Αφηρημένο

Οικόπεδο-ειδικές τροποποιήσεις των ιστονών είναι σημαντικές επιγενετικές ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Όπως απορύθμιση των γονιδίων συχνά οδηγεί σε περίπλοκες διαταραχές, διορθωτική ρύθμιση των σημάτων της ιστόνης site-specific θα μπορούσε να είναι ένα ισχυρό θεραπευτικό ή ασθένεια προληπτική στρατηγική. Ωστόσο, μια τέτοια διαφοροποίηση από διατροφικές ενώσεις και τη συνακόλουθη επίπτωση στον κίνδυνο της νόσου παραμένουν σχετικά ανεξερεύνητη. Εδώ εξετάσαμε phenethylisothiocyanate (PEITC), ένα κοινό διαιτητική ένωση που προέρχεται από τα σταυρανθή λαχανικά με γνωστές χημειοπροληπτικές ιδιότητες υπό πειραματικές συνθήκες, ως πιθανό διαμορφωτή των τροποποιήσεων ιστονών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η παρούσα μελέτη αναφέρει νέα, δυναμική, site-specific χημικές αλλαγές να ιστόνης Η3 κατά τρόπο γονίδιο-υποκινητή-ειδικό, συνδέονται με την έκθεση PEITC σε επιθηλιακά κύτταρα SW480 που προέρχονται από όγκους ανθρώπινου κόλον. Επιπλέον, PEITC εξασθενημένο πολλαπλασιασμό κυττάρου σε ένα συγκέντρωσης- και χρονοεξαρτώμενο τρόπο, πιθανότατα διαμεσολαβείται από την κασπάση-εξαρτώμενη σηματοδότηση αποπτωτικά. Οι επιδράσεις της PEITC για τροποποιήσεις των ιστονών και μεταβολές γονιδιακής έκφρασης επιτεύχθηκαν σε χαμηλές, μη-κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, σε αντίθεση με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις απαραίτητες για την ανάσχεση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Αυξημένη κατανόηση των συγκεκριμένων επιγενετικές αλλοιώσεις από διαιτητικά ενώσεις μπορούν να παρέχουν βελτιωμένη χημειοπροληπτικές στρατηγικές για τη μείωση της υγειονομικής περίθαλψης άχθους του καρκίνου και άλλων ασθενειών του ανθρώπου

Παράθεση:. Liu Υ, Chakravarty S, Dey M (2013) Phenethylisothiocyanate Alters Site- και υποστηρικτής-ειδικές τροποποιήσεις ιστονών ουρά σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10.1371 /journal.pone.0064535

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17η Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 16η Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 28, 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Σημαντικές υποστήριξης για το έργο αυτό προήλθε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγούν [R00AT4245] (σε MD). Πρόσθετα στηρίγματα ήρθε από το σταθμό Πείραμα Νότια Ντακότα Γεωργία χορηγεί 328100/318000 (σε MD) και 3AH386 (σε SC), ο βιολογικός έλεγχος και ανάλυση από την Applied Photonics: η Νότια Ντακότα το 2010 3SG163 κέντρο επιχορήγηση (για SC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος παραμένει η δεύτερη κύρια αιτία όλων των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ευτυχώς, πολλές διαιτητικές ενώσεις μπορούν ισχυρά ρυθμίζουν διάφορες μοριακών στόχων, με αποτέλεσμα την πρόληψη της έναρξης του καρκίνου, προώθηση και εξέλιξη. Ειδικότερα, τα φρούτα και τα λαχανικά είναι πλούσιες πηγές των βιολογικά δραστικών ενώσεων, που συχνά έχουν χαμηλή τοξικότητα αλλά σημαντική απόδοση των [2]. Στο παρελθόν, ο καρκίνος ήταν στενά σχεδιάστηκε ως μια ασθένεια των μεταλλάξεων, αλλά οι νεότερες έρευνα συνδέει επίσης τη νοσηρή κατάσταση με την διαταραχή της κυτταρικής ρυθμιστικών δικτύων, καθώς και τη διακοπή της λειτουργίας των γονιδίων και γονιδιακής ρύθμισης είναι πλέον τόσο αναγνωριστεί ως σήμα κατατεθέν του καρκίνου [3] , [4], [5]. Ως εκ τούτου, τα μέτρα ασθένεια προληπτικά με στόχο να στοχεύουν βασικά στοιχεία των δικτύων που ρυθμίζουν τη λειτουργία του γονιδίου, όπως χρωματίνης, μπορεί να είναι αποτελεσματική. Οι μεταβολές των τροποποιήσεων της χρωματίνης site-specific, γνωστή ως επιγενετικές μεταβολές, είναι σχετικές με την κλινική ογκολογία, όπως αυτοί σχετίζονται στενά με την έκφραση του γονιδίου και διαταραχές του δικτύου στην κατάσταση ασθένειας [6], [7]. Ως εκ τούτου, την αποσαφήνιση του ρόλου των διατροφικών ενώσεων σε επαναφορά των παρεκκλίνουσα επιγενετικών τοπία υπεύθυνη για αλλοιωμένη έκφραση του γονιδίου μπορεί να διευκολύνει την προληπτικές ιατρικές πρακτικές.

Η επιγενετική βάση της γονιδιακής ρύθμισης εκδηλώνεται κατά τη δομική μονάδα της χρωματίνης, νουκλεοσώματος, το οποίο είναι ένα συγκρότημα από οκταμερή ιστονών τυλιγμένο με γονιδιακό DNA. Τροποποιήσεις των ιστονών αποτελούν μείζονα σημείο μοριακό ελέγχου στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, και οι εν λόγω τροποποιήσεις μεταβάλλονται συχνά σε καρκίνους [6], [7]. Μεταξύ των πολλών γνωστών ιστόνης τροποποιήσεις ουρά αμινοξέων, μεθυλίωση και ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης επί της ιστόνης Η3 έχουν μελετηθεί εκτενώς σε σχέση με γονιδιακή σίγηση και γονιδιακή ρύθμιση. Διμεθυλίωση των Η3 στη λυσίνη 9 (H3K9me2) και trimethylation του Η3 στη λυσίνη 27 (H3K27me3) συχνά συνδέονται με μεταγραφική καταστολή και γονιδιακή σίγηση [8]. Τα site-specific μεθυλιώσεις ιστόνης λυσίνη καταλύεται από ιστόνης μεθυλ τρανσφεράσες (HMTs), και η απομάκρυνση των ομάδων μεθυλίου καταλύονται από demethylases. Ομοίως, αποακετυλίωση ιστονών σε υποκινητές γονιδίων που καταλύεται από αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) συσχετίζεται με τη συμπύκνωση των χρωμοσωμικών περιοχών σήμανσης περιοχές μεταγραφικής ανικανότητα και ρύθμιση προς τα κάτω των συνδεδεμένων γονιδίων [9]. Αν και υπάρχουν in vitro μελέτες του ρόλου των διατροφικών φυτοχημικών στη ρύθμιση των επιπέδων της HMTs και HDACs σε μικρούς αριθμούς [10], η διαμόρφωση της θέσης-ειδικές τροποποιήσεις H3 λυσίνη με διαιτητικές ενώσεις σε ένα γονίδιο-ειδικό τρόπο παραμένει σχετικά ανεξερεύνητη [11] . Εδώ, ερευνήσαμε Η3-ακετυλίωση (Η3-Ac) και τοπο-ειδική μεθυλιώσεις H3 λυσίνη (H3K27me3 και H3K9me2) σε συνδυασμό με phenethylisothiocyanate (PEITC) διαμόρφωση μεσολάβηση έκφραση γονιδίων σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αυτό αποτελεί συνέχεια των προηγούμενων εκθέσεων μας την PEITC ως διαιτητικό ένωση με δυνατότητες αντι-φλεγμονώδεις λειτουργίες σε διάφορα πειραματικά μοντέλα [12], [13].

PEITC εμφανίζεται φυσικά με τη μορφή του προδρόμου γλυκοζινόλης της, gluconasturtiin, σε λαχανικά όπως το λάχανο, το κουνουπίδι, wintercress, και το μπρόκολο. PEITC έχει δείξει δυναμικό αντιοξειδωτική και χημειοπροληπτική δραστικότητα σε πειραματικά μοντέλα διαφόρων καρκίνων [14], [15]. Είναι παρουσίασαν καμία εμφανή τοξικότητα σε μελέτες ασφάλειας του φαρμάκου [16] και είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές για θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). Στο ποντίκι, έχουμε ήδη αποδείξει ότι PEITC μειώνει τη φλεγμονή του παχέος εντέρου και ρυθμίζει μια σειρά πιθανών βιοδεικτών που σχετίζονται με τη φλεγμονή και την καρκινογένεση του παχέος εντέρου. Αυτές οι βιοδείκτες που περιλαμβάνονται γονίδια που σχετίζονται με την φλεγμονώδη αντίδραση, την απόπτωση, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, κυτοκινών /χημειοκινών δραστηριότητα, και μεταγραφική ρύθμιση [12], [13].

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου -σχετικών θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες [21]. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια μηχανιστική συσχέτιση μεταξύ της χρόνιας φλεγμονής και αυξημένο κίνδυνο καρκίνου που προκύπτει από φλεγμονή που προκαλείται γενετικές και επιγενετικές αστάθεια είναι τώρα καλά αποδεκτή [17]. Βασικούς παίκτες σε αυτή την ένωση περιλαμβάνουν παράγοντες μεταγραφής, όπως πυρηνικού παράγοντα κάπα Β (ΝΡκΒ) και μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (stats), κυτοκίνες /χημειοκίνες, και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), μια πολυγονιδιακή οικογένεια του ψευδαργύρου που εξαρτώνται από εξωκυττάρια matrix- αναδιαμόρφωση ενδοπεπτιδάσες. Αυτές οι κυτταρικές μεσολαβητές, μερικά από τα οποία μελετήσαμε προηγουμένως σε μοντέλα ποντικών [12], [13], έχουν σημαντικές λειτουργίες που σχετίζονται με την παράκαμψη της προσαρμοστικής ανοσίας, πολλαπλασιασμό, την επιβίωση των κακοηθών κυττάρων, ανάπτυξη όγκου, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση [17 ], [18], [19], [20]. Η τρέχουσα μελέτη διερεύνησε μεταβολές της χρωματίνης σε συνδυασμό με PEITC μεσολάβηση διαμόρφωση της έκφρασης αυτών των μεσολαβητών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Drug and Chemicals

Διμεθυλ σουλφοξείδιο (DMSO), λιποπολυσακχαρίτη (LPS, από

Escherichia coli στέλεχος

O55: Β5), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και phenethylisothiocyanate (PEITC) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Τροποποιημένο Μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), και TrypLE αγοράστηκαν από την Gibco (Grand Island, ΝΥ). Ανθρώπινη ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝγ) αγοράστηκε από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Φωσφορικό ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (PBS) αγοράστηκε από την Thermo Scientific (Rockford, IL). Για στύπωμα Western, ένα αντίσωμα έναντι β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και αντισώματα έναντι STAT1 και φωσφορυλιωμένων STAT1 (Ser727) αγοράστηκαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Dylight δευτερεύον αντίσωμα αντι-800 κουνελιού αγοράστηκε από Li-Cor Βιοεπιστημών (Lincoln, NE). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία της χρωματίνης ανοσοκαταβύθισης (chip) θα ήταν αντι-ακετυλο-ιστόνης Η3, αντι-τριμεθυλ-ιστόνης Η3 (Lys27) και κουνελιού IgG για τα δείγματα αρνητικού ελέγχου από την Upstate Biotechnology (Billerica, ΜΑ) και αντι-διμεθυλο-ιστόνης Η3 (Lys9) από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται για την δοκιμασία των μαρκών είχε μικροκοκκική νουκλεάση (MNase) από την Cell Signaling (Beverly, ΜΑ) και πρωτεϊνάση Κ από Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν με IDT DNA Inc. (Coralville, ΙΑ). Η απρωτινίνη χημικά δοκιμασία ChIP, DL-1, 4-διθειοθρεϊτόλη (DTT), και Nonidet-Ρ40 (ΝΡ-40) αγοράστηκαν από την Thermo Scientific (Rockford, IL), ενώ το βουτυρικό νάτριο, πρωτεΐνη-Α sepharose, και σακχαρόζη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). ρυθμιστικό επώασης ChIP αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ), και ένας πολτός DNA καθαρισμού για τον καθαρισμό του DNA τσιπ βαθμού αγοράστηκε από Diagenode (Denville, NJ).

Cell Culture

SW480 (ATCC CCL-228), ΗΤ-29 (ATCC ΗΤΒ-38), και ΤΗΡ-1 (ATCC ΤΙΒ-202) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% πενικιλίνη (25 U /ml) /στρεπτομυκίνη (25 μg /ml) σε ένα 95% αέρα /5% CO

2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Τρεις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα ΤΗΡ-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PEITC σε μία προκαθορισμένη δόση για 8 ώρες πριν από την πρόκληση με LPS (1 μg /ml). SW480 και ΗΤ-29 κύτταρα πριμοδοτήθηκαν με ΙΡΝγ (10 ng /ml) για 12 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PEITC για 5 ώρες, και στη συνέχεια διεγείρονται με LPS (10 ή 50 ng /ml) για 4 ή 1 ώρα, αντίστοιχα. LPS και PEITC διαλύθηκαν σε DMEM και DMSO, αντίστοιχα, με DMSO που χρησιμοποιείται ως όχημα. Για κάθε πείραμα, συμπεριελήφθησαν ένας θετικός έλεγχος (κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO και LPS /ΙΡΝγ) και ένα αρνητικό μάρτυρα (κύτταρα κατεργασμένα με μόνο DMSO). Δύο επαναλήψεις για κάθε κατεργασία. θεραπείες PEITC διεξήχθησαν σε 2,5, 5, 10, και 15 μΜ συγκεντρώσεις. Για την ανάλυση των αλλαγών έκφραση εξαρτώμενη από το χρόνο του STAT1 και άλλα γονίδια που παρουσιάζουν ενδιαφέρον (ΚΙ) σε απόκριση προς PEITC, SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ PEITC για 5, 8, 12, και 18 ώρες. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Κυττάρου Βιωσιμότητα Δοκιμασία, Δόση Εύρος Προσδιορισμός και κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Ένα CellTiter 96 Υδατικό One Λύση κιτ προσδιορισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού (MTS, 3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, εσωτερικό άλας? Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του σχετικού αριθμού των βιώσιμων κυττάρων SW480 απομένει μετά την επεξεργασία PEITC, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δοκιμασία διεξήχθη με κατεργασία SW480 κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις PEITC, ακολουθούμενα από την προσθήκη 20 μl αντιδραστηρίου CellTiter απευθείας σε φρεάτια καλλιέργειας, επώαση για 2 ώρες στους 37 ° C, και στη συνέχεια, την καταγραφή της απορρόφησης στα 490 nm με έναν αναγνώστη τρυβλίου Biotek Synergy Η4 ( BioTek, Winooski, VT). Υπόβαθρο 490 nm απορρόφηση διορθώθηκε με την παρασκευή ενός τριπλούν ομάδα φρεατίων ελέγχου (χωρίς κύτταρα) που περιέχουν τις ίδιες ποσότητες του μέσου καλλιέργειας και αντιδραστήριο CellTiter όπως στα πειραματικά φρεάτια. Η ίδια δοκιμασία διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας υψηλότερες συγκεντρώσεις PEITC (έως 80 μΜ) και έκθεση των κυττάρων για μεγαλύτερες χρονικές περιόδους έως και 48 ώρες για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις αντι-πολλαπλασιασμό των PEITC σε SW480 κύτταρα (Σχήμα 1). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ακόμη και χαμηλότερες συγκεντρώσεις (πάνω από 5 μΜ) της θεραπείας PEITC για μεγαλύτερες περιόδους επωάσεως όπως 48 ώρες επάγουν σημαντικές κυτταρικό θάνατο και την υποβάθμιση του mRNA (Σχήμα 1). Επελέγησαν συγκεντρώσεις PEITC στο οποίο δεν υπάρχει σημαντική απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων έλαβε χώρα (δεν κυτταροτοξικά αποτελέσματα) για όλα τα περαιτέρω πειράματα (Εικόνες 2, 3, 4, 5, 6). Ως εκ τούτου, όλοι οι προσδιορισμοί γονιδιακή έκφραση (RNA και την πρωτεϊνική έκφραση) και επιγενετικές μεταβολές που αναφέρθηκαν σε αυτό το χειρόγραφο προσδιορίστηκαν στο χρονικό σημείο 5 ώρες, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Μια έκθεση 40 μΜ PEITC για 12 ώρες ή λιγότερο δεν έδειξε στατιστικά σημαντική απώλεια κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 1Α). Για παρατηρήσεις χρονο-εξαρτώμενη (Σχήμα 5 και S1, S2, S3, S4, S5), κύτταρα με 10 μΜ θεραπεία PEITC επωάστηκαν για έως και 18 ώρες, ως μια στατιστικώς σημαντική απώλεια στην βιωσιμότητα των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε μέχρι εκείνο το χρονικό σημείο ( Σχήμα 1Α).

Μετά 12, 24, και 48 ώρες έκθεσης PEITC και επακόλουθη επώαση 2 ωρών με CellTiter υδατικό αντιδραστήριο (Promega), το Α

490 nm μετρήθηκε σε κύτταρα SW480 σε BioTek Synergy Η4 αναγνώστης. βιωσιμότητα Ποσοστό κυττάρων δείχνεται σε σχέση προς τον έλεγχο (χωρίς PEITC) ως ο μέσος όρος ± SEM (Α)? Εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της PEITC στις 48 ώρες επί κατακερματισμού του DNA (Β)? Εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση διαμόρφωση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο με PEITC στις 48 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος οικοκυρική για σχετική ποσοτικοποίηση των αλλαγών έκφρασης γονιδίου (C)? για όλα τα πειράματα n = 3. * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. Καμία απώλεια στη βιωσιμότητα κυττάρου σε 10 μΜ ομάδα PEITC σύγκριση με την ομάδα άνευ PEITC παρατηρήθηκε μέχρι και 12 ώρες.

Η

Έξι γονίδια δείχνονται για τις οποίες PEITC σχετιζόμενη αλλαγές στην Η3 τροποποιήσεις παρατηρήθηκαν επίσης . Gois για τα οποία δεν παρατηρήθηκαν PEITC έκθεσης που σχετίζονται με αλλαγές Η3 φαίνονται στον Πίνακα 3, αλλά όχι στην τρέχουσα εικόνα. Τα αποτελέσματα των θεραπειών PEITC μετρήθηκαν από τη σχετική ποσότητα του mRNA που εκφράζεται από ΚΙ στα επεξεργασμένα κύτταρα. Η ποσότητα mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR, με GAPDH ως εσωτερικός έλεγχος. Οι χαμηλότερες τιμές αντιπροσωπεύουν μεγαλύτερη ανασταλτική δράση. Οι τιμές είναι μέσες ± SEM (n = 6). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. Όταν όλες οι τιμές κάτω από τη διακεκομμένη γραμμή αντιστοιχεί στην ίδια κατηγορία

p

αξίας, τα μεμονωμένα αστέρια παραλείπονται για την αποφυγή συνωστισμού του σχήματος. Στατιστική σημασίες μετρήθηκαν σε σχέση με το θετικό μάρτυρα, τα οποία είναι κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με LPS και χωρίς PEITC, που δείχνει τα υψηλότερα επίπεδα επαγωγής του γονιδίου.

Η

ιστόνης Η3 μεθυλίωση αλλαγές στις περιοχές προαγωγού των γονιδίων ενδιαφέροντος (ΚΙ ) σε κύτταρα SW480. Χρωματίνης από κύτταρα SW480 συλλέχθηκε μετά από 5 ώρες από κατεργασία 10-μΜ PEITC. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων ChIP χρησιμοποιώντας (Α) αντι-τριμεθυλ-ιστόνης Η3 Lys27 (H3K27me3) και (Β) αντι-διμεθυλο-ιστόνης Η3 Lys9 (H3K9me2) είναι αντισώματα που φαίνεται. Από 13 Gois δοκιμαστεί σε κύτταρα SW480, έξι γονίδια που έδειξαν στατιστικά σημαντική PEITC που σχετίζονται με αλλαγές στην H3K27me3 κράτη και ένα γονίδιο έδειξε στατιστικά σημαντική PEITC που σχετίζονται με αλλαγές στην κατάσταση H3K9me2. DNA αλληλουχίες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές υποκινητή. Μέσο ποσοστό εισόδου ± SEM (n = 3) από κάθε πείραμα σχεδιάζεται. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα θετικού ελέγχου

Η

ιστόνης Η3 αλλαγές ακετυλίωση στην περιοχή του υποκινητή των γονιδίων ενδιαφέροντος (ΚΙ) στην SW480 κύτταρα. Χρωματίνης από κύτταρα SW480 συλλέχθηκε μετά από 5 ώρες 10 μΜ θεραπεία PEITC. Από 13 Gois δοκιμαστεί σε κύτταρα SW480, δύο γονίδια που έδειξαν στατιστικά σημαντική PEITC που σχετίζονται με αλλαγές στην κατάσταση του Η3-Ac. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων ChIP χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-ακετυλο-ιστόνης Η3 φαίνονται. DNA αλληλουχίες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές υποκινητή. Μέσο ποσοστό εισόδου ± SEM (n = 3) από κάθε πείραμα σχεδιάζεται. * P & lt? 0,05, *** p & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα θετικού ελέγχου

Η

Εκπρόσωπος αποτελέσματα δείχνουν τα χρονικά εξαρτώμενη αποτελέσματα των 10 μΜ θεραπείας PEITC στα επίπεδα STAT1 mRNA και για την κατάσταση μεθυλίωσης H3K27me3 . SW480 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ PEITC στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία (Α, Β). Τα επίπεδα mRNA STAT1 κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH και εκφράζεται ως ποσοστό σε σχέση με κύτταρα θετικού μάρτυρος (Α). Ιστόνης Η3 αλλαγές μεθυλίωσης στην περιοχή STAT1 υποκινητή σε SW480 κύτταρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-H3K27me3 για chip. DNA αλληλουχίες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με πραγματικού χρόνου PCR (Β). Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (n = 4) από κάθε πείραμα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα θετικού ελέγχου. Οι πράσινες διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν μία πιθανή αντίστροφη συσχέτιση (για κατασταλτικές σήματα) μεταξύ των αλλαγών στα επίπεδα mRNA και την κατάσταση τροποποίηση Η3 στα κύτταρα. Η παρουσία ή η απουσία παρόμοιων συσχετίσεων για τους υπόλοιπους πέντε ΚΙ φαίνονται στις Εικόνες S1, S2, S3, S4, S5.

Η

αναλύσεις ανοσοστυπώματος δείχνουν καταστολή του ολικού κυτταρικού STAT1 καθώς ενεργοποιείται η πυρηνική pSTAT1 σε απόκριση σε αγωγές PEITC σε κύτταρα SW480 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. (Α) Ανοσοστύπωμα. (Β) Η πυκνομετρική αναλύσεις ανοσοστυπώματος. Τα κύτταρα προ-αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις PEITC για 5 ώρες πριν από την ενεργοποίηση LPS 4 ώρες. Μη διεγερμένα κύτταρα και διεγείρονται κύτταρα χρησίμευσαν ως αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι. εντάσεις Band ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 3) από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt?. 0.01

Η

Δοκιμασία DNA κατακερματισμός για την ανίχνευση της απόπτωσης

SW480 κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις PEITC επωάστηκαν για 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας DNazol (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. κατάτμηση DNA οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5% και GelRed χρώσης (Biotium, Hayward, CA).

Ολικό RNA Extraction, καθαρισμός και cDNA Synthesis

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm χρησιμοποιώντας το σύστημα NanoDrop φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA στη συνέχεια κατεργάστηκε με ϋΝάση Ι (Invitrogen Inc.), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε ίχνη μόλυνσης DNA. Τα cDNA συντέθηκαν χρησιμοποιώντας 3 μg του RNA για κάθε δείγμα με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. εκχύλιση RNA, του καθαρισμού και σύνθεση cDNA εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Τα συντιθέμενα cDNAs αραιώθηκαν τέσσερις φορές. Δύο μικρολίτρα από κάθε αραιωμένο δείγμα προστέθηκε σε 0.5 μΐ γονιδίου-ειδικών εκκινητών και 12,5 μΙ Ισχύος SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosciences, Foster City, CA) και ο τελικός όγκος φέρεται σε 25 μΐ με προσθήκη στείρου απεσταγμένου ύδατος. ενισχύσεις PCR εκτελέστηκαν σε ένα σύστημα MX3005P (Roche /Stratagene) χρησιμοποιώντας έναν κύκλο στους 50 ° C για 2 λεπτά, ένας κύκλος 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 15 s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C , και ένα τελευταίο κύκλο με 95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 30 s, και 95 ° C για 30 s, όπως περιγράφεται [13]. NTC (κανένας έλεγχος πρότυπο), κανένας-RT ελέγχου και PEITC μόνο έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν ως κατάλληλη για σκοπούς ελέγχου ποιότητας. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν. Οι Gene-ειδική, εσώνια που εκτείνονται εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη που περιγράφεται στον Πίνακα 1 (για έκφραση PEITC εξαρτάται από τη συγκέντρωση του mRNA) και στον Πίνακα 2 (για πειράματα με κύκλωμα). Οι υπολογισμοί των σχετικών επιπέδων έκφρασης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ΔΔC

t-μέθοδο [25]. τιμές δεδομένων είναι οι μέσοι όροι από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και εκφράζονται ως η σχετική ποσότητα του mRNA σε σχέση με ένα θετικό μάρτυρα, η οποία είναι κανονικοποιημένη σε μία τιμή 1,0.

Η

Ανάλυση Western Blot

για αναλύσεις ανοσοστυπώματος, ΙΡΝγ-γεμάτοι, PEITC επεξεργασμένα SW480 κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με LPS για 4 ώρες και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό λύσης (20 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Να

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% ΝΡ-40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Να

3νο

4, 1 μg /ml λευπεπτίνη). Για την παρασκευή πυρηνικού εκχυλίσματος και τον προσδιορισμό συγκέντρωσης πρωτεΐνης, του κατασκευαστή (Thermo Scientific, Rockford, IL) πρωτόκολλα για NE-PER Nuclear Εκχύλιση Αντιδραστήρια και κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης Pierce BCA ακολουθήθηκαν. Πρωτεΐνες (50 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και τα προϊόντα ήταν ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Thermo Scientific, Rockford, IL). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα, πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS, επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (αντι-β-ακτίνης από την Santa Cruz Biotechnology και κουνελιού αντι-STAT1 και αντι-φωσφορυλιωμένη STAT1 [Ser727] από την Millipore) όλη τη νύκτα, πλύθηκαν τρεις φορές σε Tween-20 (0,1% σε PBS) και επωάστηκαν με Dylight 800 αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα από Li-Cor για 1 ώρα, όλα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το ξέπλυμα σε Tween-20 (0,1% σε PBS), κηλίδες απεικονίστηκαν με ένα σύστημα Odyssey υπέρυθρης απεικόνισης (Li-Cor).

Ποσοτική χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Ανάλυση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα ~3-5 × 10

6 ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων 18-24 ώρες πριν από τη θεραπεία, στη συνέχεια ξεπλένονται δύο φορές με ψυχρό PBS και συλλέχθηκαν μετά την αγωγή [26]. Η δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη έκδοση ενός προηγουμένως δημοσιευμένης μεθόδου [27]. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα 1 (0,06 Μ KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCl ρΗ 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 0,3 Μ σακχαρόζη, 180 μg απροτινίνη, 5 mM βουτυρικό νάτριο, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) και Ρυθμιστικό 2 (0,8% ΝΡ40 + Ρυθμιστικό 1) για 10 λεπτά επί πάγου. εναιωρήματα κυττάρων προστέθηκαν σε νέους σωλήνες που περιέχουν ρυθμιστικό 3 (0,06 Μ KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCl ρΗ 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 1,2 Μ σακχαρόζη, 180 μg απροτινίνη, 5 mM βουτυρικό νάτριο, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT). Μετά φυγοκεντρήθηκαν τα δείγματα, οι πυρήνες συλλέχθηκαν και επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό πέψης MNase (0.32 Μ σακχαρόζη, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4-7,6, 4 mM MgCl

2, 1 mM ΟαΟ

2, 0,1 mM PMSF, 5 mM βουτυρικό νάτριο), επωάζονται σε 37 ° C υδατόλουτρο επί 6 λεπτά, και 20 μΐ 0,5 Μ ΕΟΤΑ προστέθηκαν για να σταματήσει η αντίδραση. Με τον τρόπο αυτό, χρωματίνη χωνεύτηκε σε μέσο μήκος DNA του 300-800 bp. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο περιείχε το πρώτο διαλυτό κλάσμα της χρωματίνης, S1. Το σφαιρίδιο επανα-αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυσης (1 mM Tris-HCI ρΗ 7,4-7,6, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 5 mM βουτυρικό νάτριο), τοποθετήθηκε σε πάγο για 1-2 ώρες, και φυγοκεντρείται. Το προκύπτον σφαιρίδιο ήταν το δεύτερο διαλυτό χρωματίνη κλάσμα, S2. Δείγματα των δύο χρωματίνης κλάσματα (10-20 μg S1 και S2 10-20 μg) αναμείχθηκαν, ο όγκος αραιώνεται σε 1 ml με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης πλινθίου (Abcam), και το μίγμα υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση με ειδικά αντισώματα, με περιστροφή όλη τη νύκτα σε 4 ° C. Ανοσοκαταβυθισμένες χρωματίνη εκχυλίστηκαν με τη χρήση πρωτεΐνης A-Sepharose και καθαρίζεται με τη χρήση ενός πολτού DNA καθαρισμού (Diagenode, Denville, NJ). Ένα κλάσμα του κάθε ανοσοκατακρημνίστηκε μήτρα DNA (100-150 ng) χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές γονίδιο υποκινητή ειδικής αλληλουχίας (Πίνακας 2). Το ΡΟΚ-ενισχυμένο ανοσοκαταβυθίστηκαν σήμα DNA κανονικοποιήθηκε προς το σήμα PCR από μη ανοσοκαταβυθίστηκαν DNA εισόδου [28]. Τα σήματα που λαμβάνονται με καταβύθιση με IgG ελέγχου αφαιρέθηκαν από τα σήματα που λαμβάνονται με τα ειδικά αντισώματα. Οι υπολογισμοί βασίστηκαν στη μέση τιμή τουλάχιστον τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της εισόδου (Σχήματα 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία των ομάδων θεραπείας αξιολογήθηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από ανάλυση posthoc του Dunnett για τη σύγκριση των επιμέρους ομάδα θεραπείας με τον μάρτυρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Μια πιθανότητα (

σ

) αξίας 0,05 ή μικρότερη θεωρήθηκε ως το κριτήριο για μια σημαντική διαφορά.

Αποτελέσματα

Επίδραση των PEITC στο Gene Expression σε ανθρώπινα κύτταρα

για να επανεξετάσει τα αποτελέσματα έκφρασης γονιδίου σε απόκριση προς PEITC θεραπείες που ελήφθη στο προηγούμενη μελέτη μας των μακροφάγων ποντικού [12], θα πραγματοποιηθεί βελτιστοποιήσεις δοκιμασία που χρησιμοποιεί τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές: η ανθρώπινη μονοκυτταρική κυτταρική γραμμή ΤΗΡ-1 και η ανθρώπινη επιθηλιακές κυτταρικές γραμμές κόλου ΗΤ-29 και SW480. Βελτιστοποίηση περιλαμβάνονται παράμετροι επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης σε κύτταρα κατεργασμένα με LPS ή LPS + ΙΡΝγ και το εύρος των μη-κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις PEITC και διάρκειες έκθεσης. Πληροφορίες δεν υπάρχουν στη βιβλιογραφία σχετικά με τις επιπτώσεις PEITC στα SW480 και κύτταρα ΤΗΡ-1. Στην προηγούμενη μελέτη [12], 21 που προκαλείται από LPS γονίδια καταστέλλονται τρεις φορές ή περισσότερο από 10 μΜ ΡΕΟ (PEITC Essential Oil) σε σύγκριση με την ενεργοποίηση LPS μόνη της σε RAW 264.7 μακροφάγων κυττάρων ποντικού. (ΠΕΟ είναι PEITC λαμβάνεται από το

ΒαΓύαΓβα Verna

σπόρους [15] Both ΠΕΟ και εμπορικά αγόρασε PEITC αποτελούνται από & gt?.. 95% καθαρό PEITC Στην παρούσα μελέτη με ΤΗΡ-1, ΗΤ-29 και SW480 κύτταρα, συμπεριλάβαμε δύο επιπλέον γονίδια, ΜΜΡ7 και ΜΜΡ9, για συνολικά 23 τελικό γονίδια που μας ενδιαφέρουν (ΚΙ). PEITC κατασταλεί 9, 3, και 13 από τις 23 γονιδίων σε ΤΗΡ-1, ΗΤ-29, και SW480 κυττάρων , αντίστοιχα (Πίνακας 3). τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι τα κύτταρα SW480 ήταν οι πιο αποκρίνεται σε ΙΡΝγ-γεμάτοι επαγωγή LPS μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. τα 13 γονίδια τα κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία PEITC σε κύτταρα SW480 αποτελούν βασικές κυτταρικών παραγόντων στην φλεγμονή και του καρκίνου. Επομένως, όλα τα πειράματα έκφρασης επακόλουθη γονιδιακή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αυτά τα 13 γονίδια σε κύτταρα SW480. οι 10 γονίδια που σαρώθηκαν αλλά δεν προκλήθηκαν /εκφράζονται στις κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου δεν συζητούνται περαιτέρω σε αυτό το χειρόγραφο. Μετά αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης , διερευνήθηκαν οι αλλαγές σε τροποποιήσεις των ιστονών (H3K27me3, H3K9me2, και Η3-Ac) στις περιοχές υποκινητή του καθενός από αυτά τα γονίδια 13. Παρατηρήσαμε διαφορικό Η3-τροποποιήσεις σε σχέση με τους ελέγχους για μόνο έξι από αυτά τα 13 γονίδια, τα οποία συζητούνται λεπτομερώς στο χειρόγραφο. Όλα τα 13 γονίδια, αν δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές Η3 σε περιοχές υποκινητών τους σε συνδυασμό με την έκθεση PEITC, παρατίθενται στον Πίνακα 3.

Η

Επίδραση των PEITC για τον Καρκίνο του παχέος εντέρου (SW480) κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Πολλά από τα επιλεγμένα γονίδια που παρατηρήθηκαν να διαμορφώνεται από PEITC σε κύτταρα SW480 ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης (Πίνακας 3). Συνεπώς, διερευνήσαμε αν PEITC είχε ανταγωνιστικό αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου, κρίνοντας ότι PEITC εξασθενημένα βιωσιμότητα σε κύτταρα SW480 σε ένα χρόνο και τη συγκέντρωση εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι συγκεντρώσεις PEITC και χρόνους έκθεσης που απαιτούνται για να σταματήσει τον καρκίνο πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι υψηλότερες και περισσότερο, αντίστοιχα, από ό, τι εκείνων που απαιτούνται για την επαγωγή αλλαγές στη χημεία χρωματίνη (Σχήματα 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) και το γονίδιο έκφρασης (σχήματα 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). Για συγκεντρώσεις κάτω από 80 μΜ, τουλάχιστον ένα άνοιγμα 24 ώρες ήταν αναγκαία για την επαγωγή σημαντικά θάνατο των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1). Για τα περισσότερα από τα υπόλοιπα πειράματα (Εικόνες 2, 3, 4, και 6), χρησιμοποιήσαμε ένα άνοιγμα PEITC από 5 ώρες σε ή κάτω από 15 μΜ. Στα Σχήματα 5 και S1, S2, S3, S4, S5, 10 μΜ PEITC χρησιμοποιήθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία σε κύτταρα SW480 για μέχρι 18 ώρες από PEITC χρόνου έκθεσης. Μια συγκέντρωση 10 μΜ PEITC επηρεάζονται σημαντικά βιωσιμότητας κυττάρων στα ή πέραν των 24 h (Σχήμα 1Α), και μία δοκιμασία κατάτμησης DNA (Εικόνα 1Β) αποκάλυψε ότι οι αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις του PEITC μπορεί να οφείλεται σε αποπτωτικό πάνω ρύθμιση αποδεικνύεται ως επίσης με υψηλότερη έκφραση της κασπάσης 3 και 8 (Σχήμα 1 C). Η απουσία σημαντικών αλλαγών στην πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου CyclinD1 (CCND1) δείχνει ότι PEITC δεν αναστέλλει άμεσα τον κυτταρικό κύκλο (σχήμα 1 C).

Modulation χημειοκινών από PEITC σε Ανθρώπινα κύτταρα κόλου

Οι χημειοκίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση των φλεγμονωδών διεργασιών στο παχύ έντερο. Η παραγωγή χημειοκινών εντός του εντέρου καθιερώνει ένα χημειοτακτικό κλίση ικανή να αυξάνει τη μετανάστευση των μονοκυττάρων /μακροφάγων, κοκκιοκυττάρων, και λεμφοκύτταρα από την κυκλοφορία του αίματος μέσω του ενδοθηλίου τόσο στο βλεννογόνο και υποβλεννογόνο διάρκεια χρόνιες φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου (IBD) [29]. Προηγουμένως, παρατηρήσαμε ότι PEITC μειωμένη φλεγμονή, εξάντληση των λαγηνοειδών κυττάρων, και διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων σε βλεννογόνο και υποβλεννογόνο [12] ποντίκι. Στην παρούσα μελέτη, εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση PEITC μεσολάβηση εξασθένησης των επιπέδων mRNA των τεσσάρων προφλεγμονωδών χημειοκινών /κυτταροκίνες (CCL2, CSF2, CXCL10, και IL8) παρατηρήθηκε σε SW480 κύτταρα (Πίνακας 3, Σχήμα 2). Επιμέρους πειράματα μάρκα σε αυτούς τους προαγωγούς χημειοκίνης αποκάλυψε υπερ-trimethylation Η3 στη λυσίνη 27 (αυξημένη μέλη H3K27me3) που περιβάλλουν τις περιοχές υποκινητή της IL8 και CCL2 και μια πρόσθετη μείωση ακετυλίωση που περιβάλλουν τις περιοχές υποκινητή της IL8 σχετίζεται με 10 μΜ PEITC έκθεση (Πίνακες 3- 4, Σχήματα 3Α και 4). Ωστόσο, ένα χρόνο-εξαρτώμενη αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε για H3K27me3 (κατασταλτικά σήμα) αλλά όχι Η3-Ac με τα επίπεδα έκφρασης του mRNA IL8 (Πίνακας 4, Σχήμα S5). Στην περίπτωση της CCL2, τα επίπεδα mRNA και H3K27me3 καταστάσεις παρατηρήθηκαν να ποικίλουν μεταξύ τους, αποκλείοντας μια πιθανή αιτιακή σχέση (Πίνακας 4, Σχήμα S4). Αν και Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2) -catalyzing trimethylation H3K27 εμπλέκεται σε γονίδιο κυτοκίνης επαναπρογραμματισμό σε απόκριση προς φλεγμονώδεις διεγέρτες [30], [31], η προφανής επιλεκτικότητα PEITC στο πλαίσιο των τροποποιήσεων ιστονών που περιβάλλουν τις περιοχές υποκινητή των στοχευόμενων χημειοκινών /κυτοκίνες μας οδηγεί να πιστέψουμε ότι PEITC είναι απίθανο να επηρεάσει άμεσα την PRC2.

η

Διαταράσσει PEITC έκθεσης Μεταγραφή Factor Δραστηριότητες σε Ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου

Οι NFκBs και τα στατιστικά είναι δύο σημαντικές οικογένειες παράγοντες μεταγραφής που ενεργοποιείται σε απόκριση σε μία ποικιλία ερεθισμάτων να ρυθμίζουν πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανοσολογικής απόκρισης και την καρκινογένεση. Οι NFκBs και τα στατιστικά έχουν διακριτές καθώς και συνεργιστικά αποτελέσματα στην κατάντη επαγωγής γονιδίου-δράστη [32]. Ο ρόλος του ΝΡκΒ στον IBD [33], καθώς και η επίδραση της στη δραστικότητα PEITC ΝΡκΒ [34], [35], [36], [37] είναι καλά μελετηθεί. Εδώ παρατηρήσαμε PEITC μεσολάβηση κατάντη ρύθμιση διαφόρων ΝΡκΒ μέλη της οικογένειας, δηλαδή NFκB1, NFκBiα, και πρωτεΐνες REL, η οποία δεν είχε προηγουμένως αναφερθεί για SW480 κύτταρα (Πίνακας 3, Σχήμα 2). Είναι ενδιαφέρον, μια χρονο-εξαρτώμενη αύξηση στην κατάσταση H3K27me3 συνδέθηκε με μια εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση της έκφρασης NFκB1 σε PEITC-εκτεθειμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας εν δυνάμει επιγενετική ρύθμιση του NFκB1 ότι τα προσόντα μέλλον επικύρωσης (Πίνακας 4, τα Σχήματα 3Α, S1).