Αφηρημένο

Τα προκλινικά θεραπευτική αξιολόγηση βασίζεται επί του παρόντος σχετικά με την ανταπόκριση ανάπτυξη καθιερωμένων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών ξενο-μεταμόσχευσις σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, μια στρατηγική που δεν είναι γενικά προγνωστική της κλινικά αποτελέσματα. Ανοσοεπαρκών γενετικά ποντίκι (GEM) προερχόμενο μοντέλα αλλομοσχεύματος του όγκου προσφέρουν εξαιρετικά προσιτό προκλινικές εναλλακτικές λύσεις και να διευκολυνθεί η ανάλυση των κλινικώς ελπιδοφόρα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα. Απεικονίσιμη δημοσιογράφοι είναι απαραίτητη για την ακριβή παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου και την ανταπόκριση, ιδίως για τις μεταστάσεις. Δυστυχώς, οι δημοσιογράφοι όπως λουσιφεράση και GFP είναι ξένα αντιγόνα σε ανοσοεπαρκή ποντίκια, ενδεχομένως εμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου και σύγχυσης θεραπευτικές αποκρίσεις. Εδώ εκτίμησε την αξία του δημοσιογράφου-ανεκτικά πετράδια ως αποδέκτες μοσχεύματος με τη στόχευση ελάχιστη έκφραση του ρεπόρτερ σύντηξης λουσιφεράσης-GFP στην πρόσθια υπόφυση (που ονομάστηκε το «Λαμπερό Head» ή GH ποντίκι). Το αναφοράς λουσιφεράσης-GFP που εκφράζεται σε κύτταρα όγκου προκάλεσε ανεπιθύμητες ανοσοαποκρίσεις σε άγριου τύπου ποντικού, αλλά όχι σε GH ποντικού, ως ξενιστές μεταμόσχευση. Η αντιγονικότητα των οπτικών ρεπόρτερ είχε ως αποτέλεσμα μείωση τόσο στην ανάπτυξη και στο μεταστατικό δυναμικό του επισημασμένου όγκου σε άγριου τύπου ποντικούς σε σύγκριση με τους ποντικούς GH. Επιπλέον, η έκφραση ρεπόρτερ μπορεί επίσης να μεταβάλλει την απόκριση όγκου σε χημειοθεραπεία ή στοχευμένη θεραπεία σε ένα πλαίσιο-εξαρτώμενο τρόπο. Έτσι, τα ποντίκια GH και πειραματικές προσεγγίσεις ελεγχθεί εδώ παρέχουν επικύρωση ιδέα και μια στρατηγική για την αποτελεσματική, επαναλήψιμη προκλινική αξιολόγηση της κινητικής ανάπτυξης και της απόκρισης για ανιχνεύσιμα όγκους

Παράθεση:. CP Ημέρα, Κάρτερ J, Ohler ZW, Bonomi C, El Meskini R, Martin P, et al. (2014) «Glowing Head» Ποντίκια: Μια Γενετική εργαλείο που επιτρέπει αξιόπιστη Προκλινικά Εικόνα-Based Αξιολόγηση των καρκίνων σε Ανοσοεπαρκείς αλλομοσχεύματα. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10.1371 /journal.pone.0109956

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29, Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 9 Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Αυτό το πρόγραμμα έχει χρηματοδοτηθεί εν όλω ή εν μέρει με ομοσπονδιακά κεφάλαια από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, στο πλαίσιο της συμβάσεως αριθ HHSN261200800001E . Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Αναπτυξιακό Πρόγραμμα Θεραπευτικής στη διαίρεση των καρκινικών θεραπεία και τη διάγνωση και εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Κέντρου Έρευνας για τον Καρκίνο, NCI, ΝΙΗ. Leidos Biomedical Research Inc. παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς John Carter, Ζωή Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry, και Lionel Feigenbaum, αλλά δεν έχει καμία επιπλέον ρόλο στην σχεδιασμός της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφείς John Carter, Ζωή Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-κεράσι και Lionel Feigenbaum απασχολούνται από Leidos Biomedical Research Inc. Leidos Biomedical Research Inc., είναι αφιερωμένο σε μια ενιαία σύμβαση για τη λειτουργία του Εθνικού Εργαστηρίου Frederick για την Έρευνα του Καρκίνου (FNLCR), μια ομοσπονδιακά χρηματοδοτούμενες Κέντρο Έρευνας και Ανάπτυξης. Δεν συμμετέχει σε οποιαδήποτε απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων κλπ που σχετίζονται με αυτή τη μελέτη. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η μέση φάρμακο που αναπτύχθηκε από μεγάλες φαρμακευτικές εταιρείες έχουν υπολογίζεται να κοστίσει μεταξύ 4 και 11 δισεκατομμύρια δολάρια [1], κοστίζει στον μέσο ασθενή με καρκίνο περίπου $ 100.000 το χρόνο. Αυτά τα συγκλονιστικό κόστος οδηγείται εν μέρει από την αδυναμία νωρίς το αναπτυξιακό αγωγού να προσδιορίσει αξιόπιστα φάρμακα που θα είναι αποτελεσματικό, και το συνολικό ποσοστό έγκρισης για ογκολογικές ένωση είναι σήμερα περίπου 5% [2]. Μεγάλο μέρος αυτής της αποτυχίας μπορεί να αποδοθεί στην ανεπάρκεια των προκλινικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική αξιολόγηση. Ιστορικά, προκλινικές μελέτες σε ζώα έχουν χρησιμοποιήσει εδώ και δεκαετίες καθιερωμένες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου, μεταμοσχεύονται ως ξενομοσχεύματα υποδορίως σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [3]. Δυστυχώς, αυτά τα μοντέλα είχαν περιορισμένη αποτελεσματικότητα-προγνωστική αξία για την ανάπτυξη φαρμάκων, αλλά έχουν κριθεί ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση της φαρμακευτικής παραγωγικότητας και της φροντίδας των ασθενών [4].

Η επάρκεια των προκλινικών μελετών καρκίνου συνδέεται με την καταλληλότητα του το ίδιο ζωικό μοντέλο. Paramount είναι η παρουσία ενός πλήρως λειτουργικό ανοσοποιητικό σύστημα, το οποίο εμπλέκεται σχεδόν σε κάθε βήμα της ανάπτυξης της νόσου, και με κριτικό πνεύμα καθορίζει τους τρόπους θεραπείας [5]. Τα κύτταρα όγκου αλληλεπιδρούν αμοιβαία και δυναμικά με το ανοσοποιητικό και άλλα μικροπεριβάλλον των κυττάρων καθ ‘όλη τη διάρκεια της μεταστατική εξέλιξη και επίσης μετά από θεραπευτική [6] παρέμβαση. Αυτή η αλληλεπίδραση είναι κατάλληλα ως πρότυπο τόσο σε αυτόχθον γενετικά ποντικού (GEM) μοντέλα καρκίνου και με ορθοτοπική μεταμόσχευση GEM-προερχόμενο αλλομοσχευμάτων (GDAs) σε πλήρως ανοσοεπαρκείς ποντικούς ξενιστή [7], αλλά όχι αποτελεσματικά σε τρέχοντα μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου καρκίνου. Τέλος, θεραπευτικές και βιοδεικτών αξιολόγηση θα πρέπει ιδανικά να βασίζονται σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου ανακεφαλαιώνοντας

φυσικά

μετάσταση, την πιο θανατηφόρα φάση του καρκίνου.

Πρακτικώς επιλύσιμα προκλινικά μοντέλα απαιτούν την ικανότητα να παρακολουθεί με ακρίβεια την εξέλιξη της νόσου και την θεραπευτική ανταπόκριση , διευκολύνοντας την έγκριση των σχετικών κλινικών παραμέτρων [8]. παρακολούθηση ασθενειών είναι απαραίτητη για μεταστάσεις και άλλως μη ανιχνεύσιμο όγκους. Οπτική απεικόνιση των κυττάρων που εκφράζουν πρωτεΐνες που παράγουν φως κυριαρχεί σήμερα τεχνολογίες παρακολούθησης, λόγω της ικανότητάς τους να μετρήσει τα γεγονότα σε πραγματικό χρόνο, σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητας και του χρόνου απόδοσης [9]. Ωστόσο, οι περισσότερες ανιχνεύσιμες πρωτεΐνες δείκτες, όπως η δημοφιλής λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (ffLuc) και μέδουσα ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eGFP), είναι ξενοβιοτικών στα θηλαστικά. Η έκφρασή τους επάγει φυσικά διάφορες ανοσολογικές αποκρίσεις σε ανοσοεπαρκείς ζώα, με αποτέλεσμα την ανομοιόμορφη δραστηριότητα [10], [11], απόρριψη μοσχευμάτων [12] και την καταστολή της μεταστατικής δραστηριότητας [13], διαψεύδοντας την εγκυρότητα των προκλινικών συμπερασμάτων. Έτσι, η αποτελεσματική χρήση των ξενοβιοτικών δημοσιογράφους περιορίζεται είτε σε βραχυπρόθεσμες μελέτες, πλήρως ή ανοσοκατεσταλμένα ζωικά μοντέλα, περιορίζοντας προκλινικές επιλογές [9], [13].

Για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, έχουμε αναπτύξει μια GEM μοντέλο που είναι ανοσολογικά ανεκτικός προς αμφότερα ffLuc και eGFP να χρησιμεύσει ως ξενιστής για μεταμόσχευση επισημασμένων συγγενικών όγκων. Χρησιμοποιώντας την ορμόνη ανάπτυξης αρουραίου (rGH) υποκινητή, έκφραση μιας πρωτεΐνης σύντηξης ffLuc ΕΟΡΡ στόχευε στην πρόσθια υπόφυση, ένα μη-ανοσο προνομιακή θέση απομακρυσμένη από συνήθως παρακολουθείται όργανα σε προκλινικές μελέτες, δημιουργώντας έτσι το «πυρακτωμένο Head» (GH) ποντίκι [14]. Έχουμε αποδείξει ότι σε άγριου τύπου ποντίκια ανοσολογικές αντιδράσεις που προκαλούνται από ξενοβιοτικών δημοσιογράφους να επηρεάσει ουσιαστικά την εξέλιξη και τη θεραπευτική απαντήσεις των εκτυπώσιμη μεταμοσχευμένων όγκων. Είναι σημαντικό, η χρήση των προ-ανεκτικά ποντίκια GH ελαχιστοποιεί ή εξαλείφει αυτές τις ανωμαλίες, με αποτέλεσμα την πιο αξιόπιστη, τιθασεύσει προκλινικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι φορείς λεντοϊών

Η λεντοϊού διάνυσμα που εκφράζει την πυγολαμπίδα πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη σύντηξης πρωτεΐνη λουσιφεράσης ενισχυμένη (FerH-ffLuc ΕΟΡΡ) περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Ήταν εδώ τροποποιημένα για την απομάκρυνση eGFP και εισάγετε μια θέση σύνδεσης εσωτερικού ριβοσώματος (IRES) και της ιστόνης Η2Β-tagged eGFP (Η2Β-eGFP) για να δημιουργήσει FerH-ffLuc-IRES-Η2Β-eGFP, που στοχεύει την έκφραση της ffLuc και eGFP με το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, αντίστοιχα. Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την ακολουθία του φορέα θα πρέπει να παρέχονται κατόπιν αιτήσεως προς τον Δρ Ντομινίκ Esposito (e-mail: [email protected])., Leidos Ιατροβιολογικών Ερευνών, Frederick, MD, USA

Ζώα

για να μειωθεί η απορρόφηση βιοφωταύγεια και πειραματική διακύμανση, αλμπίνο 6- έως 8-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια αμιγές επί ένα C57BL /6 (C57BL /6

C-brd /c-brd /Cr) ή FVB /N φόντο χρησιμοποιήθηκαν ως ξενιστές για μελέτες μεταμόσχευσης. F1 ποντίκια από την εκτροφή των C57BL /6 με 129 (Β6? 129) ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως ισογονιδιακές φιλοξενεί στη μελέτη της ΕΡΑ

Q61K /p19

ΤΑΠ-null μελάνωμα, το οποίο προέρχεται από ένα μικτό γενετικό υπόβαθρο [ ,,,0],15], [16]. Όλα τα ζώα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το ερευνητικό έργο ήταν φροντίδας και χρήσης ανώδυνα σύμφωνα με τις ακόλουθες πολιτικές: Η ΗΠΑ Υπηρεσίας Δημόσιας Υγείας πολιτικής για ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των ζώων (1996)? ο Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (1996)? και οι Αρχές των ΗΠΑ Κυβέρνηση για τη χρήση και τη φροντίδα των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται στις δοκιμές, Έρευνας και Εκπαίδευσης (1985). Όλα τα πειράματα του ποντικιού πραγματοποιήθηκαν σε αυστηρή συμφωνία με ζωικά πρωτόκολλα μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση (ACUC), NCI, στο Εθνικό Εργαστήριο Frederick για την Έρευνα του Καρκίνου, το οποίο είναι διαπιστευμένο από AAALACi και ακολουθεί τη Δημόσια Πολιτική Υπηρεσία Υγείας για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών ζώων. Τα ακόλουθα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το ACUC για την εκτέλεση αυτής της μελέτης:. ASP # 08-084, 11-044, 11-058 και

Τα ποντίκια σε αυτή τη μελέτη υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία CO2 παρακάτω NCI-ενέκρινε τις κατευθυντήριες γραμμές ACUC : (1) Μεταφέρετε τα ποντίκια σε ένα θάλαμο CO2 ακριβώς πριν την ευθανασία. (2) Ενεργοποιήστε το CO2 σε 2 λίτρα ανά λεπτό για ένα πρότυπο μεγέθους του θαλάμου. (3) Εντός περίπου δύο με τρία λεπτά, ενήλικα ποντίκια θα πρέπει να είναι ακίνητος και αδιάφορη? όταν αυτό είναι προφανές, αυξάνουν το ρυθμό ροής σε υψηλή ή περίπου 10 λίτρα /λεπτό. (4) Όταν η αναπνοή παύει για όλα τα ζώα μέσα από το κλουβί, ρυθμίστε το χρονοδιακόπτη για 2 λεπτά. Στο τέλος του δύο λεπτά, οι ποντικοί μπορεί να αφαιρεθεί από το CO2 γεμάτο κλουβί. Βεβαιωθείτε θάνατο κάνοντας ότι δεν υπάρχουν κινήσεις του κάθε είδους για άλλα 60 δευτερόλεπτα εκτός του CO2 γεμάτο κλουβί, χρησιμοποιώντας το χρονόμετρο.

Δημιουργία του «Glowing Head»

ποντίκι

Η rGH -hGH κατασκεύασμα [17] (ένα δώρο του Dr. Rhonda Kineman, University of Illinois-Chicago, Chicago, IL) τροποποιήθηκε με εισαγωγή ενός γονιδίου σύντηξης ffLuc ΕΟΡΡ για να δημιουργήσει το φορέα πρόσθια υπόφυση-στόχευσης, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών τόσο στην C57BL /6 και FVB /N γενετικό υπόβαθρο με βλαστοκύστη μικροέγχυση. Μικρές αποικίες των ομόζυγα διαγονιδιακά ποντίκια διατηρήθηκαν για αναπαραγωγικούς σκοπούς, και ετερόζυγοι απόγονοι τους χρησιμοποιούνται για όλες τις προκλινικές μελέτες. Όλα τα διαγονιδιακά και αναπαραγωγή εργασία εκτελέστηκε μέσω του Προγράμματος Εργαστήριο Animal Science, Frederick Εθνικό Εργαστήριο.

Ποντικού όγκους, καρκινικές κυτταρικές σειρές, και η επισήμανση τους

Ο Lewis του πνεύμονα (LLC) ιστού ήταν διατηρούνται μόνο

in vivo

αφού προέλευσή της από τον αρχικό όγκο του πνεύμονα C57BL /6 ποντίκια [8]. Η αυθόρμητα μεταστατικά σειριακός HGF-TG /CDK4

R24C μελανώματος μεταμόσχευση δέρματος δημιουργήθηκε από ένα πρωτογενές μελάνωμα που επάγεται σε HGF-TG /CDK4

R24C C57BL /6 ποντίκια με επιδερμική εφαρμογή του καρκινογόνου παράγοντα DMBA [18]. HGF-TG /CDKN2A

– /- μελάνωμα προήλθε από όγκους που επάγεται σε HGF-TG /CDKN2A

– /- ποντίκια FVB με ακτινοβολία UV [19]. Αυτοί οι όγκοι διατηρήθηκαν μόνο σε συγγενή ποντίκια. Για τη μεταμόσχευση, τα συλλεχθέντα ιστούς όγκων χωρίστηκαν σε κομμάτια 3 mm χ 3 mm και το καθένα εισήχθη εντός μια περικοπή 5 mm στο δέρμα του ποντικιού. MVT-1 ποντικού κύτταρα καρκίνου του μαστού προήλθαν από μαστικούς όγκους του MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF δι-διαγενή ποντικιού σε ένα FVB /N καθαρών φόντο [20]. Είχαν καθιερωθεί ως μία κυτταρική γραμμή και να διατηρηθούν με in vitro καλλιέργεια. Για τη μεταμόσχευση, 1,0 χ 10

6 κύτταρα παρασκευάστηκαν από καλλιέργεια και ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε ποντικό. Μεταλλαγμένα ΕΡΑ

Q61K /p19

ΤΑΠ-null κύτταρα μελανώματος παρήχθησαν όπως περιγράφεται [15], [16]. Στο πρώτο πέρασμα, 1,0 χ 106 κύτταρα από ίη vitro καλλιέργεια εμβολιάσθηκαν σε ποντικούς C57BL /6×129 F1 για να σχηματίσουν όγκους. Στα ακόλουθα περάσματα, τα θραύσματα που διαιρούνται από συγκομίζονται όγκου χρησιμοποιήθηκαν για μεταμόσχευση, όπως περιγράφεται ανωτέρω.

για την επισήμανση του

in vivo

διατηρείται όγκους, κυτταρικά εναιωρήματα παρασκευάζονται από

in vivo

-επεκταθούν όγκους μολύνθηκαν

ex vivo

με φακοϊό από

ex vivo

spinoculation [10], [21]. LLC ιστός μολύνθηκε με φακοϊό κωδικοποιεί ffLuc-eGFP ή ffLuc-IRES-Η2Β ΕΟΡΡ και στη συνέχεια υποβάλλεται σε

in vivo

ποδήλατο για να ληφθεί ομοιόμορφα σημασμένη όγκους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Οι κυτταρικές σειρές σημάνθηκαν με ffLuc ΕΟΡΡ lentivirus

in vitro

, και το eGFP

+ πληθυσμοί απομονώθηκαν με τη χρήση του φθορισμού που ενεργοποιείται διαλογέα κυττάρου (FACS).

Προκλινικές μελέτες και παθολογικές ανάλυση

Για προκλινικές μελέτες, ένα κρυογονικά διατηρημένο την ένδειξη όγκου αναβίωσε και διευρύνθηκε με υποδόρια μεταμόσχευση σε ποντίκια. Αυτοί οι όγκοι ανατμήθηκαν μετά την επίτευξη 500 mm

3 και επεκτάθηκε μέσω διόδου στο απαιτούμενο αριθμό ποντικών για τις πραγματικές μελέτες που περιγράφονται στο κείμενο. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με το χέρι και υπολογίστηκε με V (mm

3) = 0,5 × L × W

2, όπου L είναι το μήκος και το W είναι το πλάτος σε mm. Για την προκλινική μοντελοποίηση των πρωτοπαθών όγκων, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες σύμφωνα με τη μελέτη του σχεδιασμού, όταν οι όγκοι τους έφθασαν 125 χιλιοστά

3. Η ομάδα ελέγχου έλαβε διάλυμα του οχήματος, και η πειραματική ομάδα έλαβε αγωγές των χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Η δόση και το πρόγραμμα σε κάθε πείραμα έχουν καθοριστεί στα αποτελέσματα. Όταν οι όγκοι αυξήθηκαν έως 2000 mm

3, τα ποντίκια είχαν φτάσει τελικά σημεία τους και θανατώθηκαν για περαιτέρω μελέτη.

Για προκλινικά μοντέλα αυθόρμητης μετάστασης, οι πρωτογενείς όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά φτάνοντας 500 χιλιοστά

3, και τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ανάλογα με το σχεδιασμό της μελέτης. Μετάσταση και η επανάληψη παρακολουθούνταν περιοδικά από την απεικόνιση χρησιμοποιώντας το σύστημα Xenogen IVIS [8] για τη μέτρηση της ροής BL (φωτονίων /sec /ακτινικό βαθμό). Η ομάδα ελέγχου έλαβε διάλυμα του οχήματος, και η πειραματική ομάδα έλαβε αγωγές των χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Η δόση και το πρόγραμμα σε κάθε πείραμα έχουν καθοριστεί στα αποτελέσματα. Όταν τα ποντίκια έδειξαν σημάδια νοσηρότητας, που ορίζεται από το πρωτόκολλο της μελέτης ζώου (π.χ. λιγότερο από ακούσιο ψιθύρισμα, δυσκολία στην κίνηση), έφτασαν τελικό σημείο τους και υποβλήθηκαν σε ευθανασία για περαιτέρω μελέτη.

Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την η Σύνθεση & amp ναρκωτικά? Χημεία Branch, DTP, NCI (Bethesda, MD). Η πακλιταξέλη διαλύεται σε 10χ την επιθυμητή συγκέντρωση σε 100% αιθανόλη, αραιώνεται με ίσο όγκο Cremaphor Εί και, στη συνέχεια, αραιώνεται με την συγκέντρωση 1χ με αλατούχο πριν από την ενδοφλέβια ένεση σε ποντίκια. Η γεμσιταβίνη διαλύθηκε σε νερό και εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς. Crizotinib επανααιωρήθηκε σε 0,5% μεθυλοκυτταρίνη σε 0,9% αλατούχο διάλυμα, και χορηγείται μία φορά ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό (ΡΟ) σε μια περίοδο 3 εβδομάδων σε 10 ml /kg. Ποντικοί που φέρουν υποδόριους όγκους τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες με βάση τη μέτρηση του όγκου (200-500 mm

3), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα μόνο, crizotinib στα 50 mg /kg, ή Crizotinib στα 100 mg /kg.

Συγκομιδής ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Δίπλα σειριακές τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για ιστολογική ανάλυση, ή να χρησιμοποιηθούν για GFP ανοσοϊστοχημεία (ab6556, Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA). Η ιστοπαθολογική εξέταση πραγματοποιήθηκε από τον Δρ Miriam Anver (Παθολογίας και Histotechnology Εργαστήριο, Leidos Ιατροβιολογικών Ερευνών, Frederick, MD). Για την ποσοτική ανάλυση, τα πλακίδια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα XT ScanScope και οι εικόνες αναλύθηκαν με Spectrum Plus λογισμικό ανάλυσης παθολογία (Aperio Technologies, Vista, CA).

ορμονών και ανοσολογική ανάλυση δείκτη

οροί παρασκευάζεται από το ολικό αίμα ακόλουθα συμβατικά πρωτόκολλα και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Για να αναλυθεί αντι-ΟΡΡ αντίσωμα στον ορό, πλάκες ELISA (Nunc MaxiSorp, cat # 439454, Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) επικαλύφθηκαν με 31.25 ng ανασυνδυασμένου GFP (ΜΒ-0752, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA) σε κάθε φρεάτιο για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Την επόμενη μέρα, οι οροί και τον έλεγχο μονοκλωνικό αντι-ΟΡΡ αντίσωμα (11814460001, Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ, USA) υποβλήθηκαν σε σειριακή αραίωση με διάλυμα αποκλεισμού (3% γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό [PBS]) για να επιτύχει το φάσμα 1:25-1:2000 για την πρώην και 6,25 έως 200 ng /ml για το τελευταίο. 50 μΙ αραιωμένου ορού ή του ελέγχου του αντισώματος προστέθηκαν στα επικαλυμμένα φρεάτια, που ακολουθείται από επώαση για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από έκπλυση με PBS που περιείχε 0,05% Tween 20 (PBST). Horse κοκκινωπό υπεροξείδιο (HRP) αντίσωμα συζευγμένο γίδινο αντι-ποντικού (115-035-062, Jackson ImmunoResearch Laboratories) σε 1:1000 αραίωση σε διάλυμα αποκλεισμού στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, ακολουθούμενη από την προσθήκη του υποστρώματος υπεροξειδάσης (ΤΜΒ 2- Συστατικό Μικροβυθισμάτων υποστρώματος υπεροξειδάσης Kit, 50-76-00, KPL, Gaithersburg, MD, USA) για την ανάπτυξη χρώματος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση Α450 των πλακών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Vmax Kinetic ELISA Απορρόφηση Microplate Reader, 97059 – 546, VWR Corp., Radnor, ΡΑ, USA). επίπεδα της αυξητικής ορμόνης στον ορό ποντικιού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το αυξητικής ορμόνης (GH) κιτ ELISA (M0934, Biotang Inc., CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή ως εξής. Οι οροί αραιώθηκαν 2 φορές με μέσο RPMI1640, και τα τυποποιημένα διαλύματα παρασκευάστηκαν για τη περιοχή συγκέντρωσης 0,3125 έως 100 ng /ml. Τα πρότυπα και τα δείγματα προστέθηκαν στο παρέχεται πλάκα ELISA, το οποίο επωάστηκε στους 37 ° C για 40 λεπτά και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Κάθε φρεάτιο προστέθηκε στη συνέχεια με 50 μΙ νερού και 50 μΙ βιοτινυλιωμένου αντισώματος αντι-GH, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 20 λεπτά. Μετά την πλύση, 100 μΐ στρεπταβιδίνης συζευγμένης με HRP προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για 10 λεπτά. Μετά από μια άλλη πλύση, 100 μΐ διαλύματος υποστρώματος HRP προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, επωάζονται στους 37 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από την προσθήκη 100 μΙ διαλύματος τερματισμού. Η απορρόφηση Α450 των πλακών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλακός VMax.

Για την ανάλυση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, μονοκύτταρους αιωρήματα παρασκευάστηκαν από συγκομίζονται σπλήνες ποντικού και επωάζονται με 5 μl /ml αντισώματος Ρογ υποδοχέα (14- 0161-85, eBiosciences, San Diego, CA, USA) για τον αποκλεισμό επί 20 λεπτά. Μετά από μία έκπλυση με διάλυμα χρώσης (PBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού [BSA]), επωάστηκαν με 0.3 μλ /κ.εκ αρουραίου αντι-ποντικού CD4 (550728, BD-Pharmingen, San Jose, CA, USA) ή CD8α ( 550281, BD-Pharmingen αντίσωμα, ή αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (559073, BD-Pharmingen) στους 4 ° C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από πλύση με διάλυμα χρώσης για τρεις φορές. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 4 μΐ /πιΐ Alexa 488- δευτερογενές αντίσωμα αντι-αρουραίου συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας (A11006, Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) στους 4 ° C για 20 λεπτά. Μετά από έκπλυση με διάλυμα χρώσης για τρεις φορές, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS (FACSCalibur, Βϋ Biosciences, San Jose, CA, USA) ή κύτταρο Analyzer εξοπλισμένο με μία μονάδα οπτικών φίλτρων για την ανίχνευση FITC για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των δεικτών των κυττάρων (Cellometer Vision, Nexcelom Bioscience, Lawrence, ΜΑ, USA). Τα δεδομένα που δημιουργούνται από FACS και Cellometer Vision αναλύθηκαν και ποσοτικοποιείται με λογισμικό FlowJo (TreeStar, Inc. Ashland, OR, USA) και FCS Express (de novo λογισμικό, Los Angeles, CA, USA), αντίστοιχα.

Η στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές στην ποσότητα διανομής (π.χ. το μέγεθος του όγκου, η ένταση βιοφωταύγειας, αναλογία CD8 /CD4) μεταξύ των ομάδων μελέτης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το παραμετρικό μη ζευγαρωμένο t τεστ. Για προκλινικές μελέτες, το τελικό σημείο ήταν η συνολική επιβίωση, ορίζεται ως ο χρόνος μέχρι την νοσηρότητα ποντίκι σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης ζώο. Ποντίκια ζωντανοί στο τέλος της μελέτης είχαν λογοκριθεί κατά την ημερομηνία αυτή. Η μέθοδος Kaplan-Meier και Mantel-Cox logrank-test εκτελέστηκαν για να συγκρίνουν τα ποσοστά επιβίωσης των ομάδων ποντικού. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε στο

P

-τιμή & lt? 0,05. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε ως το μικρότερο χρόνο επιβίωσης για τα οποία η λειτουργία επιζώντων έφθασε το 50%. Οι υπολογισμοί έγιναν με GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

δραστηριότητα Δημοσιογράφος της ffLuc-eGFP-επισημασμένο όγκους ποντικών είναι ασυνεπής σε ανοσοεπαρκή συγγενή ποντίκια

Η υποδορίως μεταμοσχευθεί Lewis του πνεύμονα (LLC) είναι ένας καλά χαρακτηρισμένο μεταστατικό μοντέλο που έχει πρόσφατα αξιοποιηθεί σε διάφορες προκλινικές μελέτες υψηλού προφίλ [22] – [24]. Εμείς ανακτηθεί πρόσφατα αρχειοθετημένα LLC ιστού ποτέ προσαρμοστεί σε καλλιέργεια κυττάρων, και έδειξε ότι μετά την μεταμόσχευση και εκτομή μετάσταση συνέβη με πολύ μικρή καθυστέρηση στο & gt? 90% των συγγενών ποντικών WT C57BL /6 υποδοχής [8]. Εδώ επισημαίνονται LLC με ffLuc-eGFP-κωδικοποιημένα lentivirus

ex vivo

[10]. Από ιική μεταγωγή αποτελέσματα στον πληθυσμό ετερογενών κυττάρων [25], υποβάλλουμε αυτό το σημασμένο όγκου σε

in vivo

ποδηλασία να καταστούν ομοιόμορφα επισημασμένο [8], [26]. Σε συντομία, ποντίκια που φέρουν μεταμοσχευμένους όγκους παρακολουθούνται για μετάσταση, και μεταστατικών οζιδίων θα συγκομιστούν για υποδόρια μεταμόσχευση να κινήσει τον επόμενο κύκλο. Δεδομένου ότι κάθε οζίδιο προήλθε από ένα μόνο κύτταρο, ο όγκος που προέρχεται από αυτό είναι πιθανώς κλωνική. Ως εκ τούτου, η ομοιογένεια θα ενισχυθεί μέσα από κάθε κύκλο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, μετά υποδόρια μεταμόσχευση και εκτομή του επισημασμένου LLC σε πέντε ποντίκια, προκύπτουν μεταστάσεις ανιχνεύθηκαν εύκολα με

in vivo

βιοφωταύγειας απεικόνισης (BL). Σε αυτό το απόσπασμα, αν και οι όγκοι αυξήθηκαν σε όλους τους κεντρικούς υπολογιστές, μεταστάσεις ανιχνεύθηκαν σε μόνο μία (# 160 στην Εικ. 1Α, κάτω πίνακας). Εμείς συγκομίζονται πνεύμονες από εκείνη ποντικού και εξετάστηκε με

ex vivo

απεικόνισης (Σχ. 1Β, άνω πίνακας). Η ανομοιόμορφα κατανεμημένη ένταση BL αντανακλούσε την ετερογένεια των μετατραπέντων κυττάρων σε πρωτογενή όγκο (Σχ. 1Β, άνω πίνακας). Εμείς που συλλέγονται από ποντίκια υποδοχής τρεις μεμονωμένες καλά σημασμένο με μεταστάσεις στους πνεύμονες, θεωρείται ότι είναι κλωνική, την κατανομή τους σε πέντε κομμάτια για μεταμόσχευση σε πέντε C57BL /6 ποντίκια. Επισημασμένα πνευμονικά οζίδια από εκείνη ποντικού συλλέχθηκαν και μεταμοσχεύθηκαν σε άλλα πέντε ποντικούς C57BL /6? Ωστόσο, αυτοί οι όγκοι στη συνέχεια, αυξήθηκε πολύ αργά και /ή δεν παρουσίασαν ανιχνεύσιμη δραστικότητα ανταποκριτή (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η δραστηριότητα ανταποκριτή στα επισημασμένα κύτταρα δεν μπορούσε να διατηρηθεί σταθερά πάνω από περάσματα σε συγγενικά ποντίκια ανοσοεπαρκείς, ακόμη και μετά από κλωνική επιλογή.

Α, κύτταρα ποντικού Lewis του πνεύμονα (LLC) μολύνθηκαν με ffLuc-eGFP εκφράζουν lentivirus

ex vivo

, και υποδορίως μεταμοσχευθεί σε πέντε συγγενικά αλμπίνο C57BL /6 (c-Brd) ποντίκια (# 160-164). δραστηριότητα Reporter παρακολουθήθηκε με BL απεικόνιση της αύξησης υποδόριου όγκου (σώμα) και πνευμονική μετάσταση (στήθος). Την ημέρα 15 μετά τον εμβολιασμό, ένα μεταστατικό BL σήμα βρέθηκε σε ένα από τα ποντίκια (# 160 στο κάτω πάνελ). Β, Ο πνεύμονας συλλέχθηκε από # 160, και ένα ενιαίο λαμπερό μεταστατικό οζίδιο επιλέγονται χρησιμοποιώντας

ex vivo

απεικόνισης (άνω πάνελ) μεταμοσχεύθηκε σε πέντε c-Brd ποντικών στην δεύτερη δίοδο. αποτελέσματα απεικόνισης έδειξαν ότι η δραστηριότητα δημοσιογράφος δεν θα μπορούσε να διατηρηθεί σταθερά στα προκύπτοντα ψηλαφητών όγκων (κάτω πάνελ).

Η

Για να προσδιορίσετε αν η συνέπεια δημοσιογράφος εξαρτάται από τον τύπο του όγκου, επεκτείναμε την ανάλυσή μας για το μελάνωμα ποντικιού. Μια ΕΡΑ

Q61K μετασχηματισμένα, p19

ΤΑΠ-ανεπάρκεια μελανοκυτταρικούς κυτταρική γραμμή [15], [16] σημάνθηκε χρησιμοποιώντας τον φακοϊό ffLuc-eGFP και μεταμοσχεύονται υποδορίως σε συγγενικά ποντίκια με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα. Μετά την εκτομή επιλέχθηκε ένας υψηλής BL πνευμονικών όζων για υποδόρια μεταμόσχευση σε δύο ποντίκια (Σχ. S1A, αριστερό πάνελ). Και οι δύο όγκοι παρουσίασαν σημαντική μείωση σε κανονικοποιημένη δραστηριότητα BL κατά την διάρκεια της ανάπτυξης υποδόρια (Σχ. S1A, δεξιά πάνελ). Εμείς επιβεβαιώνονται αυτά τα αποτελέσματα σε δύο άλλα μοντέλα. κύτταρα μελανώματος που συλλέγονται απευθείας από HGF-διαγονιδιακό /CDKN2A-knockout FVB /N ποντικού μετάγονται με το γονίδιο ffLuc-eGFP

ex vivo

, και μεταμοσχεύονται υποδορίως σε συγγενικά FVB N ποντίκια /. Ενώ όλοι οι όγκοι αυξήθηκαν, η ένταση BL ήταν είτε μειώνεται ή αυξάνεται πιο αργά (Εικ. S1B), και BL ένταση /αναλογία μεγέθους, που χρησιμεύει ως ένδειξη διατήρησης επισήμανση, μειώθηκε σε τρεις από τις πέντε όγκων. Σε ένα άλλο μοντέλο, ffLuc-ΕΟΡΡ- εκφράζουν ποντικού καρκίνος MVT-1 κύτταρα μαστού μεταμοσχεύονται ορθοτοπικά σε μαστικά λιπώδη σώματα συγγενή FVB /N ποντικούς έδειξαν επίσης φτωχή κατακράτηση του BL σηματοδότησης (βλέπε παρακάτω). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση ffLuc-eGFP σε αλλομοσχεύματα σε ανοσοεπαρκείς άγριου τύπου (WT) ποντίκια ασυνέπεια διατηρείται μεταξύ ποντικών ή /και περάσματα, ανεξάρτητα από τον τύπο του όγκου, το γενετικό υπόβαθρο ή την ιστοσελίδα μεταμόσχευση.

Δημιουργία ενός μοντέλου GEM ανοσολογικά ανεκτικός στη GFP και ανταποκριτές λουσιφεράσης

Τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι η ανοσογονικότητα των ξενοβιοτικών προϊόντων γονιδίου αναφοράς είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για ασυνέπεια τους στο πλαίσιο ενός πλήρως λειτουργικού ανοσοποιητικού συστήματος. Για να παρακάμψουν αυτό το ζήτημα, δημιουργήσαμε C57BL /6 και μοντέλα GEM FVB /Ν-με βάση την αναγνώριση πρωτεϊνών ffLuc και eGFP ως ανεξάρτητοι. Για υψηλή εξειδίκευση της, αλληλουχίες γονιδίων rGH [17] (Σχ. 2Α) χρησιμοποιήθηκαν για τη στόχευση της έκφρασης ενός γονιδίου σύντηξης ffLuc ΕΟΡΡ προς την πρόσθια υπόφυση του ποντικού, αποφεύγοντας έτσι παρεμβολές σηματοδότηση από τις πιο κοινές μεταστατικές θέσεις.

Α, Δομή του φορέα έκφρασης για την παραγωγή των Λαμπερό Head (GH) διαγονιδιακών ποντικών. Η έκφραση ενός πυγολαμπίδας γονιδίου σύντηξης της λουσιφεράσης-eGFP (ffLuc ΕΟΡΡ) είχε ως στόχο την υπόφυση πρόσθιο ποντικού με τη χρήση του προαγωγού ορμόνης ανάπτυξης αρουραίου (rGH) και γονιδιακές αλληλουχίες της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης, τα οποία περιλαμβάνουν μία θέση πολυαδενυλιώσεως (hGHpA)

20. Β, Οπτική μορφή έκφρασης του διαγονιδίου σε GH ποντικούς όπως οπτικοποιείται με BL απεικόνισης. δραστηριότητα Reporter ανιχνεύθηκε στο πρόσθιο λοβό της υπόφυσης και των δύο φύλων και τους όρχεις αρσενικών ποντικών. C, τα επίπεδα ορού της αυξητικής ορμόνης από ίδιας ηλικίας ποντίκια GH και φυσικού τύπου (WT) c-Brd ποντικών αξιολογήθηκε με ELISA (μέση ± SE). Αίμα τραβήχτηκε κατά την ίδια ώρα της ημέρας. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα κυκλοφορούντα επίπεδα της αυξητικής ορμόνης μεταξύ των ποντικών WT και GH βρέθηκαν. D, ffLuc-eGFP-σημασμένο όγκοι LLC υποδορίως μεταμοσχεύθηκαν σε WT, GH, και NOD-SCID ποντικούς. Αίμα τραβήχτηκε να προετοιμάσει ορών όταν οι όγκοι έφθασαν 500 mm

3, καθώς και τα επίπεδα ορού αντι-ΟΡΡ αντίσωμα αναλύθηκαν με ELISA. Τα επίπεδα αντι-ΟΡΡ αντίσωμα σε ποντικούς WT είναι σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στις GH και NOD-SCID ποντικούς (ρ & lt? 0.005), αλλά δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ αυτών σε GH και NOD-SCID ποντικούς (ρ = 0,19). Οι οροί από υγιή ποντίκια χωρίς τη μεταμόσχευση όγκου χρησίμευσαν ως μάρτυρες για να ορίσετε το σημείο μηδέν.

Η

Το πρόσθιο λοβό της υπόφυσης δεν είναι ένα ανοσοποιητικό προνομιακή τοποθεσία και αποτελεί έτσι μέρος της συστηματικής κυκλοφορίας [27]. Ως εκ τούτου, το διαγονίδιο-κωδικοποιημένες πρωτείνες ffLuc και eGFP εκφράζονται στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη συμμετέχουν στην επιλογή των Τ και Β κυττάρων και αναγνωρίζονται ως αυτο-αντιγόνα, με αποτέλεσμα δημιουργία ανοχής τους. Για τη μείωση της προσρόφησης του φωτός από χρωστική ουσία η διαγονιδίου ffLuc-eGFP αναπαρήχθη στο αλμπίνο C57BL /6F (c-Brd) υπόβαθρο. γραμμές ιδρυτής επιλέχθηκαν από κάθε στέλεχος που αποδεικνύεται Μέντελ κληρονομικότητα διαγονιδίου και φυσιολογική γονιμότητα. Σε προηγούμενη μελέτη μας, εντοπίσαμε το όριο ανίχνευσης του σήματος BL από το απεικόνισης ποντίκι vivo ήταν 1,5 × 10

5 φωτονίου /sec /rad [8]. Για να αποφευχθούν πιθανές συγχυτικές επιδράσεις που συνδέονται με την υψηλή έκφραση του διαγονιδίου, αυτές οι γραμμές ο ιδρυτής παρουσιάζουν χαμηλή αλλά σταθερή σήμα BL πάνω από το υπόβαθρο ανάγνωση (περίπου 2-6 × 10

5 φωτονίου /sec /rad) επιλέχθηκαν (Εικ. S2A). Συνεπής με στόχευση αναφερθεί για τον υποκινητή rGH [17], το σήμα BL ήταν εμφανής στο κεφάλι και όρχεις του διαγονιδιακές σειρές (Σχήμα 2Β).? μέτρια σήμα θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί σε θυρεοειδή αδένα, αλλά μόνο με τη χρήση

ex vivo

απεικόνισης (δεν φαίνεται). Τα επίπεδα BL στο σώμα της GH ποντικών είναι παρόμοιες με εκείνες στα ποντίκια WT, υποδεικνύοντας την υψηλή εξειδίκευση του διαγονιδίου (Εικ. S2B). Με βάση την ιστοσελίδα της δραστηριότητας δημοσιογράφος και rGH προαγωγός που χρησιμοποιείται για τη στόχευση αυτών των πολύτιμων λίθων έχουν βαπτιστεί «Glowing Head» (GH) ποντίκια.

Η πιθανή επίδραση της έκφρασης του διαγονιδίου στη λειτουργία της υπόφυσης αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τα κυκλοφορούντα επίπεδα της αυξητικής ορμόνης σε GH και WT C57BL /6 ποντίκια. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα της αυξητικής ορμόνης στον ορό δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των διαγονιδιακών και WT (Σχ. 2C), ανεξάρτητα από το φύλο, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση του διαγονιδίου ffLuc ΕΟΡΡ δεν επηρεάζει εμφανώς πρόσθια λειτουργία της υπόφυσης σε ποντικούς GH.

Για την εκτίμηση των ανοσολογικών συνέπειες της έκφρασης ρεπόρτερ, κύτταρα από ffLuc-eGFP-σημασμένο όγκοι LLC μεταμοσχεύθηκαν υποδορίως σε GH και WT C57BL /6 ποντίκια, καθώς επίσης και MHC-απαράμιλλη, ανοσοκατασταλμένους μη-παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) ποντικούς (BALB /c υπόβαθρο). Όταν οι όγκοι έφθασαν 500 mm

3 αίμα τραβήχτηκε και οι οροί ελέγχονται για την παρουσία αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. Ενώ φέρουν όγκους ποντικούς WT κατείχε σημαντικά επίπεδα κυκλοφορούντων αντι-ΟΡΡ αντίσωμα (Σχ. 2D και το Σχ. S2C), δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ φέρουν όγκο GH και NOD-SCID ποντικούς, η οποία είναι γνωστή ανίκανος να παράγει αντίσωμα (Σχ . S2C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ενώ ανοσογονική σε ποντικούς WT, ffLuc ΕΟΡΡ είναι ανεκτή και αναγνωρίζονται ως αυτο σε ποντικούς GH.

Ανάπτυξη και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν απεικονίσιμη ξενοβιοτικών ρεπόρτερ αλλοιώνονται με WT και NOD /SCID ποντίκια σε σύγκριση με GH ποντίκια

Για να ελέγξετε τη λειτουργία των ποντικών GH, θα εμφυτεύονται ffLuc-EGFP-επισημασμένο όγκους υποδόρια σε συγγενικά WT και GH ποντίκια. Αν και το μέγεθος του όγκου αυξήθηκε παρομοίως σε δύο τύπους ποντικών ξενιστών, BL αυξήσεις στους όγκους ήταν σημαντικά καθυστερημένη σε ποντικούς WT σε σύγκριση με GH ποντίκια (Σχ. S3A). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η χρήση GH ποντίκια ως αποδέκτες μοσχεύματος θα μπορούσε να βοηθήσει να διορθώσει τις ασυνέπειες που παρατηρούνται σε BL σήματα από την ένδειξη όγκοι μεταμοσχεύθηκαν σε ποντίκια με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα. Για να επικυρώσετε αυτό το σημείο, δοκιμάσαμε GH ποντίκι σε μια μελέτη μεγαλύτερης κλίμακας που αφορούν τόσο πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων. Μεταστατικό MVT-1 κύτταρα καρκίνου του μαστού [20], [28] μετήχθησαν με ffLuc ΕΟΡΡ φακοϊό και μεταμοσχεύθηκαν ορθοτοπικά σε μαστικά λιπώδη σώματα GH ή WT συγγενικά FVB /ποντικών δεκτών Ν. Τα σημασμένα κύτταρα MVT-1 εμφάνισαν σημαντική βελτίωση όσον αφορά BL σηματοδότηση την πάροδο του χρόνου, όταν μεταμοσχεύονται σε ποντικούς GH εναντίον WT, η οποία απέτυχε να διατηρήσει σηματοδότησης (Σχ. 3Α και υψηλότερες πάνελ του Σχ. S4A). Δεδομένου απεικονίσιμη ανταποκριτές είναι απαραίτητα για την παρακολούθηση της μετάστασης, υπεύθυνος για την συντριπτική πλειοψηφία των θανάτων ασθενή με καρκίνο, πρωτογενών όγκων MVT-1 αποκόπηκαν και ποντίκια υποδοχής ακολούθησε την πάροδο του χρόνου.