Αφηρημένο

καρκίνο του στομάχου (GC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο στον κόσμο. Ο ρόλος της αποακετυλάσης ιστόνης 4 (HDAC4) σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων και ιστών έχει ταυτοποιηθεί. Ωστόσο, βιολογικούς ρόλους της στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) και στύπωμα western χρησιμοποιήθηκαν για να αναλυθεί η έκφραση του HDAC4 στα κλινικά δείγματα. siRNA και υπερέκφραση HDAC4 και siRNA ρ21 χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη λειτουργικές επιδράσεις σε έναν πολλαπλασιασμό, ένας σχηματισμός αποικίας, ένας 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ) δοκιμασία και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), του κυτταρικού κύκλου, τα ποσοστά των κυττάρων απόπτωσης, και autophagy δοκιμασίες. HDAC4 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και διάφορες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Ο πολλαπλασιασμός, αποικία ικανότητα σχηματισμού και το επίπεδο ATP ενισχύθηκαν σε HDAC4 υπερέκφραση κύτταρα SGC-7901, αλλά αναστέλλεται HDAC4 νοκ ντάουν SGC-7901 κύτταρα. HDAC4 νοκ ντάουν οδήγησε στη σύλληψη των κυττάρων G0 /G1 φάση και προκάλεσε την απόπτωση και την αύξηση των ROS. Επιπλέον, HDAC4 βρέθηκε να αναστέλλει την έκφραση ρ21 σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα SGC-7901. p21 νοκ ντάουν εξασθενεί δραματικά την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, προώθηση κυτταρικής απόπτωσης και αυτοφαγία up-ρύθμιση σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα. Έχουμε αποδείξει ότι HDAC4 προωθεί γαστρικό καρκινικό κύτταρο εξέλιξη διαμεσολαβείται μέσω της καταστολής της p21. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια πειραματική βάση για την κατανόηση του μηχανισμού προ-καρκινικών της HDAC4 ως θεραπεία για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Kang Ζ-Η, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) δεακετυλάσης ιστόνης HDAC4 Προωθεί γαστρικός καρκίνος SGC-7901 κύτταρα Πρόοδος μέσω p21 καταστολή. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 12 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Υπουργείο Υγείας της επαρχίας Jilin (Νο 2012z119). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. χώρες της Ασίας και της Νότιας Αμερικής έχουν υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης της GC από τις Ηνωμένες Πολιτείες και τη Δυτική Ευρώπη [2]. Οι περισσότερες στοχευμένες θεραπείες επικεντρώνονται αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) που σχετίζονται με τις ενδείξεις στην προηγμένη GC. Ενώσεις έναντι νέων στόχων, όπως mTOR [3], (υποδοχέας αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων) c-Met [4], και HDACs, είναι επίσης υπό έρευνα.

ιστόνης αποακετυλάσης 4 (HDAC4), η οποία είναι μια κατηγορία ΙΙα HDAC, είναι γνωστό ότι υπάρχουν σε ξεχωριστά σύμπλοκα μεταγραφική συγκαταστολέας. HDAC4 είναι ένα κρίσιμο συστατικό της οδού απόκρισης βλάβη στο DNA που δρα μέσω 53BP1 [5]. HDAC4 καταστέλλει την έκφραση του εξαρτάται από κυκλίνη αναστολέα κινάσης ρ21 (επίσης γνωστή ως p21WAF1 /Cip1) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μέσω Sp1-εξαρτώμενη, ρ53-ανεξάρτητο μηχανισμό [6]. HDAC4 προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω της καταστολής της p21 [7]. Η αδρανοποίηση του HDAC4 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ή αναστολείς HDAC καταστέλλει νευρωνικό κυτταρικό θάνατο [8].

Ο ρόλος των HDAC4 σε συγκεκριμένα κύτταρα (HeLa (καρκίνος τραχήλου), U373 (γλοίωμα), OVCAR (ωοθηκών), T98G ( γλοίωμα), HCT116 (ορθοκολικό), ΝΗΑ (αστροκυτταρικές) και SKBR3 (μαστού)) και οι ιστοί (εγκεφαλικού φλοιού, των όρχεων, του προστάτη, και η επιδερμική στοιβάδα του δέρματος) γίνεται όλο και πιο ξεκάθαρο [9]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της HDAC4 σε γαστρικό καρκίνο δεν έχει προσδιοριστεί. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η πρώτη για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης HDAC4 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές. Δεύτερον, η επίδραση της HDAC4 επί κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου εξετάστηκε χρησιμοποιώντας υπερέκφραση και knockdown. Τέλος, διερευνήθηκε κατά πόσον HDAC4 είχε μια σχέση με το p21 στον καρκίνο του στομάχου κύτταρα. Μαζί, ο στόχος μας ήταν να βρούμε αν HDAC4 έχει βιολογική ρόλο στην ανάπτυξη GC και για τη διαλεύκανση του υποκείμενου μηχανισμού.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα ιστών

Είκοσι εννέα ζεύγη πρωτοβάθμια ιστούς του γαστρικού καρκινώματος και μακρινό φυσιολογικό γαστρικό ιστοί συλλέχθηκαν από ασθενείς (ηλικία: 58.46 ± 9,17 χρόνια), κατά τον συνήθη θεραπευτική χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα γαστρεντερικού Χειρουργικής, το πρώτο νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Jilin. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με ενημερωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Δεοντολογίας του Πρώτου Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Jilin και το Πανεπιστήμιο Jilin, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901, AGS, και BGC-823 και το κανονικό γαστρικό επιθήλιο κυτταρική σειρά GES ήταν που ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

Σταθερό επιμολυσμένη κυτταρική σειρά και παροδική επιμόλυνση

Το θραύσμα HDAC4 πλήρους μήκους ενισχύθηκε με PCR αντίστροφης μεταγραφής από κύτταρα ΓΕΣ χρησιμοποιώντας τους ειδικούς εκκινητές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10] και εισήχθη εντός των θέσεων BamH Ι και Hind III του pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Η pcDNA3.1 (+) – HDAC4 πλασμίδιο επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας για να επιβεβαιωθεί η απουσία των μεταλλάξεων. SGC-7901 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με τη pcDNA3.1 (+) – HDAC4 και pcDNA3.1 (+) – φορέων, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή για 24 ώρες χωρίς επιλογή με αντιβιοτικό. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 400 μg /ml G418 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) μέχρις ότου όλα τα κύτταρα στην καλλιέργεια μη επιμολυσμένα ελέγχου θανατώθηκαν.

SGC-7901 κύτταρα σπάρθηκαν στις 6 φρεατίων και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με μη-στόχευση siRNA ή siRNA που κατευθύνεται έναντι του ανθρώπινου HDAC4 ή ρ21 (Santa Cruz) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000, σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Πειράματα Stretch διεξήχθησαν σε κύτταρα 48 ή 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από ιστούς ή κύτταρα από το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ( Invitrogen), και αντίστροφη μεταγραφές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της Takara RNA PCR kit (Takara, Dalian, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Japan) σε ένα σύστημα PCR πραγματικού χρόνου (Eppendorf, Γερμανία). Η σχετική αναλογία έκφραση σε κάθε συνδεδεμένο όγκου και μη όγκου ιστό υπολογίσθηκε από την 2

-ΔΔCT μέθοδο.

καταμέτρηση κυττάρων kit-8 (CCK-8) δοκιμασία

Οι πολλαπλασιασμοί των SGC-7901 κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK-8 (Beyotime, Jiangsu, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνιστάται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων σε μια συγκέντρωση 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο. Στους 0, 1, 2 και 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση, ο προσδιορισμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 10 μl διαλύματος CCK8 σε κάθε φρεάτιο, και ακολούθησε επώαση στους 37 ° C για 2 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε με αναγνώστη ELISA σε μήκος κύματος 450 nm.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Εν συντομία, τα HDAC4 υπερεκφράζουν και -knockdown SGC-7901 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε τριπλούν (1000 κύτταρα ανά 60 mm δίσκο καλλιέργειας) και επωάστηκαν στους 37 ° C για δύο εβδομάδες για να σχηματίσει κλώνους. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% κρυσταλλικό ιώδες, 1% παραφορμαλδεΰδη και 20% μεθανόλη σε PBS) για 30 λεπτά. Οι αποικίες σε κάθε πλάκα μετρήθηκαν, και η επιβίωση των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό του αριθμού των αποικιών που επιβιώνουν στις πλάκες ελέγχου.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και απαλά επαναιωρήθηκαν σε εναιωρήματα μονών κυττάρων σε κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) ρυθμιστικό (PBS που περιέχει 2% FBS). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκαν σε RNase Α διάλυμα και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το εναιώρημα προστέθηκε σε 0,05 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Beyotime) που ακολουθείται από επώαση στους 4 ° C για 30 λεπτά και ανάλυση με τη χρήση FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

κυτταρικής απόπτωσης δοκιμασία

Propidiumiodide (ΡΙ, 1 μg /ml) και αννεξίνης V-FITC (1 μg /ml) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της κυτταρικής απόπτωσης. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν με ΡΙ και αννεξίνης V-FITC για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής FACS Calibur κυτταρόμετρο. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ενδοκυτταρικά επίπεδα αδενοσίνης 5′-τριφωσφορική (ΑΤΡ) δοκιμασία

ενδοκυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας βιοφωταύγεια [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε περίπου 15.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια αναμιγνύονται με ένα διάλυμα εργασίας ΑΤΡ μίγματος δοκιμασίας (Sigma), και η ποσότητα του φωτός που εκπέμπεται μετρήθηκε αμέσως με ένα φωτόμετρο (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, ΜΑ). Τα δεδομένα φωταύγειας κανονικοποιήθηκαν από την πρωτεΐνη του δείγματος ποσότητες (που μετράται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία BCA).

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μέτρηση

Παραγωγή της ενδοκυτταρικής ROS εξετάστηκε χρησιμοποιώντας 6-καρβοξυ-2 ‘ , 7’-διχλωροφθορεσκεϊνης διοξική (H

2DCFDA). Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 60-mm και αφήνονται να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μΜ H

2DCFDA για 30 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια συλλέγεται, και ο φθορισμός αναλύθηκε με ένα φασματόμετρο φθορισμού (Flex StationII 384, Molecular Devices) στα 485 nm (διέγερση) και 538 nm ( εκπομπή). Cellular επίπεδα οξειδωτικού εκφράστηκαν ως σχετική DCF φθορισμός ανά δείγμα ποσότητες πρωτεΐνης (μέθοδος BCA). Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 mM

N

-acetylcysteine ​​(NAC) πριν από την ανάλυση της παραγωγής ROS.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε IP ρυθμιστικού λύσης (Beyotime), μετουσιωμένο για 10 λεπτά στους 95 ° C, διάτμηση με μια σύριγγα ινσουλίνης, και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS /PAGE. Μετά ανοσοστύπωση, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε PBS /0.1% Tween-20 με 5% άπαχο ξηρό γάλα. Αντισώματα που κατευθύνονται έναντι HDAC4, ρ21, LC3, Beclin 1 ΑΤΟ 7, Κασπάση 3, 9, Bcl-2, Βαχ και αντι-β-ακτίνης ήταν όλα αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Ανίχνευση χημοφωτισμού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης ECL (Pierce, Rockford, IL, USA). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση Ποσότητα Ένα λογισμικό για να ληφθεί η αναλογία οπτική πυκνότητα πρωτεΐνης-στόχου για β-ακτίνης.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (Sigma- Aldrich) για 10 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 /PBS. Τα κύτταρα δεσμεύτηκαν με 1% BSA για 1 ώρα, και ακολούθησε επώαση για μια νύχτα στους 4 ° C με το αντίσωμα αντι-LC3, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (Beyotime) για 1 ώρα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ? Sigma). Η απεικόνιση φθορισμού έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± S.E.M. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ή με t-test του Student μεταξύ των δύο ομάδων με τη χρήση GraphPad Prism 5 στατιστικό λογισμικό.

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

έκφραση HDAC4 ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές

Κατ ‘αρχάς, αναλυθεί έκφραση HDAC4 σε είκοσι εννέα ζεύγη γαστρικό καρκίνο και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου με ανάλυση qRT-PCR και κηλίδος western. Βρήκαμε ότι HDAC4 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε γαστρικό ιστό καρκινώματος (Σχήματα 1Α, Β και C,

** Ρ

& lt? 0,01,

*** P

& lt? 0.001). Επιπλέον, αρκετές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου αναλύθηκαν επίσης. Παρατηρήσαμε υψηλότερη έκφραση του HDAC4 σε τρεις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (AGS, BGC-823 και SGC-7901), σε σύγκριση με ένα φυσιολογικό γαστρικό επιθήλιο κυτταρική γραμμή (ΓΕΣ) (Σχήματα 1D και Ε,

* Ρ

& lt ? 0,05,

** P

& lt? 0,01). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση HDAC4 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και στις δύο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές.

Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης HDAC4 αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) και στύπωμα western σε φυσιολογικούς ιστούς (NOR) ή γαστρικό καρκινικούς ιστούς (GC) (Α) και (Β) (n = 29). Η πυκνομετρική ανάλυση των HDAC4 στο Σχ. 1Β (C). Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης HDAC4 αναλύθηκαν σε φυσιολογικά κύτταρα γαστρικό επιθήλιο (κύτταρα GES) και διάφορες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων AGS, BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα (D) και (Ε) (n = 4). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± S.E.M.

* P & lt?

0.05,

** P & lt?

0.01,

*** P & lt?.

0.001

Η

Η έκφραση HDAC4 ήταν επιτυχία κατάντη ή up-ρυθμίζεται με SGC-7901 κύτταρα

φορέα έκφρασης

ένα pcDNA3.1 (+) χρησιμοποιήθηκε για να υπερεκφράζουν HDAC4 στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα, προκειμένου να εξετάσει την αποτελεσματικότητά της ως ρυθμιστής ανάπτυξης. Μετά σταθερή επιμόλυνση, η έκφραση των επιπέδων HDAC4 mRNA ήταν πιο άφθονο στον pcDNA3.1 (+) – HDAC4 κύτταρα σε σχέση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα ή αρνητικό έλεγχο (NC) SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 2Α,

** * Ρ

& lt?. 0.001), η οποία ήταν σύμφωνη με αποτέλεσμα της ανάλυσης κηλίδος western (Σχήμα 2Β)

έκφραση HDAC4 προσδιορίστηκε σε SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (NC) ή HDAC4 (Α ) και (Β). έκφραση HDAC4 προσδιορίστηκε σε SGC 7901-κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης HDAC4 (si-HDAC4) ή ως κωδικοποιημένο siRNA (si-NC) με qRT-PCR και Western Blot (Γ) και (Δ) (n = 4). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± S.E.M.

*** Ρ & lt?.

0.001

Η

Για την αξιολόγηση της γονιδιακής σίγησης αποτελεσματικότητα της ανθρώπινης HDAC4-siRNA, η έκταση της έκφρασης πρωτεΐνης HDAC4 μετρήθηκε μετά HDAC4-siRNA επιμόλυνση και ένα περίοδο επώασης 48 ωρών σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή SGC-7901. Real-time PCR ανάλυση έδειξε ότι η μόλυνση HDAC4 siRNA είχε ως αποτέλεσμα 36.3% knockdown των επιπέδων HDAC4 mRNA (Σχήμα 2C,

*** P

& lt? 0.001). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η πρωτεΐνη HDAC4 ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 2D), σε συνέπεια με τη μείωση του mRNA της. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι HDAC4 siRNA θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά την ενδογενή έκφραση HDAC4.

HDAC4 προωθείται κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της HDAC4 στην κυτταρική ανάπτυξη. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας kit-8 (CCK-8) στα χρονικά σημεία των 24, 48 και 72 ώρες. Οι καμπύλες ανάπτυξης έδειξαν ότι όταν HDAC4 ήταν υπερέκφραση σε SGC-7901 κύτταρα, η ανάπτυξη των κυττάρων αυξήθηκε κατά 1,5 φορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου την ημέρα 3 (Εικόνα 3Α,

* Ρ

& lt? 0,05,

∧∧P

& lt? 0,01). Επιπλέον, η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας που εμφανίζεται μια δραματική αύξηση κατά 2 φορές σε αριθμό αποικιών όταν SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με το pcDNA3.1 (+) – HDAC4 σχέση με την ομάδα NC (Σχήματα 3Β και C,

** P

& lt?. 0.01)

Η καμπύλη ανάπτυξης (

* P & lt?

0,05 και

∧∧P & lt?

0,01 σε σύγκριση με την ομάδα NC) (Α), σχηματισμός κλώνος (Β) και (C) και το σχετικό επίπεδο ΑΤΡ και παραγωγή ROS (G) σε SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο pcDNA3.1 (+) – φορέα (NC) ή HDAC4. Η καμπύλη ανάπτυξης (

∧P & lt?

0.05 σε σύγκριση με την ομάδα si-NC) (D), σχηματισμός κλώνος (Ε) και (F) σε SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης HDAC4 (SI-HDAC4) ή με τα ανακατωμένα ολιγο siRNA (si-NC). Το αποτέλεσμα του αντιοξειδωτικού

N

-acetylcysteine ​​(NAC) σε σχετικό επίπεδο ΑΤΡ και παραγωγή ROS σε SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με SI-NC ή σι-HDAC4 (H). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± S.E.M.

* P & lt?

0.05,

** P & lt?

0.01,

∧P & lt?

0.05,

∧∧P & lt?.

0.01

Θα εξεταστούν επίσης τα αποτελέσματα της HDAC4 ρύθμιση προς τα κάτω στην SGC-7901 κύτταρα. Η δοκιμασία δοκιμασία και ο σχηματισμός αποικίας CCK-8 έδειξε ότι η HDAC4 κάτω ρύθμιση κατέστειλε την ικανότητα πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3D,

∧P

& lt? 0,05) και οι αριθμοί σχηματισμό αποικιών της ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Εικόνες 3Ε και F,

** P

& lt? 0,01). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι HDAC4 θα μπορούσε να είναι ένας αυξητικός παράγοντας στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα.

HDAC4 αυξημένα επίπεδα ΑΤΡ και μειωμένη παραγωγή ROS

Μια αύξηση των επιπέδων ΑΤΡ σε HDAC4 κύτταρα που υπερεκφράζουν ήταν συγκριτικά με τα NC SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 3G,

* P

& lt? 0,05). Επιπλέον, το επίπεδο ATP μειώθηκε σε HDAC4 νοκ ντάουν κύτταρα (Σχήμα 3Η,

* P

& lt? 0,05).

Επειδή ενδοκυτταρική παραγωγή ROS μπορεί να σχετίζεται με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, θα εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον HDAC4 θα μπορούσε να τονώσει την παραγωγή ROS σε SGC-7901 κύτταρα. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι μια σημαντική μείωση της παραγωγής ROS παρατηρήθηκε σε pcDNA3.1 (+) – HDAC4 SGC-7901 κυττάρων σε σύγκριση με NC SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 3G,

∧P

& lt? 0,05). Εν τω μεταξύ, αποσιώπηση των HDAC4 ενεργοποιείται δυναμικά γενιά ROS στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Σχήμα 3Η,

** P

& lt? 0,01). Μπλόκο της παραγωγής ROS, χρησιμοποιώντας την αντιοξειδωτική NAC παρεμπόδισε σημαντικά την παραγωγή ROS (Σχήμα 3Η,

∧P

& lt? 0,05). Αυτό το μπλοκάρισμα της παραγωγής ROS από την προεπεξεργασία των κυττάρων με NAC επίσης εμπόδισε σημαντικά την απώλεια ΑΤΡ στο HDAC4 siRNA-ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Σχήμα 3Η,

∧P

& lt? 0,05).

κάτω έκφραση -regulated HDAC4 συνελήφθη κύτταρα σε G0 /G1 φάση

Η ρύθμιση προς τα κάτω της HDAC4 παρουσίασαν μια σαφή αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στον /G1 φάση G0 (78,74% σε σύγκριση με 49,92% στο NC-siRNA ομάδα). Υπήρχε επίσης μια αντίστοιχη μείωση του αριθμού των κυττάρων στη φάση S (12,94% σε σύγκριση με το 34,61% στην ομάδα NC-siRNA) (Σχήμα 4Α). Τα αποτελέσματα της διανομής ποσοτικοποίηση του κυτταρικού κύκλου έχουν δείξει ότι HDAC4 νοκ ντάουν σημαντικά προκαλείται από SGC-7901 κύτταρα G0 /G1 σύλληψη και αναστολή φάγων S (Σχήμα 4Β,

* P

& lt? 0,05,

** P

& lt? 0,01). Ως εκ τούτου, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το επίπεδο HDAC4 θα μπορούσε να ρυθμίσει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απεικονίζεται εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου από SGC-7901 κυττάρων μετά knockdown του HDAC4 (Α) και τα προφίλ κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν για την ποσοτικοποίηση των κυττάρων κατανομή του κύκλου (Β). Οι SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο ελέγχου (si-NC) ή ολίγο HDAC4 siRNA (si-HDAC4) απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC /ΡΙ (C). Έκφραση των θετικών και των αρνητικών αποπτωτικών πρωτεϊνών και των κασπασών 3 και 9 αναλύθηκαν με western blot (D). Τα κύτταρα ανοσοχρώση με αντισώματα αντι-LC3 (FITC, πράσινο) και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε) και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία (Ε). Ανάλυση κηλίδας Western των ATG7, Beclin 1 και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης LC3 σε SGC 7901-κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο ελέγχου (si-NC) ή ολίγο HDAC4 siRNA (si-HDAC4) κατεργάζεται με ή όχι με 3-ΜΑ (F). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± S.E.M.

* P & lt?

0.05,

** P & lt?.

0.01

Η

Η κάτω-ρυθμίζονται HDAC4 έκφραση που προκαλείται απόπτωση και αυτοφαγία

Για να μελετήσουμε αν η κάτω-ρυθμιζόμενη HDAC4 επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης ήταν συνδεδεμένη στην κυτταρική απόπτωση, η επίδραση του κάτω ρυθμισμένα HDAC4 στην κυτταρική απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ. Παρατηρήθηκε ότι η απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα NC-siRNA (Σχήμα 4C). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω την επαγωγή απόπτωσης μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 και 9 με κηλίδα western. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω HDAC4 αυξημένη διάσπαση των κασπασών-3 και 9 σύγκριση με την ομάδα NC-siRNA. Η έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και το προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax επίσης ποσοτικά. Ο λόγος Bax /Bcl-2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε HDAC4 siRNA-ΓΓΕ-7901 κύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα NC-siRNA (Σχήμα 5D).

Η έκφραση της ρ21 αναλύθηκε με κηλίδα western σε ΓΓΕ-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο pcDNA3.1 (+) – φορέα (NC) ή HDAC4 και ομελέτα ελέγχου siRNA (si-NC) ή HDAC4 siRNA ολίγο (si-HDAC4) αντίστοιχα (Α). Το επίπεδο του mRNA p21 αναλύθηκε με qRT-PCR σε SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με SI-NC, si-HDAC4 μόνη ή συνδυασμό με siRNA p21 (si-p21) (Β). Η καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 δοκιμασίας (

* Ρ & lt?

0.05 σε σύγκριση με την ομάδα si-NC,

∧∧P & lt?

0,01 σε σύγκριση με SI-HDAC4 ομάδα) (Γ) . Τα σχετικά επίπεδα ΑΤΡ και παραγωγή ROS (D). Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (E, F). Η απόπτωση προσδιορίστηκε με κηλίδα western (G) και κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC /ΡΙ (H) αντιστοίχως. Autophagy αξιολογήθηκε με ανοσοφθορισμό (Ι) και στύπωμα Western (J) αντίστοιχα SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με SI-NC, si-HDAC4 μόνη ή συνδυασμό με si-p21. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± S.E.M.

* P & lt?

0.05.

** P & lt?

0.01,

*** P & lt?.

0.001

Η

Για να διερευνηθεί κατά πόσο τα κάτω-ρυθμίζονται HDAC4 προκαλείται από αυτοφαγία στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα, που εξέτασε για πρώτη φορά την ενδοκυτταρική εντόπιση της LC3 σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα με ανάλυση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας φθορίζοντα αντισώματα για LC3. Η συγκεκριμένη κατανομή στικτή ενδογενούς LC3 παρατηρήθηκαν ως κουκίδες διάστικτη πράσινου φθορισμού σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας NC-siRNA (Σχήμα 4Ε), υποδεικνύοντας ότι autophagy προκλήθηκε ως μέσο επιβίωσης. Η υποκυτταρική κατανομή της LC3 σημαντικά αναστέλλεται από την αυτοφαγία ειδικός αναστολέας 3-MA στην HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 4Ε). Στη συνέχεια, οι σχετικές αυτοφαγία πρωτεΐνες ATG7, Beclin 1 και η αναλογία των LC3-ΙΙ LC3-Ι αναλύθηκαν με western blot. Παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του ATG7, Beclin 1 και LC3-ΙΙ ήταν όλα αυξήθηκαν σημαντικά σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα NC-siRNA (Σχήμα 4F). Η ATG7, Beclin 1 και η αναλογία του LC3-ΙΙ LC3-Ι μειώθηκαν σημαντικά σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3-ΜΑ σε σχέση με την ομάδα NC-siRNA (Εικόνα 4F).

η έκφραση HDAC4 κάτω ρυθμισμένα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω της p21 πάνω ρύθμιση

Επειδή η θεραπεία των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων με αναστολείς HDAC οδηγεί με συνέπεια να τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης p21, έναν αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, που είναι ένα καθιερωμένη στόχος των αναστολέων HDAC [6], [7], [12], επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν η υπερέκφραση ή knockdown του HDAC4 θα μπορούσε να επηρεάσει ρύθμιση p21 και να εικάζουν το μηχανισμό της HDAC4 μεσολάβηση προώθηση της ανάπτυξης στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, ο προς τα πάνω ρύθμιση του HDAC4 οδήγησε δραματικά με την μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ρ21. Σε αντίθεση, HDAC4 κάτω ρύθμιση οδήγησε στην αυξημένη έκφραση p21 (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια εξετάστηκε αν p21 knockdown θα μπορούσε να επηρεάσει την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα στα οποία έχει διαγραφεί HDAC4. Οι SGC-7901 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με siRNA HDAC4 και siRNA p21. Το επίπεδο του mRNA p21 ήταν σημαντικά μειωμένη σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κυττάρων μετά από p21 νοκ ντάουν (Σχήμα 5Β,

** P

& lt? 0,01,

*** P

& lt? 0.001). p21 νοκ ντάουν δραματικά εξασθενημένη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 5C,

* P

& lt? 0,05, ∧∧

P

& lt? 0,01). Το επίπεδο ΑΤΡ αυξήθηκε, αλλά ενδοκυτταρική παραγωγή ROS μειώθηκε στην ομάδα siRNA-p21-HDAC4 συγκριτικά με την ομάδα siRNA HDAC4 (Σχήμα 5D,

* Ρ

& lt? 0,05,

** Ρ

& lt ? 0,01). p21 κάτω ρύθμιση σημαντικά εξασθενημένο G0 /G1 σύλληψη και την αναστολή φάγοι S σε HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα (Σχήματα 5Ε και F,

* P

& lt? 0,05). Η ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι η ποσότητα του Bcl-2 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη, αλλά Bax ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα siRNA-p21-HDAC4 (Σχήμα 5G). Το κύτταρο απόπτωσης μειώθηκε σημαντικά σε siRNA-p21-HDAC4 SGC-7901 κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα siRNA HDAC4 (Εικόνα 5Η). Παρατηρήθηκε επίσης ότι p21 knockdown θα μπορούσε να σώσει την αυξημένη autophagy διακόπτονται φθορισμού κηλίδες (Σχήμα 5θ) και στην ATG 7, Beclin 1 και την έκφραση των πρωτεϊνών LC3II σε SGC 7901-κυττάρων που επάγεται από siRNA HDAC4 (Σχήμα 5J). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση του p21 θα μπορούσε να μιμούνται την επίδραση της HDAC4 υπερέκφραση και θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής στην HDAC4 μεσολάβηση SGC-7901 την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων.

Συζήτηση

Πολλά HDAC αναστολείς, τα οποία έχουν αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και διεγείρουν διαφοροποίηση ή απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, που ερευνώνται σε κλινικές δοκιμές είτε ως αντι-καρκινικοί παράγοντες ή σε συνδυασμό με άλλη θεραπεία [13]. Υψηλή έκφραση του HDAC1 /2 βρέθηκε σε ιστούς γαστρικό καρκίνωμα [14]. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι η έκφραση HDAC4 ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές

in vitro

. HDAC4 κάτω ρύθμιση σε SGC-7901 κύτταρα κατέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τους αριθμούς σχηματισμό αποικίας, συνελήφθη κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή απόπτωσης εξαρτάται από την ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 9, το οποίο είναι συνεπές με τις αντι-πολλαπλασιαστικές και προαποπτωτική επιδράσεις των αναστολέων HDAC σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [15] και με την προηγουμένως αναφερθείσα παρατήρηση ότι HDAC4 κάτω ρύθμιση μειώνει κλωνογόνο επιβίωση και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα HeLa [5]. Η επίδραση της proproliferative HDAC4 σε γαστρικό καρκίνο κυττάρων είναι σύμφωνο με αυτό που αναφέρθηκε προηγουμένως για τις HDACs κατηγορίας Ι, HDAC1, -2, και -3 [16]. Έτσι, με στόχο την αναστολή της δραστηριότητας HDAC4 μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Autophagy είναι ουσιαστικά ένα σύστημα πρωτεϊνικής αποδόμησης των ιδίων λυσοσώματα του κυττάρου. Μια ποικιλία των σημάτων του στρες, όπως η θρεπτική πείνα ή θεραπεία με διαφορετικές αντικαρκινικών παραγόντων, διεγείρουν τη διαδικασία αυτοφαγία [17]. Autophagy γενικά χαρακτηρίζεται από την παρουσία αυτοφαγοσώματα και την αύξηση διάσπαση LC3 [18]. Ο ρόλος της αυτοφαγία στη διαδικασία του κυτταρικού θανάτου είναι αμφιλεγόμενη, αλλά έχει επιβεβαιωθεί ότι αλληλοπαρεμβολές μεταξύ απόπτωσης και αυτοφαγία είναι απαραίτητη προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [19]. Στη μελέτη μας, η επαγωγή της αυτοφαγία στο HDAC4-siRNA SGC-7901 κυττάρων αποδεικνύεται από το σχέδιο στικτή της LC3 ανοσοχρώση και τη συσσώρευση των βιοχημικών πρωτεϊνών σήμα κατατεθέν της αυτοφαγία (ATG7, Beclin 1 και LC3) με ανάλυση Western blot. αναστολή αυτοφαγία από τον αναστολέα 3-ΜΑ εξασθενεί την επαγωγή αυτοφαγία στην HDAC4-siRNA SGC-7901 κύτταρα. Έτσι, εικάζουν autophagy συνέβη μπορεί να προστατεύσει SGC-7901 απόπτωση καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από HDAC4 knockdown.

πρωτεΐνη ρ21, επίσης γνωστή ως εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (CKD) αναστολέα 1, ρυθμίζει την εξέλιξη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου . ρ21 είναι συχνά κακή ρυθμίζονται σε ανθρώπινους καρκίνους, και μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκου ή ως ένα ογκογονίδιο [20]. Εκείνοι με ρ21-θετικών και p53-αρνητικών καρκίνοι έχουν σημαντικά υψηλότερες καμπύλες επιβίωσης σε γαστρικό καρκίνωμα [21], ενώ η απώλεια της έκφρασης p21 μαζί με την αυξημένη ανίχνευση ρ53 συνδέεται με κακή πρόγνωση και μειωμένη συνολική επιβίωση σε γαστρικό καρκίνο [22]. Συνεπής με αποτέλεσμα ότι η πρωτεΐνη ρ21 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στα γαστρικά καρκινικούς ιστούς [23], παρατηρήσαμε ότι HDAC4 προάγει γαστρική τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη, που προκαλείται από την καταστολή της ρ21 σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα, και συνοδεύεται από αύξηση της ATP επίπεδα και η καταστολή της παραγωγής ROS. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν p21 ήταν ένας σημαντικός μεσολαβητής για HDAC4 μεσολάβηση SGC-7901 την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, HDAC4 knockdown επάγεται σημαντικά την αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ρ21, ενώ HDAC4 υπερέκφραση μείωσε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης p21 με SGC-7901 κύτταρα. Τα δεδομένα αυτά υπονοείται ότι η p21 θα μπορούσε να είναι ένας μεταγενέστερος στόχος των HDAC4. Λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν τα κάτω ρύθμιση p21 θα μπορούσε να μιμηθεί την επίδραση της υπερέκφρασης HDAC4 επί SGC-7901 προαγωγή της κυτταρικής ανάπτυξης. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HDAC4 κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να προωθήσει SGC-7901 κυττάρων απόπτωσης με up-ρυθμίζουν την έκφραση του p21. ρ21 θα μπορούσε να είναι ένας καταστολέας όγκων στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου, η έκφραση των οποίων μπορεί να βοηθήσει στον έλεγχο μιας ποικιλίας κακοηθών συμπεριφορές του γαστρικού καρκίνου. Ωστόσο, η δυνητική σημασία της ρύθμισης HDAC4 της έκφρασης p21 πρέπει επίσης να εξεταστεί στο πλαίσιο ότι υπάρχουν πολλαπλές βασικούς παράγοντες και τα μονοπάτια που ενδεχομένως να ρυθμίζουν την έκφραση του p21 στον καρκίνο του στομάχου.

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας έχουν αποκάλυψαν ένα σημαντικό ρόλο για HDAC4 στον έλεγχο ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC-7901 ανάπτυξη μέσω της ρύθμισης του p21, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταβολή της έκφρασης ή /και της δραστηριότητας HDAC4 μπορεί να είναι ένα σημαντικό γεγονός κατά τη διάρκεια γαστρικού καρκίνου. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά προσδιορίζουν HDAC4 ως σημαντικός ρυθμιστής της πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκίνου μέσω της καταστολής της p21

in vitro

.