Αφηρημένο

Η συνοδός nucleophosmin (NPM1) υπερεκφράζεται στον επιθηλιακό διαμέρισμα των όγκων του προστάτη σε σύγκριση με το παρακείμενο υγιές επιθήλιο και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένας από τους βασικούς παράγοντες που υποστηρίζουν την νεοπλασματικών φαινότυπο των κυττάρων αδενοκαρκινώματος του προστάτη. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω από NPM1 μεσολάβηση φαινότυπο παραμένουν άπιαστο στον προστάτη. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις λειτουργίες NPM1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, επιδιώξαμε να χαρακτηρίζουν τις επιπτώσεις της στην καρκινικών κυττάρων του προστάτη συμπεριφορά και να αποκρυπτογραφήσει τους μηχανισμούς με τους οποίους μπορεί να δράσει. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι NPM1 ευνοεί τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, εισβολή και σχηματισμού αποικιών. Επιπλέον, knockdown του NPM1 οδηγεί σε μείωση της ανάπτυξης των όγκων LNCaP προερχόμενων μεταμοσχευμένων σε γυμνά ποντίκια

in vivo

. Τέτοιες ογκογόνες ιδιότητες παρόμοιες βρίσκονται σε συνδυασμό με ένα θετικό ρύθμιση του NPM1 για την ERK1 /2 (εξωκυτταρικό σήμα-ρυθμιζόμενες κινάσες 1/2) φωσφορυλίωση κινάσης σε απόκριση σε EGF (επιδερμικό αυξητικό παράγοντα) ερέθισμα, το οποίο είναι κρίσιμο για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη μετά τη συγκρότηση ενός αυτόνομου παραγωγή του αυξητικού παράγοντα. NPM1 θα μπορούσε τότε να είναι ένας στόχος για να απενεργοποιήσετε συγκεκριμένα ERK1 /2 ενεργοποίηση του μονοπατιού για να μειώσετε ή να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση

Παράθεση:. Loubeau G, Boudra R, Maquaire S, LOurs-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et al. (2014) NPM1 κατασιγάσει Μειώνει όγκου ανάπτυξη και την ΜΑΡΚ σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10.1371 /journal.pone.0096293

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9η Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 6 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου του 2014

Copyright: © 2014 Loubeau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας της Γαλλίας (CNRS) και από την Περιφέρεια Auvergne. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη συνδέεται με μεταβολές των βασικών γονιδίων που ελέγχουν την ομοιόσταση των κυττάρων, η απορρύθμιση ή /και ενίσχυση τους με αποτέλεσμα την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής ικανότητες. Έχουμε προηγουμένως εντοπιστεί

NPM1

(nucleophosmin 1) ως ένα από τα γονίδια των οποίων η έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα όγκου του προστάτη σε σύγκριση με μη-όγκου γειτονικό ιστό [1], υποδεικνύοντας ότι NPM1 θα μπορούσε να δράσει ως ενισχυτής του προστάτη εξέλιξης του καρκίνου. NPM1 είναι μια μεγάλη πολυλειτουργική φωσφοπρωτεΐνη συσσωρευτεί σε υψηλό επίπεδο στην κοκκώδη περιοχή του πυρηνίσκου και είναι σε θέση να λεωφορείο μεταξύ του πυρηνίσκο, πυρηνόπλασμα και στο κυτταρόπλασμα [2]. Λόγω της πυρηνισκικό εντοπισμό της, εγγενή δραστικότητα RNase του και τη σύνδεσή του με την ωρίμανση προ-ριβοσωμική ριβονουκλεοπρωτείνες, NPM1 ήταν η πρώτη που προτείνει να ρυθμίζει ριβοσωμικού μεταγραφή και επεξεργασία του RNA. Ωστόσο, NPM1 έχει καταδειχθεί πιο πρόσφατα για να εμφανιστεί δραστηριότητες συνοδού. Θα συνδέεται με ιστόνες, ευνοεί τη συναρμολόγηση DNA-ιστόνης, μεσολαβεί ο σχηματισμός νουκλεοσώματος και χαλαρώνει χρωματίνης [3] ελέγχοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου. NPM1 αλληλεπιδρά επίσης με ένα ευρύ φάσμα ωρίμασης πρωτεΐνες για να προκληθεί κατάλληλη αναδίπλωση τους στην ενεργό κατάσταση. Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, υπάρχουν ρυθμιστές της ανάπτυξης των κυττάρων, όπως η ογκοπρωτεϊνης MDM2 (Mouse Double Minute 2 ομόλογο). Επιπλέον, NPM1 συνδέεται με και αναστέλλει τη ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνες Ρ53 και Rb (ρετινοβλάστωμα) [4] τονίζοντας ότι NPM1 θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην ογκογόνες διαδικασίες. Μερικές από τις συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις NPM1 με ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχουν ήδη διευκρινιστεί, αλλά ο ρόλος του στη συμπεριφορά των στερεών καρκινικών κυττάρων, καθώς και την ένταξή του στο κύτταρο σηματοσώματος έχει ακόμη προσδιοριστεί. Εδώ έχουμε αντιμετωπίσει το ζήτημα αν NPM1 θα μπορούσε να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι το επίπεδο της NPM1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ρυθμίζει ειδικά την έκφραση EGF και το ΜΑΡΚ (μιτογόνα ενεργοποιημένες πρωτεϊνοκινάσες) οδού σηματοδότησης. Δείχνουμε επίσης ότι τα υψηλά επίπεδα της NPM1 επηρεάσει θετικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων, συμμετέχοντας έτσι στον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα ελεγχόμενο περιβάλλον και τα ζώα φροντίδα διεξήχθη σύμφωνα με το εθνικό πρότυπο πολιτικές (C 63 014,19). Όλα τα πειράματα ενέκρινε την Auvergne Περιφερειακή Επιτροπή Δεοντολογίας, η Γαλλία (CE09-08 πρωτόκολλο).

Κυτταρική καλλιέργεια και σταθερή επιμόλυνση

κύτταρα LNCaP (λεμφαδένων καρκίνου του προστάτη) καλλιεργήθηκαν σε ερυθρό φαινόλης Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, Γαλλία) συμπληρωμένο με 10% από πρότυπες συνθήκες απενεργοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και επωάστηκαν σε (37 ° C, 5% CO

2).

τα κύτταρα μολύνθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν είτε τρία κατασκευάσματα ειδικού στόχου (shNPM1) ή άσχετες ακολουθίες (shScr, Srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Μετά τη μόλυνση, Πουρομυκίνης (1 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας, προκειμένου να επιλέξει σταθερώς μεταδιεγερθέντα κύτταρα και να εκτελέσει μονοκλωνικών επιλογή

τραύματος

επούλωσης δοκιμασία μετανάστευσης

Τα κύτταρα ελέγχου LNCaP. (ShScr ) και νοκ-κάτω LNCaP κύτταρα NPM1 (shNPM1) σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και αναπτύχθηκαν σε συρροή επί 24 ώρες. Η καλλιέργεια μονοστοιβάδας ακολούθως ξύσει τραυματίες με ένα αποστειρωμένο άκρο μικροπιπέτας, προκειμένου να δημιουργηθεί ένα κενό σταθερό πλάτος. Τα κυτταρικά υπολείμματα πλύθηκαν με Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό 1 × (PBS) (Life Technologies). Τα κύτταρα επόμενο αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 10% FBS, που αντικαταστάθηκε 12 ώρες μετά τον τραυματισμό και στη συνέχεια κάθε 24 ώρες. μετανάστευση LNCaP κυττάρων φωτογραφήθηκε στην τραυματίες περιοχή στο 24, 48 και 72 ώρες μετά την απόξεση (100 × μεγέθυνση) και υπόλοιπες περιοχές του τραύματος στη συνέχεια ποσοτικά με ImageJ ελεύθερο λογισμικό.

δοκιμασία εισβολής Boyden Επιμελητήριο

Για την δοκιμασία κυτταρική μετανάστευση, 3 × 10

5 shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 χωρίς ορό σπάρθηκαν στο άνω φρεάτιο ενός συστήματος θαλάμου Transwell. Μέσο που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από επώαση για 24 έως 48 ώρες, τα μη μεταναστεύσαντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με την άνω καλά. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια ένθετο στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με ένα διάλυμα 5% Giemsa. Πέντε τυχαία πεδία φωτογραφήθηκαν (200 × μεγέθυνση) και κύτταρα ποσοτικοποιούνται με ImageJ ελεύθερο λογισμικό ως η μέση τιμή ± SD της αποικίες ανά πεδίο.

Soft δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας agar

Έξι-φρεατίων παρασκευάστηκαν με 2 ml /φρεάτιο ενός θερμού διαλύματος αγαρόζης 0,6% χαμηλού σημείου τήξεως (Sea Plaque Agarose FMS προϊόν χαμηλού σημείου τήξεως, 50101, της Lonza, Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Γαλλία) σε RPMI 1640, 10% FBS. Μετά τη στερεοποίηση, 5 × 10

3 κυττάρων shScr ή shNPM1 LNCaP απλώθηκαν ανά φρεάτιο σε ένα διάλυμα 500 μΐ 0,3% αγαρόζη σε μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν σε RPMI 1640, 10% FBS μέσο που αλλάχθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Μετά από 2 εβδομάδες, ο σχηματισμός αποικίας προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ: αποικίες φωτογραφήθηκαν (100 × μεγέθυνση) επί 5 διαφορετικούς τομείς και ο σχετικός αριθμός αποικιών υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SD από τις αποικίες μετρήθηκαν ανά πεδίο

κλωνογονική δοκιμασία

1 × 10

4 shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πηγαδιών πλάκες σε RMPI 1640, 10% FBS μέσου. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 2 εβδομάδες, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS 1 × έπειτα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με ένα διάλυμα 5% Giemsa. σχηματισμός Εστίες αξιολογήθηκε και σχηματισμός αποικιών προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ: αποικίες φωτογραφήθηκαν (100 × μεγέθυνση) επί 5 διαφορετικούς τομείς και ο σχετικός αριθμός αποικιών υπολογίστηκε ως η μέση τιμή ± SD από τις αποικίες μετρήθηκαν ανά πεδίο

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πολλαπλασιασμός των κυττάρων ELISA BrdU (βρωμοδεοξυουριδίνη) χρωματομετρική κιτ (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία 5 × 10

3 shScr ή shNPM1 LNCaP κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε μια πλάκα 96-φρεατίων. Ήταν καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο RPMI 1640, 10% FBS με την παρουσία ή απουσία EGF (E9644, Sigma). Στη συνέχεια, διάλυμα σήμανσης BrdU προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 10 μΜ για 2,5 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα αντι-BrdU POD για 1 ώρα, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 655 nm.

Western Blotting

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας HEPES 20 mM, NaCl 0,42 Μ , MgCl

2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, και Nonidet Ρ-40 1% συμπληρωμένο με φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) 1 mM (Sigma), αναστολείς πρωτεάσης (Complete 1Χ? Roche), NaF 0,1 mM, και Na

3νο

4 0,1 mM (Sigma). Σαράντα μg ολικών πρωτεϊνών στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μετουσιωτική SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνη Hybond-ECL (GE Healthcare Life Sciences, Velizy-Villacoublay, Γαλλία). Ανιχνεύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναπτύχθηκαν έναντι β-ακτίνης (A2066, Sigma), NPM1 (sc-6013-Κ, Santa Cruz, Heidelberg, Γαλλία), EGFR (υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, NB100596, Novus), φωσφο-EGFR Tyr 1068 ( 2236S, Cell Signaling, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Γαλλία), φωσφο-ERK1 /2 Ρ42 /44 (9101S, Cell Signaling, Ozyme) ΑΚΤ (9272, Cell σηματοδότησης, Ozyme), φωσφο-ΑΚΤ Ser 473 (2118-1 Epitomics) και αποκάλυψε με συζευγμένο με υπεροξειδάση IgG αντι-κουνελιού (ανοσοσφαιρίνη G, ΠΑΡΙΣΙ, Compiègne, Γαλλία) χρησιμοποιώντας ένα κιτ Σύστημα Δυτική Lightning (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, Γαλλία). ποσοτικοποίηση του σήματος έγινε χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό (Bio-Rad).

κατασκεύασμα Διοργανωτή, επιμόλυνση και λουσιφεράσης

Το θραύσμα ανθρώπινου υποκινητή EGF (-392 /+ 123) δημιουργήθηκε με την ακόλουθη εκκινητές: 5′-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3’ (αντίστροφο), τότε κλωνοποιήθηκε στις θέσεις περιορισμού HindIII /XhoI σε pGL3-βασικό φορέα (Promega, Charbonnieres, France). Το πλασμίδιο έκφρασης ουσιαστικά δραστική kinase1 κινάση ΜΑΡ κινάσης (caMEKK1) ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Dirck Bohmann (University of Rochester Medical Center, Rochester, USA). shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά με τον pGL3-hEGF και /ή πλασμίδια caMEKK1 σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ χρησιμοποιώντας Metafectene επιμόλυνσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Biontex, Martinsried-Planegg, Γερμανία). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος Reporter λύσης 1 × (Promega) και η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με τη χρήση του Genofax Ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Yelen, προκύψουν la Redonne, France).

Παρασκευή RNA και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) και cDNA συνετέθη με 200 U Moloney λευχαιμίας ποντικού ιό αντίστροφης μεταγραφάσης (Promega), 5 pmol τυχαίων εναρκτήρων ( C1181, Promega), 40 U RNAsin (Promega), και 2,5 mM τριφωσφορικό δεοξυνουκλεοτίδιο. τα επίπεδα του mRNA ποσοτικοποιούνται σε Mastercycler ep Realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, Γαλλία) με Mesagreen QPCR βασικού μείγματος Plus για SYBR (Promega). Ακολουθίες των εκκινητών είναι τα ακόλουθα: NPM1, 5′-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3′ (Reverse)? PCNA, 5’-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 ‘(Forward) και 5′-ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3′ (Reverse), ακτίνη, 5’-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ‘(Forward) και 5’TCACCGGAGTCCATCACGA-3’ (Reverse) (Eurogentec, Angers , Γαλλία). Για ανθρώπινη EGF, εκκινητές αγοράστηκαν από την Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, France).

In vivo

Γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου ποντικού

ShScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή μετά επαναιωρήθηκαν σε matrigel (BD υπόγειο matrigel φαινόλης μήτρα μεμβράνης ελεύθερο ερυθρού, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Γαλλία) σε συγκέντρωση 9 × 10

6 κύτταρα /ml. Τριακόσια μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (περίπου 3 × 10

6 κύτταρα) ενέθηκαν υποδορίως σε ηλικίας 6 εβδομάδων Γυμνά ποντίκια (Swiss ηυ /ηυ, Charles River, L’Arbresle, France). εξέλιξη της νόσου παρακολουθείται καθημερινά, βασίζεται σε ένα σύνολο γενικών κριτηρίων ευεξίας που καθορίζονται από την επιτροπή φροντίδα των ζώων, και η μάζα του σώματος καταγράφηκε τρεις φορές την εβδομάδα μέχρι να επιτευχθεί ένα προκαθορισμένο τελικό σημείο. Καταληκτικά σημεία περιελάμβαναν: αφυδάτωση ή /και απώλεια βάρους άνω του 10%, οποιαδήποτε ένδειξη αναπνευστικής δυσχέρειας, αύξηση του σωματικού βάρους πάνω από 5 g από το μέσο όρο. Οι όγκοι μετρήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό παχύμετρο αφού ψηλαφητών όγκων ήταν ανιχνεύσιμα. Τα ποντίκια θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση υπό αναισθησία αερίου. Τα ξενομοσχεύματα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν, ζυγίζεται και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο για RNA και πρωτεϊνών αναλύσεις.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι δοκιμασίες έγιναν σε τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα τυπικά σφάλματα υπολογίστηκαν για κάθε μέσο, ​​και στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκαν με του Student

t

δοκιμής ή το μη παραμετρικό Mann & amp? Whitney τεστ U χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism. Για διαμήκη αναλύσεις, ένα μοντέλο τυχαίας επίδρασης (μικτό μοντέλο) θεωρήθηκε για να μελετήσει την ομάδα σταθερές επιδράσεις (έκφραση NPM1), χρονικά σημεία και η ομάδα αλληλεπίδρασης × λαμβάνοντας υπόψη το χρόνο μεταξύ και εντός θέματος μεταβλητότητας (κλίση τυχαία εφέ και σημείο τομής).

Αποτελέσματα

NPM1 ρυθμίζει κλωνογονικού και πολλαπλασιαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

για να αναλύσει τον αντίκτυπο των NPM1 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, επιλέξαμε ένα νοκ ντάουν στρατηγική και δημιουργείται LNCaP κυττάρων sublines που εκφράζει σταθερά τον έλεγχο (shScr) ή NPM1 συγκεκριμένες shRNA (shNPM1). Όπως φαίνεται στο σχήμα 1α, το επίπεδο NPM1 mRNA μειώνεται κατά περισσότερο από 50% και η έκφραση πρωτεΐνης NPM1 κατά περισσότερο από 30% σε κύτταρα shNPM1, αλλά αυτό δεν σχετίζεται με τροποποιήσεις στην κυτταρική μορφολογία. Ωστόσο, NPM1 knockdown μεταβάλλει την ικανότητα των κυττάρων LNCaP να σχηματίσουν αποικίες μετά την σπορά σε χαμηλή συρροή (Σχήμα 1Β). Αυτή η μείωση των κλωνογόνων ικανότητες συμπίπτει με μια μείωση στην κυτταρική πολλαπλασιαστικού δυναμικού (σχήμα 1γ). Πράγματι, ο κάτω ρύθμιση NPM1 οδηγεί σε μείωση κατά 30% σε ενσωμάτωσης BrdU και αυτό συνδέεται με μια μείωση 60% του επιπέδου του mRNA του PCNA (πολλαπλασιαζόμενο κύτταρο Nuclear Antigen), ένα βασικό δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1 D). Είναι ενδιαφέρον, NPM1 knockdown δεν μεταβάλλει την επιβίωση των κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε από PARP (Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης) διάσπαση αναλύσεις με κηλίδωση Western (σχήμα S1), υποδεικνύοντας έτσι ότι αυτή η μείωση του ποσοστού πολλαπλασιασμού δεν σχετίζεται με την αύξηση της απόπτωσης. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι NPM1 εμπλέκεται στην αύξηση του πολλαπλασιασμού και κλωνογόνων ικανότητες των κυττάρων του όγκου του προστάτη.

(α) NPM1 knockdown δεν μεταβάλλει τα κύτταρα LNCaP μορφολογία. LNCaP κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τον έλεγχο shRNA (shScr) ή ειδικές NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με RT-qPCR και western αποτύπωση αντίστοιχα. Μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε με ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν. (Β) NPM1 knockdown αναστέλλει κύτταρα LNCaP κλωνογονικότητας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή συμβολή σε μια εβδομάδα, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 5% Giemsa μπλε πριν από τη μικροσκοπική παρατήρηση. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με συνεπή αποτελέσματα. Το γράφημα αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυτταρικών κλώνων (& gt? 50 κύτταρα) στην κατάσταση shNPM1, που υπολογίζεται ως ο μέσος όρος ± SD του αριθμού των κλώνων μετρήθηκαν ανά πεδίο, στις 5 τυχαία πεδία, χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ και εκφράζεται σε σχέση με τον αριθμό κλώνων μετρήθηκαν σε κατάσταση ελέγχου. (C, d) NPM1 ελέγχους πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Πέντε χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. (Γ) Τα κύτταρα επωάστηκαν στη συνέχεια με ένα διάλυμα σήμανσης BrdU για 2,5 ώρες και BrdU ενσωμάτωση μετρήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση στα 655 nm. (Δ) πολλαπλασιασμός αναλύθηκε επίσης με δοκιμασία RT-qPCR αξιολογώντας PCNA συσσώρευση σχετικό επίπεδο mRNA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας επίπεδο β-ακτίνης mRNA. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν και ενσωμάτωσης BrdU ως μέση τιμή των τριπλών πειραμάτων 96 πόντους το καθένα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

Η

NPM1 επίδραση στον πολλαπλασιασμό συνδέεται με τον έλεγχο της μετανάστευσης, εισβολή, τρισδιάστατη ικανότητες ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και ανάπτυξη όγκου

τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι NPM1 ασκεί έλεγχο επί των κλωνογόνων ικανότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και υποδηλώνει ότι, εκτός από την επίδρασή της στην πολλαπλασιαστική ρυθμό κύτταρο, θα μπορούσε επίσης να συμβάλει τόσο στην ανάπτυξη του όγκου και την επιθετικότητα. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω ο ρόλος της NPM1, εξετάσαμε την εισβολή και τη μετανάστευση ικανότητες των κυττάρων LNCaP shNPM1. Η knockdown του NPM1 ελάττωσε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων LNCaP μέσα από φίλτρα Matrigel επικαλυμμένα κατά 40% (Σχήμα 2Α). Εκτιμήσαμε περαιτέρω την ικανότητα LNCaP κύτταρα μετανάστευση από φυσικώς τραυματισμό κύτταρα απλώνονται επί των πλακών κυτταρικής καλλιέργειας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2b, σε 72 ώρες μετά την επεξεργασμένη, τα κύτταρα shNPM1 δεν ήταν σε θέση να επαναποικίζουν απογυμνωμένη ζώνη ταχύτερη όπως έκαναν τα κύτταρα ελέγχου. Για να ελεγχθεί αν η μείωση της μετανάστευσης και της εισβολής των ικανοτήτων συνοδεύεται από μείωση των ικανοτήτων τρισδιάστατη ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP shNPM1,

in vitro δοκιμασίες

σε μαλακό άγαρ εκτελέστηκαν (Εικόνα 2c). Μείωση NPM1 σε κύτταρα LNCaP καταργεί σχεδόν ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες 3-D. Τα αποτελέσματα από το

in vitro

αναλύσεις υποδεικνύουν έντονα ότι NPM1 ρυθμίζει τα μεταναστευτικά και επεμβατική ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

(α) NPM1 ελέγχει τις ικανότητες μετανάστευση των κυττάρων LNCaP. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε συρροή, προκειμένου να δημιουργηθεί ένα τραύμα 24 ώρες αργότερα. Τραύματος επαναποικιοποίηση παρατηρήθηκε μετά από 72 ώρες καλλιέργειας με ανεστραμμένη μικροσκοπία και φωτογραφήθηκε. Ιστογράμματα δείχνουν πληγή περιοχή ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας το ImageJ και οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με συνεπή αποτελέσματα. (Β) NPM1 knockdown αναστέλλει την επεμβατική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε συρροή σε RPMI μέσο ελεύθερο ορού 1640 επί matrigel επικαλυμμένα μικροπορώδη μεμβράνη. 48 ώρες αργότερα, μετανάστευσε κυττάρων που υπάρχουν στην απέναντι πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 5% Giemsa μπλε και παρατηρήθηκε σε μικροσκόπιο (200 χ μεγέθυνση). Η γραφική παράσταση παριστά τον αριθμό των κυττάρων στην κατάσταση shNPM1, που υπολογίζεται ως ο μέσος όρος ± SD του αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν ανά πεδίο, στις 5 τυχαία πεδία, χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ και εκφράζεται σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν σε κατάσταση ελέγχου . (Γ) οι επιπτώσεις NPM1 τρισδιάστατη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Έλεγχος ή NPM1 χτυπηθεί κάτω κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή συρροή σε αγαρόζη /RPMI 1640 10% FBS για 2 εβδομάδες. Αριθμό και το μέγεθος των αναδυόμενων κλώνοι στη συνέχεια παρατηρήθηκε κάτω ανεστραμμένο μικροσκόπιο (x100) και φωτογραφήθηκαν. Το γράφημα αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυτταρικών κλώνων (& gt? 50 κύτταρα) στην κατάσταση shNPM1, που υπολογίζεται ως ο μέσος όρος ± SD του αριθμού των κλώνων μετρήθηκαν ανά πεδίο, στις 5 τυχαία πεδία, χρησιμοποιώντας το ελεύθερο λογισμικό ImageJ και εκφράζεται σε σχέση με τον αριθμό κλώνων μετρήθηκαν σε κατάσταση ελέγχου. (Δ, ε, στ, ζ) NPM1 knock-down καταργεί ογκογονικότητα κυττάρων LNCaP όταν εγχέονται σε γυμνούς ποντικούς. shScr (n = 14) και shNPM1 (n = 14) των κυττάρων LNCaP υποδορίως μπολιάζονται με γυμνούς ποντικούς και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κάθε 2 ημέρες μετά από την εμφύτευση (δ). Graph σε (ε) είναι η ποσοτικοποίηση της shScr και shNPM1 προερχόμενο όγκος όγκους κατά την ημέρα 24 μετά την ένεση. επίπεδο σχετική έκφραση NPM1 αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western σε όγκους όταν θυσιάστηκαν ποντίκια (στ) και το βάρος όγκου μετρήθηκε (g). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος της NPM1 στον καρκίνο του προστάτη, αναλύσαμε ογκογένεσης του shNPM1 LNCaP και shScr LNCaP του προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές

in vivo

μετά από υποδόρια ένεση στο πλευρό αρσενικών γυμνών ποντικών. κύτταρα ShNPM1 παράγουν μικρότερους όγκους (Σχήμα 2d, e) και, σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP shScr, είναι πιο πιθανό να παράγουν κανένα όγκου καθόλου όταν μπολιασμένα (Σχήμα 2Ε). Αναλυτικά, όγκους που ξεκίνησαν από κύτταρα ελέγχου LNCaP εμφανίζονται στο 22 ημέρες μετά την ένεση ενώ οι όγκοι που προέρχονται από κύτταρα LNCaP shNPM1 είναι εμφανή μόνο στο 24 ημέρες μετά την ένεση. Επιπλέον, καμπύλες ανάπτυξης ποτέ να παραλληλιστεί ακόμα και μετά από 29 ημέρες (εικόνα 2d). Έτσι, όγκους που ξεκίνησαν από NPM1 κύτταρα νοκ-κάτω παρέμεινε μικρότερο από όγκους ελέγχου με 85% μείωση του μέσου όγκου του όγκου (Σχήμα 2Ε). Αυτή η σημαντική μείωση του όγκου του όγκου αποτέλεσμα σε μείωση 95% του βάρους του όγκου από κύτταρα LNCaP shNPM1 (σχήμα 2 g). Αυτή η μείωση είναι απίθανο οφείλεται σε απώλεια έκφρασης του αντι-NPM1 shRNA αφού όλοι οι όγκοι shNPM1 διατηρήσουν μια μείωση 90% σε συσσώρευση NPM1 (εικόνα 2f). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά καταδεικνύουν σαφώς ότι NPM1 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη

in vitro

και

in vivo

.

NPM1 εμπλέκεται στον έλεγχο της έκφρασης EGF

για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς NPM1 μπορεί να προωθήσει προστάτη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση array qPCR (array RT2 ProfilerTM, οι PAH-121Α-2, Qiagen) και προσδιορίζεται η φύση των γονιδίων των οποίων τα επίπεδα μεταγραφής ρυθμίζονται από το knockdown του NPM1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταξύ των 84 γονιδίων στίγματα στη συστοιχία, η συσσώρευση mRNA Επιδερμικού Παράγοντα Ανάπτυξης (EGF) ήταν η πιο μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα LNCaP shNPM1. Αυτή η διαμόρφωση της έκφρασης EGF δεν προκύπτει από μια παγκόσμια ανασταλτική επίδραση στην γονιδιακή έκφραση, όπως οι περισσότεροι από τα γονίδια δεν επηρεάζονται ή πάνω ρυθμισμένα όταν NPM1 μειώνεται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμούς RT-qPCR ως συσσώρευση EGF mRNA είναι μειωμένη κατά 40% σε κύτταρα LNCaP shNPM1 (σχήμα 3α). Επιπλέον, για να δοκιμαστεί η σχετική δραστικότητα του γονιδίου δραστηριότητας του υποκινητή EGF σε κύτταρα LNCaP shSCR και shNPM1, επιμολύναμε αυτά τα κύτταρα με ένα phEGF-λουσιφεράσης πλασμίδιο ανταποκριτής. Εξόντωση NPM1 προκαλεί μια μείωση της δραστηριότητας προαγωγού EGF, δείχνοντας ότι η επίδραση του NPM1 είναι πιθανό να εξασκείται στο μεταγραφικό επίπεδο (σχήμα 3β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι NPM1 ελέγχει άμεσα ή έμμεσα EGF έκφρασης. Όπως EGF είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί ειδικά τον υποδοχέα EGF (EGFR), διερευνήσαμε κατά πόσον η ενεργοποίηση του συμπλόκου EGFR, καθώς και η ενεργοποίηση του κατάντη τελεστές της, ERK1 /2 και ΑΚΤ, διαμορφώνεται από το επίπεδο έκφρασης NPM1. Με βάση την ανάλυση της κατάστασης φωσφορυλίωσης τους, δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση του EGFR (pEGFR) και του ERK1 /2 (pERK1 /2) είναι δραματικά μειωμένη ή σχεδόν καταργηθεί όταν η έκφραση NPM1 αναστέλλεται (Σχήμα 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ είναι λιγότερο ευαίσθητο σε μια τέτοια αναστολή, γεγονός που υποδηλώνει ότι NPM1 ειδικά επηρεάζει το μονοπάτι ΜΑΡΚ (Σχήμα 3C). Αυτές οι επιδράσεις της NPM1 στην έκφραση EGF και ERK1 /2 οδού υποδεικνύουν έντονα ότι NPM1 θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην ρύθμιση του ΕΤΠ αυτορρύθμισης βρόχο.

(α) NPM1 ελέγχει την έκφραση του ΕΤΠ. Σχετικά επίπεδα EGF mRNA σε σύγκριση με την β-ακτίνης αναλύθηκαν με RT-qPCR σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν ελέγχου (shScr) ή NPM1 ειδικό shRNA (shNPM1). (Β) τις δραστηριότητες ελέγχου NPM1 EGF υποκινητή. shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς phEGF-λουσιφεράσης. δράση υποκινητή EGF αξιολογήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης 24 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας τυποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προαγωγό CMV ως έλεγχος και εκφράζεται ως πολλαπλάσια επαγωγή επί κύτταρα ελέγχου (shScr). (Γ) NPM1 ελέγχει την ενεργοποίηση του μονοπατιού EGF /EGFR καθοδικούς τελεστές. Πρωτεΐνες, εκχυλίζονται από shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 10% FBS, υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με SDS-PAGE. Μεταφέρεται μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοτικοποίηση μπάντα που αναφέρθηκαν στο επίπεδο β-ακτίνης. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με συνεπή αποτελέσματα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

Η

NPM1 ενισχύει ειδικά τη δραστηριότητα ΜΑΡΚ μονοπάτι για την προώθηση πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ικανοτήτων των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Τα ανωτέρω δεδομένα αποδεικνύουν ότι NPM1 εμπλέκεται στον έλεγχο της έκφρασης EGF, ένας αυξητικός παράγοντας που ελέγχει το μονοπάτι ΜΑΡΚ και προάγει ογκογόνο συμπεριφορά των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Έτσι, αναρωτηθήκαμε αν ήταν ο λόγος για τον οποίο τα κύτταρα shNPM1 LNCaP έδειχναν μειωμένη ογκογόνο συμπεριφορά. έτσι ερευνήσαμε αν ένας εξωγενής πρόσληψη του ΕΤΠ θα μπορούσε να σώσει την ενεργοποίηση των δραστών οδού /EGFR EGF και εν συνεχεία αυξάνονται τα κύτταρα LNCaP πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Ελέγχου (shScr) ή NPM1 γκρέμισε (shNPM1) LNCaP κύτταρα στερήθηκαν για να απενεργοποιήσετε τα μονοπάτια σηματοδότησης και στη συνέχεια κατεργάζεται με EGF.

κηλίδας Western αναλύσεις δείχνουν ότι ένας εξωγενής συμπλήρωση EGF οδηγεί στη φωσφορυλίωση,

δηλαδή

, η ενεργοποίηση τόσο του υποδοχέα EGF και ενός κατάντη στόχου της, ΑΚΤ, και στις δύο κύτταρα shScr και shNPM1. Αντιθέτως, και το πιο ενδιαφέρον, φωσφορυλίωση των ERK1 /2 είναι ειδικά μειωμένη σε κύτταρα shNPM1 (σχήμα 4α). Σε συμφωνία με αυτό το αποτέλεσμα, η προσθήκη εξωγενούς ΕΤΠ δεν είναι σε θέση να αποκαταστήσει τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των κυττάρων LNCaP shNPM1 στις αντίστοιχες δοκιμασίες (σχήμα 4β, γ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι NPM1 απαιτείται ειδικά για την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ και ότι η ενίσχυση αυτής της οδού μεταγωγής εμπλέκεται στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των ικανοτήτων των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

(α) NPM1 κάτω ρύθμιση αναστέλλει EGF προκάλεσε ERK1 /2 δραστικότητα μονοπατιού. shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ EGF και φωσφορυλίωση των τελεστών οδού EGF /EGFR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοτικοποίηση μπάντα που αναφέρθηκαν στο επίπεδο β-ακτίνης. Η κηλίδα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με συνεπή αποτελέσματα. (Β) Παρά την αγωγή με EGF, ικανότητες μετανάστευση των LNCaP μειώθηκε για NPM1 δεν αποκαταστάθηκαν. Το κλείσιμο της πληγής αναλύθηκε 72 ώρες μετά από συνεχή θεραπεία με 100 nM EGF. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από αντεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκε. Ιστογράμματα δείχνουν πληγή περιοχή ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας ImageJ. (Γ) EGF θεραπεία δεν διασώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NPM1 νοκ ντάουν LNCaP. δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU διεξήχθη σε shScr και shNPM1 LNCaP 24 ώρες μετά από 100 nM θεραπεία EGF. Πυκνομετρία μετρήθηκε στα 655 nm. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

Η

NPM1 δρα ανάντη του ΜΕΚ1 και κατάντη του EGFR να ενεργοποιούν την οδό ΜΑΡΚ, για τον έλεγχο ενός EGF αυτο -Κανονισμός βρόχος σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Ως φωσφορυλίωση των ERK1 /2 είναι ειδικά μειωμένη σε κύτταρα shNPM1 ακόμη και με την παρουσία του EGF, προτείνει ότι, στην οδό ΜΑΡΚ, NPM1 δρα ανοδικά της ERK1 /2. Για την αναγνώριση του τελεστή (ες) του EGFR που προκαλείται από μονοπάτι σηματοδότησης στην οποία NPM1 μπορεί να ενεργεί και να καθορίσει εάν η δράση NPM1 είναι άμεση ή όχι στον υποκινητή του γονιδίου EGF, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς επιμόλυνσης με μόνιμα ενεργή μορφή της ΜΕΚΚ1 (caMEKK1) : caMEKK1 φωσφορυλιώνει ERK1 /2 κινάσης ΜΕΚ1 /2, και με τον τρόπο αυτό, ενεργοποιεί ιδιοσυστατικά ERK1 /2 με την απουσία του ΜΕΚ1 αναστολής /2. Σε κύτταρα shScr LNCAP, caMEKK1 διαμόλυνση επάγει την φωσφορυλίωση των ERK1 /2. Σε κύτταρα shNPM1 LNCaP caMEKK1 επιμόλυνση προκαλεί ένα παρόμοιο αποτέλεσμα, τη διάσωση έτσι το EGFR μονοπάτι σηματοδότησης (σχήμα 5α). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι NPM1 στοχεύει το μονοπάτι ΜΑΡΚ κατάντη του EGFR αλλά ανάντη του ΜΕΚ1 /2 για να ρυθμίσουν τις ERK1 /2. Επιπλέον, συνεπιμόλυνση του caMEKK1 κατασκεύασμα με ένα phEGF-λουσιφεράσης πλασμίδιο ανταποκριτή επίσης διασώζει τη δραστηριότητα υποκινητή EGF (Σχήμα 5Β) σε κύτταρα LNCaP νοκ-κάτω για NPM1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η 1- είναι απίθανο ότι NPM1 διαενεργοποιεί άμεσα τον προαγωγό EGF σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. 2- NPM1 μπορεί μάλλον διεγείρει την οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ να ενισχυθεί η μεταγραφή του γονιδίου EGF. 3- δεδομένα φωσφορυλίωση σε AKT και ERK1 /2 υποδεικνύουν έντονα ότι NPM1 δρα στο επίπεδο της ΜΕΚΚ1 ή Ras /Raf σε αυτό το μονοπάτι.

(α) την ενεργοποίηση των ERK1 /2 διασώζεται από caMEKK1. Οι shScr και shNPM1 LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με ένα ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένο κατασκεύασμα του ΜΕΚΚ1 (caMEKK1) και /2 επίπεδο φωσφορυλίωσης ERK1 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας westem αποτύπωση. (Β) την ενεργοποίηση των ERK1 /2 οδό αποκαθιστά δράση προαγωγού EGF στα κύτταρα LNCaP ρυθμίζεται προς τα κάτω για NPM1. LNCaP shSCR και τα κύτταρα shNPM1 ήταν παροδικά συν-επιμολυσμένα με phEGF-Luc και caMEKK1. δράση υποκινητή EGF αξιολογήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης 24 ώρες μετά. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας τυποποιήθηκαν ενάντια δραστηριότητα ανταποκριτή ελέγχου CMV-Luc και εκφράστηκαν ως πολλαπλάσια επαγωγή επί κύτταρα ελέγχου (shScr). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Συζήτηση

NPM1 διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό. Μεταξύ άλλων, ευνοεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ριβοσωμάτων βιογένεση και κεντροσώματος επικάλυψη [5] – [7]. Κατά συνέπεια, ένας συσχετισμός μεταξύ αυξημένων επιπέδων έκφρασης NPM1 και την εξέλιξη του όγκου έχει καθιερωθεί σε ένα ευρύ σύνολο των στερεών όγκων διαφόρων ιστολογικών προελεύσεων, όπως στην gastric- [8], [9], του παχέος εντέρου [9], των νεφρών [10] ή των ωοθηκών καρκίνους [11]. Παρ ‘όλα αυτά πολλές μελέτες αποκάλυψαν ότι, παραδόξως, NPM1 είναι σε θέση τόσο να δρα ως καταστολέας των όγκων και ως πρωτο-ογκογονίδιο κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [12]. Από τη μια πλευρά, NPM1 συμμετέχει στη διατήρηση της σταθερότητας των χρωμοσωμάτων και ρυθμίζει ARF δραστηριότητα [13] και, αφ ‘ετέρου, NPM1 προωθεί την αναστολή διαφόρων καταστολείς όγκων συμπεριλαμβανομένων Ρ53 ή Rb, και την ενεργοποίηση του πρωτο-ογκογονιδίου c-Myc για την ενίσχυση της μεταμόρφωσης δραστηριότητα της [14]. προηγούμενα ευρήματα μας έδειξαν ότι ο συνοδός NPM1 μοριακό υπερεκφράζεται σε ιστό καρκινώματος του προστάτη, σε σύγκριση με τον έλεγχο γειτονικό ιστό, όπου διεγείρει την εξαρτώμενη από ανδρογόνο μεταγραφής [1]. Τώρα ήθελε να διερευνήσει πιο συγκεκριμένα εάν αυτή η απορρύθμιση της έκφρασης NPM1 μπορεί να ενεργεί για τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη επεμβατική και τις δυνατότητες της μετανάστευσης.