Οι

Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) /καρκινικά κύτταρα initiaiting (CICs) ορίζεται ως ένα μικρό πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων που έχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης, το δυναμικό διαφοροποίησης και υψηλή ικανότητα ογκογενή . ΚΕΠ /έχουν CICs του καρκίνου των ωοθηκών έχουν απομονωθεί από την πλευρά του πληθυσμού (SP) ανάλυση, προσδιορισμός ALDEFLUOR και χρησιμοποιώντας δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Ωστόσο, αυτές οι προσεγγίσεις δεν είναι οριστικά δείκτες για ΚΕΠ /CICs, και είναι απαραίτητο να προσαρμοστούν πρόσφατες μεθόδους για την ταυτοποίηση περισσότερο υψηλά καθαρισμένη ΚΕΠ /CICs. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τα κύτταρα SP και αλδεΰδη dehydrogenese φωτεινά (ALDH

Br) κύτταρα από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Και τα δύο κύτταρα SP και ALDH

Br κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερο όγκο έναρξη ικανότητα και υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ενός δείκτη βλαστικών κυττάρων,

σεξ περιοχή καθορισμού Υ-box 2 (SOX2)

, από εκείνες των κύριων πληθυσμού (MP ) κύτταρα και ALDH

Χαμηλή κύτταρα, αντίστοιχα. Αναλύσαμε ένα SP και ALDH

Br επικάλυψη πληθυσμού (SP /ALDH

Br), και το SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού εμφάνισαν υψηλότερη ικανότητα όγκου κίνηση από εκείνη των κυττάρων SP ή ALDH

κύτταρα Br , επιτρέποντας την έναρξη των όγκων με τόσο λίγα όπως 10

2 κύτταρα. Επιπλέον, SP /ADLH

Br πληθυσμού έδειξε υψηλότερη σφαίρα-ικανότητα σχηματισμού, σισπλατίνη αντοχή, την ικανότητα διαφοροποίησης των λιποκυττάρων και την έκφραση του

SOX2

από εκείνες της SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα. Gene knockdown του SOX2 κατέστειλε την ογκο-έναρξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Μια SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού ανιχνεύθηκε σε διάφορα γυναικολογικά καρκινικά κύτταρα με αναλογίες 0,1% για τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος HEC-1 ενδομητριοειδές στο 1% για ΝΕΠ ωοθηκών βλεννώδη κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Στο σύνολό τους, η χρήση του SP και ΑΙ_ϋΗ

Br επικάλυψη του πληθυσμού είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την απομόνωση υψηλής καθαρότητας ΚΕΠ /CICs και SOX2 μπορούσε να είναι μια νέα λειτουργικά δείκτης για ωοθηκών ΚΕΠ /CICs

Παράθεση:. Yasuda K , Torigoe Τ, Morita R, Kuroda Τ, Takahashi Α, Matsuzaki J, et al. (2013) Καρκίνος των ωοθηκών βλαστικά κύτταρα είναι εμπλουτισμένα σε Side τον Πληθυσμό και την Αλδεΰδη αφυδρογονάσης Bright Συρροή πληθυσμού. PLoS ONE 8 (8): e68187. doi: 10.1371 /journal.pone.0068187

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 28 Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Αύγ 2013

Copyright: © 2013 Yasuda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (χορηγήσουν αρ. 16209013, 17016061 και 15659097) για την πρακτική έρευνα Εφαρμογή από την Επιστήμη και την Τεχνολογία Οργανισμού της Ιαπωνίας, καθώς και για Έρευνα του Καρκίνου (15-17 και 19-14) από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας, Ono καρκίνο του Ταμείου Έρευνας (στην NS) και το Ίδρυμα Takeda Επιστημών (με ΥΗ). Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Έρευνας και Ανάπτυξης Ταμείο (23-Α-44). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) /καρκινικά κύτταρα κίνηση (CICs) ορίζεται ως μικρός πληθυσμός των καρκινικών κυττάρων που έχουν τις ιδιότητες του υψηλού όγκου έναρξη ικανότητα, την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και τη δυνατότητα διαφοροποίησης [1] – [3]. Επιπλέον, οι ΚΕΠ /CICs αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε καθιερωμένες θεραπείες του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία? Ως εκ τούτου, ΚΕΠ /CICs είναι υπεύθυνα για την υποτροπή του καρκίνου μετά τη θεραπεία [4], [5]. Αρκετές προσεγγίσεις έχουν περιγραφεί για τον εντοπισμό ΚΕΠ /CICs, συμπεριλαμβανομένης της απομόνωσης η CSC /CIC-ειδική έκφραση δείκτη επιφανείας κυττάρου (π.χ. CD44, CD133, CD166), η ανίχνευση των πλευρικών πληθυσμού (SP) κυτταρικό φαινότυπο με Hoechst 33342 αποκλεισμό και την ανίχνευση των αλδεϋδικής αφυδρογονάσης 1 (ΑΙ_ϋΗ1) δραστικότητα στον προσδιορισμό ALDEFLUOR [6]. Ωστόσο, η έκφραση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, τα κύτταρα SP και η έκφραση του ΑΙ_ϋΗ1 δεν σχετίζονται με την ικανότητα ογκογενή σε ορισμένες αναφορές [7] – [9]. έτσι Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι αυτοί οι δείκτες αρχέγονων κυττάρων (δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, τα κύτταρα SP και ΑΙ_ϋΗ1) δεν είναι λειτουργικές και δεν είναι απαραίτητη για τη συντήρηση του ΚΕΠ /CICs. Αυτοί οι δείκτες δεν μπορούν να καθορίσουν υψηλό ογκογόνο ΚΕΠ /CICs, και αυτοί οι δείκτες είναι έτσι απλώς υποκατάστατο δείκτες για την ΚΕΠ /CICs. Ως εκ τούτου, η λειτουργική μη-υποκατάστατος δείκτης που είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ΚΕΠ /CICs αναμένεται.

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα από τα σημαντικότερα κακοηθειών και προκαλεί το θάνατο περισσότερων από ένα εκατομμύριο άνθρωποι στον κόσμο κάθε χρόνο [10 ]. Επιπλέον, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν άθλιο επεισόδια ασκίτη, ειδικά σε προχωρημένα στάδια. Για να βελτιωθεί η κλινική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, την έρευνα του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων των ωοθηκών έχει αναδειχθεί ως ένα πρόσφατο θέμα. CD44 δείκτη επιφάνειας κυττάρου, τα κύτταρα SP και ALDH

τα κύτταρα Br αναφερθεί ως δείκτες αρχέγονων κυττάρων για γυναικολογικές κακοήθειες που χρησιμοποιούν κυτταρικές γραμμές OVCAR3, HEC-1 και άλλες γραμμές και δείγματα υπεροχής [11] – [14], και CSC /CIC η έρευνα μπορεί να βελτιώσει την έκβαση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών.

για να βελτιωθούν οι μέθοδοι για την απομόνωση της υψηλής καθαρότητας των ωοθηκών ΚΕΠ /CICs, αναλύσαμε το συνδυασμό των γνωστών δεικτών CSC /CIC των ωοθηκών. Αναλύσαμε ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές με ανάλυση SP και δοκιμασία ALDEFLUOR και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα SP και ALDH

κύτταρα Br ήταν υψηλότερες ογκογόνο από εκείνες των κύριων πληθυσμού κυττάρων (MP) και ALDH

Χαμηλή κύτταρα, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι η επικάλυψη του πληθυσμού των κυττάρων SP και κύτταρα ALDH

Br (SP /ALDH

Br) ήταν πιο πολύ ογκογόνο. Και βρήκαμε ότι

SOX2

εκφράστηκε σε SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού σε υψηλότερο επίπεδο, και το γονίδιο νοκ ντάουν του

SOX2

κατήργησε τον όγκο έναρξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, SOX2 μπορούσε να είναι μια νέα λειτουργικά δείκτης για ωοθηκών ΚΕΠ /CICs και SP /ALDH

Br πληθυσμού είναι πιο κατάλληλος πληθυσμός για την ανάλυση των ωοθηκών ΚΕΠ /CICs από κύτταρα SP ή κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

τα ποντίκια διατηρήθηκαν και πειραματίστηκε σε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της και μετά από έγκριση από την Επιτροπή των Sapporo Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Ιατρικής, πειραματισμός Κέντρο ζώων υπό τον αριθμό αδείας 08-006. Κάθε ζώο που βρέθηκε ανθυγιεινό ή άρρωστα έγιναν αμέσως ευθανασία. Ανοσοϊστοχημική μελέτη χρώση εγκρίθηκε από Institutional Review Boards (IRB) του Sapporo Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Έχουμε λάβει γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς σύμφωνα με τις οδηγίες της Διακήρυξης του Ελσίνκι.

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (ΝΕΠ, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) και την ανθρώπινη ενδομητρίου κύτταρα καρκινώματος (HEC-1) ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA, USA). ΝΕΠ και τα κύτταρα HEC-1 διατηρήθηκαν σε Μίνιμουμ βασικό μέσο (ΜΕΜ) (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA). HTBoA και OVCAR3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). κύτταρα OVSAHO διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 (Sigma-Aldrich). Κάθε κυτταρική γραμμή συμπληρώθηκε με 10% FBS και καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

Side πληθυσμού (SP) δοκιμασία

Side πληθυσμού (SP) ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις [15], [16]. Hoechst 33342 (Lonza, Walkersville, MD, USA) χρωστική χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 2,5 ή 5,0 μg /ml παρουσία ή απουσία verapamil (50 mM? Sigma-Aldrich) ως ένας αναστολέας του μεταφορέα ABC. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά ή 90 λεπτά με συνεχή ανάδευση. Ένα εκατομμύριο από βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Το 33342 χρωστική Hoechst ήταν ενθουσιασμένος στα 357 nm και φθορισμού του αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη διπλή μήκη κύματος (μπλε, 402-446 nm? Κόκκινο, 650-670 nm).

δοκιμασία ALDEFLUOR

Αλδεΰδη αφυδρογονάση (ALDH) δραστηριότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας ALDEFLUOR (StemCell Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή [17]. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ) σε 1,5 mM και επωάζονται για 30 λεπτά στους 37 ° C. Ένας αναστολέας του ΑΙ_ϋΗ1, διαιθυλαμινο- βενζαλδεΰδη (ϋΕΑΒ), σε Α10-πλάσια μοριακή περίσσεια χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ένα εκατομμύριο από βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS Aria II. Τα φωτεινά φθορισμού ΑΙ_ϋΗ1-κύτταρα που εκφράζουν (ΑΙ_ϋΗ1

Br) ανιχνεύθηκαν στο πράσινο κανάλι φθορισμού (520-540 nm).

SP και ALDEFLUOR διπλή χρώση

Τα κύτταρα βάφονται με χρωστική Hoechst 33342 και στη συνέχεια χρωματίζονται με ΒΑΑΑ. Ένα εκατομμύριο από SP και ALDEFLUOR-dual-βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS Aria II. Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες ανάλογα με την ένταση ALDH (ALDH

Br (ΑΙ_ϋΗ φωτεινό), ΑΙ_ϋΗ

Mid (ΑΙ_ϋΗ μέση), ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή (ALDH χαμηλό)), στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη δοκιμασία SP.

Ανοσοϊστοχημική χρώση

Ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές σταθεροποιημένο με φορμαλίνη του χειρουργικά ιστού καρκινώματος των ωοθηκών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. αντίσωμα ποντικού αντι-ΑΙ_ϋΗ1 χρησιμοποιήθηκε σε 250-φορές αραίωση. Αντι-ABCG2 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε σε 5 μg /ml. Σημασμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα (Nichirei, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε ως το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και οπτικοποιήθηκαν με DAB. Αλκαλική φωσφατάση γίδινη πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού (Nichirei) χρησιμοποιήθηκε ως το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και οπτικοποιήθηκαν με τη Νέα φουξίνη (Nichirei). Μεμβράνη καφέ χρώση κρίθηκε ως θετική χρώση για ABCG2, και κυτόπλασμα ερυθρά χρώση κρίθηκε ως θετική χρώση για ΑΙ_ϋΗ1.

μεταμόσχευση ξενομοσχεύματος

ταξινόμηση κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-εναιωρήθηκαν σε συγκεντρώσεις 10

2-10

4 κύτταρα ανά 50 μΙ PBS και στη συνέχεια αναμιγνύεται με 50 μΙ Matrigel (BD Biosciences). Το κύτταρο-matrigel μίγμα εγχύθηκε στον υποδόριο χώρο του 6-εβδομάδων μη παχύσαρκα διαβητικά /σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια (/SCID ΝΟϋ) ποντικοί (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Ιαπωνία) υπό αναισθησία. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με XY

2/2 (Χ = μακρύ άξονα, Υ = μικρός άξονας).

Σφαίρα σχηματισμός δοκιμασία

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας Σφαιρικό διεξήχθη χρησιμοποιώντας CSC Complete Recombinan Medium (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, USA). SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 6-καλά εξαιρετικά χαμηλή πλάκες στερεώσεως (Corning Inc., Corning, ΝΥ, 14831) και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες. Η μορφολογία των κυττάρων εκτιμήθηκε και φωτογραφίες τραβήχτηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός κάθε ημέρα. συστάδες γύρο κυττάρων μεγαλύτερο από 100 μm κρίθηκαν ως σφαίρες.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Για την δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Low, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα απομονώθηκαν. Στη συνέχεια, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 1000 κύτταρα ανά τρυβλίο 96 φρεατίων για 1 ημέρα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη για 3 ημέρες υπό διάφορες συγκεντρώσεις. Στη συνέχεια, η κυτταρική βιωσιμότητα διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την Premix WST-1 Κυττάρου System Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

λιποκυττάρων διαφοροποίηση δοκιμασία

Για λιποκυττάρων δοκιμασία διαφοροποίηση, SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα απομονώθηκαν. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε 10000 κύτταρα ανά πλάκα 24 φρεατίων, και αναπτύχθηκαν σε ορό μειώνεται RPMI:DMEM (1:01) μέσο που περιέχει 0,5 mM trans-ρετινοϊκό οξύ (Sigma-Aldrich) και 50 ηΜ ινσουλίνης (Sigma-Aldrich) για 2 ημέρες που ακολουθείται από την προσθήκη του μέσου διαφοροποίησης λιπώδους που περιέχει 170 ηΜ ινσουλίνης, 2 ηΜ τριιωδοθυρονίνη και 0.5 mM ροσιγλιταζόνη [19]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν εντός του μέσου για 5 ημέρες και συσσώρευση ουδέτερο λιπίδιο ανιχνεύθηκε σε 4% φορμαλδεΰδης σταθεροποιημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας κόκκινο έλαιο Ο (Sigma-Aldrich) χρώση. χρώση των λιπιδίων παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο, και τα λιπίδια χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν.

SOX2

mRNA νοκ ντάουν από siRNA

Ένα

SOX2

γονιδίου νοκ ντάουν πείραμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNA). SOX2 siRNA (NM003106) και αρνητικό siRNA ελέγχου αγοράστηκαν από την Life Technologies. κύτταρα ΝΕΠ σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων, και επιμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAi max (Life Technologies) σε Opti-ΜΕΜ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναλύθηκαν για την έκφραση του

SOX2

,

ALDH1A1

και

ABCG2

με RT-PCR.

Αντίστροφη πολυμεράσης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση (RT-PCR) ανάλυση

Gene knockdown του SOX2 επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Απομόνωση RNA και ανάλυση RT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. Οι συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης ήταν 94 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 15 sec στους 94 ° C, 30 sec στους 60 ° C, και 30 sec στους 72 ° C. Ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση RT-PCR ήταν 5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3 ‘και 5′-TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3’ για το

ALDH1A1

με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR 154 ζεύγη βάσεων (bps), 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA -3 ‘και 5′-CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3’ για το

ABCG2

με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR 206 bps, 5′-CATGATGGAGACGGAGCTGA-3 ‘και 5′-ACCCCGCTCGCCATGCTATT-3’ για το

SOX2

με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR 410 bps, 5′-GCAGTCAACAGTCGAAGAAGG-3 ‘, και 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ και 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘για το

αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH)

με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος των 452 bps.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR (qPCR)

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

SOX2

(Hs01053049_s1),

ABCG2

(Hs00184979_m1),

CD44

(Hs01075861_m1),

PROM1

(Hs01009250_m1) και

ABCB1

(Hs00184500_m1) εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν από τον κατασκευαστή (δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene? Applied Biosystems). Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 60 ° C για 1 λεπτό. Κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν, και ομαλοποιήθηκε ως προς το

GAPDH

γονίδιο ως εσωτερικός έλεγχος.

Αποτελέσματα

ΚΕΠ /CICs εμπλουτίστηκαν στα κύτταρα SP

ωοθηκών ΚΕΠ /CICs έχουν απομονωθεί ως SP κύτταρα από ανθρώπινα κύτταρα και τα ποντίκια των ωοθηκών γραμμή του καρκίνου [11], [21]. Αναλύσαμε διάφορα γυναικολογικά Caner κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών ωοθήκης (ΝΕΠ, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) και το ανθρώπινο καρκίνο του ενδομητρίου (HEC-1) κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Α και Εικόνα S1). κύτταρα SP θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλα τα κύτταρα γραμμής και η αναλογία SP κυττάρων κυμαινόταν από 1,2% έως 2,6%. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει έκθεση στην οποία περιγράφεται ανθρώπινο βλεννώδες γραμμή αδενοκαρκινώματος κύτταρο ΝΕΠ, εμείς έτσι αναλυθούν περαιτέρω τα κύτταρα SP προέρχονται από ΝΕΠ. ΚΕΠ /CICs έχουν υψηλή ικανότητα ογκογενή [22], μπορούμε έτσι εγχέεται αραιώνονται σειριακά αριθμούς κυττάρων SP και κυττάρων MP στις πλάτες των τριών NOD /SCID ποντίκια υποδορίως για να εξετάσει την ικανότητα ογκογενή. Σε όλες τις τρεις ποντικούς, οι όγκοι άρχισαν με 10

4 SP κύτταρα, και οι όγκοι άρχισαν με 10

4 κύτταρα MP σε 2 από τα 3 ποντίκια. Σε ένα ποντίκι, ένας όγκος ξεκίνησε με 10

3 SP κύτταρα, ενώ το 10

3 MP κύτταρα δεν κίνησε καμία όγκου (Πίνακας 1). Το μέγεθος των όγκων που προέρχονται από κύτταρα SP ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων που προέρχονται από κύτταρα MP (Σχήμα 1Β). Τα επίπεδα έκφρασης δεικτών βλαστοκυττάρων διερευνήθηκαν με qPCR, και τα κύτταρα SP προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα του στελέχους δεικτών κυττάρου

SOX2

,

CD44

και

PROM1

και το γονίδιο μεταφορέα ABC

ABCG2

, ενώ

ABCB1

δεν ήταν (Σχήμα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΚΕΠ /CICs εμπλουτίστηκαν στα κύτταρα SP που προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ. Τα αποτελέσματα αναπαράγονται σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Α. Ανίχνευση SP κυττάρων από κύτταρα ΝΕΠ. ΝΕΠ βλεννώδες κύτταρα αδενοκαρκινώματος ωοθηκών βάφτηκαν με χρωστική Hoechst 33342 και αναλύονται. Το ποσοστό αντιπροσωπεύει την αναλογία των κυττάρων SP. B. έναρξη του όγκου των κυττάρων SP που προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ. 10

3 και 10

4 SP και κυττάρων ΜΡ προερχόμενο από κύτταρα ΝΕΠ εμβολιάσθηκαν υποδορίως στη ράχη του NOD /SCID ποντίκια, και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Διαφορές μεταξύ SP και κυττάρων ΜΡ εξετάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. * Οι τιμές Ρ. Γ qPCR των δεικτών CSC /CIC στα κύτταρα ΝΕΠ SP και βουλευτής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά. * P & lt? 0,05. t-test.

Η

ΚΕΠ /CICs εμπλουτίστηκαν με ALDH

κύτταρα Br

ΚΕΠ /CICs θα μπορούσε να απομονωθεί ως ΑΙ_ϋΗ

Br κύτταρα από το ALDEFLUOR δοκιμασία [23]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν ΚΕΠ /CICs μπορεί να απομονωθεί επιτυχώς από τη δοκιμασία ALDEFLUOR. ΝΕΠ, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO και τα κύτταρα HEC-1 αναλύθηκαν με την δοκιμασία ALDEFLUOR και βρήκαμε ότι η αναλογία των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br ήταν 8,1% σε 11,3% (Σχήμα 2Α και Σχήμα S1). ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Βγ και ALDH

χαμηλής κύτταρα που προέρχονται από ΝΕΠ ταξινομήθηκαν και εγχύθηκαν μέσα στις πλάτες των πέντε NOD /SCID ποντίκια για να εξεταστεί η ικανότητα ογκογενή. Σε πέντε ποντίκια, οι όγκοι άρχισαν με 10

4 ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br, ενώ οι όγκοι άρχισαν με 10

4 ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα μόνο σε 2 από τα 5 ποντίκια (Πίνακας 1). Το μέγεθος των όγκων που προέρχονται από ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων που προέρχονται από ΑΙ_ϋΗ

χαμηλής κύτταρα (Σχήμα 2Β). Τα επίπεδα έκφρασης δεικτών βλαστοκυττάρων ερευνήθηκαν με qPCR. κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα των βλαστικών κυττάρων δεικτών

SOX2

,

CD44

και

PROM1

, ALDH1A1, και ο μεταφορέας ABC γονίδιο

ABCG2

και

ABCB1

(Σχήμα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΚΕΠ /CICs επίσης εμπλουτισμένη με ALDH

br κυττάρων που προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ. Τα αποτελέσματα αναπαράγονται σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Α. Ανίχνευση των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ

Br από τα κύτταρα ΝΕΠ. ΝΕΠ βλεννώδες κύτταρα αδενοκαρκινώματος ωοθηκών βάφτηκαν με ΒΑΑΑ και αναλύθηκαν. Το ποσοστό αντιπροσωπεύει την αναλογία της ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br. Αναστολέα δείχνουν αναστολέας ΑΙ_ϋΗ1 (διαιθυλαμινο- βενζαλδεϋδη (ϋΕΑΒ)). B. έναρξη του όγκου των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ. 10

4 ALDH

Br και ALDH

χαμηλής κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ εμβολιάσθηκαν υποδορίως στη ράχη του NOD /SCID ποντίκια, και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι διαφορές μεταξύ των ΑΙ_ϋΗ

Br και ALDH

χαμηλής κύτταρα εξετάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας t-test του Student. * Οι τιμές Ρ. Γ qPCR των δεικτών CSC /CIC στα κύτταρα ΝΕΠ SP και βουλευτής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά. * P & lt? 0,05. t-test.

Η

SP και ALDEFLUOR διπλή ανάλυση

κύτταρα SP και ALDH

κύτταρα Br δείχνουν μεγαλύτερη εκροή της Hoechst 33342 βαφής και υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της dehydrogenese αλδεΰδη, η οποία είναι διαφορετικούς φαινοτύπους, και αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα απομονώθηκαν ως SP και του πληθυσμού ALDH

Br σε μια προηγούμενη μελέτη [24]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επικάλυψη του πληθυσμού των κυττάρων SP και κύτταρα ALDH

Br. Μετά από χρώση των κυττάρων ΝΕΠ με χρωστική Hoechst 33342, τα κύτταρα πλύθηκαν και στη συνέχεια χρωματίζονται με το αντιδραστήριο ALDEFLUOR και αναλύθηκαν. Σε αυτό το πείραμα, ο λόγος των κυττάρων SP ήταν 5,3% και ο λόγος του ALDH

κύτταρα Br ήταν 14,4%. 7,1% των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br έδειξε πληθυσμού SP, και το 6,9% των ΑΙ_ϋΗ

Mid κύτταρα έδειξαν πληθυσμού SP, και μόνο το 3,7% των ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα έδειξαν πληθυσμού SP (Εικόνα 3Α). κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br παρουσίασαν μερική αλληλοεπικάλυψη, και μόνο το 1,0% των συνολικών κυττάρων (7,1% του 14,4% του πληθυσμού) εκφράζεται τόσο SP φαινοτύπου των κυττάρων και ALDH

Br φαινότυπο (Σχήμα 3Α).

Α. Περίληψη της SP και ALDEFLUOR διπλή δοκιμασία. κύτταρα ΝΕΠ βάφτηκαν με βαφή Hoechst 33342 και στη συνέχεια χρωματίζονται με ΒΑΑΑ και αναλύθηκαν. Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες ανάλογα με την ένταση ALDH (ALDH

Br (ΑΙ_ϋΗ φωτεινό), ΑΙ_ϋΗ

Mid (ΑΙ_ϋΗ μέση), ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή (ALDH χαμηλό)), στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη δοκιμασία SP. Η αναλογία των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br ήταν 14,4%, και η αναλογία των κυττάρων SP ήταν 5,3%. Οι αναλογίες των κυττάρων SP στον ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br, ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Μεσαίας και ALDH

Χαμηλή κύτταρα ήταν 7,1%, 6,9% και 3,7%, αντίστοιχα. Η αναλογία του SP /κυττάρων ΑΙ_ϋΗ

Br συνολικά κύτταρα ήταν 1,0%. B. έναρξη των όγκων του SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP και ΑίϋΗ κυττάρων

Br. 10

2 και 10

3 SP /ALDH

Br, SP και ALDH

κύτταρα Br προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ εμβολιάσθηκαν υποδορίως στη ράχη του NOD /ποντίκια SCID, και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Διαφορές μεταξύ SP /ALDH

Br και τα κύτταρα SP ή κύτταρα ALDH

Br εξετάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας t-test του Student. * Οι τιμές Ρ. Στιλέτα δείχνουν ποντίκια θάνατο λόγω όγκου. C. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ABCG2 και ΑΙ_ϋΗ1. ιστός ωοθηκών καρκίνωμα χρωματίστηκε με αντι-ABCG2 αντίσωμα και αντι-ΑΙ_ϋΗ1 αντίσωμα. χρώση καφέ μεμβράνης υποδεικνύει ABCG2 και κυτταρόπλασμα ροζ χρώση δείχνει ΑΙ_ϋΗ1. Αστερίσκος υποδεικνύει σκάφος, και βέλη δείχνουν ABCG2 και διπλά-θετικά κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών ΑΙ_ϋΗ1. Μεγέθυνσης, × 400.

Η

SP και ALDH

br κύτταρα έχουν υψηλή ικανότητα όγκου έναρξη

Η ογκογενή ικανότητα του SP και ALDH

Br (SP /κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br) εξετάστηκε με ένεση 10

3 και 10

2 κύτταρα, αντίστοιχα, σε NOD /SCID ποντίκια. Παραδόξως, οι όγκοι άρχισαν με 10

3 SP ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα /Br και με τόσο λίγα όπως 10

2 SP /κυττάρων ΑΙ_ϋΗ

Br σε όλα τα ποντίκια (Πίνακας 1). Επιπλέον, οι όγκοι που προέρχονται από SP /ALDH

κύτταρα Br παρουσίασαν σημαντικά ταχύτερη ανάπτυξη από εκείνη των όγκων που προέρχονται από κύτταρα SP και τα κύτταρα ALDH

Br (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το SP ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα /Br είναι εξαιρετικά εμπλουτισμένο με CICs /ΚΕΠ.

Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση για την ανίχνευση SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού στην πρωτοβάθμια ιστό ανθρώπινου ωοθηκικού καρκινώματος. Χρησιμοποιήσαμε αντι-ABCG2 αντίσωμα για την ανίχνευση κυττάρων SP, αφού τα κύτταρα SP γνωστό ότι εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα ABCG2. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3C, διπλή θετική (ABCG2-θετικά και ΑΙ_ϋΗ1-θετικά) τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ήταν ανιχνεύσιμα σε ιστό καρκινώματος των ωοθηκών. Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες dual-θετικά κύτταρα υπάρχουν δίπλα στα σκάφη, θα μπορούσε να αναφέρει ωοθηκών ΚΕΠ /υπάρχουν CICs στην αγγειακή θέση. SP /κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br ανιχνεύθηκαν επίσης και από άλλες ωοθηκών ορώδες κύτταρα γραμμή αδενοκαρκινώματος (OVSAHO, OVCAR3 και HTBoA) και ενδομητρίου κυτταρική σειρά (HEC-1), και οι αναλογίες του SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br ήταν 0,1 % έως 0,8% (Σχήμα S1).

SP /ΑΙ_ϋΗ

Br κύτταρα έχουν βλαστικών κυττάρων φαινοτύπων

το SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού σε σύγκριση με άλλους πληθυσμούς από τη σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού. SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα απομονώθηκαν από κύτταρα ΝΕΠ και καλλιεργούνται σε μια εξαιρετικά χαμηλή κατάσταση προσάρτησης για τον τομέα διαμόρφωσης χημική δοκιμή. SP /κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br παρουσίασαν υψηλότερη απόδοση σχηματισμού σφαίρας από εκείνο του βουλευτή /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα (Εικόνα 4Α). Η διαφορά μεταξύ SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br και /ALDH

Χαμηλή κύτταρα SP δεν ήταν σημαντική? Ωστόσο, τα κύτταρα SP /ΑΙ_ϋΗ

Br τείνουν να έχουν υψηλότερη απόδοση σχηματισμού σφαίρας από εκείνο του SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα.

Α. δοκιμασία Σφαίρα σχηματισμό. Οι αριθμοί των αποικιών από τέσσερα κλάσματα (SP /ALDH

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή) αξιολογήθηκαν κατά την ημέρα 7. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι διαφορές εξετάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. * Οι τιμές Ρ. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από σφαίρες εμφανίζονται (× 100). Β λιποκυττάρων δοκιμασία διαφοροποίησης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ύπαρξη trans-ρετινοϊκού οξέος που ακολουθείται από μέσο διαφοροποίησης των λιποκυττάρων. Oli Red O-θετικά λιποκύτταρα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι διαφορές εξετάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. * Οι τιμές Ρ. Αντιπροσωπευτικά εικόνες Oil Red Ο χρώση εμφανίζονται (× 200). Red-χρώση δείχνουν τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων.

Η

ΚΕΠ /έχουν CICs περιγραφεί να έχουν πλειοδυναμία [25], μπορούμε έτσι ανέλυσε τη δυνατότητα διαφοροποίησης των λιποκυττάρων του SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br (Εικόνα 4Β). Απομονωμένες SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MPALDH

Br και MP /ALDH

Χαμηλή πληθυσμού καλλιεργήθηκαν σε κατάσταση διαφοροποίησης adypocyte. SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ αποκάλυψε υψηλότερη ικανότητα διαφοροποίησης των λιποκυττάρων σε σύγκριση με το SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα ΝΕΠ.

ΚΕΠ /CICs είναι ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία [4], που έτσι αναλύθηκαν ανθεκτικότητας στα φάρμακα της SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br. Δεδομένου ότι η σισπλατίνη είναι ένα βασικό φάρμακο για χημειοθεραπεία καρκίνωμα των ωοθηκών, χρησιμοποιήσαμε σισπλατίνη. Απομονωμένες SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MPALDH

Br και MP /ALDH

Χαμηλή πληθυσμού καλλιεργήθηκαν σε μια ύπαρξη της σισπλατίνης. SP /κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br σημαντικά υψηλότερη αντίσταση σισπλατίνη σε σύγκριση με το SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα, MP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα. Χαμηλή κύτταρα και, MP /ΑΙ_ϋΗ

παρουσίασαν υψηλότερη ευαισθησία στην cisplatin (Σχήμα 5Α).

Α. δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ύπαρξη σειριακά αραιωμένου σισπλατίνη. Τα βιώσιμα κύτταρα αναλύθηκαν με WST-1 κιτ. Υ-άξονας δείχνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι διαφορές εξετάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. * Οι τιμές Ρ. Ανάλυση Β qPCR. Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή, MP /ΑΙ_ϋΗ

Br και MP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά. * P & lt? 0,05. t-test. Γ

SOX2

νοκ ντάουν καταστείλει τις εκφράσεις του

ALDH1A1

και

ABCG2

.

SOX2

mRNA χτυπήθηκε κάτω από siRNA. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση του SOX2 siRNA, οι εκφράσεις του

ALDH1A1

και

ABCG2

ερευνήθηκαν με RT-PCR.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Έλεγχος siRNA (si-Cont) επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Δ SOX2 γκρεμίσουμε καταστέλλουν τον όγκο την έναρξη της διαδικασίας.

SOX2

mRNA χτυπήθηκε κάτω από siRNA. Δέκα χιλιάδες si-SOX2 και τον έλεγχο siRNA (si-Cont) επιμολυσμένα κύτταρα εμβολιάσθηκαν υποδορίως στη ράχη του NOD /SCID ποντίκια, και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. Διαφορές εξετάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας t-test του Student. * P τιμές.

Η

Για να αναλύσει τα μοριακά χαρακτηριστικά του SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού, πραγματοποιήσαμε qPCR (Εικόνα 5Β).

ABCG2

το mRNA εκφράζεται κατά προτίμηση σε SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br και SP /ALDH

Χαμηλή κύτταρα.

ALDH1A1

εκφράστηκε σε SP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Βγ και κύτταρα MP /ΑΙ_ϋΗ

Br. Αυτά τα προφίλ έκφρασης είναι συνεπείς με το γεγονός ότι ο φαινότυπος SP κύτταρο εξαρτάται από την έκφραση του

ABCG2

και ο ALDH κυτταρικό φαινότυπο

Br εξαρτάται από την έκφραση του

ALDH1A1

.

SOX2

mRNA εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο /κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br SP αλλά όχι σε SP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα, MP /ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br ή MP /ΑΙ_ϋΗ

Χαμηλή κύτταρα (Σχήμα 5Β), υποδεικνύοντας ότι το SP /ALDH

Br πληθυσμός περιλαμβάνει κατά προτίμηση έναν πληθυσμό βλαστικών κυττάρων. Από SOX2 έχει ένα ρόλο στη διατήρηση του πνεύμονα ΚΕΠ /CICs [26], ερευνήσαμε τη σχέση του

SOX2

και τις εκφράσεις του

ABCG2

και

ALDH1A1

. Οι εκφράσεις του

ABCG2

και

ALDH1A1

μειώθηκαν σε

SOX2

mRNA γκρέμισε κύτταρα (Σχήμα 5C). Επιπλέον, SOX2 γκρέμισε κύτταρα παρουσίασαν χαμηλότερο όγκο έναρξη από εκείνη του ελέγχου siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΕΠ (Σχήμα 5D). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι SP /ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού εκφράζουν υψηλό επίπεδο γονιδιακής βλαστικών κυττάρων

SOX2

, η οποία μπορεί να έχει ρόλο στη διατήρηση του ΚΕΠ /CICs και εκφράσεις του

ABCG2

και

ALDH1A1

.

Τα επίπεδα έκφρασης του CD44, ένα αντιπροσωπευτικό δείκτη για ΚΕΠ ωοθηκών /CICs [27], [28], ήταν παρόμοια σε όλους τους πληθυσμούς (Εικόνα 5Β). Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η σχέση του SP κυττάρων, ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Br και CD44-θετικό (CD44

+) κυττάρων. Η αναλογία των CD44

+ κυττάρων ήταν 8,0%. Η αναλογία του SP /CD44

+ επικάλυψη του πληθυσμού ήταν 0,9%, και η αναλογία των ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ επικάλυψη του πληθυσμού ήταν 3,3%. Επιπλέον, η αναλογία του SP /ALDH

Br /CD44

+ επικαλυπτόμενες πληθυσμός ήταν 0,4% (Σχήμα 6).

κύτταρα ΝΕΠ βάφτηκαν με χρωστική Hoechst 33342, ΒΑΑΑ και αντι-CD44 αντίσωμα, και αναλύθηκαν. Οι αναλογίες του SP, ΑΙ_ϋΗ

Br, CD44

+, SP /ΑΙ_ϋΗ

Br, SP /CD44

+, ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ και SP /ΑίϋΗ

Br /CD44

+ κυττάρων ήταν 5,3%, 14,4%, 8,0%, 1,0%, 0,9%, 3,3% και 0,4%, αντίστοιχα.

Η

Συζήτηση

Η έννοια της ΚΕΠ /CICs προτάθηκε πριν από πολύ καιρό [29]. έχουν λευχαιμία βλαστικά κύτταρα έχουν απομονωθεί από οξεία λευχαιμικά κύτταρα [30], [31], και η πρώτη πληθυσμός CSC /CIC απομονώθηκε από καρκίνωμα του μαστού με τον συνδυασμό CD44 και CD24 έκφραση [32]. Στις παρακάτω έργα, ΚΕΠ /CICs επιτυχία απομονωθεί σε διάφορες κακοήθειες. Ωστόσο, δεδομένου ότι οι μοριακοί μηχανισμοί της ΚΕΠ /CICs είναι ακόμα ασαφείς, ακριβείς δείκτες για την ΚΕΠ /CICs είναι ακόμη άγνωστες. Ως εκ τούτου, οι βελτιώσεις στις μεθόδους για την απομόνωση των ΚΕΠ /CICs εξακολουθούν να χρειάζονται.

μεθόδους Συνδυασμός με διπλό ή τριπλό δείκτες και δείκτες και δοκιμασία ALDEFLUOR έχουν αναφερθεί. Οι πληθυσμοί των ΑΙ_ϋΗ

Br και CD44

+ /CD24

– κύτταρα παρουσίασαν μερική αλληλοεπικάλυψη, και η ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ /CD24

– πληθυσμού έδειξε υψηλότερη ογκογενή ικανότητα από εκείνη της ΑΙ_ϋΗ

Br πληθυσμού ή CD44

+ /CD24

– πληθυσμού [17]. Η ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ πληθυσμού και ALDH

Br /CD133

+ πληθυσμού που προέρχονται από ανθρώπινο καρκίνωμα πρωτογενή παχέος εντέρου παρουσίασαν μεγαλύτερη ικανότητα όγκου κίνηση από εκείνη της ΑΙ_ϋΗ

Br, CD44

+ και CD133

+ πληθυσμούς [33]. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι οι εκφράσεις των δεικτών CSC /CIC είναι εν μέρει επικαλύπτονται και ότι η επικαλυπτόμενη πληθυσμού είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο με ΚΕΠ /CICs. Πράγματι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης παρόμοια επικάλυψη των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα Βγ και κύτταρα SP, και η επικάλυψη του πληθυσμού εμφάνισαν υψηλότερη ικανότητα όγκου-κίνηση. Σε μια μελέτη για τον καρκίνο των ωοθηκών, κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

Br ήταν πιο εμπλουτισμένη σε CD44

+ κυττάρων σε σχέση με τη χρήση των

+ κύτταρα CD133 [23], αλλά η ΑΙ_ϋΗ

Br και CD44

+ επικαλυπτόμενες ήταν μερική. Εντοπίσαμε SP /ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ επικαλυπτόμενα πληθυσμό από κύτταρα ΝΕΠ (Σχήμα 6). Ως εκ τούτου, η χρήση της αλληλεπικάλυψης πληθυσμού της SP /ΑΙ_ϋΗ

Br /CD44

+ κύτταρα μπορεί να είναι μια καλύτερη προσέγγιση για τον εντοπισμό των πληθυσμών CSC /CIC.

Γλοίωμα βλαστικά κύτταρα έχουν περιγραφεί να διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα [34]. Τα βλαστοκύτταρα Κακοήθη methotelioma έχουν περιγραφεί να διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα, νευρικά κύτταρα και τα λιποκύτταρα [25]. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα SP /ΑΙ_ϋΗ

Br έχουν μεγαλύτερη δυνατότητα διαφοροποίησης των λιποκυττάρων.