Αφηρημένο

Ιστορικό

Χρησιμοποιήσαμε εντατική σύγχρονη πρωτεομική προσεγγίσεις για την εντοπίσει πρόβλεψης πρωτεΐνες στον καρκίνο των ωοθηκών. Εντοπίζουμε πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα και στον ορό και περιτοναϊκό υγρό. Για να αξιολογηθεί η συνολική απόδοση της προσέγγισης που παρακολουθούν τη συμπεριφορά του 20 επικυρωμένους δείκτες σε όλη αυτά τα πειράματα.

Μεθοδολογία

Η φασματομετρία μάζας με βάση ποσοτική πρωτεομική μετά από εκτενείς πρωτεΐνη κλασματοποίηση χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση ορό των γυναικών με ορώδες καρκίνο των ωοθηκών σε υγιείς γυναίκες και γυναίκες με καλοήθεις όγκους των ωοθηκών. Η ποσοτικοποίηση επιτεύχθηκε με ισοτοπικά επισήμανση κυστεΐνη αμινοξέα. φασματομετρία μάζας Label χωρίς χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση περιτοναϊκό υγρό που λαμβάνεται από γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών ορώδες και εκείνων με καλοήθεις όγκους. Όλα τα δεδομένα ενσωματώνονται και σχολιάζονται με βάση το αν οι πρωτεΐνες έχουν προηγουμένως επικυρωθεί χρησιμοποιώντας αναλύσεις που βασίζονται σε αντισώματα.

Ευρήματα

Έχουμε επιλέξει 54 ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες ορού και 358 περιτοναϊκή πρωτεΐνες ρευστό του οποίου οι διαφορές ασθενών-μαρτύρων υπερβεί ένα προκαθορισμένο όριο. Δεκαεπτά πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν σε αμφότερα τα υλικά και 14 είναι εξωκυτταρικό. Από 19 επικυρωμένες δείκτες που εντοπίστηκαν όλοι βρέθηκαν στον καρκίνο περιτοναϊκό υγρό και ένα υποσύνολο 7 προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε ορό, με μία από αυτές τις πρωτεΐνες, IGFBP1, πρόσφατα επικυρωμένη εδώ.

Συμπέρασμα

Proteome profiling εφαρμόζεται σε συμπτωματικές περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών προσδιορίζει έναν μεγάλο αριθμό επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες ορού, πολλά από τα οποία είναι ή έχουν επιβεβαιωθεί από ανοσοπροσδιορισμούς. Ο αριθμός των επί του παρόντος γνωστών επικυρωμένων δεικτών είναι υψηλότερη στη περιτοναϊκό υγρό, αλλά συνθέτουν ένα υψηλότερο ποσοστό των πρωτεϊνών που παρατηρούνται και στον ορό και περιτοναϊκό υγρό, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι 10 επιπλέον δείκτες σε αυτή την ομάδα μπορεί να είναι υψηλή υποψήφιοι ποιότητας.

Παράθεση: Amon LM, Δίκαιο W, Fitzgibbon MP, Gross JA, O’Briant Κ, Peterson A, et al. (2010) Ολοκληρωμένη πρωτεομική ανάλυση του ορού και περιτοναϊκή Ρευστών βοηθά στον εντοπισμό πρωτεϊνών που είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω στον ορό των γυναικών με καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10.1371 /journal.pone.0011137

Επιμέλεια: Sudhansu Kumar Dey, Ίδρυμα Έρευνας Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Μάρτη 2010? Αποδεκτές: 26η Μάη 2010? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιούν του 2010

Copyright: © 2010 Amon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί εν μέρει με την Ομοσπονδιακή κονδύλια από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, σύμφωνα με τους αριθμούς επιχορήγηση U01 CA111273, Ρ50 CA83636, σύμβαση Νο HHSN261200800001E, και των Καναρίων Ιδρύματος. Το περιεχόμενο αυτής της δημοσίευσης δεν αντανακλά απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Τμήματος Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών, ούτε αναφέρει εμπορικών ονομάτων, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών (OC) είναι η κύρια αιτία του πόνου και του θανάτου για τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες, και τη διάγνωση αυτή σε ένα προ-μεταστατικό στάδιο μπορεί να μειώσει δραματικά τη θνησιμότητα. Αν και λογαριασμούς OC μόλις το 4% του συνόλου των διαγνώσεων καρκίνου στις γυναίκες (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. https://www.cancer.gov) είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών καρκίνων. Όπως συμβαίνει με πολλούς καρκίνους, η επιβίωση μιας γυναίκας [1] με OC συνδέεται στενά με το στάδιο της κατά τη διάγνωση. Υδαρής καρκίνο των ωοθηκών (SOC) είναι η πιο διαδεδομένη και θανατηφόρα ιστολογία? πάνω από το 70% όλων των περιπτώσεων OC διαγιγνώσκονται σε μεταστατικό στάδιο.

στρατηγικών έγκαιρης ανίχνευσης για OC επί του παρόντος υπό αξιολόγηση τυπικά εμπλέκονται συνδυασμό ενός ή περισσοτέρων δεικτών με βάση το αίμα (τυπικά ο δείκτης CA 125) ως μέσο για την αναφέρονται γυναίκες σε επιβεβαιωτική μέθοδο απεικόνισης, όπως διακολπικό υπερηχογράφημα. Κατά τη χρήση ενός δείκτη όπως μια οθόνη πρώτης γραμμής, η απόδοση ολόκληρης της στρατηγικής διαλογής θα περιορίζεται από την απόδοση αυτού του δείκτη και ένα πολύ σημαντικό χαρακτηριστικό απόδοσης για έναν δείκτη πρώιμης ανίχνευσης μολύβδου-εποχή, δηλαδή πόσο νωρίς στη διαδικασία της νόσου ο δείκτης ανυψώνει. Παρά το γεγονός ότι τα προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η επίτευξη μιας θετικής πρόβλεψης ορίου ποσοστού 10% [2] είναι εφικτή με τη χρήση της διαδοχικής πολυτροπικής προσέγγισης, προσεγγίσεις μοντελοποίησης [3] – [6] και μελέτες προ-κλινική επικύρωση προφίλ CA 125 και άλλους δείκτες [7 ] δείχνουν ότι ο χρόνος προετοιμασίας που λαμβάνονται από CA 125 μπορεί να είναι ανεπαρκής για να μειώσει ουσιαστικά τη θνησιμότητα σε ένα μεγάλο τμήμα των γυναικών.

Πολλοί δείκτες, εκτός από CA 125 έχουν ταυτοποιηθεί και επικυρωθεί σε ανεξάρτητες μελέτες χρησιμοποιώντας δείγματα που συλλέχθηκαν κατά τη χρόνο της κλινικής διάγνωσης [8] – [18]. Αναφερόμαστε σε αυτούς τους δείκτες ως «επικυρωμένες προγνωστική πρωτεΐνες», με την οποία εννοούμε πρωτεΐνες επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ανοσοπροσδιορισμών σε πολλαπλά ανεξάρτητα δείγματα και, ως εκ τούτου, ως ομάδα, είναι πιθανό να είναι κατά κύριο λόγο αληθώς θετικά. Πιο πρόσφατα, πολλοί από αυτούς τους δείκτες έχουν αξιολογηθεί σε δείγματα που λαμβάνονται πριν από τη διάγνωση και δείχνουν ότι μπορούμε να περιμένουμε λίγες πρωτεΐνες επικυρωθεί σε συμπτωματική νόσο επίσης να ανυψώσει πριν αναπτύξει συμπτώματα [7]. Σαφώς, η βελτίωση της έγκαιρης ανίχνευσης για SOC θα απαιτήσει την αναγνώριση των νέων κατηγοριών δεικτών, ενδεχομένως, από πλάσμα ή πρωτεομική προσεγγίσεις στον ορό.

Ένας από τους στόχους της μελέτης μας περιλαμβάνει τον εντοπισμό επιπλέον δεικτών με τη χρήση πρωτεομική ορό. Ωστόσο, η δυνατότητα της ανακάλυψης απόκλιση πρωτεϊνών στον ορό και το πλάσμα υπήρξε αμφιλεγόμενη και δεν είναι ευρέως επιτυχημένη, και έτσι ένα δευτερεύοντα στόχο της μελέτης μας είναι να επικυρώσει τη συνολική proteome ορού πειραματική ροής εργασίας χρησιμοποιώντας διάφορα δεικτών ως πρότυπα χρυσό. Σε αυτό το χειρόγραφο περιγράφουμε ένα σύνολο πρωτεομική πειραμάτων που ανακρίνουν σύνθετα μείγματα των ανθρώπινων βιοϋλικών OC. Τα πειράματα είχαν δύο σκοπούς? η πρώτη ήταν να προσδιορίσει προηγουμένως αγνώστων πρωτεϊνών που μπορεί να είναι επιπλέον των υποψηφίων ως προγνωστική δείκτες. Το δεύτερο ήταν να επικυρώσει την προσέγγιση πρωτεομική ορό με την παρακολούθηση της συμπεριφοράς των γνωστών επικυρωθεί πρόβλεψης πρωτεΐνες, προκειμένου να αποδείξει ότι η πλατφόρμα είναι σε θέση να ανακαλύψετε δεικτών. Νωρίς το πλάσμα και τον ορό πρωτεώματος προσπάθειες ανακάλυψης, τις περισσότερες φορές βασίζονται σε SELDI ή MALDI μεθόδους [19] – [26], έχουν αποτύχει σε μεγάλο βαθμό από αυτή την άποψη. Πιο πρόσφατες προσεγγίσεις χρησιμοποιώντας διαδοχική MS σε συνδυασμό με την εντατική κλασματοποίηση [27] – [29] μπορεί να είναι πιο κατάλληλη για βιοδείκτη ορό και πλάσμα ανακάλυψη όπως έχουν δείξει για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών για τον καρκίνο του παγκρέατος [30] που έχουν μεταγενέστερα επικυρωθεί. Ωστόσο, επειδή η επιτυχία οποιασδήποτε προσέγγισης ανακάλυψη σίγουρα θα εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της νόσου όσο και της τεχνολογίας, πριν από την επένδυση πόρων για την ανάπτυξη αντισωμάτων για νέους δείκτες, πρέπει πρώτα θέλησε να επιβεβαιώσει ότι η προσέγγιση είναι ικανή να παράγει επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Έχουμε ανακρίνεται τόσο ένα υγρό που κυκλοφορεί, ορός, και ένα ρευστό πλησίον του όγκου, ασκητικό υγρό ή περιτοναϊκό υγρό από ασθενείς της ομάδας ελέγχου με καλοήθεις όγκους ορώδης (BST). Πραγματοποιήσαμε δύο διαφορετικά πειράματα σε ορό: Το πρώτο πείραμα σε σύγκριση πισίνες ορού από ασθενείς με μεταστατικό SOC στις πισίνες από υγιών εθελοντών ασυμπτωματική? Το δεύτερο πείραμα σε σύγκριση πισίνες ορού από ένα διαφορετικό σύνολο ασθενείς με μεταστατικό SOC στις πισίνες ορού από γυναίκες με BST. Για τα πειράματα εγγύς ρευστό, συγκρίναμε δεξαμενές ασκητικού υγρού από ασθενείς με μεταστατικό SOC για δεξαμενές περιτοναϊκό υγρό από ασθενείς με BST. Σε όλα τα πειράματα, τα δείγματα συμφωνημένα με βάση την ηλικία, τη διάρκεια αποθήκευσης, η χρήση θεραπείας ορμονικής υποκατάστασης και ο χρόνος της συλλογής πριν τη χειρουργική επέμβαση (για σύγκριση υπόθεση /έλεγχος). Με το συνδυασμό αυτών των συνόλων δεδομένων και τον εντοπισμό των πρωτεϊνών που φαίνεται να είναι up-ρυθμίζεται SOC και στον ορό και εγγύς υγρό στον όγκο, ελπίζουμε να εμπλουτίσουν το δυναμικό ψηφοδέλτιο μας με τον καρκίνο-ειδικούς δείκτες.

Αποτελέσματα

Σχολιασμός των πρωτεϊνών με βάση τους υπάρχοντες πόρους δεδομένων

ο κατάλογος των 21 πρωτεϊνών προηγουμένως δείξει ότι είναι up-ρυθμίζονται στο πλάσμα ή στον ορό του SOC σε σύγκριση με υγιή ελέγχου από δοκιμασίες ELISA συντάχθηκε από την εξέταση του βιοδείκτη OC βιβλιογραφία. Ταυτοποιήσαμε τις πρωτεΐνες αυτές, καθώς και μία επιπλέον πρωτεΐνη, IGFBP1, ανακαλύφθηκε και επικυρώνονται σε αυτό το έργο ως αληθή θετικά δείγματα αναφοράς. Τέσσερα από τα αληθώς θετικά πρωτεΐνες δεν προσδιορίζονται σε ένα πλάσμα ή περιτοναϊκό υγρό: MUC 16 [31] – [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (ψευδώνυμα CA 125, DcR3, Β7-Η4, αντίστοιχα ) και VEGF [16]. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα 19 αληθώς θετικά πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν στο πλάσμα ή περιτοναϊκό υγρό [14], [16], [17], [31] – [33]. Όλοι τους παρατηρήθηκαν και ποσοτικά κατά περιτοναϊκό υγρό, και 7 παρατηρήθηκαν στο πλάσμα? Δεν θετικοί μάρτυρες ταυτοποιήθηκαν αποκλειστικά στο πλάσμα.

Η

συγκρίσεις Serum

Τα πειράματα πρωτεομική ορού (που περιγράφεται παρακάτω) σε σύγκριση μεταστατικό ορώδης καρκίνο των ωοθηκών (SOC) είτε υγιείς ασυμπτωματικά (ΗΑ) γυναίκες ή γυναίκες με καλοήθεις όγκους ορώδες (BST). Ο Πίνακας 2 δείχνει το συνολικό αριθμό των ποσοτικοποιείται πρωτεϊνών σε κάθε πείραμα ορό. Πάνω από 360 πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα και συνολικά 470 πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν σε τουλάχιστον ένα ή το άλλο πείραμα. Η κατάρρευση αυτών των πρωτεϊνών με τα αποτελέσματα σύμβολο γονιδίου σε ελαφρώς χαμηλότερη σύνολα λόγω των διαφορετικών ισομορφών που προσδιορίζονται για το ίδιο γονίδιο. Στο Σχήμα 1, η ένωση μεταξύ αναλογιών log2 για όλων των ποσοτικοποιημένων πρωτεϊνών με σύμβολο γονίδιο για τα δύο πειράματα ορού χαράσσεται (οριζόντιο και κάθετο άξονα αντανακλούν SOC έναντι ΗΑ και SOC έναντι BST, αντίστοιχα). Σημειώστε ότι όλες οι αναλογίες προσανατολισμένα έτσι ώστε μια θετική τιμή σημαίνει μια αναλογία πρωτεΐνης υψηλότερο σε SOC. Οι πρωτεΐνες που δεν παρατηρήθηκαν σε ένα πείραμα που αντιπροσωπεύεται από μια αναλογία ψευδο του «1» (log2 = 0) για αυτό το πείραμα.

Πράσινο σημεία αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα και στα δύο πειράματα. Μπλε σημεία αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα σε ένα πείραμα και δεν παρατηρήθηκαν σε άλλη. * Δείκτης Benchmark επικυρωθεί από δοκιμασία ELISA? ** Νέα δείκτης επικυρωθεί από δοκιμασία ELISA

Η

Σχήμα 1 αποκαλύπτει ένα πολλά υποσχόμενο σχέδιο που μπορεί κανείς να περιμένει να δει σε ένα πείραμα που συγκρίνει δύο πολύπλοκα μείγματα και στην οποία κάποιοι απόκλιση πρωτεΐνες που παρατηρείται.: περισσότερες πρωτεΐνες πέφτουν κοντά στην καταγωγή και ποικίλλουν σε ασυσχέτιστες τρόπο δεδομένου ότι δεν υπάρχουν συστηματικές αλλαγές που συμβαίνουν, αλλά ένας αριθμός από αυτούς στην επάνω δεξιά τεταρτημόριο τάση μακριά από τον όγκο. Για τον χαρακτηρισμό αποτελεσμάτων μας, επισημαίνουν μια πρωτεΐνη ως up-ρυθμίζονται εάν αναλογία συναίνεση του πληροί ή υπερβαίνει ένα 2-φορές αλλαγή (δηλαδή, log2 (SOC /ΗΑ) + log2 (SOC /BST) ≥1 όπως υποδεικνύεται από το γραμμή στο Σχήμα 1). Όλα τα 54 πρωτεΐνες που πληρούν το κριτήριο αυτό εμφανίζεται με πράσινο χρώμα όταν παρατηρείται και στις δύο συγκρίσεις ή μπλε εάν παρατηρηθεί μόνο σε ένα. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι επίσης παρατίθενται στον Πίνακα S1 (σε συμπληρωματικές πληροφορίες).

Αυτές οι πρωτεΐνες που αντιστοιχούν σε «σημείο αναφοράς» των πρωτεϊνών μας από τον Πίνακα 1, σημειώνονται με αστερίσκο. Ένα σύνολο επτά πρωτεΐνες αναφοράς παρατηρήθηκαν στον ορό, συμπεριλαμβανομένων έξι που είχαν προηγουμένως επικυρωθεί, καθώς και ένα επιπλέον δείκτη, IGFBP1, που υποδηλώνεται με ένα διπλό αστερίσκο, το οποίο επικυρώνεται εδώ βασίζονται σε αυτά τα πειράματα. Όλα τα επτά από τα παρατηρούμενα πρωτεϊνών αναφοράς ήταν επάνω-ρυθμίζονται με τα κριτήριά μας. Η παρατηρούμενη εμπλουτισμού (7 από 7) είναι ιδιαίτερα σημαντική (p-value = 1e-6), αποδεικνύοντας ότι η πρωτεομική ανάλυση του ορού μας βρίσκει υψηλή συμφωνία με έγκυρες δοκιμασίες.

περιτοναϊκή πειράματα ρευστό

Η τα πειράματα περιτοναϊκό υγρό σε σύγκριση με τη χρήση μιας μεθόδου χωρίς σήμανση που μας επιτρέπει να ποσοτικοποιήσει όλες τις παρατηρηθείσες πρωτεΐνες, όχι μόνο εκείνες που περιέχουν μία ισοτοπικά επισημασμένου κυστεΐνη αμινοξέος. Μετά την κατάρρευση του σύμβολο γονίδιο, οι 2950 πρωτεΐνες παρατηρούνται και στα δύο πειράματα. Η σύγκριση του log2 (πεπτίδιο φασματική μετρήσεις) μεταξύ SOC να BST σχεδιάζεται στο Σχήμα 2. Για λόγους ευκολίας, οι πρωτεΐνες με φασματική count = 0 σε ένα υγρό, αλλά παρατηρούνται στο άλλο ρευστό έχουν ρυθμιστεί σε 0,5. Ορίζουμε μια πρωτεΐνη που ρυθμίζεται προς τα πάνω αν έχει ένα πεπτίδιο SOC μετράνε τουλάχιστον δύο φορές μεγαλύτερη από την αντίστοιχη αρίθμηση πεπτίδιο BST. Από τα 2950 που προσδιορίζονται πρωτεΐνες με σύμβολο γονίδιο, 358 επιλέγονται ως δυνητικά πάνω ρυθμισμένα με βάση αυτό το κριτήριο (βλέπε πίνακα S1). Οι πρωτεΐνες που βρέθηκαν επίσης επάνω ρυθμισμένη στα πειράματα του ορού φαίνεται στο κόκκινο. Μπορούμε επίσης να σχολιάσετε αυτές τις πρωτεΐνες που αναφέρθηκαν από Κουκ

et al

[34] οι οποίοι αξιολόγησαν SOC ασκιτικού υγρού. Στα πειράματά μας, 73 από τους υποψηφίους Kuk παρατηρούνται, που φαίνεται στο μπλε στο σχήμα 2, και διανέμονται ευρέως μεταξύ SOC και BST μετράει με μόνο 37 ρυθμισμένα προς τα πάνω. Kuk

et al

δεν αξιολογεί υλικό από BST. Όπως στα πειράματα του ορού, βρήκαμε ένα σημαντικό εμπλουτισμό των επικυρωμένων βιοδεικτών μεταξύ των up-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες στο ασκητικό υγρό. Από τους 19 πρωτεΐνες αναφοράς παρατηρούνται είτε σε περιτοναϊκό υγρό (με την ένδειξη στο Σχήμα 2), όλα εκτός από δύο, MIF και MSLN, ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (ρ-τιμή = 2e-16). Σημειώστε ότι MIF πάνω ρύθμιση είναι πιθανόν σχετίζεται με προκατάληψη διαπίστωση δείγμα [9]. Τα δεδομένα εδώ είναι σύμφωνη με τα συμπεράσματα του Κουκ

et al.

Ότι υγρού καρκίνο του ασκητικού μπορεί να είναι μια πολύτιμη πηγή για τον εντοπισμό των υποψηφίων βιοδεικτών, αν και τα αποτελέσματα μας από την BST δείχνουν ότι πολλοί από αυτούς δεν θα είναι καρκίνου συγκεκριμένες.

Red σημεία είναι up-ρυθμίζονται SOC ορό. Μπλε σημεία είναι πρωτεΐνες που παρατηρήθηκαν σε ρευστό καρκίνο των ωοθηκών ασκητικό από Kuk κ.ά. [34]. Οι Benchmark πρωτεΐνες επισημαίνονται. Τα παραπάνω σημεία πράσινη διακεκομμένη γραμμή θεωρείται up-ρυθμίζονται στο περιτοναϊκό υγρό.

Η

σύγκριση ορού έναντι περιτοναϊκής

υγρού

Για να συγκρίνετε τα δύο διαφορετικά είδη υγρών, οι αναλογίες συναίνεση log2 πάνω από δύο πειράματα ορού συναρτήσει της αναλογίας log2 του ρευστού SOC ασκητικού πάνω BST περιτοναϊκό υγρό, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Επειδή μόνο πρωτεΐνες παρατηρήθηκαν και στα δύο υλικά μπορούν να καταγράφεται, η σύγκριση αυτή περιλαμβάνει μόνο τα 358 πρωτεΐνες που παρατηρούνται και στον ορό και περιτοναϊκό υγρό. Ένα σύνολο 17 από αυτές τις πρωτεΐνες ονομάσθηκαν πάνω ρυθμισμένα σε δύο σειρές. Η συνολική συμφωνία όλων των πρωτεϊνών, όπως μετράται με την συσχέτιση στις αναλογίες, δεν είναι ισχυρή, αλλά αυτό δεν είναι μη αναμενόμενο δεδομένου ότι οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν αλλάζουν μεταξύ των δύο πηγών και για εκείνες τις πειραματικές πηγές διακύμανσης θα πρέπει να κυριαρχούν. Μόνο μεταξύ των πρωτεϊνών που διαφέρουν συστηματικά ανάμεσα υπόθεση και ελέγχου πρέπει να βρούμε συμφωνία. Τα 17 πρωτεΐνες που είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω και στα δύο πειράματα (που παρατίθενται στον Πίνακα 3 και δείχνεται στο μπλε στο Σχήμα 3) είναι εντόνως εμπλουτισμένα για τις επικυρωμένες βιοδείκτες που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Όλα τα επτά παρατηρούμενο πρωτεΐνες αναφοράς μετρήθηκε σε δύο πειράματα βρέθηκαν πάνω ρυθμισμένα (p-value = 2e-16). Ωστόσο, το μεγαλύτερο όφελος παρατηρούμε χρησιμοποιώντας την επικάλυψη των δύο πειραμάτων είναι μια σημαντική αύξηση του ποσοστού των επικυρωμένων δεικτών μεταξύ όλων των up-ρυθμίζονται δείκτες. Στον ορό, το 15% των up-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες πρωτεΐνες αναφοράς και στον κατάλογο υποψήφιων ασκητικού υγρού, 5% ήταν πρωτεΐνες αναφοράς. Αν χρησιμοποιήσουμε την επικάλυψη των δύο αυτών πειραμάτων, το ποσοστό των υποψήφιων πρωτεϊνών από τα επικυρωμένα αναφοράς λίστας αυξήσεις 7 από 17 (41%).

Πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα σε αμφότερες ρευστά χρωματισμένα μπλε. * Δείκτης Benchmark επικυρωθεί από δοκιμασία ELISA? ** Νέα δείκτης επικυρωθεί από δοκιμασία ELISA.

Η

Εκτός από τα πειραματικά δεδομένα, πίνακας 3 περιλαμβάνει επίσης σχολιασμό για δύο κατηγορίες GO, εξωκυττάρια περιοχή και φλεγμονώδεις ή απάντηση σε τραυματισμό, όπου ένα «ναι» υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη είναι σχολιασμένο για αυτόν τον όρο είτε στο φύλλο ή ένα μητρικό κόμβο. Η «εξωκυτταρική περιοχή» όρος υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη βρίσκεται έξω από την μεμβράνη του πλάσματος και μπορεί να εκκρίνεται στο αίμα. Μεταξύ των 17 πρωτεΐνες, 14 (82%) από αυτούς περιγράφονται ως εξωκυτταρικό σύγκριση με το 17% όλων των πρωτεϊνών που παρατηρείται στα πειράματα. Αυτό δυσαναλογία υποστηρίζει την υπόθεση ότι συνδυάζοντας στοιχεία από κυκλοφορούντα και εγγύς υγρά μπορεί να είμαστε πιο πιθανό να ανακαλύψει βιοδεικτών πρωτεΐνη που εκκρίνεται ή αποβάλλεται από τον όγκο και όχι απορρέουν αλλού στον ξενιστή. Έχουμε επίσης συμπεριλάβει GO όρους που σχετίζονται με τη φλεγμονή σε αυτόν τον πίνακα για να αποκλείσει πρωτεΐνες που μπορεί να μην είναι ειδική για τον καρκίνο. Μόνο δύο από τους 17 πρωτεΐνες επικάλυψης είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε φλεγμονή.

επικύρωση ELISA του IGFBP1

Η κατάσταση επικύρωση όλων των 17 υποψήφιων πρωτεϊνών υποδεικνύεται στον Πίνακα 3. προσδιορισμούς Εμπορική ELISA είναι διαθέσιμες για 8 από τις 17 πρωτεΐνες. Από αυτούς, έξι επικυρώθηκαν σε προηγούμενες μελέτες (βλέπε Πίνακα 1). Τα υπόλοιπα δύο πρωτεΐνες που προέρχονται από τη μελέτη αυτή, ΜΜΡ9 και IGFBP1, αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Η επαλήθευση εκτελέστηκε σε τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο, οι δείκτες δοκιμάστηκαν σε μια σειρά μιγμάτων ποικίλες αναλογίες συγκεντρωμένων ορών από ασθενείς OC και συνενωμένων ορών από τους ελέγχους ΗΑ από το σύνολο φιλτραρίσματος των δειγμάτων (50 OC, 9 έλεγχοι ΗΑ) περιγράφεται στις Μεθόδους. Και οι δύο πρωτεΐνες είχαν υψηλές συγκεντρώσεις στο υψηλό πισίνα OC αλλά μόνο IGFBP1 έδειξε μια εξάρτηση από την συγκέντρωση με την αναλογία των ορών του καρκίνου των ωοθηκών σε έλεγχο. Αμφότερες οι πρωτεΐνες στη συνέχεια εξετάστηκαν έναντι μεμονωμένων δειγμάτων από το σύνολο φιλτραρίσματος (12 OC, 12 ΗΑ έλεγχοι) περιγράφεται στις Μεθόδους. επίπεδα IGFBP1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ορό καρκίνου (p-value = 0,0097), ενώ τα επίπεδα ΜΜΡ9 δεν ήταν (p-value = 0.20). Ένα τρίτο σύνολο των δειγμάτων που περιορίστηκε στο ορώδες περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών (44 SOC, 78 ΗΑ έλεγχοι) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ανύψωση του IGFBP1. Σε αυτό το σύνολο δεδομένων, η σημασία της υπόθεσης για τον έλεγχο διαφορά αυξήθηκε σε 5.0e-4 και η καμπύλη ROC είχε AUC 0,860. Η καμπύλη ROC για αυτά τα δείγματα που φαίνεται στο Σχήμα 4 καταδεικνύει την ικανότητα του IGFBP1 να ταξινομήσει OC έναντι ΗΑ και BST ελέγχους, δείχνοντας τα αποτελέσματα συμφωνούν με τη συμπεριφορά στα πειράματα πρωτεομική.

SOC vs ΗΑ παρουσιάζεται σε μαύρο και SOC vs BST σε μπλε

η

Συζήτηση

πρωτεομικής προφίλ του ορού ή του πλάσματος να ανακαλύψετε βιοδείκτες του καρκίνου δεν έχει ακόμα συναντήθηκε με ευρέως αποδεδειγμένο επιτυχία [19] – [26]. όπου οι πρωτεΐνες επικυρωθούν σε ανεξάρτητα δείγματα ή χρησιμοποιώντας ανεξάρτητες πλατφόρμες. Μια αξιοσημείωτη εξαίρεση είναι μια μελέτη του καρκίνου του παγκρέατος χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού και σε βάθος κλασμάτωση ακέραιες πρωτεΐνες [30]. Σε αυτό το χειρόγραφο έχουμε χρησιμοποιήσει μια παρόμοια προσέγγιση για tandem MS πρωτεομική προφίλ του ορού σε συνδυασμό με το προφίλ των περιτοναϊκό υγρό, όπως εγγύς υγρού όγκου. Έχουμε παράγεται μια σύντομη λίστα των 17 βιοδεικτών που βρέθηκαν μέχρι οργανωμένη και στον ορό και εγγύς υγρό – που περιλαμβάνουν 7 πρωτεΐνες που έχουν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας τα υπάρχοντα δοκιμασίες ELISA, συμπεριλαμβανομένου ενός νέου βιοδείκτη SOC (IGFBP1). Οι υπόλοιποι 10 δείκτες σε αυτή την ομάδα μπορεί να αντιπροσωπεύει την ποιότητα των υποψηφίων υψηλή.

Η επιτυχία μας στον εντοπισμό πολλών επικυρωμένους δείκτες μπορεί να έχουν προκύψει από μια σειρά από χαρακτηριστικά στο σχεδιασμό του πειράματος. Δείγμα προκατάληψη αποβλήθηκε με προσεκτική σφιχτά ταιριάζουν περιπτώσεις με ελέγχους συλλογή δειγμάτων και. Εκτός από το ταίριασμα με βάση την ηλικία, τη φυλή και το οικογενειακό ιστορικό της OC, έλεγχοι και συμφωνημένα στην χρήση HRT και τον αριθμό των ημερών πριν από τη χειρουργική επέμβαση στην κλήρωση του αίματος. HRT έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν δραματικά τα επίπεδα πολλών πρωτεϊνών του ορού [35], [36]. Thorpe

κ.ά.

[37] έδειξε ότι το αίμα που λαμβάνεται την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης που συνδέεται με την ανύψωση αρκετών πρωτεϊνών του ορού. Αυτή η προκατάληψη αποφεύχθηκε εδώ με την προσεκτική αντιστοίχιση του δείγματος με βάση την κατάσταση συλλογή υπόθεση /έλεγχος. Μια άλλη σημαντική πτυχή αυτής της ανάλυσης ήταν η χρήση της εκτεταμένης κλασματοποίησης δείγμα πριν από την σκλήρυνση κατά πλάκας. Αυτό το σχέδιο, το οποίο έχει αποδειχθεί να ληφθεί ευαισθησίες συγκέντρωση 10 ng /ml [35], [36], επέτρεψε μεγαλύτερο βάθος της κάλυψης πρωτεώματος με tandem MS για τον εντοπισμό δυνητικά σημαντικές μεταβολές.

Μια σημαντική πτυχή του σχεδιασμού των πειραμάτων ορού ήταν η χρήση τριών διαφορετικών τύπων θέματα: ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, υγιείς εθελοντές και ασυμπτωματικούς ασθενείς με καλοήθεις όγκους. Πρωτεΐνες επάνω ρυθμισμένη σε SOC σχέση με ΗΑ, αλλά όχι σε σχέση με την BST δεν είναι πιθανό να είναι ειδική για τον καρκίνο και απομακρύνθηκαν από την εξέταση. Το ίδιο ίσχυε πρωτεϊνών πάνω ρυθμισμένα σε σχέση με BST αλλά όχι προς ΗΑ. Χρησιμοποιώντας μόνο το SOC vs σύγκριση BST, θα είχαμε βρει 5 από 7 ποσοτικά έγκυρους δείκτες, σε αντίθεση με 7 από 7 (TIMP1 και SLPI θα αφαιρεθούν).

Συνδυάζοντας τα δεδομένα στον ορό με δεδομένα από πρωτεομική προφίλ της περιτοναϊκής ασκιτικό υγρό μας επέτρεψε να προσδιορίσει μια ομάδα πρωτεϊνών έχουν ένα μεγάλο κλάσμα αληθώς θετικά πρωτεΐνες μας? εξαλείφοντας πρωτεΐνες δεν βρέθηκε επίσης στο περιτοναϊκό υγρό μειώνεται πιθανών υποψηφίων μας 54 – 17, ενώ διατηρεί όλες τις επτά αναφοράς πρωτεΐνες ποσοτικά στον ορό. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται σε μια εγγύς υγρό στον όγκο και επίσης σε ένα κυκλοφορούν ρευστό θα προσδιορίσει αποτελεσματικές βιοδείκτες. Kuk

κ.ά.

[34] έδειξε ότι ασκιτικό υγρό από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών περιείχε μεγάλο αριθμό δεικτών υψηλής ποιότητας, και τα αποτελέσματά μας είναι σύμφωνη με τις διαπιστώσεις αυτές. Ωστόσο, επειδή ο αριθμός των πρωτεϊνών αναφοράς βρέθηκαν σε περιτοναϊκό υγρό είναι υψηλότερη από ό, τι βρέθηκε στον ορό, δεν μπορεί κανείς να κάνει τον ισχυρισμό ότι περισσότεροι δείκτες μπορούν να ταυτοποιηθούν με την απαίτηση παρατηρήσεις και στον ορό και εγγύς ρευστό. Πράγματι, τα δεδομένα μας και ότι από Κουκ

et al.

Δείχνουν ότι ασκιτικού υγρού δεδομένα πρωτεομική μπορεί να περιέχει το μεγαλύτερο αριθμό των δεικτών υψηλής ποιότητας. Τα ευρήματά μας δείχνουν μόνο ότι η απαίτηση πρωτεϊνών που πρέπει να τηρούνται στα δύο δείγματα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μεγαλύτερη αναλογία των δεικτών υψηλής ποιότητας. Η υπόθεση αυτή δεν μπορεί να επιβεβαιωθεί, ωστόσο, χωρίς επίσης να αξιολογεί συστηματικά αλήθεια αρνητική δείκτες, καθώς και πραγματικά θετικά. Επιπλέον, δεν προσδιορίζοντας όλα τα γνωστά δείκτες δεν δείχνουν ότι ο δείκτης δεν είναι υψηλής ποιότητας, ούτε ότι η διαδικασία είναι κατ ‘ανάγκη σε υπαιτιότητά του. Για παράδειγμα, η πλατφόρμα μας δεν ήταν σε θέση να προσδιορίσει CA 125 ούτε άλλες τρεις δείκτες που επιλέχθηκαν αρχικά ως πρωτεΐνες αναφοράς, πιθανώς λόγω των περιορισμών ευαισθησίας φασματομετρία μάζας. Ωστόσο, δεδομένου ότι η πλατφόρμα είναι σε θέση να ποσοτικοποιήσει τις υπάρχουσες έγκυρους δείκτες, κάποιος θα βρει αντιστοιχία μεταξύ των δύο πλατφόρμες καθησυχαστικά, το οποίο βρήκαμε εδώ.

Σε συνδυασμό των δεδομένων τους από τέσσερις διαφορετικές μεθόδους κλασματοποίησης Kruk

κ.ά. .

εντοπίστηκαν 445 πρωτεΐνες συνολικά, ένας αριθμός πολύ χαμηλότερος από τις χιλιάδες των ομάδων πρωτεϊνών που παρατηρήσαμε στα πειράματά μας. Η διαφορά αυτή οφείλεται εν μέρει στην εστίασή τους στο subproteome πρωτεϊνών μικρότερη από 100 kDa ως σύνολο μας περιλαμβάνει 490 πρωτεΐνες μεγαλύτερο από 100 kDa. Αλλά η χρήση της εντατικής κλασματοποίησης μπορεί να ευθύνεται για την υπόλοιπη διαφορά. Παρά τις διαφορές αυτές, τα συμπεράσματα της μελέτης τους είναι σε μεγάλο βαθμό συνεπής με τα ευρήματά μας? μετά την εφαρμογή ορισμένων τεχνικών εξόρυξης δεδομένων, θα μειωθεί λίστα υποψηφίων τους στις 77 πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων 25 γνωστών δεικτών OC), 73 εκ των οποίων παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. Όπως είναι προφανές στο Σχήμα 2, οι σχετικές αφθονίες των πρωτεϊνών Kuk περιλαμβάνουν κάποια που είναι επάνω, καθώς και κάτω? μόνο τα μισά από αυτά είναι πάνω από δύο φορές σε σχέση με την καλοήθη περιτοναϊκό υγρό. Από τους 19 αναφοράς πρωτεΐνες παρατηρήθηκαν σε είτε δεξαμενή περιτοναϊκό υγρό, 17 έχουν φασματικές μετρήσεις δύο φορές υψηλότερη σε SOC από BST. Αυτό υποδηλώνει ότι αν Κουκ

et al

ήταν ακριβής ο ισχυρισμός τους ότι ασκιτικού υγρού είναι μια πλούσια πηγή των πιθανών δεικτών, την εργασία μας δείχνει ότι η ένταξη ενός υλικού ελέγχου μπορεί να είναι χρήσιμη για τη μείωση false positives. Ένα από τα δυνατά σημεία της μελέτης αυτής είναι η χρήση της σχετικής αφθονίας των SOC να BST για να βρείτε τις πρωτεΐνες ειδικά για κακοήθη νόσο.

Το ζήτημα της σύγχυσης φλεγμονωδών πρωτεϊνών (απευθύνεται πρόσφατα από Checlinska

et al

[38]) ελαχιστοποιείται με πολλούς τρόπους στη μελέτη μας. Κατ ‘αρχάς, οι μέθοδοι της εξάντλησης και της κλασματοποίησης μας, μας επιτρέπουν την πρόσβαση σε πρωτεΐνες πέρα ​​από τα εξαιρετικά πλούσια αυτά που συχνά περιλαμβάνουν πολλές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη φλεγμονή. Επιπλέον, οι συγκρίσεις μας μεταξύ καρκίνου και καλοήθη ασθένεια φιλτράρει πολλές πρωτεΐνες που ανεβάζουν λόγω της παρουσίας ενός καλοήθους όγκου? Οι φλεγμονώδεις πρωτεΐνες μοιράζονται από τις δύο συνθήκες εξαλείφονται. Επίσης, δεδομένου ότι είμαστε στόχευση εκκριμένες πρωτεΐνες ψάχνοντας για επικάλυψη μεταξύ πρωτεϊνών στο εγγύς ρευστό και εκείνων που είναι αυξημένα σε ορό, θα μειώσει την πιθανότητα παρατήρησης πρωτεϊνών του ορού συντίθεται στο ήπαρ ως φλεγμονώδη απόκριση. Ακόμα, ο πίνακας 3 περιλαμβάνει δύο πρωτεΐνες (ORM1, SERPINA3) από τους υποψηφίους 17 βιοδεικτών που έχουν ρόλους σε φλεγμονή. Ενώ έχουμε βελτιώσει σημαντικά το ποσοστό των βιοδεικτών που σχετίζονται με τη φλεγμονή σε σχέση με προηγούμενα πειράματα προφίλ [39], [40], δεν μπορούμε να καταργήσετε εντελώς όλα τα συγχυτικούς παράγοντες και πρέπει να βασίζονται σε σχολιασμό όταν θα είναι διαθέσιμα για την προώθηση φιλτραρίσματος.

αυτή η εργασία έχουμε επίσης ανακαλύψει και να επικυρώνεται ένα νέο βιοδείκτη για τη συμπτωματική ορώδης καρκίνο των ωοθηκών, δεσμευτικός παράγοντας ανάπτυξης ινσουλίνης πρωτεΐνη 1. όπως IGFBP2, IGFBP1 είναι μέλος της σύνδεσης παράγοντα ανάπτυξης οικογένεια πρωτεϊνών που μοιάζει με ινσουλίνη και δεσμεύεται τόσο με ινσουλίνη αυξητικοί παράγοντες, IGF1 και IGF2. Όπως και τα άλλα IGFBPs, IGFBP1 εκφράζεται σε τοπικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, και υπάρχει σε φυσιολογικό πλάσμα. Τα επίπεδα ορού του IGFBP1 μειώθηκε σημαντικά σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες που λαμβάνουν θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης [35]. Αν και έχουν αυξημένα επίπεδα IGFBP2 ορού έχουν καταδειχθεί σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών [10], αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι τα επίπεδα IGFBP1 αυξάνουν σε ορό ή πλάσμα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Μια άλλη μελέτη έδειξε αυξημένα επίπεδα IGFBP1 (και IGFBP2) στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνους της κεφαλής και του λαιμού [41].

Τέλος, μπορούμε επίσης να σημειωθεί ότι μεταξύ των 17 δείκτες δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα στον ορό και ασκητικό υγρό του SOC, όλες εκτός από τρεις πρωτεΐνες εκκρίνονται. Αν και είναι συνήθως ισχυρίστηκε ότι εκκρινόμενη πρωτεΐνες θα πρέπει να προτιμάται ως υποψήφιοι λόγω της δυνατότητάς τους να εκκρίνουν στο αίμα, ο ισχυρισμός αυτός δεν είναι συχνά υποστηρίζεται εμπειρικά. Τα δεδομένα μας παρέχει μια ισχυρή υποστήριξη για αυτήν την γενικά αποδεκτή υπόθεση.

Όπως περιγράφεται στην εισαγωγή αυτού του χειρογράφου, αν και έχουν πολλές βιοδείκτες ορού για τον καρκίνο των ωοθηκών έχουν ανακαλυφθεί και επικυρωθεί, όλοι οι δείκτες έχουν δείξει κακή απόδοση σε προ -diagnostic δείγματα. Σε αυτή τη μελέτη, έθεσε ως στόχο να αποδείξει την ικανότητα της πρωτεομική προφίλ του ορού για να ανακαλύψετε ωοθηκών βιοδείκτες του καρκίνου, όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα προφίλ του εγγύς υγρού. Έχοντας αποδείξει την επιτυχία αυτής της προσέγγισης, μπορούμε τώρα να εφαρμόσουν με σιγουριά αυτές τις μεθόδους για πιο προκλητική προ-συμπτωματική δείγματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Πρόσληψη και η συλλογή του ανθρώπινου αίματος και περιτοναϊκό υγρό για την ανακάλυψη

Όλη η έρευνα για την παρούσα μελέτη ήταν ειδικά διεξάγεται υπό Fred Διοικητικό κριτική Θεσμικών Cancer Research Center Hutchinson εγκεκριμένα πρωτόκολλα, IR # 6045 και IR # 6094. Όλα τα ανθρώπινα δείγματα προέρχονται από άτομα που με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα.

ορού από γυναίκες με ορώδες καρκίνο των ωοθηκών (SOC), καλοήθεις όγκοι ορώδες (BST), και από υγιή ασυμπτωματικά (ΗΑ) έλεγχοι χρησιμοποιήθηκε στην πρωτεομική πειράματα ανακάλυψη και επικύρωση μας. Οι Δείγμα πρωτόκολλα συλλογής έχουν περιγραφεί προηγουμένως λεπτομερώς αλλού [32], [37]. Εν συντομία, ο ορός και περιτοναϊκό υγρό από γυναίκες με SOC και BST συλλέχθηκαν πριν από την χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία, ως μέρος ενός καρκίνου των ωοθηκών εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας (SPORE) που χρηματοδοτείται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Διάγνωση του SOC και BST επιβεβαιώθηκαν από την κεντρική επανεξέταση παθολογία. Η ηλικία και η θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης (HRT) μάρτυρες ΗΑ είχαν προσληφθεί μέσω ενός προγράμματος ωοθηκών έλεγχο του καρκίνου, όπου όλοι οι ασθενείς αντιπροσωπεύουν ασυμπτωματικοί έλεγχοι. Όλα τα δείγματα ορού, ανεξάρτητα από την πηγή συλλογής, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ίδιο πρωτόκολλο? αίμα συλλέχθηκε σε Vacutainer 10cc Serum Separator Tubes (SST) και αφέθηκε να καθίσει για 30 λεπτά έως 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν στα 1200- χ g για 10 λεπτά, στη συνέχεια χωρίζεται σε πολλαπλά υποπολλαπλάσια του ορού του 1 ml και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς Κελσίου. Πριν από τη χρήση, το κάθε ένα 1-ml φιαλίδιο ορού αποψύχθηκε πάνω σε πάγο, χωριστεί σε πολλαπλές subaliquots 110 μικρολίτρων, και αποθηκεύεται πίσω στους -80 βαθμούς Κελσίου.

περιτοναϊκό υγρό συνελέγη σε ένα αποστειρωμένο δοχείο κενού σφραγισμένο στο χειρουργείο με χειρουργική προσωπικό. Χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη σύριγγα 1cc, 20.000 μονάδες ηπαρίνης (φιαλίδια περιέχουν 10.000 μονάδες ανά cc) προστέθηκε σε κάθε λίτρο υγρού για την πρόληψη του σχηματισμού θρόμβων στο αίμα. Στο εργαστήριο, το υγρό μεταφέρθηκε σε κωνικά σωληνάρια φυγοκέντρησης (50cc ή 250cc ανάλογα με τον όγκο του υγρού) και περιστράφηκε σε ένα ισορροπημένο φυγόκεντρο στις 2000 rpm για 5 λεπτά για να σφαιροποιηθούν το κυτταρικό συστατικό. Ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε κωνικό σωλήνα ένα 50cc και πέντε 1,5 ml σωληνάρια μικροφυγοκέντρου για αποθήκευση στους -80 βαθμούς Κελσίου καταψύκτη.

Η επιλογή των δειγμάτων για τα πειράματα ανακάλυψη

Μόνο μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες που έχουν συμπεριλήφθηκαν μέσο όρο κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών ή του μαστού (μέση κινδύνου δεν συνεπάγεται σημαντικό οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού ή των ωοθηκών και χωρίς προηγούμενη διάγνωση του καρκίνου) στα πειράματα ανακάλυψη. Το πρώτο πείραμα ανακάλυψη στον ορό σε σύγκριση γυναίκες με προχωρημένο στάδιο SOC σε ελέγχους ΗΑ και το δεύτερο σε σύγκριση με τις γυναίκες με BST. επιλεγμένες ομάδες SOC μεγέθους 4 (με τους υγιείς μάρτυρες) και το μέγεθος 5 (για να BST) ήταν να συνδυάζεται στενά με τους ελέγχους με βάση την ηλικία (+/- 2 έτη), ο χρόνος αποθήκευσης του δείγματος (+/- 1 έτος) και HRT [35 ]. Επιπλέον, επειδή το περιβάλλον συλλογή έχει μια γνωστή επίδραση στην πρωτεώματος ορό [37], περιπτώσεις και έλεγχοι ταίριαζε επίσης με βάση το αν η συλλογή αίματος συνέβη την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης (για SOC έναντι ελέγχων BST) ή αν συλλέχθηκαν τρεις ή περισσότερες ημέρες πριν στη χειρουργική επέμβαση (για SOC έναντι ελέγχων ΗΑ). Για τα πειράματα περιτοναϊκό υγρό, ένα σύνολο δειγμάτων SOC μέγεθος 10 συγκρίθηκε με μία δεξαμενή μέγεθος 4 δείγματα BST. Το μέγεθος της πισίνας για BST είναι μικρότερη γιατί, ενώ ένα μεγάλο μέρος των ασθενών SOC την ανάπτυξη ασκίτη, λίγοι ασθενείς BST παραγωγή συγκρίσιμων ασκιτικού υγρού.

Η επιλογή των δειγμάτων ορού για πειράματα επικύρωση

Τα πειράματα για την επικύρωση της πρωτεΐνες διεξήχθησαν για δύο δείκτες σε τρεις περιγράφηκε προηγουμένως [32], [33] σετ των δειγμάτων ορού. Αυτά τα σύνολα περιλαμβάνονται δύο σύνολα φιλτραρίσματος. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από ομαδοποιημένα δείγματα από 50 ασθενείς OC (πισίνα περίπτωση) σειριακά αραιωμένο με ορό από 9 ΗΑ ελέγχους (πισίνα ελέγχου). Η δεύτερη ομάδα αποτελούνταν από επιμέρους δείγματα από 12 ασθενείς OC και 12 έλεγχοι ΗΑ. Ένα τρίτο μεγαλύτερο σύνολο μεμονωμένων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει πρωτεΐνες που έδειξαν σημαντική ανύψωση στο δεύτερο σετ.