Αφηρημένο

σηματοδότηση WNT είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε μια ευρεία ποικιλία των φυσιολογικών και καρκινικούς ιστούς. Παρά τον πλούτο των γνώσεων σχετικά με το πότε και πού διάφορα

Οι WNT

γονίδια εκφράζονται και κατάντη εκδηλώσεις υπό τον έλεγχό τους, δεν είναι απορίας άξιο γιατί δημοσιεύσει στοιχεία για το πώς ρυθμίζονται. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι παρεκκλίνουσα WNT7A παρατηρείται σε ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών, και WNT7A είναι ο μοναδικός συνδέτης επιτάχυνση της προόδου των όγκων των ωοθηκών μέσω CTNNB1 (β-κατενίνης) /TCF σηματοδότηση απουσία μεταλλάξεων CTNNB1. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι

WNT7A

αποτελεί άμεσο στόχο του

miR-15b

στον καρκίνο των ωοθηκών. Δείξαμε ότι ένας δημοσιογράφος λουσιφεράσης που περιέχει την υποτιθέμενη θέση δέσμευσης του

miR-15b

στο

WNT7A

3′-UTR είχε κατασταλεί σημαντικά από

miR-15b

. Μετάλλαξη της υποθετικής θέσεως συνδέσεως του

miR-15b

στη δραστηριότητα

WNT7A

3′-UTR αποκατασταθεί λουσιφεράσης. Επιπλέον,

miR-15b

ήταν σε θέση να καταστείλει αυξημένα επίπεδα δραστηριότητας TOPFLASH από WNT7A, αλλά όχι εκείνες που προκαλούνται από S33Y. Επιπλέον,

miR-15b

μειώθηκε με δοσοεξαρτώμενο

WNT7A

έκφρασης. Όταν αξιολογήσαμε την προγνωστική επίδραση του

WNT7A

και

miR-15b

έκφραση χρησιμοποιώντας TCGA σύνολα δεδομένων, μία σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με τον οποίο υψηλού έκφραση

WNT7A

και χαμηλής έκφρασης του

miR-15b

συσχετίστηκε με μειωμένο ποσοστά επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Η θεραπεία με Decitabine με δοσοεξαρτώμενο αυξηθεί

miR-15b

έκφραση και αποσιώπηση των

DNMT1

αυξηθεί σημαντικά

miR-15b

έκφρασης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

WNT7A

είναι μετα-μεταγραφικά ρυθμίζεται από

miR-15b

, η οποία θα μπορούσε να είναι κάτω-ρυθμίζονται από υπερμεθυλίωση προαγωγού, πιθανώς μέσω DNMT1, στον καρκίνο των ωοθηκών.

Παράθεση: MacLean JA ΙΙ, βασιλιάς ML, Okuda η, Hayashi Κ (2016) WNT7A κανονισμού με miR-15b στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 11 (5): e0156109. doi: 10.1371 /journal.pone.0156109

Επιμέλεια: Kwong-Kwok Wong, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 21 Μαρ 2016? Αποδεκτές: 9η Μαΐου 2016? Δημοσιεύθηκε: 19 του Μάη 2016

Copyright: © 2016 MacLean et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA179214

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

microRNA (miRNAs) είναι μικρά RNAs μη κωδικοποιητική που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με μετα-μεταγραφική σίγηση mRNA. Οι διαδικασίες που ρυθμίζονται από miRNAs περιλαμβάνει μια ποικιλία βιολογικών οδών, και απορρύθμισης τους αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό του ανθρώπινου καρκίνου [1-3]. Η οικογένεια miR-15 περιλαμβάνει έξι εξαιρετικά διατηρημένη μέλη,

miR-15a

,

miR-15b

,

miR-16-1

,

miR-16- 2

,

miR-195

και

miR-497

, τα οποία είναι συγκεντρωμένα σε τρία διαφορετικά χρωμοσώματα [4, 5]. Η

miR-15a /16-1

σύμπλεγμα, είχε αρχικά αναφερθεί ως στόχο της 13q14 διαγραφές ή προς τα κάτω ρύθμιση σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) [6]. Συγκεκριμένα,

miR-15a

και

miR-16-1

άμεσα ρυθμίζουν

BCL2

, το οποίο είναι ένα αντι-αποπτωτικό ογκογονιδίου [7], και ως εκ τούτου δρουν ως καταστολείς όγκων με την επαγωγή απόπτωσης [8]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι

miR-15a

και

miR-16-1

δρουν ως πιθανοί καταστολείς όγκων με τη στόχευση

BCL2

,

BMI1 CCND1

,

MCL1

και

Wnt3A

σε CLL, μελάνωμα, καθώς και καρκίνους του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης, των ωοθηκών και του προστάτη [4, 9, 10]. Η

miR-15b

/

miR-16-2

σύμπλεγμα, το οποίο βρίσκεται στο 3q25, έχει επίσης αναφερθεί ότι δρουν στην καταστολή του όγκου με στόχευση

BCL2

,

BM1

,

CCND1

και

SUZ12

[11-13]. Μείωση του

miR-15b

παρατηρήθηκε σε CLL, μελάνωμα, γαστρικό και στη χημειοθεραπεία του καρκίνου της γλώσσας, καθώς και καρκίνο βλαστικών κυττάρων [11-15]. Διαγραφή του

miR-15b

και

miR-16-2

προωθεί Β-κυττάρων παθογένεια [11]. Έτσι, οι άμεσοι στόχοι των μελών της οικογένειας miR-15 είναι πιθανό να είναι κρίσιμα ογκογονίδια.

Έχουμε πρόσφατα ανέφεραν ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του WNT7A (μοναδικά μεταξύ 19 WNT συνδετήρες) έχει ως αποτέλεσμα την επιτάχυνση της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών (OVCA), και παίζει κρίσιμο ρόλο στην πρόοδο του όγκου που προκαλείται από την WNT7A /CTNNB1 οδού [16, 17] σηματοδότησης. Οι μελέτες μας δείχνουν περαιτέρω ότι

FGF1

είναι μια άμεση προς τα κάτω στόχος του WNT7A σηματοδότησης /CTNNB1, και ότι αυτή η οδός έχει δυναμικό ως θεραπευτικός στόχος OVCA [16]. Ένα από τα ευρήματά μας έδειξαν σαφώς ότι η υψηλή έκφραση του

WNT7A

και

FGF1

συσχετίστηκαν με OVCA, ειδικά σε ορώδες καρκίνωμα, και την κακή συνολική επιβίωση των ασθενών [16]. Έτσι, WNT7A κωδικοποιεί ένα ισχυρό ογκογόνο παράγοντα που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για OVCA. Ωστόσο, εμείς ακόμα δεν γνωρίζουμε την απάντηση ως προς το γιατί WNT7A γίνεται ειδικά υπερεκφράζεται σε ορώδες OVCA.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η αφθονία WNT7A, που υπάρχει στην OVCA, είναι μετα-μεταγραφικά προς τα κάτω-ρυθμίζονται από

miR-15b

. Προς στήριξη του ρόλου της στην αναστολή του καρκίνου, OVCA ασθενείς είχαν κακή συνολικό ποσοστό επιβίωσης στην ομάδα με υψηλή έκφραση του

WNT7A

και χαμηλή έκφραση του

miR-15b

. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι διαμορφώνει DNMT1

miR-15b

μεταγραφή μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντιδραστήρια και πλασμίδια

Η 3′ UTR τμήματα του ενδογενούς

WNT7A

γονιδίου και μεταλλαγμένη μορφή της ενισχύθηκαν με PCR και υποκλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pMIR-REPORT (Thermo Fisher) χρησιμοποιώντας τις θέσεις περιορισμού SpeI και HindIII για να δημιουργηθεί pMIR-

WNT7A

και pMIR-

WNT7A

μετάλλαξη 3′-UTR που περιέχουν πλασμίδια. Decitabine (5’aza-2’δεοξυκυτιδίνη, γνωστός και ως: 5-αζα-2′-dC),

mir

Βάνα miRNA μιμούνται (αρνητικός μάρτυρας και HSA-miR-15b-5P), DNMT1 siRNAs, προ- κατασκευάσματα έκφρασης miR-15b και σύστημα προσδιορισμού διπλής λουσιφεράσης αγοράστηκαν από την Cayman Chemical, Thermo Fisher, Qiagen, Σύστημα Βιοεπιστημών και Promega, αντίστοιχα.

οι κυτταρικές σειρές

OVCAR3, OVCAR5, SKOV3, και κύτταρα ES2 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). κύτταρα OVCAR4 ήταν προικισμένος από τον Δρ Joanna Burdette (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο). KURAMOCHI, OVKATE και OVSAHO αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων JCRB (Osaka, Japan). κύτταρα SKOV3.ip1 αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. Όλα τα κύτταρα επικυρώνονται από μικρή διαδοχική επανάληψη ανάλυση (STR) και περάστηκαν μέσα σε 6 μήνες από την παραλαβή. Όλα τα κύτταρα εξετάζονται τακτικά για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η ενσωμάτωση BrdU καθώς και τη μόλυνση του μυκοπλάσματος. Όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοια μορφολογία, χαρακτηριστικό ρυθμούς ανάπτυξης, και παρέμεινε αρνητικός για μόλυνση μυκοπλάσματος σε όλα τα πειράματα. OVCAR4, KURAMOCHI, OVKATE και OVSAHO κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS και πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη, και άλλα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS, 2 mM γλουταμίνη και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και σταθερή 5% CO

2.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR) δοκιμασία

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα και cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit από την Thermo Fisher. Σχετική έκφραση του γονιδίου προσδιορίστηκε με SYBR πράσινο (Bio Rad) ενσωμάτωση χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad myCycler όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Micro RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης Καθαρό Σύνδεσμος miRNA (Thermo Fisher), και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας miScript II RT Kit (Qiagen). Σχετική έκφραση miRNA προσδιορίστηκε με κιτ miScript SYBR Green PCR (Qiagen) και miR-15b και SNORD68 ειδικούς εκκινητές (Qiagen). Ένας πίνακας ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για κάθε γονίδιο παρουσιάζεται στον Πίνακα S1.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και την προσκόλληση δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, δοκιμασίες προσκόλλησης και μετανάστευσης διεξήχθησαν ακολουθώντας προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους μας [16, 17] . Για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων, και μετρήθηκαν 24, 48 και 72 ώρες με κόμισσα II FL Automated κυττάρων Counter (Thermo Fisher) με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου. Για την εκτίμηση της κυτταρικής προσκόλλησης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και συλλέχθηκαν μετά από 4 ώρες επώασης.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα πειραματικά δεδομένα υποβλήθηκαν σε μονόδρομη ANOVA και οι διαφορές μεταξύ των μεμονωμένων μέσων ήταν δοκιμάζονται από ένα τεστ πολλαπλών εμβέλειας Tukey χρησιμοποιώντας Prism 5.0 (Graphpad). δεδομένα QPCR διορθώθηκαν για διαφορές στη φόρτωση του δείγματος με τη χρήση του

RPL 19

δεδομένων ως συμμεταβλητή. Δοκιμές σημασία πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους όρους σφάλματος σύμφωνα με την προσδοκία των μέσων τετραγώνων λάθους. Μια ρ-τιμή 0,05 ή μικρότερη θεωρήθηκε σημαντική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές με τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των ποσοστών επιβίωσης και αξιολογήθηκε από τη δοκιμασία log-rank χρησιμοποιώντας ένα σύνολο δεδομένων TCGA, επιλέχθηκε TCGA-Ον, που περιείχε 554 πρωτοπαθείς όγκους των ωοθηκών με ολοκληρωμένες σειρές δεδομένων, για την ανάλυση επιβίωσης.

αποτελέσματα

έκφραση WNT7A στα κύτταρα OVCA ανάλογα με το γενετικό υπόβαθρο ή διαθέτει

Όταν ανέφερε την κλινική σημασία των WNT7A κατά την κακοήθη εξαλλαγή των OVCA, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

WNT7A

ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ορώδες καρκίνωμα, η πιο κοινή /επιθετική υπότυπο του OVCA [16, 17]. Έτσι, παρεκκλίνουσα WNT7A μπορούσε να προκληθεί από μη φυσιολογική γενετικό υπόβαθρο ή συσχετίζεται με την επιθετική χαρακτήρες σε OVCA. Όταν εξετάσαμε

WNT7A

επίπεδα έκφρασης σε OVCA κύτταρα, άφθονα

WNT7A

(& gt? 1000 φορές) παρατηρήθηκε σε επεμβατικές ή υψηλής ποιότητας ορώδες OVCA κύτταρα (SKOV3.ip1, KURAMOCHI, OVCAR4 και OVSAHO, S1 σχήμα). Σημείωση: Οι KURAMOCHI, OVCAR4 και OVSAHO κύτταρα επιβεβαιώθηκε πρόσφατα ως υψηλής ποιότητας ορώδες OVCA κυτταρικές σειρές από γονιδιακό προφίλ του [19]. κύτταρα SKOV3.ip1 διαθέτουν άκρως διεισδυτική και μεταστατική χαρακτηριστικά, όπως αυτά τα κύτταρα απομονώνονται από τα υγρά ασκίτη [20]. ES2, OVCAR3 και OVCAR5 κύτταρα έχουν γονιδιωματικής προφίλ που είναι εν μέρει παρόμοια με ορώδες OVCA όγκους.

WNT7A είναι ένας άμεσος στόχος του miR-15b

Εξετάσαμε μεταγραφική ενεργοποίηση του

WNT7A

υποστηρικτής χρησιμοποιώντας λουσιφεράση δοκιμασίες δημοσιογράφος, όμως, τη διαγραφή μας αναλύσεις δεν αποκάλυψε κρίσιμες περιοχές ή δυνητικές ρυθμιστικές αρχές σε απόσταση 10 kb ανάντη ή κατάντη του

υποστηρικτής WNT7A

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Ως εκ τούτου, έχουμε υποστεί το

WNT7A

3′-UTR με μια in silico ανάλυση χρησιμοποιώντας 3 διαφορετικούς αλγόριθμους (TargetScan, PicTar και Μιράντα) να εντοπίσει πιθανές σειρές σπόρων που ταιριάζουν miRNA. Και οι τρεις μηχανές αναζήτησης ανιχνεύεται

miR-15a

,

miR-15b

και

miR 195-

ακολουθίες δεσμευτική συμφωνία (Σχήμα 1Α) στην 3′-UTR του

WNT7A

(Σχήμα 1Β). Αξιολογήσαμε την επόμενη την προγνωστική επίδραση του

WNT7A

και /ή

miR-15b

έκφραση χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων TCGA (συνολικός αριθμός των ασθενών είναι 554). Ενώ η υψηλή έκφραση του

miR-15b

(n = 278), έδειξαν καλή πρόγνωση (P = 0.0394) σε σύγκριση με χαμηλή έκφραση του

miR-15b

(n = 276),

WNT7A

δεν έδειξε καμία συσχέτιση (υψηλής έκφρασης WNT7A, n = 279 vs χαμηλό = έκφραση του WNT7A, n = 275, Ρ = 0,2364). Μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με τον οποίο υψηλού έκφραση

WNT7A

και χαμηλή έκφραση του

miR-15b

(n = 147 vs n = 146 χαμηλής έκφρασης του

WNT7A

και υψηλής έκφρασης της

miR-15b) συσχετίστηκε με μειωμένο ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών από δοκιμασία log-rank (P = 0.0297, σχήμα 1Γ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: υψηλή έκφραση του

WNT7A

/

miR-15b

n = 132 και χαμηλή έκφραση του

WNT7A

/

miR-15b

n = 129 δεν περιλαμβάνονται στην αντίστροφη ανάλυση συσχέτισης. Ωστόσο, δεν αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ

WNT7A

και

miR-15a

ή

miR-197

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στο

miR-15b

για περαιτέρω αναλύσεις. Επιπλέον, εξετάσαμε την αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του

BCL2

και

miR-15b

, όπως

BCL2

είναι ένα από τα γνωστά τους στόχους του miR-15 οικογένεια και λειτουργεί ως ένα ογκογονίδιο. Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ

BCL2

και

παρατηρήθηκε miR-15b

σχετικά με το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων TCGA-OV (P = 0.2760), γεγονός που υποδηλώνει ότι

WNT7A

είναι πιο σχετικό κρίσιμο στόχο της

miR-15b

σε σχέση με OVCA.

(α) πρόβλεψη Βιοπληροφορική των miRNA αλληλεπιδράσεων με σπόρους αλληλουχίες από το 3′-UTR του

WNT7A

χρήση τριών διαφορετικών αλγορίθμων. (Β) Σχηματική του υποτιθέμενου

miR-15b

αλληλουχία πρόσδεσης στο

WNT7A

3′-UTR. (C)

WNT7A

ή

BCL2

και

miR-15b

έκφραση συσχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με την επιβίωση υπολογίζεται με TCGA-OV σύνολα δεδομένων (σύνολο n = 554, υψηλή

WNT7A

/

miR-15b

, n = 132? υψηλό

WNT7A

/χαμηλή

miR-15b

, n = 147? χαμηλό

WNT7A

/υψηλή

miR-15b

, n = 146? χαμηλό

WNT7A

/

miR-15b

, n = 129) με τη μέθοδο Kaplan-Meier, χρησιμοποιώντας Prism 5.0. Η τιμή Ρ καθορίστηκε από τη μακρά δοκιμασία κατάταξης.

Η

Χρησιμοποιήσαμε TargetScan 7.0 [21], για τον εντοπισμό

miR-15b

θέσεις στόχους εντός του

WNT7A

3′-UTR και βρήκε ένα υποτιθέμενο

δεσμευτική miR-15b ιστοσελίδα (Σχήμα 1Β). Να εξετάσει κατά πόσον

miR-15b

συνδέεται με αυτή τη σειρά, OVCA κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο pMIR-ΕΚΘΕΣΗ που περιέχει την υποτιθέμενη θέση δέσμευσης του

miR-15b

στο

WNT7A

3′-UTR, και

Mir

Βάνα miRNA μιμούνται (αρνητικός έλεγχος ή miR-15b), και στη συνέχεια μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή (Σχήμα 2Α). δραστηριότητα λουσιφεράσης ήταν σημαντικά καταπιεσμένη από

miR-15b

σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα. Στην προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι WNT7A ενεργοποιεί το κανονικό μονοπάτι σηματοδότησης CTNNB1 [16, 17]. Προκειμένου να καθοριστεί αν

miR-15b

αναστέλλει δράση WNT7A του, εξετάσαμε CTNNB1 μεσολάβηση μεταγραφική δραστηριότητα με το κατασκεύασμα TOPFLASH δημοσιογράφο (Σχήμα 2Β). Βρήκαμε ότι

miR-15b

καταστέλλεται σημαντικά δραστηριότητας TOPFLASH δημοσιογράφος. Όταν η δραστηριότητα TOPFLASH αυξήθηκε κατά WNT7A ή S33Y-μεταλλαγμένο CTNNB1 (μια καθιερωμένη θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση του ρεπόρτερ TOPFLASH) σε κύτταρα ES2, ότι ταπεινούς ή μην-ανιχνεύσιμη διαθέτουν ενδογενή WNT7A,

miR-15b

ήταν σε θέση να καταστείλει αυξημένη επίπεδα δραστηριότητας TOPFLASH από WNT7A, αλλά όχι εκείνες που προκαλούνται από S33Y (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η μετάλλαξη της υποθετικής θέσεως συνδέσεως του

miR-15b

στο

WNT7A

3′-UTR (5’TGCTGCT3 ‘στο 5’TaaTGCT3 ») αποκατέστησε τη δραστηριότητα λουσιφεράσης προηγουμένως καταστέλλεται από

miR-15b

(Σχήμα 2C). Προς στήριξη αυτών των ευρημάτων,

miR-15b

δοσο-εξαρτώμενο μειώθηκε

WNT7A

επίπεδα mRNA στα κύτταρα OVCA (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

WNT7A

έκφραση άμεσα ρυθμίζεται από

miR-15b

στην OVCA. Επειδή

BMI1

και

BCL2

έχουν αναφερθεί ως γονιδίων στόχων του

miR-15b

στον καρκίνο [12, 13], εξετάστηκαν επίσης τα επίπεδα mRNA σε OVCA. Ενώ

miR-15b

ήταν σε θέση να μειώσει

BCL2

,

BMI1

ήταν που δεν ρυθμίζονται από

miR-15b

στα κύτταρα OVCA.

(Α) Luciferase δημοσιογράφος του

WNT7A

3′-UTR στα κύτταρα SKOV3.ip1 και OVSAHO 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του

miR-15b

ή αρνητικό μάρτυρα μιμούνται. Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν δραστηριότητες ανταποκριτή που έχουν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0,05) διαφορές στις μέσες δραστηριότητες. ανάλυση ανταποκριτή (Β) σε κύτταρα TOPFLASH SKOV3.ip1 και OVSAHO 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του

miR-15b

ή αρνητικό μιμούνται ελέγχου (αριστερά). TOPFLASH ανάλυση δημοσιογράφος σε κύτταρα ES2 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του

miR-15b

μιμούνται, WNT7A ή S33Y με αρνητικούς μάρτυρες (μιμούνται ή pcDNA3.1, δεξιά). (C) Ανάλυση λουσιφεράσης ανταποκριτή του

WNT7A

3′-UTR, η μετάλλαξη του

WNT7A

3′-UTR ή φορέα pMIR-ΕΚΘΕΣΗ στα κύτταρα SKOV3.ip1 και OVSAHO 48 ώρες μετά την επιμόλυνση

miR-15b

ή αρνητικό μιμούνται τον έλεγχο.

Η

τα δεδομένα που στο επίπεδο υποβάθρου από 1 σε σχέση με τον έλεγχο των επιπέδων. Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν μεταγραφές που έχουν στατιστικά σημαντική (P & lt? 0,05). Διαφορές στις μέσες τιμές των επιπέδων έκφρασης

Η

MiR-15b αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την προσκόλληση

Ο ρόλος των

ΜΙΚ 15b

ως καταστολέα όγκου έχει χαρακτηριστεί ως απώλεια του

miR-15b

σε ποντικούς οδηγεί στην ανάπτυξη του Β-κυττάρου κακοήθειας [11], και η υπερέκφραση του

miR-15b

καταστέλλει τη διάδοση της μετάστασης χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα καρκίνου της γλώσσας [12]. Στην παρούσα μελέτη,

miR-15b

υπερεκφράζουν OVCA κύτταρα χρονικά εξαρτώμενο λιγότερο πολλαπλασιαστική (Σχήμα 4Α), και μειωμένη προσκόλληση κυττάρου (Σχήμα 4Β), υποδεικνύοντας ότι

miR-15b

επίσης δρα ως ογκοκατασταλτικό στο OVCA.

(Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ή (Β) προσκόλληση είτε με

miR-15b

εκφράζουν ή τον έλεγχο των κυττάρων.

η

miR-15b ρυθμίζεται από υπερμεθυλίωση προαγωγού

παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η άφθονη έκφραση του

WNT7A

είναι πιθανόν οφείλονται στην αρνητική ρύθμιση του

miR-15b

. Η προγνωστική επίπτωση των ασθενών OVCA με αντίστροφη συσχέτιση του

WNT7A

και

miR-15b

υποστηρίξει περαιτέρω την υπόθεση αυτή. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την πιθανότητα ότι

miR-15b

μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε OVCA μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού. Η θεραπεία με έναν αναστολέα του DNMTs, 5-αζα-2’dC, εξαρτώμενο από την δόση αύξησε

miR-15b

έκφρασης και μειώθηκε

WNT7A

έκφραση σε κύτταρα OVCA (Σχήμα 5Α). Όταν εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης των τριών ενεργών ισομορφών DNMT (

DNMT1

,

Dnmt3a

και

DNMT3B

) σε 5-αζα-2’dC (5 μΜ) αντιμετωπίζονται OVCA κύτταρα, μόνο

DNMT1

μειώθηκε σε SKOV3.ip1 και OVCAR4 κύτταρα (Σχήμα 5Β), υποδεικνύοντας ότι DNMT1 θα μπορούσε να είναι λειτουργικό για να μεθυλιώσει

miR-15b

. Πράγματι, σίγηση του

DNMT1

σημαντικά αυξημένο

miR-15b

έκφραση σε κύτταρα OVCA (Σχήμα 5C), υποδεικνύοντας ότι

miR-15b

είναι δυνητικά κάτω-ρυθμίζονται, ειδικά σε υψηλής WNT7A κύτταρα που εκφράζουν, με υπερμεθυλίωση προαγωγού μέσω DNMT1 σε OVCA.

(Α) 5-αζα-2′-άΟ επάγει θεραπεία

miR-15b

έκφραση (αριστερά) και μειώνει

WNT7A

έκφρασης (δεξιά) σε OVCA κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5-αζα-2′-DC για 3 ημέρες, και

miR-15b

ή

WNT7A

αξιολογήθηκε με qPCR σε σύγκριση με 0 ελέγχου μΜ (σύνολο στο επίπεδο φόντου 1 σε κάθε κύτταρο). Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν μεταγραφές που έχουν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0.05) διαφορές στα μέσα επίπεδα έκφρασης. (Β)

DNMT1

,

Dnmt3a

και

DNMT3B

επίπεδα έκφρασης εκτιμήθηκαν σε κύτταρα OVCA μετά από 5-αζα-2′-dC (5 μΜ) αγωγή για 3 ημέρες . (C) Τα επίπεδα έκφρασης του

DNMT1

(άνω) και

miR-15b

(κάτω) αξιολογήθηκαν σε OVCA κύτταρα επιμολυσμένα με DNMT1 siRNA 1-4, DNMT1 siRNA αναμειγνύεται ή τον έλεγχο αγωνίζομαι. Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν μεταγραφές που έχουν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0,05). Διαφορές στα μέσα επίπεδα έκφρασης

Η

Συζήτηση

σηματοδότηση WNT είναι καλά γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην βιολογία του καρκίνου [22 ]. Ενώ CTNNB1 είναι το κλειδί μεσολαβητής του σηματοδότηση Wnt, δείξαμε ότι WNT7A είναι ο μοναδικός πρόσδεμα ενεργοποίησης άθικτο CTNNB1 /TCF σηματοδότηση (δηλαδή εντός των κυττάρων που στερούνται την ενεργοποίηση με μετάλλαξη CTNNB1), ειδικά το ορώδες OVCA υποτύπου [16, 17]. Παρά τον πλούτο των γνώσεων σχετικά με την έκφραση των διαφόρων WNT συνδέτες και κατάντη εκδηλώσεις υπό τον έλεγχό τους, δεν είναι απορίας άξιο γιατί δημοσιεύσει στοιχεία για το πώς

Οι WNT

γονιδίων που ρυθμίζονται, και γιατί ορισμένα μέλη ρυθμίζεται προς τα πάνω σε συγκεκριμένους τύπους όγκων. Πρόσφατα,

Wnt3A

, το οποίο προωθεί την ογκογένεση μέσω επιταχυνόμενης κυτταρικό πολλαπλασιασμό και εισβολή [23], βρέθηκε ότι ρυθμίζεται άμεσα από την

miR-15a /16-1

σύμπλεγμα, και προς τα πάνω ρύθμιση του

Wnt3A

είναι αντιστρόφως συσχετίζεται με μειωμένη

miR-15a

και

miR-16-1

σε προχωρημένους όγκους του προστάτη [10]. Στην παρούσα μελέτη, η βιοπληροφορική προγράμματα σπόρους που ταιριάζουν προσδιόρισε τρεις εξαιρετικά διατηρημένες μέλη miR-15 οικογένεια,

miR-15a

,

miR-15b

και

miR-195

, η οποία θα μπορούσε να είναι κρίσιμη ρυθμιστές της

WNT7A

. Ωστόσο, ούτε

miR-15a

ούτε

miR-195

παρουσίασαν σημαντική αντίστροφη συσχετίσεις με το

WNT7A

στα σύνολα δεδομένων επιβίωσης των ασθενών OVCA. Έτσι,

WNT7A

έκφραση είναι πιο πιθανό υπόκειται σε ρύθμιση από

miR-15b

στο OVCA.

Προηγούμενη εργασία σε ΧΛΛ έχει αποδείξει την κατασταλτική δράση του όγκου του

miR-15a /16-1

συμπλέγματος εξαρτάται από την καταστολή των

BCL2

[8].

BCL2

έχει επίσης αναφερθεί ως άμεσο στόχο της

miR-15b

χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο των ανθεκτικών στα φάρμακα γαστρικών καρκινικών κυττάρων [13]. Έχει χαρακτηριστεί ότι

miR-15b /16-2 ποντίκια

νοκ-άουτ την ανάπτυξη Β-κυττάρων κακοήθειας, ενώ BCL2 ελαφρώς πάνω ρυθμισμένα σε Β-κύτταρα από knockout ποντίκια [11]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

miR-15b

καταπιεσμένη

BCL2

έκφραση στα κύτταρα OVCA. Ωστόσο, δεν αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ

BCL2

και

miR-15b

παρατηρήθηκε στην ανάλυση της επιβίωσης ασθενών σε OVCA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση των BCL2 από

miR-15b

έχει μικρότερη επίπτωση στην ωοθηκική καρκινογένεση.

Οι δράσεις του

miR-15b

ως καταστολέας των όγκων έχουν αποδειχθεί σαφώς στην παθογένεση των Β-κυττάρων σε CLL [11]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του

miR-15b

αναστέλλει τη διάδοση της μετάστασης μέσω επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση στο μοντέλο του στη χημειοθεραπεία ξενομοσχεύματα καρκίνου γλώσσα κυττάρου [12]. Προς τα κάτω ρύθμιση του

miR-15b

εμφανίζεται σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του μαστού, και η υπερέκφραση του

miR-15b

αναστέλλει την ανάπτυξη και διαφοροποίηση [15] τους. Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στόχευσης της κυκλίνης D1, και η επαγωγή απόπτωσης με

miR-15b

έχουν επίσης αναφερθεί [11-14, 24]. Τα αποτελέσματα περαιτέρω υποστήριξη

miR-15b

‘s λειτουργία καταστολής όγκου, και προσθέστε την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων OVCA και την προσκόλληση των κυττάρων στον κατάλογο των σχετικών όγκων.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι 5-αζα-2′-dC, ένας αναστολέας της δραστικότητας DNMT, αυξημένη

miR-15b

έκφρασης. Ομοίως, μειώθηκε

DNMT1

παρατηρήθηκε από την επεξεργασία των 5-αζα-2′-dC, και σίγηση του

DNMT1

αυξηθεί

miR-15b

στα κύτταρα OVCA. Αυξημένα επίπεδα DNMT1 έχουν αναφερθεί σε OVCA, με χαμηλότερη έκφραση σε Ι /ΙΙ όγκους και κορυφή έκφρασης που συμβαίνουν στο στάδιο III /IV [25] αρχικό στάδιο. DNMT1 μεσολάβηση υπερμεθυλίωση προαγωγού προκαλεί μείωση του Ε-καδερίνης και εξελίσσεται επεμβατική χαρακτηριστικό του OVCA [26]. Υπάρχει μια έκθεση που εξετάζει τη συσχέτιση μεταξύ της μεταβολής του αριθμού αντιγράφων σε χρωμοσωμική θέση του

miR-15b

και οι αλλαγές στο

miR-15b

κατάσταση μεθυλίωσης υποστηρικτής του μαστού, των ωοθηκών, της κεφαλής και του τραχήλου , του πνεύμονα και καρκίνου των νεφρών χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων TCGA [27]. Αυτή η ομάδα βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του

miR-15b

έκφρασης και να αντιγράψετε παραλλαγή αριθμό σε αυτές τις θέσεις, καθώς και μεταξύ των

miR-15b

επίπεδα έκφρασης και μεθυλίωσης στους σχετικούς τύπους καρκίνου και την συγκεντρωτικά στοιχεία από όλους τους τύπους καρκίνου. Σημείωση: δεν υπάρχουν διαθέσιμα για τον καρκίνο των ωοθηκών σε TCGA (μόνο την έκφραση και τον αριθμό αντιγράφων της μετατροπής) Δεν υπάρχουν δεδομένα μεθυλίωση. Επιπλέον, η περιοχή του υποκινητή του

miR-16-2

, η οποία είναι παρούσα σε ένα σύμπλεγμα με

miR-15b

βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3q25, μεθυλιώνεται στην αληθή πολυκυτταραιμία CD34 + κύτταρα [28]. Παρά το γεγονός ότι η επιγενετική ρύθμιση της

miR-15b

στο OVCA μένει να διερευνηθεί, DNMT1 μπορεί να είναι μία από τις ρυθμιστικές αρχές για την καταστολή

miR-15b

.

Εν ολίγοις, έχουμε διαπίστωσε ότι

WNT7A

άμεσα ρυθμίζεται από

miR-15b

στην OVCA. Όπως WNT7A ενεργοποιεί την ανάπτυξη του όγκου και της προόδου στην OVCA μέσω του WNT7A /CTNNB1 οδού [16, 17], προς τα κάτω ρύθμιση του

miR-15b

επιτρέπει ανώμαλης σηματοδότησης

WNT7A

έκφραση στηρίξει περαιτέρω την επίδραση της WNT7A και τους μηχανισμούς της σε OVCA.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. . Οι σχετικές

WNT7A

έκφραση αξιολογήθηκε με qPCR σε OVCA κύτταρα

δεδομένα εκφράζονται ως φορές πάνω από τα επίπεδα έκφρασης ES2, η οποία ήταν η σχεδόν υπόβαθρο και αυθαίρετα οριστεί σε 1.

doi: 10.1371 /περιοδικό. pone.0156109.s001

(EPS)

S1 πίνακα. Εκκινητές για qPCR

doi: 10.1371 /journal.pone.0156109.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Μαντζίτ Rao (Το Πανεπιστήμιο του Τέξας Health Science Center στο San Antonio) για την παροχή φορέα pMIR-REPORT, και ο Δρ Ιωάννα Burdette (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο) για την παροχή των κυττάρων OVCAR4.