Αφηρημένο

Ιστορικό

Phyllanthus

είναι ένα παραδοσιακό φαρμακευτικό φυτό που έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων της ηπατίτιδας και του διαβήτη. Ο κύριος σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνήσει τις πιθανές κυτταροτοξικά αποτελέσματα της υδατικής και μεθανολικά εκχυλίσματα των τεσσάρων

Phyllanthus

είδη (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

και

P.watsonii

) εναντίον του μελανώματος του δέρματος και του προστάτη καρκινικά κύτταρα.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Phyllanthus

φυτό φαίνεται να έχουν κυτταροτοξικές ιδιότητες με το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωση (IC

50) τιμές των 150-300 μg /ml για το υδατικό εκχύλισμα και 50-150 μg /ml για μεθανολικού εκχυλίσματος που προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS αναγωγή. Σε σύγκριση, τα φυτικά εκχυλίσματα δεν δείχνουν οποιαδήποτε σημαντική κυτταροτοξικότητα σε φυσιολογικά ανθρώπινα δέρματος (CCD-1127Sk) και του προστάτη κύτταρα (RWPE-1). Τα εκχυλίσματα φάνηκε να δρουν προκαλώντας τον σχηματισμό ενός διαυγούς «σκάλα» κατακερματισμός των αποπτωτικών DNA σε πηκτή αγαρόζης, εμφανίζεται TUNEL-θετικών κυττάρων με μια ανύψωση της κασπάσης-3 και -7 δραστηριότητες. Το επίπεδο του γαλακτικού αφυδρογονάσης (LDH) ήταν χαμηλότερη από το 15% στο

Phyllanthus

αντιμετωπίζονται καρκινικά κύτταρα. Αυτά δείχνουν ότι

Phyllanthus

εκχυλίσματα έχουν την ικανότητα να επάγει απόπτωση με ελάχιστη νεκρωτική αποτελέσματα. Επιπλέον, η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι

Phyllanthus

προκάλεσε μια σύλληψη /G1-φάση Go στο PC-3 κύτταρα και διακοπή φάσης S σε κύτταρα MeWo και αυτά συνοδεύονταν από τη συσσώρευση κυττάρων στο Sub-G1 ( απόπτωση) φάση. Οι κυτταροτοξικές ιδιότητες μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των πολυφαινολικών ενώσεων όπως ελλαγιταννίνες, gallotannins, φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα που βρίσκονται τόσο στο εκχύλισμα νερό και μεθανόλη των φυτών.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Phyllanthus

φυτό ασκεί την επίδρασή αναστολή της ανάπτυξης του κατά επιλεκτικό τρόπο προς τα καρκινικά κύτταρα μέσω της διαφοροποίησης του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης μέσω ενεργοποίησης των κασπασών σε μελάνωμα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου,

Phyllanthus

μπορεί να προέρχονται για την ανάπτυξη ενός ισχυρού επαγωγής απόπτωσης αντικαρκινικός παράγοντας

Παράθεση:. Tang YQ, Jaganath ΙΒ, Sekaran SD (2010)

Phyllanthus

spp. Προκαλεί επιλεκτική ανάπτυξη Αναστολή της PC-3 και κύτταρα MeWo Human Cancer μέσω διαμόρφωσης του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή απόπτωσης. PLoS ONE 5 (9): e12644. doi: 10.1371 /journal.pone.0012644

Επιμέλεια: Niyaz Ahmed, του Πανεπιστημίου της Hyderabad, Ινδία

Ελήφθη: 25 Ιούν, 2010? Αποδεκτές: 17 του Αυγούστου 2010? Δημοσιεύθηκε: 8η Σεπτεμβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Μεταπτυχιακό Ερευνών Grant, Πανεπιστήμιο Malaya (UM PS183 /2009β) (www.um.edu.my) και της Μαλαισίας Γεωργικών και Ερευνητικό Ινστιτούτο Ανάπτυξης (MARDI) (53-02-03-1002) (www.mardi.gov .μου). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι ένα όνομα που δόθηκε στην ομάδα των ασθενειών που προκύπτουν από την ανεξέλεγκτη ανάπτυξη, εξάπλωση της μη φυσιολογικής κυτταρικής και μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο. Είναι εξαιρετικά δύσκολο να αντιμετωπιστούν λόγω της αρκετά διακριτές τάξεις των όγκων που εμφανίζουν διαφορετικές αποκρίσεις σε θεραπεία και δεν είναι όλες οι αντικαρκινικοί παράγοντες δίνουν αποτελεσματικά μια θετική απάντηση σε κάθε περίπτωση [1]. Μερικά από αυτά έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα, που συνοδεύεται από ανεπιθύμητα αποτελέσματα, όπως έμετος, ναυτία και αλωπεκία. Έτσι, αναποτελεσματικό αντικαρκινικών παραγόντων έχουν οδηγήσει σε υψηλά ποσοστά θνησιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο [2]. Το μελάνωμα είναι ένας τύπος καρκίνου του δέρματος που προκύπτει από μελανοκύτταρα, μια χρωστική ουσία που παράγει κύτταρο μαυρίσματος. Μελάνωμα συχνότητα και το ποσοστό θνησιμότητας της έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε ανοιχτόχρωμο δέρμα πληθυσμοί σε όλα τα μέρη του κόσμου, συμπεριλαμβανομένης της Αυστραλίας, των ΗΠΑ και του Ηνωμένου Βασιλείου [3] – [4]. Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μετά τον καρκίνο του πνεύμονα σε όλο τον κόσμο [3]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες για τόσο μελάνωμα και τον καρκίνο του προστάτη, και ως τέτοια έντονη έρευνα απαιτείται για τη λήψη νέων αντικαρκινικών παραγόντων για αυτούς τους καρκίνους.

Η υψηλή θνησιμότητα σε ασθενείς με καρκίνο έχει οδηγήσει πολλούς ερευνητές να πηγή για πιθανούς φυσικό προϊόν θεραπευτικές ενώσεις με βάση [2]. Φυτικά φυτά και τα φυτικά φάρμακα παράγωγα έχουν χρησιμοποιηθεί ως η πηγή του δυναμικού αντικαρκινικών παραγόντων σε παραδοσιακούς πολιτισμούς σε όλο τον κόσμο και γίνονται όλο και πιο δημοφιλής στη σύγχρονη κοινωνία [5]. Οι πιθανές φυσικές αντικαρκινικοί παράγοντες προϊόν προερχόμενο είναι γνωστό ότι διαθέτουν διάφορες βιοδραστικές ενώσεις όπως η ροσκοβιτίνη από κόκκινο ραπανάκι και φλαβοπιριδόλη από

Amoora rohituka

, ένα τροπικό δέντρο που έχει δείξει τεράστια αποτελέσματα στην θεραπεία των καρκίνων [6] – [8].

το φυτό του γένους

Phyllanthus

ανήκει στην οικογένεια

Euphorbiaceae

και έχει αναφερθεί ότι έχουν φαρμακολογικές δράσεις όπως αντι-ιική δράση κατά της ηπατίτιδας Β και των σχετικών ιούς ηπατίτιδας [9] – [12], αντι-βακτηριακή δραστηριότητα [13], [14], αντι-ηπατοτοξικά ή ήπατος-προστατευτική δραστηριότητα [15] – [19], καθώς και κατά του όγκου και αντι-καρκινογόνες ιδιότητες [16 ], [20]. Επιπλέον, έχει επίσης εκτεθεί ιδιότητες υπογλυκαιμίας [21], [22]. Αν και οι γένος φυτών

Phyllanthus

έχει αποδειχθεί ότι είναι ευεργετική για την ανθρώπινη υγεία, αλλά και την αποτελεσματικότητά της κατά του καρκίνου δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί.

Μία από τις προκλήσεις στη θεραπεία του καρκίνου είναι ότι ο καρκίνος έχει η ικανότητα να διαφεύγουν απόπτωση (ή κυτταρικών πρόγραμμα θανάτου) η οποία οδηγεί σε αναποτελεσματικότητα ως ένα κυτταροτοξικό φάρμακο για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα. Η αποπτωτική διεργασία είναι ένας σημαντικός μηχανισμός κυτταρικού θανάτου σε απόκριση κυτταροτοξικών θεραπεία και την επαγωγή του είναι ένα πολύ επιθυμητό τρόπο λειτουργίας για ένα αντικαρκινικό παράγοντα [23]. κυτταρικού κύκλου είναι μια διαδικασία που λειτουργεί ως κλειδί για τον έλεγχο της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού ενός κυττάρου. Η διατάραξη της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου, θα προκαλέσει μια ανισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου (απόπτωση), στη συνέχεια οδηγεί σε ανάπτυξη καρκίνου. Έτσι, κυτταρικού κύκλου θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως στόχος για αντικαρκινικός παράγοντας για την ανάσχεση ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και να τα κινεί να υποστούν απόπτωση [24]. Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των

Phyllanthus

εκχυλίσματα (υδατικά και μεθανόλη) στην αναστολή της ανάπτυξης κατά μελανώματος του δέρματος και κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε κυτταρικό κύκλο τους θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει τη λειτουργία της δραστηριότητάς τους. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιορίσει την κυτταροτοξική δράση του

Phyllanthus

εξάγει στον πολλαπλασιασμό του δέρματος και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα και επίσης να διερευνήσει τη σχέση αυτών των αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις με πιθανή απόπτωση και διαφοροποίηση κυτταρικού κύκλου.

Αποτελέσματα

Η κυτταροτοξική δράση του υδατικού και μεθανολικά εκχυλίσματα του

Phyllanthus

είδη

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του αργού υδατικά και μεθανολικά εκχυλίσματα των τεσσάρων διαφορετικά

Phyllanthus

είδη,

P.amarus, P.niruri, P, urinaria,

και

P.watsonii

, σε δύο ανθρώπινων καρκίνων (MeWo και PC-3) καθώς και κανονική (CCD-1127Sk και RWPE-1) κυτταρικές σειρές. Οι κυτταροτοξικές ιδιότητες της

Phyllanthus

εκχυλίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την MTS [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλο) -2Η -tetrazoliuminner αλάτι) δοκιμασία μείωσης. Η αρχή πίσω από αυτή τη δοκιμασία βασίζεται στην ικανότητα μείωση ενός διαλυτού άλατος τετραζολίου, με μιτοχονδριακή αφυδρογονάση ένζυμο των βιώσιμων κυττάρων, σε μία έγχρωμη διαλυτό προϊόν φορμαζάνης που μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά. Η ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) αξία καθορίστηκε από την κατασκευασμένη καμπύλη δόσης-απόκρισης και ρυθμίζεται ως παράμετρος για την κυτταροτοξικότητα.

Ο Πίνακας 1 δείχνει τη σύγκριση της IC

50 τιμές για τόσο ακατέργαστο υδατικά και μεθανολικά εκχυλίσματα των τεσσάρων

Phyllanthus

είδη τόσο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (MeWo και PC-3) και φυσιολογικά (CCD-1127Sk και RWPE-1). Αποτέλεσμα αποκαλύπτει την παρουσία των κυτταροτοξικών επιδράσεων της

Phyllanthus

είδη τόσο μελάνωμα του δέρματος και των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, όπου

προσδιορίστηκαν Phyllanthus

εκχυλίσματα το αντίστοιχο IC

50 αξίες της. Σε σύγκριση, το φυτό δεν έδειξαν καμία σημαντική κυτταροτοξική δράση σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα, ενώ οι τυπικές αντικαρκινικά φάρμακα (5’Fluorouracil και δοξορουβικίνη) έδειξαν ισχυρότερη κυτταροτοξική επίδραση από τα

Phyllanthus

εκχυλίσματα, αλλά εμφανίζει τοξικότητα σε κανονική κύτταρα (Πίνακας 1). Μεταξύ των τεσσάρων

Phyllanthus είδη

φυτών,

P.urinaria

έδειξε ισχυρότερη κυτταροτοξική δράση, ακολουθούμενο από

P.watsonii, P.niruri

και

P.amarus

. Επιπλέον, το IC

50 τιμές της μεθανόλης εκχυλίσματα

Phyllanthus

είδη ήταν αισθητά χαμηλότερες από τις υδατικά εκχυλίσματα και στις δύο καρκινικών κυττάρων υποδεικνύοντας ότι το εκχύλισμα μεθανόλης είναι περισσότερο κυτταροτοξικό από το υδατικό εκχύλισμα.

Προσδιορισμός των πολυφαινολών στο

Phyllanthus

είδος

η μεθανόλη και υδατοδιαλυτά εκχυλίσματα που λαμβάνονται από διάφορα είδη του

Phyllanthus

υποβλήθηκαν σε ανάλυση με HPLC (Υψηλής απόδοσης Υγρή Χρωματογραφία), σε συνδυασμό με σειρά φωτοδιόδων (PDA) και ανίχνευση MS-MS που επιτρέπει την αναγνώριση των ενώσεων πολυφαινόλης (Πίνακας 2). Δώδεκα κύρια ενώσεις ταυτοποιήθηκαν με βάση το χρόνο κατακράτησης, φάσματα UV, και τα φάσματα μητρική μάζα τους και δευτερεύοντα πρότυπα κατακερματισμού. Οι ενώσεις ανιχνεύθηκαν ήταν γαλλικό οξύ, galloylglucopyronside, digalloylglucopyronside, trigalloylglucopyronside, tetragalloylglucopyronoside, corilagen, geraniin, ρουτίνη, κουερσετίνη γλυκοζίτη, quercetin διγλυκοζίτη, quercetin ραμνοζίδιο και caffeolquinic οξύ.

Η

DNA κατακερματισμό

ένα από τα βιοχημικά χαρακτηριστικά στην αποπτωτική διεργασία είναι ο σχηματισμός του κατακερματισμού πυρηνικού DNA, η οποία δείχνει την παρουσία τυπικών θραυσμάτων DNA σκάλα του 180 – 200 ζεύγη βάσεων και πολλαπλάσια αυτής σε μια γέλη αγαρόζης. Αντίθετα, η τυχαία διάσπαση του DNA σε νεκρωτικά κύτταρα θα παράγουν ένα διάχυτο επίχρισμα κατά την ηλεκτροφόρηση του DNA. Ως εκ τούτου, το DNA μέθοδος ηλεκτροφόρηση γέλης χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η πιθανή λειτουργία του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από

Phyllanthus

εκχυλισμάτων. Το Σχήμα 1Α δείχνει την παρουσία θραυσμάτων DNA που παράγονται με κατεργασία των κυττάρων με MeWo

Phyllanthus

εκχυλίσματα και ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε με το πρότυπο φάρμακο (5’Fluorouracil) ως θετικός έλεγχος. Δεν σχηματισμός σκάλα παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτά τα φαινόμενα παρατηρήθηκαν επίσης σε PC-3 κυτταρική γραμμή και για τα δύο εκχυλίσματα όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Έτσι, αυτό δείχνει ότι και οι δύο εκχυλίσματα

Phyllanthus

ήταν ικανό να επάγει απόπτωση ή προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε MeWo και PC-3 κύτταρα σε απόκριση στην κυτταροτοξική δράση του

Phyllanthus

.

Διαδρομή 1 -4: υδατικό και Lane 6 έως 9: εκχυλίσματα μεθανόλης για

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

και

P.watsonii

, με τη σειρά. Διαδρομή 5 και 10: 1 δείκτης kb DNA, Λωρίδα 11: πρότυπο φάρμακο, όπου A) 5’Fluorouracil για MeWo και Β) Doxorubicin για PC-3 κύτταρα. Λωρίδα 12:. Ακατέργαστα κύτταρα

Η

δοκιμασία TUNEL και ευρετήριο αποπτωτικά

ΤΟΥΝΕΛ (τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση) δοκιμασία είναι μια τεχνική που να επιτρέπει την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων από την επισήμανση της ελεύθερης άκρο των αποπτωτικών DNA με ένα δείκτη που μπορεί να απεικονιστεί υπό οπτικό μικροσκόπιο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τα αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν ως καφέ χρώματος κύτταρα σε

Phyllanthus

εξάγει επεξεργασμένου MeWo (Σχήμα 2Α, κεφαλή βέλους) και PC-3 (Σχήμα 2Β, κεφαλή βέλους) τα καρκινικά κύτταρα, η εμφάνισή τους ήταν παρόμοια για αποπτωτικά κύτταρα που υπήρχαν στους θετικούς μάρτυρες, αποπτωτικά-επαγωγέα αντικαρκινικό φάρμακο (5’Fluorouracil και δοξορουβικίνη), ενώ τα βιώσιμα κύτταρα χρωματίστηκαν μπλε. Αυτό επιβεβαιώνει περαιτέρω ότι

Phyllanthus

εκχυλίσματα ικανό να επάγει απόπτωση σε μελάνωμα του δέρματος και κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Οι πληθυσμοί του κυτταρικού θανάτου μπορεί να υπολογιστεί και να εκφραστεί σε ένα μαθηματικό τρόπο, γνωστό ως αποπτωτικό δείκτη. Από το Σχήμα 2C, το ποσοστό κυτταρικού θανάτου (δείκτης αποπτωτικών) των επεξεργασμένων-MeWo και PC-3 κύτταρα σημαντικά αυξημένη έως και 50% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε 72 ώρες από την αγωγή με

Phyllanthus

εκχυλισμάτων. Επιπλέον, το ποσοστό των

Phyllanthus

εκχυλίσματα επάγεται αποπτωτικών κυττάρων ήταν κοντά στα αντικαρκινικά φάρμακα (5’Fluorouracil και δοξορουβικίνη) με μόνο το 8% διαφορά.

ανάλυση TUNEL του MeWo και PC-3 καρκινικών κυττάρων μετά από θεραπεία με το

Phyllanthus

εξάγει σε 100 × μεγέθυνση. TUNEL θετικά κύτταρα (αποπτωτικών) ήταν παρατηρήσιμα ως καφέ χρώση κύτταρα (κόκκινο βέλος) σε

Phyllanthus

Α εκχυλίσματα επεξεργασμένου) MeWo και Β) PC-3 κύτταρα και φυσιολογικά βιώσιμων κυττάρων λεκιάζουν ως μπλε χρώμα. Γ) Το γράφημα δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών δείκτη (%) των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων (

Phyllanthus

εκχυλίσματα και αντικαρκινικά φάρμακα) MeWo και τον καρκίνο κύτταρα PC-3 από την ανάλυση TUNEL.

Η

Phyllanthus

εκχυλίσματα επαγόμενη κασπάσης-3/7 ενεργοποιήσεις

μια ενεργοποίηση κασπασών (ασπαρτική ειδική πρωτεάση κυστεΐνη) είναι μία από τις βιοχημικές αλλαγές κατά την διάρκεια της απόπτωσης. Τα επίπεδα της κασπάσης-3/7 που προκαλείται από

Phyllanthus

αγωγής σημαντικά αυξημένη (3-4 φορές) σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής (Σχήμα 3) και για τις δύο εκχυλίσματα

Phyllanthus

. Το επίπεδο της κασπάσης-3/7 από συνήθη φάρμακα, 5’Fluorouracil και δοξορουβικίνη σε MeWO και PC-3 κύτταρα, αντίστοιχα, ήταν 6-πτυχώσεις αυξάνει σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου και 0,5 φορές υψηλότερη από ό, τι

Phyllanthus

εξάγει μετά από 72 ώρες θεραπείας. Αυτά δείχνουν ότι η απόπτωση που επάγεται από

Phyllanthus

εκχυλισμάτων διαμεσολαβείται μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών.

Το γράφημα δείχνει τα επίπεδα της κασπάσης-3 και -7 σε επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα ομάδες MeWo και κύτταρα PC-3 . Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SE

Η

Phyllanthus

εκχυλίσματα που προκαλείται ελάχιστη νεκρωτική επίδραση

Η νέκρωση είναι μια άλλη μορφή κυτταρικού θανάτου που θα προκαλέσει φλεγμονώδη αντίδραση των γύρω κυττάρων μέσω η διαρροή των ενδοκυτταρικών περιεχομένων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το ποσοστό των επιπέδων LDH που παράγονται ως αποτέλεσμα της θεραπείας με τα δύο εκχυλίσματα του

Phyllanthus

ειδών ήταν μικρότερη από 10% για τα κύτταρα MeWo και λιγότερο από 15% για κύτταρα PC-3, σε σύγκριση με εκείνη των ομάδων ελέγχου μετά από 72 ώρες της θεραπείας. Η νεκρωτική επίδραση των εκχυλισμάτων μεθανόλης ήταν εντονότερη, όπου παρατηρήθηκε ότι είναι 4% υψηλότερη από το υδατικό εκχύλισμα του

Phyllanthus

είδη. Αυτό υποδηλώνει ότι οι

Phyllanthus

ειδών έχει ελάχιστη νεκρωτική αποτελέσματα και το μελάνωμα του δέρματος ήταν λιγότερο επιρρεπείς να εμφανιστεί νεκρωτικό αποτέλεσμα από κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αντίθετα, το επίπεδο LDH που επάγεται από τον θετικό μάρτυρα (5’Fluorouracil και δοξορουβικίνη) ήταν 25% υψηλότερη από ό, τι τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και 18% στην παραλλαγή με το

Phyllanthus

κύτταρα κατεργασμένα στις 72 ώρες της θεραπείας.

το γράφημα δείχνει το ποσοστό των επιπέδων LDH στο

Phyllanthus

Εκχυλίσματα αντιμετωπίζονται MeWo και PC-3 καρκινικά κύτταρα ήταν υψηλότερες από ό, τι το μη επεξεργασμένο ομάδα μετά από 72 ώρες θεραπείας. Μπάρες δείχνουν το μέσο ποσοστό ± SE

Η

Phyllanthus

εκχυλίσματα προκληθεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου που ακολουθείται από την απόπτωση

Για τον προσδιορισμό της φάσης του κυτταρικού κύκλου που αναστέλλεται από

Phyllanthus

εκχυλίσματα φυτών, τόσο MeWo και τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή στα αντίστοιχα IC τους

50 τιμές για 24, 48, 60 και 72 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η κινητική της κατανομής του κυτταρικού κύκλου των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ομάδων MeWo και PC-3 κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 5 και 6, αντίστοιχα. Αλλαγές στην κατανομή των επεξεργασμένων κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου ήταν παρατηρήσιμα από 24 ώρες μετά τη θεραπεία με

Phyllanthus

εκχυλισμάτων για τις κυτταρικές σειρές και τα δύο του καρκίνου.

Το ποσοστό των

Phyllanthus

εκχυλίσματα κατεργασμένα κύτταρα σε Α) Sub-G1, Β) Πηγαίνετε /G1, C) S, και D) G2 /M φάσεις των κυττάρων MeWo σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48, 60 και 72 ώρες) της θεραπείας . Μπάρες δείχνουν το μέσο ποσοστό ± SE

Η

Το ποσοστό των

Phyllanthus

εκχυλίσματα επεξεργασμένα κύτταρα σε Α) Υπο-G1, Β) Go /G1, C) S και D) G2 /M φάσεις PC-3 κύτταρα σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48, 60 και 72 ώρες) του Μπαρ θεραπείας δείχνουν το μέσο ποσοστό ± SE

η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, em

Phyllanthus

εκχυλίσματα εμφάνισαν διακοπή της ανάπτυξης στη φάση S σε κύτταρα MeWo από 24 ώρες και παρέμεινε εμφανής μετά από 72 ώρες αγωγής και αυτό συνοδεύεται από συσσώρευση κυττάρων στο Υπό-G1 (κύτταρα απόπτωση) φάση και για τις δύο υδατικές και μεθανολικά εκχυλίσματα. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων είχε αυξηθεί σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο από 1,8% σε 24 ώρες σε 6.1% στις 72 ώρες σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Εικόνα 5Α). Εν τω μεταξύ, το ποσοστό των κυττάρων στην S-φάση του κατεργασμένων κυττάρων MeWo ανυψώθηκε σε 15% πάνω από τους ελέγχους στις 72 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 5C). Επιπλέον, το ποσοστό των κυττάρων στο Go /G1 και G2 /M φάσεις μειώθηκε με τον χρόνο κατά την επεξεργασία με

Phyllanthus

εκχυλισμάτων οφείλεται στο γεγονός ότι αντιμετωπίζονται κύτταρα έχουν συλληφθεί στο S-φάση και ακολούθως συσσωρευμένη σε υπο-G1 (απόπτωση) φάση (Σχήμα 5Β και 5D). Ωστόσο, η ισχύς του

Phyllanthus

αποσπάσματα για να προκαλέσει τη σύλληψη S-φάσης δεν ήταν τόσο η ισχυρή ως πρότυπο φάρμακο (5’Fluorouracil), με διαφορά 22,1% στις 72 ώρες μετά τη θεραπεία.

για κύτταρα PC-3,

Phyllanthus

εκτίθενται διακοπή της ανάπτυξης στο /G1 φάση Go στις 72 ώρες μετά τη θεραπεία με τη συσσώρευση των αποπτωτικών κυττάρων στο Sub-G1 φάση και για τα δύο υδατικά και μεθανολικά εκχυλίσματα. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 3,4% σε 24 ώρες έως και 7,4% στις 72 ώρες κατά τη διάρκεια των μη επεξεργασμένων ομάδων (Σχήμα 6Α). Το ποσοστό των κατεργασμένων PC-3 κύτταρα σε Go /G1-φάση ήταν 13,7% στις 24 ώρες και αυτό αυξήθηκε σε 18,8% στις 72 ώρες πάνω από τα χωρίς θεραπεία ομάδες (Σχήμα 6Β). Ωστόσο, το ποσοστό των κυττάρων στη S και G2 3 κατεργάζεται-PC-/M φάσεις μειώθηκε με τον χρόνο της αγωγής (Σχήμα 6C και 6D), λόγω του γεγονότος ότι τα επεξεργασμένα κύτταρα PC-3 συνελήφθησαν στο Go /G1 φάση και ακολούθως συσσωρευμένη σε φάσεις Sub-G1. Ενώ δοξορουβικίνη έδειξε G2 /M σύλληψης φάσης σε PC-3 κύτταρα σε 24 ώρες και παρέμεινε εμφανής μετά από 72 ώρες θεραπείας.

Συζήτηση

Ο άνθρωπος έχει χρησιμοποιήσει φυτά εκτενώς για τη θεραπεία διαφόρων ειδών ασθενειών από την αρχαιότητα [7]. Φυτικά φυτά και τα φυτικά φάρμακα παράγωγα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε παραδοσιακούς πολιτισμούς σε όλο τον κόσμο και έχουν κερδίσει σε δημοτικότητα στη σύγχρονη κοινωνία ως φυσικές εναλλακτικές λύσεις για την παραγωγή νέων πιθανών θεραπευτικών ενώσεων για την καταπολέμηση των ασθενειών [5]. Εξήντα τοις εκατό των σημερινών διαθέσιμων αντικαρκινικά φάρμακα προέρχεται από φυσικά προϊόντα και τα παράγωγά τους (συμπεριλαμβανομένων των αντιβιοτικών). Αυτό έχει οδηγήσει σε μεγαλύτερη εμπιστοσύνη στα φυσικά προϊόντα, όπως σημαντικές πηγές για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντικαρκινικών παραγόντων [7].

Στην παρούσα μελέτη, υδατικά και μεθανόλης εκχυλίσματα από τα τέσσερα είδη φυτών του

Phyllanthus

εμφανίζεται κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί ανθρώπινου μελανώματος του δέρματος (MeWo) και του προστάτη (PC-3) κυτταρικές σειρές. Οι διακυμάνσεις στο IC

50 τιμές του

Phyllanthus

εκχυλίσματα έναντι του μελανώματος και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα θα μπορούσε να οφείλεται στις διαφορετικές επίπεδα βιοδραστικών ενώσεων που υπάρχουν στο κάθε

Phyllanthus

ειδών όπως κερσετίνη, γαλλικό οξύ, και caffeolquinic οξύ που έχουν αποδειχθεί ότι κατέχουν αντικαρκινικών επιδράσεων [16], [25] – [27]. Επιπλέον, τα δεδομένα που ελήφθησαν δείχνουν ότι η μεθανολικό εκχύλισμα του

Phyllanthus

φάνηκε να έχει πιο έντονη κυτταροτοξική δράση από υδατικό εκχύλισμα, αναφέροντας τις βιοδραστικές ενώσεις μεθανόλης-διαλυτών που περιέχονται στο

Phyllanthus

είναι πιθανώς πιο ισχυροί από τα υδατικά διαλυτά βιοδραστικών ενώσεων σε θανάτωση καρκινικών κυττάρων. Μεταξύ των τεσσάρων

Phyllanthus

είδη που χρησιμοποιούνται,

P. urinaria

έδειξε την ισχυρότερη κυτταροτοξική επίδραση. Αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με αποκλειστικό περιεχόμενο της trigalloylglucopyronoside και tetragalloylglucopyronosid. Είναι ενδιαφέρον ότι,

Phyllanthus

εκχυλίσματα δεν προκαλούν οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην κυτταρική βιωσιμότητα και των φυσιολογικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινου δέρματος (CCD-1127Sk) και του προστάτη (RWPE-1). Αυτά τα ευρήματα συσχετίζονται με μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί από τους Huang et al. στην οποία

Phyllanthus

φυτά εμφανίζονται επιλεκτική θανάτωση ενάντια στα καρκινικά κύτταρα [28]. Αυτή η επιλεκτική κυτταροτοξική επίδραση είναι ένα σημαντικό κριτήριο, επειδή οι επί του παρόντος διαθέσιμα φάρμακα στοχεύουν φυσιολογικά κύτταρα καθώς επίσης και οδηγεί σε παρενέργειες.

Η ζωή και το θάνατο του κυττάρου ελέγχεται από τον κυτταρικό κύκλο, η οποία ρυθμίζεται στενά από κυκλίνη , εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDK), αναστολείς CDK (CDKI) και άλλα γονίδια καταστολής όγκου. Έτσι, η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου θα οδηγήσει σε ανώμαλο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του DNA-κατεστραμμένο και evasiveness της απόπτωσης [29].

Phyllanthus

εκχυλίσματα διαταράσσεται τον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων MeWo σε S-φάση, υπονοώντας έτσι ότι αυτοί ενδέχεται να παρεμποδίσει τη σύνθεση του DNA, η ανάσχεση της προόδου του κυτταρικού κύκλου στη φάση S και οδηγώντας σε απόπτωση. Η διακοπή φάσης S με

Phyllanthus

εκχυλίσματα επί MeWo κύτταρο θα μπορούσε να οφείλεται σε: (1) αναστολή των ενζύμων cdc25 [16], [30] – [32], ή (2) την αναστολή της DNA τοποϊσομεράσης II η οποία οδηγεί σε ενεργοποίηση κασπασών [16], [33]. Έτσι, τα υψηλά επίπεδα της κασπάσης-3 και -7 δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν μετά από 72 ώρες μετά τη θεραπεία του

Phyllanthus

εκχυλισμάτων. Ωστόσο, η σύλληψη του S-φάσης που παρουσιάζεται από

Phyllanthus

αποσπάσματα δεν ήταν τόσο έντονη όσο 5’Fluorouracil, η οποία είναι ένα S-φάσης ευαίσθητο αντικαρκινική του φαρμάκου στο δέρμα, υποδεικνύοντας ότι

Phyllanthus

εξάγει πιθανώς να σκοτώσει τα κύτταρα του μελανώματος με άλλους τρόπους εκτός από ρήξη του κυτταρικού κύκλου, όπως μεταβολές στις οδούς σηματοδότησης των κυττάρων του μελανώματος, συμπεριλαμβανομένων FAS οδός [34]. Περαιτέρω έρευνες θα αφορούν τη λειτουργία των δράσεων του

Phyllanthus

εξάγει σε κύτταρα μελανώματος.

Phyllanthus

εκχυλίσματα που ασκείται ανάπτυξη σύλληψή τους για θεραπεία-PC-3 κύτταρα από τη συσσώρευση των κυττάρων στο Go /G1-φάση, πράγμα που σημαίνει ότι

Phyllanthus

εκχυλίσματα μπορεί να επηρεάσει την σύνθεση των πρωτεϊνών PC-3 κύτταρα σταματώντας έτσι την εξέλιξη τους από G1 προς S φάση κατά τη διάρκεια της κυτταρικού κύκλου τους και στη συνέχεια την έναρξη της απόπτωσης. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στις ανασταλτικές επιδράσεις επί MDM2 πρωτεΐνη, η οποία μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση από την ανύψωση του p21, Bax και τα επίπεδα pRb καθώς και μείωση υπερφωσφορυλιωμένης Rb και E2F1 [35].

Phyllanthus

επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC-3 θα μπορούσε να σχετίζεται με αύξηση της έκφρασης του γονιδίου του υποδοχέα /συνδέτη Βαχ και Fas όπως προτείνεται από Huang et al. [25]. Οι αυξήσεις του Βαχ πρωτεΐνη συνδέεται με τη συμμετοχή του μιτοχονδριακού (ενδογενές) μονοπάτι σε απόπτωση η οποία περιλαμβάνει τη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, δελτία κυτοχρώματος C και στη συνέχεια οδηγούν σε ενεργοποίηση κασπασών [36]. Τα υψηλά επίπεδα της κασπάσης-3 και -7 δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με

Phyllanthus

εκχυλισμάτων. Ο /σύλληψη G1 φάσης Go στο PC-3 από

Phyllanthus

αποσπάσματα θα μπορούσαν να συνδέονται με υψηλής περιεκτικότητάς του σε πολυφαινολικές ενώσεις. Τα 12 πολυφαινόλες που προσδιορίζονται στο

Phyllanthus

, κατατάσσονται σε τέσσερις κύριες ομάδες, δηλαδή, ελλαγιταννίνες, gallotannins, φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα με ελλαγιταννίνες είναι η πιο άφθονη ομάδα της ένωσης. Ελλαγιταννίνες επίσης άφθονα βρέθηκαν στο ρόδι και έχουν μελετηθεί αρκετά καλά για ποικίλες θεραπευτικές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου καταστέλλοντας ιδιότητες [37]. Geraniin, η κύρια ellagitannin βρέθηκαν σε όλα τα P

hyllanthus

είδη, έχουν δειχθεί ότι συμβάλλουν σε συλλήψεις ανάπτυξη σε άλλους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [38], [39]. Ωστόσο, το πρότυπο φάρμακο για τον καρκίνο του προστάτη, δοξορουβικίνη, διαταράσσεται την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη σύλληψή τους σε φάση G2 /M και τελικά την έναρξη της απόπτωσης μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών όπως αναστολή για τα ένζυμα τοποϊσομεράσης, όπως φαίνεται σε άλλες μελέτες [40], [ ,,,0],41]

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -7 δραστηριότητες σε αγωγή καρκινικά κύτταρα κατά την διάρκεια της απόπτωσης οδηγεί σε: (1). αδρανοποίηση της πολυμεράσης ή PARP ενζύμου πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη), και (2) την ενεργοποίηση του κασπάσης ενεργοποιημένη DNase (CAD), ακολούθως προκαλώντας κατακερματισμού του DNA, το οποίο είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης [42], [43]. Έτσι, ανύψωση αυτών των κασπασών μετά

Phyllanthus

θεραπείες επιτρέπει την εμφάνιση αποπτωτικών θραυσμάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την παρουσία του TUNEL-θετικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, η κυτταροτοξική δράση του

Phyllanthus

εξάγει στο ανθρώπινο δέρμα (MeWo) και του προστάτη (PC-3) κυτταρικές σειρές καρκίνου διαμεσολαβείται μέσω ενός αποπτωτικό μηχανισμό με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -7 και αυτό θα μπορούσε να οφείλεται με την παρουσία του γαλλικού οξέος που βρέθηκαν στο

Phyllanthus

εκχυλίσματα. Γαλλικό οξύ έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση μέσω της κασπάσης-3 ενεργοποίησης [44].

Στο φυσικό προϊόν με βάση την ανακάλυψη και ανάπτυξη φαρμάκων, νέκρωση μπορεί να συμβεί σε συνδυασμό με την απόπτωση. Αυτό έχει αποδειχθεί σε πολλές αντικαρκινικά φάρμακα όπως κλαδριβίνη, σισπλατίνη, δοξορουβικίνη και 5’fluorouracil, οι οποίες διαθέτουν τόσο αποπτωτικών και νεκρωτικών επιδράσεων [45], [46]. Η LDH είναι μια ομάδα ενζύμων που υπάρχουν στο σώμα μας και ασυνήθιστα υψηλό επίπεδο τους υποδεικνύει προβλήματα υγείας. Σε κύτταρα, LDH παράγονται κυρίως από τα μιτοχόνδρια και να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην οξείδωση του γαλακτικού παράλληλη μείωση πυροσταφυλικό [47]. Σε νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο, την ακεραιότητα μεμβράνης πλάσματος χάνεται και αυτό οδηγεί στην διαρροή των κυτταροπλασματικών περιεχόμενο στο εξωκυτταρικό περιβάλλον προκαλώντας μία φλεγμονώδη αντίδραση [23]. Μετρήσεις του ενζύμου LDH ως δείκτης της νέκρωσης, έδειξαν ότι το

Phyllanthus

πέραν του ότι έχει αποπτωτική δραστικότητα, διαθέτουν επίσης ελάχιστη ικανότητα να επάγει νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο και στις δύο MeWo και τα κύτταρα PC-3. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το

Phyllanthus

φυτό διαθέτει dual-ικανότητα του κυτταρικού θανάτου, ίσως λόγω του ακατέργαστου φύση των

Phyllanthus

εκχυλίσματα, όπου όλες οι εν δυνάμει βιοδραστικών ενώσεων αναμιγνύονται μαζί και μπορεί δρουν μεμονωμένα ή σε συνέργεια, συμβάλλοντας έτσι σε αυτή την διπλή ικανότητα του κυτταρικού θανάτου »αποτελέσματα.

τα βιοδραστικών ενώσεων που πιστεύεται ότι διαθέτει κυτταροτοξικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα μέσω της ικανότητάς της να διαταράξει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου και την κίνηση τους προς υποβάλλονται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αν και οι λεπτομερείς ή υποκείμενων μηχανισμών της επιλεκτικότητας των

Phyllanthus

φυτών ενάντια δέρματος και του προστάτη καρκινικά κύτταρα είναι ακόμα ασαφής, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι

Phyllanthus

φυτό ασκεί την αναστολή της ανάπτυξης της προς τα καρκινικά κύτταρα μέσω της διαφοροποίησης των κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης μέσω ενεργοποίησης των κασπασών. Περαιτέρω καθαρισμοί των

Phyllanthus

εκχυλίσματα και έρευνες του μονοπατιού της απόπτωσης που απαιτείται για να αποκαλύψει τον ακριβή τρόπο δράσης της

Phyllanthus

φυτό για αντικαρκινικές ιδιότητες του.

Υλικά και μέθοδοι

φυτικά εκχυλίσματα και συνήθη φάρμακα

Τα υδατικά και μεθανολικά εκχυλίσματα των τεσσάρων

Phyllanthus

είδη (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria, και P .watsonii

) δόθηκαν από τον Dr. ΒΙΟΜ Bala, Βιοτεχνολογίας Κέντρο, MARDI. Πρόσφατης συγκομιδής φυτικά δείγματα πλύθηκαν, ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθως λυοφιλοποιήθηκε. Για το υδατικό εκχύλισμα, ξηραίνεται φυτικό δείγμα ήταν εμποτισμένο με εξαιρετικά καθαρό νερό, ενώ απόλυτη μεθανόλη χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή μεθανολικό εκχύλισμα. Τα δείγματα στη συνέχεια ομογενοποιούνται με ρυθμιστικό εκχύλισης και το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από τρεις γύρους εκχύλισης. Η δοξορουβικίνη και 5’Fluorouracil ήταν οι πρότυπες φαρμάκων που χρησιμοποιούνται ως θετικοί έλεγχοι σε αυτή τη μελέτη. Και οι δύο ελέγχονται δείγματα? φυτικά εκχυλίσματα και συνήθη φάρμακα φυλάχθηκαν στους -20 ° C.

υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με electronspray ιονισμού (ESI) και φασματομετρία μάζας (LC-MS-MS) ανάλυση

Για το νερό εξάγεται δείγματα, 2 ml υπερκείμενου ξηραίνεται σε συμπυκνωτή κενού (Concentrator 5301 Eppendorf, Γερμανία) και επανα-διαλύθηκε σε 20 mg /ml με 30% μεθανόλη πριν υποβληθεί για ανάλυση LC-MS-MS. Για αυτά τα δείγματα εκχυλίζονται με μεθανόλη, συνολική υπερκείμενο εξατμίστηκε χρησιμοποιώντας περιστροφικό εξατμιστήρα (Rotavapor RII, BUCHI, Ελβετία) και την εκ νέου διαλύεται και πάλι με 20% μεθανόλη. Τα δείγματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) στήλη (LiChrolut RP-18 1000 mg /6 ml, Merck Γερμανίας) με κινητή φάση 60% μεθανόλης και 70% μεθανόλη. Όλα εκλούεται συμπυκνώθηκαν σε 0.5 ml, κατόπιν αραιώθηκε 8 φορές με 40% μεθανόλη πριν υποβληθεί για ανάλυση LC-MS-MS.

Τα δείγματα διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα HPLC αποτελείται από μια δυαδική αντλία HPLC, ένα διαμέρισμα αυτόματο δειγματολήπτη εγχυτήρα και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων (DAD) (1200 σειρά, Agilent Technologies, Γερμανία). Οι διαχωρισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία αντίστροφης φάσης C-18, 150 mm × mm i.d 4,6, 5 μm μέγεθος σωματιδίου στήλη Thermo Hypersil GOLD (Thermo Scientific, UK). Διαχωρισμός αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας μια κινητή φάση 0.1% μυρμηκικό οξύ σε νερό (διαλύτης Α) και 0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο (διαλύτης Β) με ρύθμιση βαθμίδα διαλύτη Β: 5% (5 λεπτά), 5-90% (60 min), 5% (4 λεπτά) σε ρυθμό ροής 1 ml /min. Ο όγκος της ένεσης καθορίστηκε σε 20 μΐ και οι ανιχνεύσεις ήταν και οι δύο στα 280 nm και 360 nm. Για την ανάλυση φασματομετρίας μάζας, 3200 σύστημα QTrap LC /MS /MS (Appiled Bioscience – MDS Sciex) χρησιμοποιήθηκε με την πηγή σιδήρου και την τάση διατηρήθηκε στους 500 ° C και -4,5 kV για αρνητική ιονισμού, αντίστοιχα. γεννήτρια αζώτου ορίστηκε να λειτουργούν σε ροή 60 psi κουρτίνα αερίου, η ροή του αερίου πηγής 90 psi και η ροή των καυσαερίων 60 psi. επιλέχθηκαν δύο τύποι τρόπους σάρωσης: ενίσχυση της φασματογράφο μάζας (EMS) και την ενίσχυση του προϊόντος ιόντων (EPI) για μια πλήρη σάρωση φάσματα μάζας που κυμαίνονται από

m /z

100-1200

καλλιέργειας κυττάρων.

μελάνωμα του δέρματος MeWo (ΗΤΒ-65) κυττάρων, καρκίνο του προστάτη PC-3 (CRL-1435) κύτταρα, κανονικό ανθρώπινο δέρμα CCD-1127Sk (CRL-2565) και του προστάτη RWPE-1 (CRL-11609) κυττάρων γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν με διαφορετικά μέσα, ΕΜΕΜ (ελάχιστο βασικό μέσο Eagle) για κύτταρα MeWo, RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) για PC-3 κύτταρα, και την ανάπτυξη των κερατινοκυττάρων μέσο, ​​CC-4455 (Lonza, USA) για RWPE-1 κύτταρα και ϋΜΕΜ (Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium) για κύτταρα CCD-1127Sk. Μέσα ανάπτυξης συμπληρώθηκε με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Hyclone) όταν φθάσουν 70-80% συρροή σε φιάλες καλλιέργειας. Τα κύτταρα που υποβάλλονται σε εκθετική αύξηση χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα.

διαλογή Κυτταροτοξικότητας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε βέλτιστη κυτταρική πυκνότητα σε αποστειρωμένες πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα για προσκόλληση.