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων σε πυκνότητα κυττάρων 9 000 κύτταρα /φρεάτιο, αφέθηκαν να προσκολληθούν στην επιφάνεια ανάπτυξης για 4 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται στα νουκλεοσίδια δοκιμής για 48 ώρες σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 1 και 120 μΜ. Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφεται από τον Mossman [16] με την εξαίρεση των διάλυση των κρυστάλλων φορμαζάνης σε DMSO. Εν συντομία, μετά την επώαση με ΜΤΤ, 100 μΙ μέσο αντικαταστάθηκε με DMSO για να διευκολυνθεί η διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η απορρόφηση των διαλυτοποιημένων κρυστάλλων φορμαζάνης μετρήθηκε στα 540 και 690 nm με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας Labsystems iEMS. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από πειράματα που επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, με κάθε σημείο δεδομένων προσδιορίζεται εις τετραπλούν. καμπύλες απόκρισης σιγμοειδούς δόσης κατασκευάστηκαν με GraphPad Prism, έκδοση 5.

Απομόνωση του ανθρώπινου περιφερικού λευκοκυττάρων

άδεια

για την απομόνωση ανθρώπινων λευκοκυττάρων από υγιείς εθελοντές ελήφθη από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Δεοντολογίας της Σχολής Υγείας Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Witwatersrand (αριθμός κάθαρση, M070519). Γράφει, εν επιγνώσει συναίνεση από κάθε δότη λήφθηκε για την πειραματική χρήση του /των λευκοκυττάρων της του στον τομέα της έρευνας. Περιφερική λευκοκύτταρα από ένα μονό δότη απομονώθηκαν από αίμα που συλλέγεται σε ένα ηπαρινωμένο σωλήνα. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια υποβλήθηκαν σε λύση επιλεκτικά με τη χρήση του Versagene DNA Blood Kit (Gentra Systems). Προσφάτως παρασκευασμένα λευκοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η τοξικότητα νουκλεοζίτη σε φυσιολογικά κύτταρα. Τα λευκοκύτταρα μεταφέρθηκαν σε RPMI (Highveld Biologicals) μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη (Sigma) και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Separations). Μετά την συγκομιδή των λευκοκυττάρων, η βιωσιμότητά τους προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου πριν εκτέθηκαν στα νουκλεοσίδια δοκιμής για 24 ώρες.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Επαγωγή της κασπάσης 3 και κασπάσης 8 δραστηριότητα.

κασπάσης 3 και κασπάσης 8 ειδικές χρωματομετρικές δοκιμασίες, ήτοι CPP32 και FLICE, χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η δραστικότητα κασπάσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Biovision Research Products). Το επίπεδο της δραστηριότητας κασπάσης στα προϊόντα λύσης κυττάρων ήταν ευθέως ανάλογη προς την απορρόφηση του

p

-νιτροανιλίνη (ρΝΑ) μετρήθηκε στα 405 nm σε έναν αναγνώστη πλάκας Multiscan Labsystems iEMS. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 50 000 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 18 ώρες πριν από τη θεραπεία με νουκλεοσίδια. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη τυποποιήθηκε σε όλα τα δείγματα δοκιμής. Κασπάσης 3 και κασπάσης 8 δραστικότητα μετρήθηκε ακόλουθες διαφορετικές περιόδους έκθεσης των κυττάρων στους νουκλεοζίτες δοκιμής, τυπικά σε 2, 4, 8, 12, και 24 ώρες μετά την προσθήκη των νουκλεοζιτών στα καλλιεργημένα κύτταρα.

Μέτρηση του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης.

Η κατιονική βαφή 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1) είναι εκλεκτική για μιτοχόνδρια και εγγενής φθορισμός του το καθιστά χρήσιμο να μετρηθεί η ηλεκτροχημική κλίση που υπάρχει κατά μήκος της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Το πρωτόκολλο ακολουθήθηκε σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή (BD Pharmingen). Η χρωστική JC-1 συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια των υγιών κυττάρων ως φθορίζοντα κόκκινα συσσωματώματα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 50 000 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε σχεδόν συρροή πριν από τη θεραπεία με νουκλεοσίδια. Η κυτταρομετρία ροής, με φίλτρα διέγερσης /εκπομπής του 485/540 nm (πράσινο φθορισμό) και 540/590 nm (ερυθρός φθορισμός), χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η επίδραση των νουκλεοζιτών δοκιμής επί δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Τα μιτοχόνδρια περιέχουν ερυθρό συσσωματώματα JC-1 σε υγιή κύτταρα ανιχνεύθηκαν στο κανάλι FL-2 (άνω πύλη στα scattergraphs), ενώ τα πράσινα μονομερή JC-1 σε αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν στο κανάλι FL-1 (κάτω πύλη στα scattergraphs ).

Μέτρηση των μιτοχονδρίων και κυτταροπλασματικά κυτοχρώματος c.

το ανθρώπινο κυτόχρωμα c Titerzyme Δοκιμασία ανοσομετρική Ενζύμου (Δοκιμασία Designs Inc.) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η συγκέντρωση του κυτοχρώματος c στο μιτοχονδριακό και η κυτταροπλασματικά κλάσματα των κυττάρων που εκτίθενται στα νουκλεοσίδια δοκιμής. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 50 000 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 18 ώρες πριν από τη θεραπεία με νουκλεοσίδια. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με παγωμένο φωσφορικό άλας. Το κυτοσολικό κλάσμα ελήφθη με επαναιώρηση του κυτταρικού ιζήματος με ένα ρυθμιστικό κυτταρική διαπερατότητα, (250 mM σακχαρόζης, 137 mM NaCl, 70 mM KCl, 4,3 mM Να

2HPO

4, 1,4 mM Κ

2HPO

4, 0,2 mg /ml Digitonin και 0,1% Hydorol Μ) που παρέχεται στο μιτοχονδριακό κιτ απομόνωσης, (Assay Designs Inc.) η οποία άφησε τα μιτοχόνδρια ανέπαφη. Αυτό ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση για να διαχωριστεί το κυτοσολικό κλάσμα και να σφαιροποιηθούν τα μιτοχόνδρια. Τα μιτοχόνδρια στη συνέχεια υπέστησαν λύση με ρυθμιστικό RIPA, που αποτελείται από 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο και 0.1% SDS.

Προσδιορισμός απόπτωσης, όπως μετράται με τη δοκιμασία αννεξίνης V.

φωσφατιδυλοσερίνης (PS) μετατόπιση προς την εξωτερική κυτταρική μεμβράνη προσδιορίστηκε με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) κυτταρομετρίας Annexin V. ροής αναλύσεις με FITC-επισημασμένο αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD Pharmingen), σε κύτταρα που εκτίθενται σε 100 μΜ του καθενός από τα νουκλεοσίδια δοκιμής ή της καμπτοθεκίνης για 24 ώρες. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 50 000 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως συρροής κοντά πριν από τη θεραπεία με νουκλεοσίδια. χρώση κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC (πράσινος φθορισμός), καθώς και μία βαφή αποκλεισμού του ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (αρνητικό για το κόκκινο φθορισμό), σημειώνοντας τουλάχιστον 10

4 γεγονότα. Μετά την έκθεση στις νουκλεοσίδια δοκιμής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε μια ροή BD LSR II κυτταρόμετρο. Τα δεδομένα απεικονίζονται ως scattergraph με FITC-αννεξίνης V (πράσινος φθορισμός) εκπροσωπείται στο Χ-άξονα

έναντι

PI (κόκκινο φθορισμό) στον άξονα Υ.

κασπάσης 9 δραστηριότητα.

δραστηριότητα

κασπάση 9 προσδιορίστηκε με την Abcam® κασπάση 9 ενεργό κιτ χρώση FITC. Η κασπάσης 9 εκλεκτικός αναστολέας LEHD-FMK συζευγμένο με FITC διεισδύει ζωντανά κύτταρα για να δεσμεύονται με δραστική κασπάση 9 με μη αναστρέψιμο τρόπο. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια στείρα καλυπτρίδες (50 000 ανά καλυπτρίδα) αφέθηκαν να προσκολληθούν για τέσσερις ώρες και εκτίθενται στους νουκλεοζίτες δοκιμής και καμπτοθεκίνη, αντίστοιχα, για 24 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάζονται με το υπόστρωμα στους 37 ° C για μία ώρα. Διαφάνειες πλύθηκαν σε PBS και εμφανίσεις σε μικροσκόπιο επιφθορισμού Ολύμπου BX41. Εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP72 και αναλύονται με το πακέτο Ολύμπου CellSens λογισμικού. Τα κύτταρα με ενεργοποιημένο οθόνη κασπάση 9 ένα φωτεινό πράσινο φθορισμό.

Αξιολόγηση των ΗΤ-29 και η μορφολογία των κυττάρων Caco-2

Το αποτέλεσμα των νουκλεοσιδίων στη μορφολογία των κυττάρων αξιολογήθηκε με αντίθεση φάσης και μικροσκοπία φθορισμού . Για μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων καλλιέργειας (50 000 κύτταρα ανά φρεάτιο), αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε νουκλεοσίδια για διάφορες χρονικές περιόδους. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με την Olympus CKX41 αντεστραμμένο μικροσκόπιο και οι εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP21. μορφολογία των κυττάρων εκτιμήθηκε περαιτέρω με τη Hoechst 33342 (Life Technologies) και πορτοκαλί της ακριδίνης (Life Technologies) φθορίζουσες χρωστικές. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες θερμότητα αποστειρώνονται και εκτίθενται στους νουκλεοζίτες δοκιμή σε διάφορες συγκεντρώσεις. Χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα φίλτρα, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο επιφθορισμού της Olympus BX41. Εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP72 και αναλύονται με το πακέτο Ολύμπου CellSens λογισμικού.

Αξιολόγηση των Bcl-2 και Bax έκφραση

Η έκφραση και την κυτταρική τοποθεσία τόσο Bcl-2 και Bax στα οι γραμμές ΗΤ-29 και Caco-κυττάρων προσδιορίστηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων (50 000 κύτταρα ανά καλυπτρίδα), αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα και εκτίθενται στους νουκλεοζίτες δοκιμής και καμπτοθεκίνης για 6 ώρες. Μετά την έκπλυση με PBS, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% φορμαλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και διαπερατά επί 5 λεπτά με 0,25% Triton Χ100, που παρασκευάζεται σε PBS με αλβουμίνη 0,5% βόειου ορού (BSA). Μετά διαπερατότητας, τα κύτταρα αποκλείσθηκαν με 1% (BSA) σε PBS για 1 ώρα. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν για μία νύχτα με τα αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα (Bcl-2 ή Bax σε PBS με 0,5% BSA) στους 4 ° C. Mouse αντί-Bcl-2 και ποντικού αντι-Βαχ ελήφθη από Biovision και χρησιμοποιήθηκε σε μια συγκέντρωση 10 mg /mL. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με είδη συμβατά 568 (Abcam) δευτερεύον αντίσωμα Alexa-fluor. FITC-συζευγμένο φαλλοϊδίνη, (Abcam), χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τον κυτταρικό σκελετό και οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με Hoechst 33342 λεκέ όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus BX41 μικροσκόπιο επιφθορισμού με τα κατάλληλα φίλτρα για κάθε φθοριόχρωμα. Εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP72 και αναλύονται με το πακέτο Ολύμπου CellSens λογισμικού.

Αξιολόγηση των κυττάρων για την επαγωγή της αυτοφαγία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια στείρα καλυπτρίδες σε 6 πλάκες και 9 (50 000 κύτταρα ανά καλυπτρίδα) αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΜ νουκλεοσιδίων δοκιμής. Η χλωροκίνη (50 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος επειδή είναι γνωστό ότι προκαλεί εκτεταμένη αυτοφαγικά σχηματισμός κενοτοπίων [17, 18]. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπό εξέταση ενώσεις, χλωροκίνη και καμπτοθεκίνη για 3 ώρες, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C με 50 μΜ monodansyl-καδαβερίνη (MDC) (Sigma), σε PBS για 15 λεπτά [19, 20, 21]. Η καμπτοθεκίνη συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός μάρτυρας για το σχηματισμό κενοτοπίων καθώς απέτυχε να προκαλέσει κενοτόπιο σχηματισμός στις δύο κυτταρικές σειρές. Οι καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν με PBS και τα ζωντανά κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο επιφθορισμού της Olympus BX41. Εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP72 και αναλύονται με το πακέτο Ολύμπου CellSens λογισμικού.

ενώσεων δοκιμής Νουκλεοσιδικοί

Η νέα παράγωγα νουκλεοσίδης, νουκλεοσιδικά 1, 2 και 5 αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη συντέθηκαν το Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο του Witwatersrand, και χαρακτηρίζεται από την 1

H και

13C NMR, IR και HRMS φασματοσκοπία. Αυτά συντέθηκαν από μια ποικιλία υλικών έναρξης που αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich σύμφωνα με την τροποποιημένη διαδικασίες που περιγράφονται στο Sproat, 1994 [22]. Νουκλεοζίτου 2 είναι μία γνωστή ένωση και τα φάσματα από τα άλλα δύο ενώσεις διατίθενται από τους συγγραφείς. Στοκ διαλύματα (20 mM) των νουκλεοζιτών δοκιμής παρασκευάστηκαν σε DMSO βαθμού κυτταρικής καλλιέργειας.

Ανάλυση δεδομένων και στατιστική

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν και οι καμπύλες δόσης-απόκρισης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism-εκδοχή 5. διαφορές μεταξύ των ελέγχων και δείγματα επεξεργασμένα νουκλεοζίτη δοκιμάστηκαν για σημαντικότητα με το πακέτο λογισμικού Prizm3 Instat, χρησιμοποιώντας ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) και τη δοκιμασία Μαθητών-τ με ένα κατώτατο όριο σημαντικότητας ορίζεται σε

ρ

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

νουκλεοσιδικά ανάλογα είναι κυτταροτοξικά σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα Caco-2

Τρία νέα ανάλογα πυριμιδίνης ριβονουκλεοσιδικό- εντοπίστηκαν κατά τη διαδικασία διαλογής των είκοσι τρία μυθιστόρημα νουκλεοτίδια ως έχουσα κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι δύο κυτταρικές σειρές ΗΤ-29 και Caco-2 όταν δοκιμάζονται σε μια συγκέντρωση 100 μΜ. Οι δομές των τριών δραστικών νουκλεοζιτών δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Ο νουκλεοζίτης 1 και 2 ήταν ουριδίνης ανάλογα και νουκλεοζίτη 5 ήταν ένα ανάλογο κυτιδίνης. Οι βάσεις πυριμιδίνης συνδέθηκαν μέσω ενός

Ν

-γλυκοζιτικούς δεσμό με τον άνθρακα 1 του σακχάρου ριβόζη. Και τα τρία μόρια υποκαταστάθηκαν με ογκώδεις ομάδες φαινυλίου επί άνθρακα 5 του σακχάρου ριβόζης. Νουκλεοζίτης 1 είχε μια Ο-Ο δεσμού με μια ομάδα 4,4-διμεθοξυτριτυλίου και νουκλεοσίδια 2 και 5 συνδέονται με μια ομάδα τριτοβουτυλδιφαινυλ μέσω ενός σταθερού δεσμού Si-O. Τα νουκλεοτίδια τα αυθαίρετα αριθμημένα 1-23 και δοκιμή Νουκλεοσίδια νούμερο ένα, δύο και πέντε βρέθηκαν να είναι ενεργοί στις δοκιμασίες αρχική διαλογή.

Η

Η ανασταλτική συγκέντρωση πενήντα τοις εκατό (IC

50 ) τιμές ελήφθησαν για τις τρεις ενεργές νουκλεοσίδες και δείχνονται στο Σχήμα 1Β. Οι δύο κυτταρικές σειρές που εμφανίζεται διαφορετική ευαισθησία για τις τρεις δραστικές ενώσεις δοκιμής και σε καμπτοθεκίνη. ΗΤ-29 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε καμπτοθεκίνη από τα κύτταρα Caco-2, με μια IC

50 τιμή του 5,7 μΜ σε σύγκριση με 10,6 μΜ, αντιστοίχως. Νουκλεοζίτη 5 ήταν το πιο αποτελεσματικό έναντι κυττάρων ΗΤ-29 με IC

50 αξία των 3,4 μΜ και έδειξε παρόμοια δραστικότητα με τα κύτταρα Caco-2 με ένα IC

50 τιμή του 4,8 μΜ. Σε κύτταρα ΗΤ-29, νουκλεοζίτη 1 και 2 είχαν IC

50 τιμές 6,4 και 3,4 φορές υψηλότερη από εκείνη της καμπτοθεκίνης, εμφανίζοντας IC

50 τιμές των 36.3 και 19.1 μΜ, αντίστοιχα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα κύτταρα Caco-2, όπου νουκλεοζίτης 1 είχε παρόμοια δράση με την καμπτοθεκίνη και νουκλεοζίτη 2 ήταν 3 φορές πιο δραστική από την καμπτοθεκίνη, με IC

50 τιμή 3.5 μΜ. Οι καμπύλες απόκρισης δόσης Αντιπροσωπευτικά φαίνεται στο Σχ S1

Η έκθεση των προσφάτως απομονωμένων λευκοκυττάρων σε καθένα από τα τρία ανάλογα νουκλεοσιδίων και να καμπτοθεκίνη, αντίστοιχα έδειξε ότι νουκλεοζίτη 2 είχε τη μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση στα λευκοκύτταρα, προκαλώντας μία μείωση 38,5% της βιωσιμότητας των λευκοκυττάρων σε μια συγκέντρωση 100 μΜ. Αυτό ήταν δύο φορές μικρότερη από την επίδραση της καμπτοθηκίνης επί των λευκοκυττάρων. Ο νουκλεοζίτης 1 και νουκλεοζίτη 5 ήταν η λιγότερο τοξική στα λευκοκύτταρα, με τη βιωσιμότητα του κυττάρου διατηρείται εις 82,7% και 99,9%, αντιστοίχως (βλέπε Εικ 1C).

Nucleosides επάγουν κασπάσης 8 και δραστικότητα κασπάσης 3

η κασπάση 8 είναι μία caspase εκκινητή που προκαλεί διάσπαση και ενεργοποίηση των κασπασών τελεστή, όπως κασπάση 3. το Σχήμα 2 δείχνει δραστικότητα κασπάσης 8 και κασπάσης 3 προσδιορίστηκε σε διάφορα χρονικά διαστήματα, μετά την προσθήκη των νουκλεοζιτών δοκιμής, και στις δύο κυτταρικές σειρές. Οι τρεις νουκλεοζίτες προκάλεσε αύξηση σε δραστικότητα κασπάσης 8 και κασπάσης 3 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Ωστόσο, με την εξαίρεση του νουκλεοζίτη 2, η δραστηριότητα της κασπάσης δεν ήταν τόσο υψηλή όσο εκείνη που προκαλείται από καμπτοθεκίνη. Νουκλεοζίτου 2 ήταν η πιο αποτελεσματική επαγωγέας της δραστικότητας κασπάσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, προκαλώντας κασπάσης 8 και 3 δραστηριότητα σε παρόμοιο επίπεδο με καμπτοθεκίνη. Ωστόσο, και στις δύο κυτταρικές σειρές ΗΤ-29 και Caco-2, η επαγωγή της μέγιστης κασπάσης 8 και 3 δραστηριότητα πήρε περισσότερο για να επιτευχθεί (12 ώρες σε αντίθεση με 2-4 ώρες). Σημαντικά, η δραστικότητα και των δύο κασπασών μειώθηκε με βραδύτερο ρυθμό από ό, τι εκείνη των κυττάρων σε επεξεργασία καμπτοθεκίνη, παραμένοντας υψηλότερο από καμπτοθεκίνη μετά από 24 ώρες έκθεσης.

Η

Nucleosides έχουν ελάχιστη επίδραση επί της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δψπι )

Ο Δψπι μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με το κατιονικό φθορίζουσα χρωστική JC-1. Τα ποσοστά των Δψπι στον νουκλεοζίτη αγωγή ΗΤ-29 και Caco-2 κύτταρα σε σύγκριση με τα αρνητικά και τα θετικά κύτταρα ελέγχου συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα, στα κύτταρα ΗΤ-29, νουκλεοζίτη 2 και 5 είχαν ένα οριακό (& lt? 3%) επίδραση στην Δψπι. Νουκλεοζίτης 1 θεραπεία κατέληξε σε 4% των κυττάρων με μειωμένη Δψπι πάνω από εκείνη του μάρτυρα. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που έλαβαν καμπτοθεκίνη είχε 34,8% των κυττάρων με μειωμένη Δψπι σύγκριση με τον έλεγχο. Στα κύτταρα Caco-2, νουκλεοσίδια 1 και 5 επηρεάζονται περίπου 17% των κυττάρων με αποτέλεσμα μια μειωμένη Δψπι, ενώ νουκλεοζίτη 2 είχε οριακό αποτέλεσμα (& lt? 3%) πάνω από εκείνη του μάρτυρα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με καμπτοθεκίνη που προκάλεσε 34,6% κυττάρων με Δψπι στα κύτταρα Caco-2. Οι Scattergraphs φαίνεται στο συμπληρωματικό S2 Εικ.

Η

Νουκλεοσίδια μεταβάλλει τα ενδοκυτταρικά κυτοχρώματος c

διανομή

Στα κύτταρα, μεταξύ 90 και 100% του συνόλου των κυτταρικών κυτοχρώματος c συνήθως βρίσκεται μέσα στα μιτοχόνδρια. Σχήμα 3Α και 3Β δείχνουν ότι οι νουκλεοζίτες δοκιμής αύξησε την κυτοσολικό κλάσμα κυτοχρώματος c και για τις δύο κυτταρικές γραμμές σε σχέση με τον αρνητικό έλεγχο, αλλά όχι στον ίδιο βαθμό όπως καμπτοθεκίνη. Στα κύτταρα ΗΤ-29, νουκλεοζίτη 2 προκάλεσε το μεγαλύτερο ποσοστό του κυτοχρώματος c να μετακινηθούν στο κυτοσόλιο (75,35 ± 1,15%), αν και χαμηλότερη από εκείνη της καμπτοθηκίνης (85,19 ± 1,54%). Νουκλεοσίδια 1 και 5 που προκαλείται κάποια 68.22 ± 0.62% και 70.42 ± 0.62% του κυτοχρώματος c να μετακινηθούν στο κυτοσόλιο, αντίστοιχα.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 100 μΜ νουκλεοσιδίου 1, 2, 5 και καμπτοθεκίνη, αντίστοιχα , για 24 ώρες. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρεις δοκιμασίες Elisa διενεργείται για κάθε νουκλεοσιδίου.

Η

Στα κύτταρα Caco-2, νουκλεοσιδικά 5 προκάλεσε το μεγαλύτερο ποσοστό του κυτοχρώματος c για να στραφούν προς το κυτταρόπλασμα (70.42 ± 1,76%), η οποία είναι χαμηλότερη από εκείνη της καμπτοθηκίνης (86,94 ± 1,72%). Τα αποτελέσματα των νουκλεοσιδίων 1 και 2 ήταν συγκρίσιμα με νουκλεοζίτη 5 με κλάσματα κυτοσολικού κυτόχρωμα c του 63,87 ± 2,03% και 68,23 ± 0,62%, αντίστοιχα. έτσι Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία με ανάλογα νουκλεοτιδίων προκάλεσε μείωση στην μιτοχονδριακή κυτοχρώματος c και ταυτόχρονη αύξηση σε κυτοσολικό κυτοχρώματος c.

αννεξίνης V αυξήσεις δεσμευτικός ΗΤ-29 και Caco-2 κύτταρα

Η δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής για αννεξίνη V-FITC, δείχνει ότι η απόπτωση διεγέρθηκε μετά την προσθήκη των δραστικών νουκλεοσιδικών αναλόγων προς αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, όπως φαίνεται στον πίνακα 2 και S3 Σχ. Μετά από 24 ώρες έκθεσης στις νουκλεοσιδικών αναλόγων ή καμπτοθεκίνη, υπήρχαν κυρίως δύο πληθυσμούς κυττάρων: βιώσιμο, μη αποπίπτουν κύτταρα (αννεξίνη V-FITC και ΡΙ αρνητικά) και κύτταρα που υφίστανται απόπτωση (αννεξίνη V-FITC θετικά και ΡΙ αρνητικό). Ένας μικρός πληθυσμός κυττάρων παρατηρήθηκαν να είναι αννεξίνη V-FITC και θετική PI, αναφέροντας ότι ήταν στο τελικό στάδιο απόπτωση ή νέκρωση.

Η

Το ποσοστό της κάθε υποπληθυσμό των κυττάρων στις δύο κυτταρικές σειρές που εκτίθενται στα ανάλογα νουκλεοτιδίων παρουσιάζεται στον πίνακα 2. στα κύτταρα ΗΤ-29, νουκλεοζίτης 1 ήταν η πιο αποτελεσματική αποπτωτικό διεγέρτη, με 38,4% των κυττάρων που ανιχνεύονται σε πρώιμη απόπτωση και 5,9% των κυττάρων στο τέλος της απόπτωσης /νέκρωσης. Ενώ ανώτερη καμπτοθεκίνη για πρώιμη απόπτωση, η θεραπεία της καμπτοθεκίνης, ωστόσο, προκάλεσε κάποια 19,6% των κυττάρων να στραφούν προς τα τέλη της απόπτωσης /νέκρωσης. Αυτό υποδεικνύει ότι η καμπτοθεκίνη ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση με ταχύτερο ρυθμό από ό, τι τα νουκλεοσίδια. Νουκλεοζίτου 2 θεραπεία κατέληξε σε 20,5% των κυττάρων είναι σε πρώιμη απόπτωση και 10,6% στα τέλη απόπτωση. Νουκλεοζίτη 5 είχε 22,2% κύτταρα σε πρώιμη απόπτωση και 2.3% των κυττάρων στο τέλος της απόπτωσης /νέκρωσης.

Τα αποτελέσματα ήταν διαφορετικές στα κύτταρα Caco-2, και οι τρεις νουκλεοζίτες έδειξαν παρόμοιο ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων, που κυμαίνονται από 61 σε 66,3%. Νουκλεοζίτη 5 ήταν η πλέον αποτελεσματική με 30.9% των κυττάρων που ανιχνεύονται σε πρώιμη απόπτωση και 4,8% στα τέλη απόπτωση ή νέκρωση, ενώ μετά τη θεραπεία ο νουκλεοζίτης 1, 17,4% των κυττάρων ήταν στην πρώιμη απόπτωση και 14,8% στα τέλη απόπτωση. Ορισμένες 21,7% κύτταρα ανιχνεύθηκαν στην πρώιμη απόπτωση και 11,4% των κυττάρων στο τέλος της απόπτωσης /νέκρωσης εξής νουκλεοζίτη αγωγή 2. Οι Scattergraphs φαίνεται στο S3 Σχ.

Τα νουκλεοσίδια αποτυγχάνουν να διεγείρουν δραστικότητα της κασπάσης 9

Η ικανότητα των νουκλεοσιδίων δοκιμής να διεγείρει δραστικότητα κασπάσης 9 προσδιορίστηκε αφού τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ από κάθε νουκλεοζίτη για 24 ώρες. Καμπτοθεκίνη (20 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και ήταν σε θέση να διεγείρει δραστικότητα κασπάσης 9, σε αντίθεση με τους τρεις νουκλεοζίτες όπως φαίνεται στο S4 Σχ.

Nucleosides δεν επηρεάζουν την έκφραση του Bcl-2 και Bax

για να αποκτήσετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την ανακατανομή του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα χωρίς εμφανή αλλαγή στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, μελετήσαμε την έκφραση των Bcl-2 και Bax στα ΗΤ-29 και Caco-2 κυττάρων γραμμές και την απόκρισή τους στη θεραπεία νουκλεοσιδίου. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ νουκλεοζίτες για 6 ώρες.

Bcl-2 εκφράζεται έντονα και συνδέονται με τον πυρήνα στις δύο κυψέλες ΗΤ-29 και Caco-2.

μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων HT -29 κύτταρα, Bcl-2 εκφράστηκε με μια ισχυρή σήμα φθορισμού και που συνδέονται με τον πυρήνα (S5 Εικ). Αυτό επιβεβαιώθηκε από τη συγχώνευση Hoechst και Bcl-2 εικόνες που παρουσίασε ένα ροζ συγχωνευμένη εικόνα υποδεικνύει συν-εντοπισμό των δύο φθοριοχρώμων. Η έκθεση στους νουκλεοζίτες δοκιμή δεν είχε καμία εμφανή επίδραση επί Bcl-2 τα επίπεδα έκφρασης ή υποκυτταρική κατανομή της. Caco-2 κύτταρα παρομοίως, είχε μια κατά κύριο λόγο πυρηνική διανομή των Bcl-2. Ωστόσο, ορισμένα κύτταρα που εκπέμπεται ένα πολύ ασθενέστερο σήμα από τους άλλους (S6 σχήμα). Η έκθεση σε νουκλεοσιδικά 1 και 2 προκαλείται ελάχιστη αναδιανομή του Bcl-2 προς περιπυρηνική χώρο που δεν παρατηρήθηκε με το νουκλεοζίτη 5 αγωγή.

Bax είναι κακώς εκφράζεται σε ΗΤ-29 και Caco-2 κύτταρα με περιπυρηνική κατανομή.

σε ΗΤ-29 κύτταρα ελέγχου, Bax ήταν αραιά σχετίζεται με τους πυρήνες με κυρίως περιπυρηνικών διανομής (S7 σχήμα). Hoechst /Bax συγχωνεύθηκε εικόνων υποστηρίζουν την παρατήρηση ότι Βαχ έχει περιπυρηνική κατανομή. Noteably, η φθορίζουσα ένταση του Βαχ ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη του Bcl-2 που δείχνει συγκριτικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης. Η έκθεση σε τρεις νουκλεοζίτες έδειξε μια μικρή αύξηση στο φθορισμό Βαχ σε σύγκριση με αυτή του μάρτυρα. Επιπλέον, η θεραπεία με νουκλεοζίτη 5, προκάλεσε μια πολωμένη πυρηνική ομαδοποίηση Βαχ (S7 Εικ). Η Hoechst /Bax συγχωνευμένη εικόνα δείχνει μια αύξηση στο φθορισμό ροζ υποδεικνύοντας αυξημένη συσχέτιση του Βαχ με τον πυρήνα.

Έκφραση και κυτταρική κατανομή του Βαχ ήταν παρόμοια σε Caco-2 κύτταρα (S8 Εικ). έκφραση Bax ήταν χαμηλή σε κύτταρα Caco-2 και οι εικόνες έπρεπε να ενισχυθεί για να δείξει την υποκυτταρική διανομή. Επομένως, δεν ήταν δυνατόν να προσδιοριστεί εάν τα νουκλεοτίδια είχαν άμεση επίδραση στα επίπεδα έκφρασης Bax ή υποκυτταρική κατανομή της στα κύτταρα Caco-2.

Επιπτώσεις των νουκλεοσιδίων στη μορφολογία των κυττάρων

Hoechst χρώση προσδιορίζει αποπτωτικών πυρήνων.

ΗΤ-29 κύτταρα, τόσο νουκλεοσιδικά 1 και 2 ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση όπως αντικατοπτρίζεται από τη συγκεκριμένη μορφή πυρηνική χρώση (υποδεικνύεται με ένα βέλος στερεού /block στο Σχήμα 4). Οι πυρήνες των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου ήταν τυπικά ωοειδές σχήμα, χρώση μπλε με μια ομοιόμορφη κατανομή της χρωστικής. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που κατεργάστηκαν νουκλεοζίτη 5 που παρέμεινε προσκολλημένη στην επιφάνεια ανάπτυξη μετά από 20 ώρες, έδειξε ακανόνιστου σχήματος πυρήνες (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι ο πυρήνας των κυττάρων μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα έδειξαν έναν υψηλό βαθμό κυτταροπλασματικής κενοτοπιώδη (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας μια εκτεταμένη κυτταροπλασματική δράση.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ νουκλεοσιδίου 1, 2 και 5 για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 λεκέ . Scalebar: 20 μm

Η

Τα ανεπεξέργαστα κύτταρα Caco-2 έδειξε την τυπική οβάλ πυρηνική δομή με βαφή, ακόμη και τη διανομή τους όταν βάφονται με τη Hoechst (Σχήμα 5)..