Αφηρημένο

Side πληθυσμού κυττάρων (SP) έχει αναφερθεί ότι έχουν ιδιότητες των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν (ΚΕΠ) σε μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), ακόμα μοριακά χαρακτηριστικά τους δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι, τα κύτταρα NSCLC-SP εμπλουτίστηκαν στο G

0 /G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου, είχαν υψηλότερη δραστηριότητα αφυδρογονάση αλδεΰδη καθώς και υψηλότερα κλωνογονικού και αυτο-ανανέωση ικανότητα σε σύγκριση με το κύριο πληθυσμό (MP) κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα SP ήταν επίσης σε θέση να trans-διαφοροποιηθούν σε αγγειογενετική σωληνάρια

in vitro

και ήταν πολύ ογκογόνο σε σύγκριση με τα κύτταρα MP. όγκοι SP-προέρχεται αποδείξει την εντός του όγκου ετερογένεια περιλαμβάνει τόσο SP και κύτταρα MP, γεγονός που υποδηλώνει την αυτο-ανανέωση και την ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων SP εκδηλώνονται

in vivo

, καθώς και. β-αρρεστίνης-1 (βArr1) εμπλέκεται στην εξέλιξη διαφόρων καρκίνων συμπεριλαμβανομένων NSCLCs και διαπιστώνουμε ότι η εξάντληση των βArr1 μπλοκάρει σημαντικά τον φαινότυπο SP? λαμβάνοντας υπόψη ότι η εξάντληση των βarr2 είχε σχετικά μικρές επιπτώσεις. Έκτοπη έκφραση βArr1 οδήγησε σε αυξημένη έκφραση συχνότητα SP και ABCG2 ενώ κατάργηση της έκφρασης βArr1 κατέστειλε την ανάπτυξη αυτο-ανανέωση και επέκταση των κυττάρων Α549. Αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1 είναι γνωστό ότι είναι ένα από τα βασικά ρυθμιστές της αυτο-ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων των ιστών και πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην επιβίωση των κυττάρων NSCLC. Τα πειράματά μας δείχνουν ότι τα υψηλότερα επίπεδα του Mcl-1 εκφράστηκαν σε κύτταρα SP συγκριτικά με κύτταρα MP τόσο σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Επιπλέον, Obatoclax, μια φαρμακολογική αναστολέας του Mcl-1, θα μπορούσε να αποτρέψει αποτελεσματικά την αυτο-ανανέωση των δύο ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα NSCLC EGFR-αναστολέα. Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι βArr1 και Mcl-1 εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση και την επέκταση των NSCLC-ΚΕΠ και είναι πιθανοί στόχοι για αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Singh S, Bora-Singhal Ν , Kroeger J, Laklai Η Chellappan SP (2013) β-αρρεστίνης-1 και Mcl-1 Modulate αυτο-ανανέωση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων Stem-Όπως Side-Πληθυσμός σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10.1371 /journal.pone.0055982

Συντάκτης: Μινγκ Tan, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10η Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 4 Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Singh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την CA127725 επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Srikumar Π Chellappan είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας για PLoS ONE? αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Παρά τις σημαντικές θεραπευτικές προόδους, ο καρκίνος του πνεύμονα προκαλεί σε όλο τον κόσμο το μέγιστο αριθμό των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο [1 ], [2]. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ), ο καρκίνος του πνεύμονα θα προκαλέσει περίπου 2,5 εκατομμύρια θανάτους ετησίως από το έτος 2030 [3]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, περίπου το 85% των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με NSCLCs, πεθαίνουν από την ασθένεια αυτή εντός πέντε ετών [4], [5]. Αυτά τα στοιχεία υπογραμμίζουν την ανάγκη για καλύτερη κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών γεγονότων στηρίζεται η γένεση της νόσου αυτής για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών. μοντέλο βλαστικών κυττάρων του καρκίνου έχει αναδειχθεί ως ένα βιώσιμο εξήγηση για την έναρξη και την πρόοδο των επιθετικών καρκίνων, όπως NSCLCs και είναι δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι [6], [7], [8], [9], [10].

μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων προτείνει ότι ένα υποσύνολο των κυττάρων που ονομάζεται ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) εντός του όγκου έχουν τις απελευθερωμένες ιδιότητες των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων με σταθερή αυτο-ανανέωση, και μπορεί να παράγει δευτερογενείς όγκους που ανακεφαλαιώνουν την ετερογένεια και ποικιλομορφία του αρχικού όγκου [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Χρωστική Hoechst 33342 εξαιρουμένων κύτταρα, που ονομάζονται πλευρά-πληθυσμός κυττάρων (SP), έχουν περιγραφεί ότι έχουν CSC σαν ιδιότητες σε μία ποικιλία όγκων, συμπεριλαμβανομένων NSCLCs [16], όπου επέδειξαν αυξημένη ογκογονικότητα όταν μεταμοσχεύονται σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [17], [ ,,,0],18] σε σύγκριση με το κύριο πληθυσμό (ΜΡ). φαινότυπος SP εξαρτάται από την διαφορική ικανότητα των κυττάρων να εκρέει η χρωστική Hoechst 33342 μέσω της κασέτας ΑΤΡ-σύνδεσης (ABC) οικογένεια πρωτεϊνών μεταφορέα, κυρίως ABCG2 (επίσης γνωστή ως πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού, BRCP1), το οποίο είναι ειδικά εκφράζεται επί της κυτταρική μεμβράνη των πληθυσμών των βλαστικών κυττάρων [19]. Προγενέστερες μελέτες έχουν αποδείξει την ύπαρξη των κυττάρων SP σε ορισμένες εγκατεστημένος ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC [16] Ωστόσο, οι λεπτομερείς μοριακό χαρακτηρισμό τους καθώς και τη λειτουργική ικανότητα να παράγουν ετερογενή όγκους παραμένει να διευκρινιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε πλήρη απόδειξη ότι το SP κύτταρα που απομονώνονται από τις καθιερωμένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC και όγκοι είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα με NSCLC-ΚΕΠ. Επιπλέον, διαπιστώνουμε ότι ΑΙ_ϋΗ1, η οποία έχει ταυτοποιηθεί ως ένας δείκτης για CSC από άλλους τύπους όγκων, εμπλουτίζονται στο SP κύτταρα από NSCLC. μοριακό μας αναλύσεις δείχνουν ότι βλαστικών κυττάρων, όπως ιδιότητες των κυττάρων SP διέπεται τουλάχιστον εν μέρει από την πρωτεΐνη σκαλωσιές, β-αρρεστίνης-1? Επιπλέον, η πρωτεΐνη επιβίωση Mcl-1 παίζει ένα ρόλο στην αυτο-ανανέωση των κυττάρων αυτών. Έτσι, φαίνεται ότι η στόχευση β-αρρεστίνης-1 ή MCL1 μπορεί να είναι βιώσιμα μέσα αναστολής των κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες βλαστικών κυττάρων SP από NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Ο μη μικροκυτταρικός αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές πνεύμονα, Α549, H1650, Η460 και H1975 ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε RPMI ή ΡΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Mediatech) σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Αν και αυτές οι κυτταρικές σειρές είχαν αρχικά αγοραστεί από ATCC, εμείς δεν τους επανεπικύρωση. Fumitremorgin C (FTC) αγοράστηκε από Sigma Inc και Obatoclax αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals LLC.

Παρασκευή RNA και σε πραγματικό χρόνο qPCR Ανάλυση

εκχύλιση RNA και cDNA παρασκευή ακολουθήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω [20 ], [21], [22]. Real-time PCR έγινε με 1 μL του cDNA σε ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ανίχνευση MyiQ (Bio-Rad) με τη χρήση iQ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διπλώστε επαγωγές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο 2

– (ΔΔCt) χρησιμοποιώντας GAPDH ως γονίδιο εσωτερικού ελέγχου. Τα ζεύγη εκκινητών γονιδίου-ειδική ήταν ως εξής. CD31 (F) 5′- CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 ‘, CD31 (R) 5′-AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT -3′? βArr1 (F) 5’- AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3 ‘, βArr1 (R) 5′-GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3′, Mcl-1 (F) 5’- ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3 ‘, Mcl-1 (R) 5′-TCCTGATGCCACCTTCTAGG -3 », GAPDH (F) 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 ‘, GAPDH (R) 5′-ΟΤΤ GCT GTA GCC ΑΑΑ TTC GTT GT-3’.

Western Blot ανάλυση

τα υλικά λύσεως από ταξινομημένα SP και τα κύτταρα ΜΡ παρασκευάστηκαν με ΝΡ40 λύσεως όπως περιγράφηκε νωρίτερα [20]. Εν συντομία, ταξινομημένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα περιστράφηκαν στις 800

g

και λύθηκαν χρησιμοποιώντας Μ2 ρυθμιστικού λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7,6, 0,5% ΝΡ-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA, και 3 mM EDTA) που περιέχει πρωτεάση αναστολέων. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (50 μ§) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad), εμποδίζεται από 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και επωάστηκαν με τα κατάλληλα πρωτογενή αντισώματα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι ABCG2 και βArr1 αγοράστηκαν από την Millipore και πολύκλωνα αντισώματα κατά του E2F1 και MCL1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc.

χρωστική Hoechst 33342 Δοκιμασία εκροής για την SP Ανάλυση και ταξινόμηση κυττάρων

Τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Accutase αντιδραστηρίου (Sigma Inc). Για μοσχεύματα όγκου, ιστό πρωτοπαθούς ανθρώπινου όγκου αναπτύχθηκαν σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς κιμά, ενζυματικώς σε πέψη με 0.2% κολλαγενάση IV (Worthington Biochemical Corporation) που παρασκευάστηκε στο μέσο που περιέχει 10% FBS για 60 λεπτά στους 37 ° C. Το προϊόν πέψης αναλυθεί περαιτέρω με διαβίβαση μέσω σιφωνίου 10 ml αρκετές φορές και διηθήθηκε μέσω σουρωτήρι στοιχείο 100/70 μm για να ληφθεί ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε DMEM /F12K με 2% FBS σε 1 × 10

6 κύτταρα /ml πυκνότητα και επωάστηκαν με 4 μg /ml του χρωστική Hoechst 33342 (Invitrogen) για 90 λεπτά στους 37 ° C σε παρουσία ή απουσία 1 μΜ FTC, όπως περιγράφεται από Goodell et al. [23]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (PI? Sigma Inc) πριν από την ανάλυση για να απεικονίσει και να αποκλείσει τα μη βιώσιμα κύτταρα. Η χρωστική Hoechst 33342 ήταν ενθουσιασμένος στα 350 nm με τη χρήση λέιζερ UV και ο φθορισμός της αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 400-500 nm φίλτρο BP για το μπλε εκπομπών και 640 – 680 nm φίλτρο BP σε συνδυασμό με 655 nm LP-φίλτρο για το κόκκινο εκπομπών. κυτταρόμετρα ροής από την BD Biosciences χρησιμοποιήθηκαν για απόκτηση δεδομένων. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας LSRII ή FACS Vantage (Diva), και να ταξινομηθούν χρησιμοποιώντας FACS Vantage (Diva) διαλογέα κυττάρων. αναλύσεις των δεδομένων έγιναν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Δέντρο Star).

Aldefluor Δοκιμασία

Το κιτ Aldefluor χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ και ξεχωριστή κύτταρα με υψηλή ΑΙ_ϋΗ δραστηριότητα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Stem Cell Technologies). Εν συντομία, η Hoechst 33342 χρωματισμένα κύτταρα επωάστηκαν με ALDH υπόστρωμα πρωτεΐνη ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ) σε ρυθμιστικό δοκιμασίας Aldefluor συμπληρωμένο με 1 μΜ FTC για την αποτροπή της εκροής Hoechst χρωστική. Μετά από 45 λεπτά επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα που θα μπορούσαν να μετατρέψουν ΒΑΑΑ να φθορίζον προϊόν ΒΟϋΙΡΥ-αμινοξικού του (ΒΑΑ) θεωρήθηκαν ALDH-Hi. Οι πύλες για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής συντάχθηκαν σε σχέση με την αρχική τιμή φθορισμού, η οποία προσδιορίστηκε με την προσθήκη ΑΙ_ϋΗ ειδικών diethylaminobenzaldehyde αναστολέα (ϋΕΑΒ). Τα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με ϋΕΑΒ σερβίρεται μόνο του ως αρνητικός μάρτυρας.

Σφαίρα Σχηματισμός ή αυτο-ανανέωση Δοκιμασία

κυττάρων

Κατάταξη σύμφωνα SP ή MP απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλή πρόσφυση των 96 φρεατίων (Corning) σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /ml (1.000 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μΙ μέσου) σε ελεύθερο ορού DMEM /F12K (1:01) (Invitrogen), συμπληρωμένο με συμπλήρωμα 1Χ-N2 (Invitrogen), 10 ng /ml EGF και 10 ng /ml bFGF (Sigma) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες. Εικόνες των σφαιρών πάρθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon) και ο συνολικός αριθμός των σφαιρών περισσότερο από το 60 μm μετρήθηκαν. Για να μελετηθεί η επίδραση των φαρμάκων επί της αυτο-ανανέωση των κυττάρων SP, φάρμακα προστέθηκαν στα αντίστοιχα φρεάτια την ημέρα 1 και 5 και το μέγεθος (& gt? 60 μm) και τον αριθμό των σφαιρών αναλύθηκαν την ημέρα 10.

In vivo

δοκιμασία σχηματισμό όγκων.

5 εβδομάδων ηλικίας θηλυκά ποντίκια SCID-μπεζ χρησιμοποιήθηκαν για αυτά τα πειράματα κάτω από ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την χρήση και τη συντήρηση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων σε το Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα (Animal Welfare Διασφάλισης Αριθμός A4100-01). Ταξινόμηση SP ή κύτταρα MP από την κυτταρική σειρά H1650 πλύθηκαν με DMEM-F12K ελεύθερο ορού και εναιωρήθηκαν σε ένα μίγμα 1:01 του αυξητικού παράγοντα μειωμένη Matrigel (BD) και HBSS στην υποδεικνυόμενη αριθμούς και εμφυτεύεται υποδορίως. Οι όγκοι των όγκων καθορίζονται μία φορά την εβδομάδα με τη μέτρηση του μήκους (

L

) και το πλάτος (

W

), και ο όγκος υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο

V =

1/2 ×

L

×

W

2as περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22], [24], [25]. Η κατάσταση της υγείας των ποντικών παρακολουθήθηκε καθημερινά για σημάδια δυσφορίας, συμπεριλαμβανομένων αδράνειας, της υποκινητικότητας, υπερκινητικότητας, ανησυχία, αυτο-τραύμα, επιθετικότητα, απομόνωση από τους συντρόφους κλουβί, αταξία, ρηχή, ταχεία και /ή δυσκολία στην αναπνοή, ωχρότητα βλεννογόνων, κυάνωση , η αποτυχία να καλλωπίσει, καχεξία, λερωμένα περιοχή του ανώτερου γεννητικού συστήματος, η αδυναμία να ανταποκριθεί σε ερεθίσματα, έλλειψη περιέργεια, φώνηση, ασκίτης, και /ή κυρτή στάση. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Στο τέλος του πειράματος, τα ζώα θα ευθανασία με έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις CO

2 σε ένα ειδικό CO

2 θάλαμος? συμπιεσμένο αέριο χρησιμοποιήθηκε μια πηγή για το CO

2.

Στατιστικές Μέθοδοι

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Για να εκτιμηθεί η στατιστική σημασία των διαφορών,

t

δοκιμή Student εκτελέστηκε. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Microsoft Excel. Τα στοιχεία θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν το

σ

αξία ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

SP κύτταρα από NSCLC Επίδειξη Stem Cell-όπως ιδιότητες

έγιναν προσπάθειες να εκτιμηθεί το ποσοστό των κυττάρων SP σε τέσσερις διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC, επιλέγονται βάσει του K-Ras ή κατάσταση μετάλλαξης EGFR. Α549 (K-Ras μεταλλαγμένο? Άγριου ενίσχυση EGFR τύπου) και Η460 (K-Ras μεταλλαγμένο), καθώς και H1650 (EGFR μεταλλαγμένο? Εξόνιο 20 διαγραφή: delE746-A750) και H1975 (EGFR μεταλλαγμένο? L858R και μεταλλάξεις Τ790Μ) κυττάρων που περιέχονται SP β-κύτταρα με διαφορετική συχνότητα που κυμαίνεται από περίπου 8% (H1975) έως 40% (Η460). Ένας ειδικός αναστολέας του ABCG2 [26], Fumitremorgin C (FTC) θα μπορούσε να μπλοκάρει την εμφάνιση των κυττάρων SP (Σχήμα 1Α), υποδηλώνοντας ότι αυτή η συγκεκριμένη μεταφορέας παίζει ένα συγκεκριμένο ρόλο στη διατήρηση του φαινοτύπου SP. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα SP είναι παρόντες στις γραμμές NSCLC, και ο επιπολασμός τους είναι ανεξάρτητη από K-Ras ή την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR.

(Α) FACS ανάλυση σε ενιαίο εναιώρημα κυττάρων των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών NSCLC βάφονται με Hoechst 33342 βαφή δείχνει κύτταρα SP. Τα κύτταρα SP περικλείεται εντός της περιοχής που οριοθετείται σε ροζ χρώμα. Fumitremorgin C ανέστειλε την εκροή της χρωστικής και προκάλεσε την εξαφάνιση των κυττάρων SP. Η συχνότητα των κυττάρων SP εκπροσωπείται. (B, C) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου μέσω της παραμέτρου περιοχή-ιστόγραμμα για το μπλε εκπομπή του Hoechst 33342, όπως περιγράφεται στο κείμενο. Το προφίλ φαίνεται στο Β είναι ο εκπρόσωπος για όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. (Δ) Aldefluor δοκιμασία για Hoechst 33342 βάφονται H1975 και H1650 κυττάρων. Ο φθορισμός βασική γραμμή ιδρύθηκε από την αναστολή της δραστικότητας ALDH με ϋΕΑΒ (αριστερά) για να δημιουργήσει την πύλη για τον εντοπισμό ALDH-Hi κύτταρα σε συνολικό καθώς και το SP και τα κύτταρα MP που δεν έχουν επωαστεί με ϋΕΑΒ (τρία δεξιά πάνελ). Όλα τα κύτταρα ΑΙ_ϋΗ-Hi περικλείεται εντός της περιοχής που οριοθετείται σε ροζ χρώμα. Η πλάσια διαφορά στη συχνότητα των ΑΙ_ϋΗ-Hi κυττάρων μεταξύ SP και κυττάρων ΜΡ χαράσσεται.

Η

Έχει προταθεί ότι τα βλαστικά κύτταρα φυσιολογικού ιστού και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν καρκινικά κινήσεως έχουν διαφορετικά προφίλ κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με διαφοροποιημένα κύτταρα, και προχωρούν μέσω του κύκλου του κυττάρου βραδύτερη [27], [28]. Με δεδομένο αυτό το φόντο, κάναμε προσπάθειες να εξετάσει κατά πόσον το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SP διέφερε από εκείνη των διαφοροποιημένων κυττάρων MP. Για να εξεταστεί η κατανομή του κυτταρικού κύκλου, το προφίλ ιστόγραμμα που δημιουργείται από την παράμετρο περιοχή για μπλε εκπομπή Hoechst 33342 χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η κατανομή του κυτταρικού κύκλου φάση για SP και τα κύτταρα ΜΡ. Εφόσον η θεραπεία FTC επιτρέπει τόσο SP και κύτταρα MP για να διατηρήσουν τη χρωστική Hoechst 33342, το δείγμα αυτό χρησιμοποιήθηκε για να σηματοδοτήσει τα όρια για το G

1 και S-G

2 /M φάσεις, με βάση το περιεχόμενο DNA τους. Παρόμοια πύλες εφαρμόστηκαν για τα δείγματα όπου FTC δεν προστέθηκε και έτσι SP κύτταρα εμφανίστηκε ως υπο-G

0 /G

1 πληθυσμού (Εικόνα 1Β). Κατά τη σύγκριση της κατανομής της FTC κατεργασμένα και ακατέργαστα κύτταρα, βρέθηκε ότι το 80-100% των κυττάρων SP ήταν στην G

0 /G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου, εξαρτάται από την κυτταρική σειρά (Εικόνα 1C). Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα SP είχε περισσότερο G

0 /G

1 κύτταρα από τα κύτταρα MP από την ίδια κυτταρική γραμμή, υποδεικνύοντας ότι έχουν εξασθενημένα εξέλιξης χαρακτηριστικό του κυτταρικού κύκλου των αρχέγονων κυττάρων που μοιάζουν.

διεξήχθησαν πειράματα για να εξεταστεί εάν οι άλλοι δείκτες καρκίνου των βλαστικών κυττάρων που εκφράζεται σε κύτταρα SP. Προς το σκοπό αυτό, κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε για τη δραστηριότητα της αφυδρογονάσης αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ-Hi), η οποία έχει χρησιμοποιηθεί πρόσφατα ως πιθανή δείκτη για τον εντοπισμό CSCs σε NSCLCs [29], [30]. Ανάλυση χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Aldefluor επί H1650 και H1975 κυτταρικές γραμμές έδειξαν 8 και 6 φορές υψηλότερη συχνότητα από ΑΙ_ϋΗ-Hi κύτταρα σε κύτταρα SP σε σύγκριση με τα κύτταρα MP, υποδεικνύοντας ότι τα SP κύτταρα που απομονώνονται από κυτταρικές σειρές NSCLC είναι εμπλουτισμένα σε βλαστικά σαν κύτταρα (Σχήμα 1D), όπως φαίνεται από την έκφραση ενός διαφορετικού δείκτη. Συνολικά, περίπου 1,3% των κυττάρων H1650-SP και 2% των κυττάρων H1975-SP ήταν ΑίϋΗ-Hi κύτταρα.

SP κύτταρα Προβολή Stem Cell-όπως χαρακτηριστικά

in vitro

Η

In vitro

πειράματα διεξήχθησαν για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η SP και τα κύτταρα ΜΡ. Μετά διαλογή κυττάρων, τα κύτταρα απλώθηκαν σε υψηλή πυκνότητα (10,000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων) σε πλήρες μέσο και ελέγχονται για 6 ημέρες με δοκιμασία ΜΤΤ. H1650-SP και κυττάρων MP είχαν συγκρίσιμες ικανότητα πολλαπλασιασμού όταν καλλιεργούνται σε πλήρες μέσο υπό συνθήκες προσκολλημένα (Σχήμα 2Α), προτείνοντας ότι αμφότερα τα ταξινομημένα κλάσματα κυττάρων είναι εξίσου υγιείς και Hoechst 33342 χρώσης χρωστικής για ανάλυση SP και πρωτόκολλο διαλογής κυττάρων είχε καμία επιβλαβή επίδραση επί Αυτά τα κύτταρα. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των βλαστικών κυττάρων είναι η ικανότητά τους να αυτο-ανανέωση, αλλά και να οδηγήσει σε πιο διαφοροποιημένα κύτταρα, μέσω ασύμμετρης κατανομής [15]. Αυτο-ανανέωση φυσιολογική ή καρκίνο βλαστικών σαν κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν ως μη προσκολλημένα σφαίρες όταν καλλιεργούνται σε χαμηλή πυκνότητα σε ελεύθερο ορού, βλαστικών κυττάρων εκλεκτικό μέσο? διαφοροποιημένα κύτταρα δεν αναπτύσσονται ή σχηματίζουν τις σφαίρες σε αυτό το μέσο [13], [31], [32]. Η ιδιότητα αυτο-ανανέωση των κυττάρων SP εξετάστηκε εκτελώντας δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας χρησιμοποιώντας SP και κύτταρα που απομονώνονται από ΜΡ H1650 κύτταρα. Ενώ τα κύτταρα SP ήταν σε θέση να αναπτυχθούν ως σφαίρες, τα κύτταρα MP είχαν σημαντικά μικρότερη ικανότητα να αναπτύσσονται κάτω από παρόμοιες συνθήκες (Σχήμα 2Β) υποδηλώνοντας ότι αυτο-ανανέωση ικανότητα χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων εμφανίζεται μόνο από κύτταρα SP. Στη συνέχεια εξετάστηκε η κλωνογόνο δυναμικό των δύο SP και κυττάρων MP με επίστρωση των κυττάρων και καλλιέργεια στους κλωνική πυκνότητα (1000 κυττάρων σε πλάκα 60 mm) για 21 ημέρες σε μέσα που περιέχουν FBS. Σε αυτόν τον πίνακα, τα κύτταρα επιστρώνονται σε πολύ χαμηλή πυκνότητα, και μακροπρόθεσμα τον πολλαπλασιασμό τους και την ικανότητά σχηματισμού αποικιών ελέγχθηκε. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, σχηματισμό μεγάλων αποικιών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μεταξύ των SP κύτταρα από ότι ήταν μεταξύ των κυττάρων MP. Η βιωσιμότητα των κυττάρων σχηματισμού αποικίας προσδιορίστηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Σχήμα 2D), συλλογικά παρέχουν αποδείξεις ότι τα κύτταρα SP εμφανίζουν αυξημένη κλωνογονικότητας.

(Α) Καμπύλη ανάπτυξης για 10.000 H1650-SP ή ΜΡ κύτταρα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων σε κανονικό μέσο ανάπτυξης [22]. (Β) SP ή κύτταρα MP από την κυτταρική σειρά H1650 απλώθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένου με EGF και bFGF για 10 ημέρες. Ο αριθμός μέσου όρου (± SD) των σφαιρών από 1000 κύτταρα χαράσσεται. κύτταρα (C) H1650-SP οδήγησε σε μεγαλύτερες και περισσότερο αποικίες σε σύγκριση με κύτταρα MP όταν επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1000 κυττάρων ανά πλάκα 60 mm. βιωσιμότητα (D) Cell προσδιορίστηκε μετά από 21 ημέρες από επιμετάλλωση μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ. (Ε) SP ή ΜΡ κύτταρα απλώθηκαν σε Matrigel και αναπτύχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης ενδοθηλιακού (Lonza) όλη τη νύχτα. κύτταρα SP οδήγησε αγγειογόνων όπως σωληνάρια αποτελεσματικά. (F) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qPCR για SP και τα κύτταρα βουλευτής πραγματοποιείται για

CD31

έκφραση του mRNA. (G) έκφραση CD31 επί αγγειογόνων σωληνάρια όπως οπτικοποιείται με ανοσοφθορισμό.

Η

ορισμένοι τύποι όγκων έχει αναφερθεί ότι επιδεικνύουν αγγειακή μιμητισμό, λόγω της ικανότητας των κυττάρων του όγκου για να αποκτήσουν ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων και άλλων κυτταρικών συστατικά του αγγειακού συστήματος [33], [34], [35]. Ο ρόλος των καρκινικών βλαστικών κυττάρων στο πλαίσιο αυτό εξετάστηκε και, πρόσφατες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η ΚΕΠ από γλοιώματα μπορούσε trans-διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά καταγωγή [33], [34], [35]. Με δεδομένο αυτό το φόντο, εξετάσαμε την ικανότητα των κυττάρων H1650 SP για να σχηματίσουν αγγειογενετική σωληνάρια

in vitro

. H1650-SP κύτταρα απλώνονται επί matrigel σχηματίζεται ένα δίκτυο αγγειογόνου σωληναρίων κατά την αγωγή με VEGF, ενώ τα κύτταρα ΜΡ ήταν σημαντικά μειωμένη σε αυτή την ικανότητα (Σχήμα 2Ε). Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα MP παρέμεινε σχετικά ανοργάνωτη, σε σύγκριση με την οργανωμένη σωληνάριο σαν δομές που σχηματίζονται από τα κύτταρα SP. Διεξήχθησαν πειράματα για να αξιολογηθεί κατά πόσον η σωληναρίου όπως δομές που αποτελούνται από κύτταρα SP εμφανίζουν βιοχημικά χαρακτηριστικά των αγγειογόνων αγγείων. Προς το σκοπό αυτό, σε πραγματικό χρόνο διεξήχθη κατ ‘αρχάς ανάλυση PCR, η οποία έδειξε μια υψηλότερη έκφραση των ενδοθηλιακών ειδικών

CD31

mRNA σε κύτταρα SP σε σύγκριση με κύτταρα MP (Σχήμα 2F). Περαιτέρω, η χρώση ανοσοφθορισμού των σωληναρίων έδειξε ότι αυτές οι σωληνάρια που αποτελούνται από κύτταρα SP ήταν ισχυρώς θετικά για έκφραση CD31 (Σχήμα 2G), υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα SP μπορεί να επιτύχει μια ενδοθηλιακή γενεαλογία. Αυτά τα πειράματα αποκαλύφθηκε ότι το SP κύτταρα που απομονώνονται από μια κυτταρική γραμμή NSCLC μπορεί transdifferentiate σε ενδοθηλιακά κύτταρα παρόμοια και να είναι σε θέση να προκαλέσουν αγγειογόνο σωληνάρια στους όγκους.

Τα SP κύτταρα εμπλουτίζονται με ογκογόνα κύτταρα και απέδειξαν Self- ανανέωση και διαφοροποίηση της SP κύτταρα

in vivo

η

με δεδομένη την ικανότητα των κυττάρων SP στον εαυτό ανανεώσει και να διαφοροποιηθούν σε αγγειογενετική σωληνάρια καθώς και κύτταρα MP, έχουμε την επόμενη εξέτασε την ικανότητα των SP ή κυττάρων MP να σχηματίζουν όγκους σε SCID ποντίκια. SP και ΜΡ κύτταρα από κυτταρική γραμμή H1650 εμφυτεύθηκαν υποδορίως στην ραχιαία λαγόνες των ποντικών SCID και η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε εβδομαδιαίως με μετρήσεις καλίμπρας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, τέσσερα ποντίκια (η = 5) εγχύθηκαν με 10.000 SP κύτταρα παρήγαγαν μεγάλους όγκους (όγκος ~1400 mm

3) εντός 11 εβδομάδων από την εμφύτευση. Ωστόσο, παρόμοια αριθμοί κυττάρων ΜΡ ήταν σημαντικά μειωμένη στην ικανότητά τους να σχηματίζουν όγκους εντός του ίδιου χρονικού πλαισίου? οι όγκοι ήταν σχετικά μικρότερα και παρέμεινε κοντά στο εμφυτευμένο μεγέθους (volume~100 mm

3) (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω, τα κύτταρα SP που σχηματίζεται όγκων ακόμη και με 1.000 κύτταρα (όγκος ~471 ± 141 mm

3) μετά από 19 εβδομάδες εμφύτευσης, ενώ παρόμοιο αριθμό κυττάρων ΜΡ απέτυχαν ήταν να δημιουργήσει οποιουσδήποτε όγκους (Σχήμα 3Α).

(Α) ταξινόμηση SP και κυττάρων MP από την κυτταρική σειρά H1650 εμφυτεύθηκαν στα πλευρά των ποντικών SCID. Tumor συχνότητα και ο μέσος όγκος (± τυπικό σφάλμα) των όγκων που σχηματίζονται εντός της ενδεικνυόμενο χρόνο πινακοποιούνται. κινητική (Β) Ανάπτυξη των όγκων από τα κύτταρα SP και ΜΡ, μετρήθηκε εβδομαδιαίως. Τα σημεία αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο (± τυπικό σφάλμα). (Γ) Η υποδόρια καρκινώματα που προέρχονται από κύτταρα 10000 H1650-SP ή 100.000 κύτταρα H1650-ΜΡ αποκόπηκαν και αναλύθηκαν για φαινότυπο SP παρουσία ή απουσία του FTC. Όγκοι από SP και κύτταρα βουλευτής περιέχεται κυρίως διαφοροποιημένα κύτταρα MP.

Η

Για να αποσαφηνιστεί εάν οι όγκοι που δημιουργούνται από τα κύτταρα SP είχε ετερογενή SP και κύτταρα MP, Hoechst 33342 χρώση και SP ανάλυση έγινε μετά από ενζυματική διάσπαση του υποδόριου όγκου ξενομοσχεύματα. Οι όγκοι που δημιουργούνται από 10.000 κύτταρα H1650-SP αποτελούνταν κυρίως από κύτταρα MP ενώ SP κύτταρα διατηρήθηκαν σε συχνότητα περίπου 3% εντός του όγκου (Σχήμα 3C, άνω πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα SP είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα με ΚΕΠ που είναι σε θέση τους οδηγούν στην όγκων, καθώς και αυτο-ανανέωση και διαφοροποιηθούν

in vivo

. Ωστόσο, οι όγκοι που δημιουργούνται σε ένα ποντίκι (από τις τρεις) κατά την εμφύτευση του 100.000 κύτταρα H1650-ΜΡ αποδειχθεί η αποδιαφοροποίηση των κυττάρων MP να παράγουν κύτταρα SP

in vivo

(Σχήμα 3C, κάτω πλαίσιο), μετά από 9 εβδομάδες σε Αυτά τα ποντίκια (Σχήμα 3Β). Πράγματι, έχει αναφερθεί ότι τα διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι σε θέση να απο-διαφοροποιηθούν και να αποκτήσουν τις ιδιότητες των βλαστικών όπως και σε ορισμένες περιπτώσεις [36], πιθανώς να διευκολύνει την καθυστερημένη ανάπτυξη των όγκων.

βArr1 Ρυθμίζει την αυτο-ανανέωση η ανάπτυξη του SP Cells

β-αρρεστίνης-1 (βArr1) είναι μια πρωτεΐνη σκαλωσιά που παίζει σημαντικό ρόλο στην απευαισθητοποίηση του G-πρωτεΐνη υποδοχείς [20], [37], [38], [39], [40]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι βArr1 παίζει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση των Src κινασών από διάφορους υποδοχείς και μπορεί να διευκολύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [38], [41]. Περαιτέρω, τα επίπεδα βArr1 βρέθηκαν να είναι αυξημένα σε μεταστατικό NSCLC και άλλους καρκίνους σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό ή πρωτογενών όγκων [20], [39], [40], [41]. Δεδομένης της συσχέτισης του βArr1 με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση, εξετάσαμε κατά πόσο αυτή η πρωτεΐνη παίζει κάποιο ρόλο στις βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες των κυττάρων SP. Στην πρώτη ομάδα πειραμάτων, siRNAs να βArr1 ή των σχετικών γονιδίων βarr2 επιμολύνθηκαν σε H1650, H1975 και Α549 κύτταρα? ένα siRNA μη στόχευση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Διαπιστώθηκε ότι παροδική επιμόλυνση των βArr1 ειδικών siRNA μείωσε την συχνότητα των κυττάρων SP κατά περίπου 40 έως 70%? η μείωση ήταν μόνο 10 έως 20%, όταν βarr2 siRNA διαμολύνθηκε (Σχήμα 4Α)? γεγονός που υποδηλώνει σημαντικό ρόλο της βArr1 στη ρύθμιση της συχνότητας SP. Για την περαιτέρω διαλεύκανση του ρόλου των βArr1 στις stem-σαν λειτουργίες των κυττάρων SP, δημιουργήσαμε Α549 κύτταρα που σταθερώς υπερεκφράζονται βArr1 αρουραίου, ή εκείνες που ήταν σταθερά διαμολυσμένα με ένα shRNA να βArr1. Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά βArr1 είχε περίπου τρεις φορές περισσότερα κύτταρα SP σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου Α549 που εκφράζουν σταθερά GFP (Α549-GFP). Αντιθέτως, μια σταθερή μείωση της βArr1 χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο shRNA (Α549-shβArr1) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση στη συχνότητα SP σε σύγκριση με μια κυτταρική γραμμή που σταθερά επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης shRNA (Α549-Control) (Σχήμα 4Β). Real-time PCR πειράματα διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί κατά πόσον οι αλλαγές στη συχνότητα SP συσχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα ABCG2. Διαπιστώθηκε ότι Α549 που υπερεκφράζουν σταθερά βArr1 είχε δύο φορές περισσότερο μήνυμα ABCG2 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με GFP. Αντιστρόφως, τα κύτταρα εξαντλούνται από βArr1 είχαν σημαντικά χαμηλότερα μήνυμα ABCG2 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν shRNA (Σχήμα 4C). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western (Εικόνα 4D)? βρέθηκε ότι null κύτταρα βArr1 είχαν χαμηλότερες ποσότητες ABCG2 καθώς βArr1, αλλά συγκρίσιμες ποσότητες β-ακτίνης και E2F1, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι.

(Α) H1650, H1975 και Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με siRNA εναντίον βArr1 και βarr2. Συχνότητα των κυττάρων SP συγκρίθηκε με μη-στόχευση siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. Τα κύτταρα SP περικλείεται εντός της περιοχής που οριοθετείται σε ροζ χρώμα. διαγράμματα Bar αντιπροσωπεύουν το πλάσια διαφορά στη συχνότητα σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα στις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές. (Β) η συχνότητα SP αναλύθηκε και εκπροσωπείται για τα κύτταρα Α549 εκτοπικά εκφράζουν αρουραίος-βArr1 ή GFP και shRNA έναντι βArr1 ή ελέγχου μη-στόχευση shRNA. (C) σε πραγματικό χρόνο PCR και ανάλυση δυτικής κηλίδας (D) για έκφραση ABCG2 διεξήχθη για αυτές τις σταθερές κυτταρικές σειρές. (Ε, F, G) Α549 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά shRNA έναντι βArr1 και μη στόχευση shRNA απλώθηκαν για δοκιμασία αυτο-ανανέωση. Τα (Ε) Φάση εικόνες μικροσκοπία αντίθεσης των σφαιρών σε παρουσία ή απουσία φαρμάκων που παρουσιάζονται. (F, G) Μέσος αριθμός και το μέγεθος των σφαιρών που παράγονται ανά καλά από 1000 κύτταρα χαράσσεται (μέση τιμή ± SD).

Η

Δεδομένου του ρόλου της βArr1 στην παραγωγή των κυττάρων SP, είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον Αυτή η πρωτεΐνη διευκολύνει αυτο-ανανέωση, καθώς και. Προς το σκοπό αυτό, τα κύτταρα SP απομονώθηκαν από κύτταρα Α549 που εκφράζουν σταθερά ένα shRNA έναντι βArr1 ή μη στόχευσης ελέγχου shRNA και ιδιοκτησία αυτο-ανανέωση αξιολογείται με δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας. Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα που στερούνται βArr1 είχαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό σφαιρών (Σχήμα 4Ε)? περαιτέρω, το μέγεθος των σφαιρών που σχηματίζονται από μηδενικά κύτταρα βArr1 ήταν σημαντικά χαμηλότερα από εκείνα που σχηματίζονται από την SP κύτταρα από τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4F, G). Αυτά τα πειράματα δείχνουν σαφώς ότι η πρωτεΐνη σκαλωσιές βArr1 παίζει ένα ρόλο στη δημιουργία των κυττάρων SP μέσω της ρύθμισης της έκφρασης ABCG2 και επίσης διευκολύνει την ιδιότητα αυτο-ανανέωση αυτών των NSCLC βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

Αναστολέας της Mcl- 1 Στόχοι η ανάπτυξη αυτο-ανανέωση της SP κύτταρα

Ενισχυμένη επιβίωση των κυττάρων και αντοχή στα φάρμακα είναι ένα χαρακτηριστικό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [10], [42]. Η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1, είναι ένα από τα πιο συχνά ενισχυμένα γονίδια στον καρκίνο του ανθρώπου συμπεριλαμβανομένου NSCLCs [22], [43], [44],. Πρόσφατα, μελέτες έχουν επίσης συσχετίσει τη λειτουργία Mcl-1 με ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [48], [49]. Δεδομένου του δυνητικού ρόλου των Mcl-1 σε αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα, έχουμε την επόμενη διερευνηθεί αν Mcl-1 λειτουργία συμβάλλει στην ιδιοκτησία αυτο-ανανέωση των κυττάρων NSCLC-SP. Ως πρώτο βήμα, qRT-PCR διεξήχθη σε RNA που απομονώνεται από SP και κύτταρα που απομονώνονται από ΜΡ H1650, Α549 και H1975 κυτταρικές σειρές. Mcl-1 μήνυμα εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα SP από όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 5Α). Το επίπεδο πρωτείνης Mcl-1 επίσης αυξημένα σε SP κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα MP σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, όπως φαίνεται με κηλίδωση Western (Σχήμα 5Β).

(Α, Β) σχετική έκφραση του Mcl-1 εξετάστηκε σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης για υποδεικνύεται κυτταρικές γραμμές με RT-PCR και ανάλυση κηλίδας western. (Γ) της δομής της Obataoclax και το χρονοδιάγραμμα της θεραπείας της εκπροσωπείται. κύτταρα (D) H1650-SP ταξινομήθηκαν και καλλιεργήθηκαν για δοκιμασία αυτο-ανανέωση, παρουσία ή απουσία Obatoclax στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση. Μέσος αριθμός σφαιρών που παράγονται ανά φρεάτιο από 1000 κύτταρα χαράσσεται (μέση τιμή ± SD). Οι Φάση εικόνες μικροσκοπίας αντίθεσης των σφαιρών σε παρουσία ή απουσία φαρμάκων που παρουσιάζονται. (Ε) κύτταρα SP διαλέχθηκαν από ανθεκτικά erlotinib H1975 κυτταρική γραμμή και καλλιεργήθηκαν για δοκιμασία αυτο-ανανέωση με την παρουσία ή απουσία υποδεικνύεται φαρμάκων. Οι Μέσος αριθμός σφαιρών που παράγονται ανά φρεάτιο από 1000 κύτταρα χαράσσεται (μέση ± SD) και (F) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης εικόνες των σφαιρών σε παρουσία ή απουσία φαρμάκων που παρουσιάζονται. (G) Ανάλυση Western blot-του βArr1 και βarr2 σε Obatoclax επεξεργασμένα κύτταρα. Αναστολή της Mcl-1 δεν επηρεάζει την έκφραση του βArr1 και βarr2 σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

Η

Obatoclax είναι ένα υδρόφοβο μόριο (Σχήμα 5C), που αναπτύχθηκε ως ανταγωνιστής οικογένεια Bcl-2 συμπεριλαμβανομένων Mcl-1 [50]. Obatoclax έχει δειχθεί να ξεπεράσει την αντίσταση στην απόπτωση που προκαλείται ειδικώς από Mcl-1 [51]. Ως εκ τούτου, εδώ χρησιμοποιήσαμε Obatoclax να διερευνήσει τον ρόλο των Mcl-1 σε αυτο-ανανέωση των κυττάρων SP, διεξάγοντας σφαίρα δοκιμασίες σχηματισμού υπό την παρουσία ή απουσία Obatoclax. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, τα κύτταρα σπάρθηκαν την ημέρα 1 για δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας και Obatoclax προστέθηκε επί day1 και την ημέρα 5 σε υποδεικνυόμενη δόση. Μετά από 10 ημέρες από την επίστρωση του αριθμού των σφαιρών μετρήθηκαν και αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, η αναστολή της δραστικότητας Mcl-1 με 200 ηΜ Obatoclax έδειξε μια 4-5 φορές μείωση στον αριθμό των σφαιρών? περαιτέρω το μέγεθος των σφαιρών μειώθηκε επίσης σημαντικά, όπως φαίνεται στην εικόνα πάνω από τη γραμμή (Εικόνα 5D). 500 nM συγκέντρωση Obatoclax κατέστειλε εντελώς τη σφαίρα σχηματισμό (Σχήμα 5D).

Η erlotinib και gefitinib είναι αναστολείς του EGFR που δείχνουν σημαντική αποτελεσματικότητα στη θεραπεία ασθενών με NSCLC που φέρουν μεταλλάξεις του EGFR [52], [53]. Ταυτόχρονα, μια δευτερεύουσα σημειακή μετάλλαξη στο εξώνιο 20 του EGFR (Τ790Μ) συνδυάζεται με επίκτητη ανθεκτικότητα σε αναστολείς EGFR, συμπεριλαμβανομένων των Η erlotinib [52].