Αφηρημένο

BTN3A2 /BT3.2 βουτυροφιλίνη έκφραση του mRNA από κύτταρα όγκου προηγουμένως αναγνωρίστηκε ως προγνωστικός παράγοντας σε μια μικρή ομάδα από υψηλής ποιότητας ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (HG-EOC). Εδώ, αξιολογήσαμε την προγνωστική αξία της BT3.2 στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε δείγμα από 199 ασθενείς HG-EOC. Δεδομένου ότι η μόνη γνωστή ρόλος των πρωτεϊνών βουτυροφιλίνη είναι στην ανοσολογική ρύθμιση, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BT3.2 και ενδοογκική διείσδυση ανοσοκυττάρων με ανοσοϊστοχημεία με ειδικά αντισώματα έναντι BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 και CD206. έκφραση Επιθηλιακά BT3.2 συσχετίστηκε σημαντικά με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση και χαμηλότερο κίνδυνο εξέλιξης της νόσου (HR = 0,651, p = 0,006 και HR = 0,642, ρ = 0,002, αντίστοιχα) και σχετίζεται σημαντικά με μια υψηλότερη πυκνότητα του διηθητικά Τ κυττάρων, ιδιαίτερα CD4 + κυττάρων (0,272, p & lt? 0.001). Παρατηρήσαμε επίσης μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της σχετικής πυκνότητας των κυττάρων CD206 +, όπως αξιολογήθηκε από την αναλογία του ενδοογκική CD206 + /CD68 + έκφραση, και τον κίνδυνο εξέλιξης της νόσου (HR = 1,355 ρ = 0,044, αντίστοιχα). Εν κατακλείδι, BT3.2 πρωτεΐνη είναι ένας δυνητικός προγνωστικό βιοδείκτη για την ταυτοποίηση των ασθενών HG-ΕΓΚ με καλύτερο αποτέλεσμα. Αντίθετα, υψηλή CD206 + /CD68 + έκφραση συνδέεται με υψηλό κίνδυνο εξέλιξης της νόσου. Ενώ ο ρόλος της BT3.2 είναι ακόμα άγνωστη, αποτέλεσμα μας δείχνουν ότι BT3.2 έκφραση από επιθηλιακά κύτταρα μπορεί να ρυθμίζει την εντός του όγκου διείσδυση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος

Παράθεση:. Le Page C, Marineau Α, Bonza PK, Rahimi Κ, L Cyr, Labouba I, et al. (2012) Έκφραση BTN3A2 σε επιθηλιακά καρκίνου των ωοθηκών συνδέεται με υψηλότερα διηθούν τους όγκους Τ κυττάρων και μια καλύτερη πρόγνωση. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10.1371 /journal.pone.0038541

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Φεβρουαρίου 2012? Δεκτές: 7 Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 7, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Le Page et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Cancer Research Society και Fondation Carole Epstein. Ο Δρ Cailhier κατέχει μια υποτροφία clinicien-chercheur από το Fonds de Recherche en Santé du Québec. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

Τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των γυναικολογικών κακοηθειών [1]. Λόγω της έλλειψης συμπτωμάτων, αυτή η ασθένεια είναι συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο (στάδιο ΙΙΙ ή IV), όταν ο καρκίνος έχει ήδη εξαπλωθεί σε δευτερεύουσες θέσεις. Η τυπική θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς είναι η χειρουργική επέμβαση και με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία, αν και η νόσος εξελίσσεται συχνά ακόμη και μετά τη χειρουργική επέμβαση και γίνεται ανθεκτική στη χημειοθεραπεία [2]. Κατά συνέπεια, το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με προχωρημένο στάδιο ΕΓΚ είναι εξαιρετικά χαμηλό (& lt? 40%). Κλινικές μεταβλητές, όπως το στάδιο της νόσου και υπολειμματικής νόσου, είναι προγνωστικός [3], [4], αλλά σε μεγάλο βαθμό uninformative για εκείνους με προχωρημένο στάδιο της νόσου.

Σε μια προηγούμενη μελέτη [5], πραγματοποιήσαμε ένα mRNA προφίλ έκφρασης του υψηλού βαθμού ορώδες ιστούς EOC όγκων για τον εντοπισμό μοριακών δεικτών πρόγνωσης χρησιμοποιώντας ένα Affymetrix πλατφόρμα γονίδιο μικροσυστοιχιών έκφρασης. Μεταξύ των δεικτών πρόγνωσης προσδιορίζονται βρήκαμε BTN3A2, επίσης γνωστή ως BT3.2 και BTF4, ένα γονίδιο που ανήκει στην οικογένεια βουτυροφιλίνη BT3, επίσης μια υποοικογένεια Β7. BTN3A2 mRNA ήταν η πιο ισχυρή βιοδεικτών μεταξύ 8 άλλων δοκιμαστεί. Όχι μόνο δεν θα έχουν προγνωστική σημασία στη μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, αλλά έδειξε επίσης την υψηλότερη αναλογία κινδύνου σε σύγκριση με τις άλλες μοριακές και κλινικές προγνωστικές μεταβλητές. Υψηλή έκφραση του mRNA του BT3.2 συνδέθηκε έντονα με καλή πρόγνωση σε σχέση με την επιβίωση ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση. Ως προγνωστικός δείκτης ΕΓΚ έφθασε το 87% ειδικότητα και 77% ευαισθησία για την πρόβλεψη πρώιμη υποτροπή (& lt? 18 μήνες). Σε μία ομάδα των 52 ασθενών [5]

Η βουτυροφιλίνη (BTN) οικογένεια περιέχει BTN1A1, BTN2A1 , τα μέλη BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3 και BTN-όπως. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτές οι νέες μέλη της οικογένειας BTN μοιράζονται σημαντική ομολογία με Β7 μέλη της οικογένειας, τα οποία έχουν IgV ομοιάζει εξωπλασματικής πεδίο ακολουθούμενο από ένα άλλο εξωπλασματικής IgC-όπως τομέα. Η κυτταροπλασματική περιοχή περιλαμβάνει μια περιοχή σύνδεσης SPRY /PRY B30.2 πρωτεΐνη [6], [7], [8]. Σε αντίθεση με άλλα μέλη BTN, BT3.2 δεν έχει έναν τομέα B30.2 στην ενδοκυτταρική περιοχή [7], [9]. μόρια BT3 (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 και BTN3A3 /BT3.3) είναι γνωστό ότι εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα [10], με το στρώμα μεμβράνης που περιβάλλει το λίπος που εκκρίνουν σταγονιδίων γάλα από επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [11] , στα κύτταρα του ανοσοποιητικού, και σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές [5], [12].

Τα μόρια Β7 μπορεί να είναι αρνητικό ή θετικό ρυθμιστές της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, Β7-Η4, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1, BTN2A2 μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ παρέχοντας ένα ανασταλτικό σήμα. Αντιστρόφως, B7-H3 έχει θεωρηθεί ως θετική και αρνητική ρυθμιστικό μόριο είναι σε θέση να διεγείρουν ή να αναστέλλουν τα κύτταρα CD4 + και CD8 + Τ ανάλογα του κυτταρικού περιβάλλοντος [13], [14], [15], [16]. Ομοίως, ορισμένα μέλη της οικογένειας BTN έχουν προκύψει πρόσφατα ως νέα ρυθμιστές του ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτές περιλαμβάνουν BTNL2 [17] – [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21] και τα μόρια BT3. Για παράδειγμα, Yamashiro

et al.

[22] κατεργάζεται PMBC με ένα αντίσωμα έναντι BT3.3 και παρατηρήθηκε μία αναστολή της CD4 + και CD8 + πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και μειωμένη έκκριση κυτοκινών από τους δύο τύπους των Τ κυττάρων. Σε μια άλλη έκθεση, Cubillos-Ruiz

et al

. έδειξε ότι BT3 έκφραση σε κύτταρα που εμφανίζουν αντιγόνο (APC) ανέστειλαν

in vitro

πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων και Th1 έκκριση κυτοκινών [23]. Ενώ αυτές οι μελέτες εξέτασαν την λειτουργία του Β7 μελών της οικογένειας όταν εκφράζεται στο ανοσοποιητικό συστατικό, δεν είναι σαφές πώς αυτά τα μόρια θα μπορούσαν να επηρεάσουν ανοσοαπόκριση όταν εκφράζεται από άλλους τύπους κυττάρων. Πράγματι, τα δημοσιευμένα στοιχεία υποστηρίζει την έκφραση των BT3 σε κύτταρα EOC σε πρωτογενείς ιστούς και μεταστατικούς ιστούς [23]. Επιπλέον, Messal Ν

et al

. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι BT3 δρα ως συν-διεγερτικό μόριο για CD4 + Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα [24]. Είναι ενδιαφέρον, παρατήρησαν μια διαφορική ανοσο-ρυθμιστικό ρόλο των διαφόρων ισομορφών BT3. Συνολικά το γεγονός αυτό δείχνει ότι οι σύνθετοι μηχανισμοί μπορούν να ρυθμίζουν τη λειτουργία των μορίων BT3. Περαιτέρω παρατηρήσεις απαιτούνται για να κατανοήσουν την ακριβή ρόλο αυτών των μορίων σε ένα πλαίσιο με ειδικό τρόπο.

Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των BT3.2 στον καρκίνο των ωοθηκών και ειδικότερα να επιβεβαιώσει παρατηρείται συλλόγου μας της έκφρασης mRNA BT3.2 με καλή πρόγνωση των ασθενών [5], πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ανοσοϊστοχημείας της πρωτεϊνικής έκφρασης BT3.2 σε μια μεγάλη ομάδα από 199 υψηλής ποιότητας ορώδες ασθενείς EOC και επιβεβαίωσε τη σύνδεση των BT3.2 και την πρόγνωση των ασθενών ΕΓΚ. Παράλληλα, αναλύσαμε την πυκνότητα των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος εντός του όγκου και βρήκε μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BT3.2 από κύτταρα EOC και ενδοογκική διήθηση των Τ κυττάρων, ενώ ένα υψηλό λόγο CD206 + /CD68 + έκφραση συσχετίστηκε να βραχύτερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα ρόλο των BT3.2 στη διείσδυση του όγκου των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

έγκρισης

Ηθική λήφθηκε από το τοπικό συμβούλιο θεσμική δεοντολογία (Comité d’éthique de la recherche du Centre νοσοκομειακό de l’Université de Montréal). δείγματα όγκων συλλέχθηκαν και κλίση μετά από κατάλληλη γραπτή συγκατάθεση από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση εντός του Τμήματος Ογκολογίας στο νοσοκομειακό κέντρο de l’Université de Montréal από το 1993 έως το 2010.

Ασθενείς και ιστών Δείγματα

όγκου δείγματα συλλέχθηκαν και κλίση μετά από κατάλληλη συγκατάθεση από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση εντός του τμήματος Γυναικολογικής Ογκολογίας στο νοσοκομειακό κέντρο de l’Université de Montréal από το 1993 έως το 2010. ένας ανεξάρτητος παθολόγος σκόραρε βαθμό του όγκου και το στάδιο και ένα γυναικολογικό ογκολόγος σκόραρε όγκου υπολειμματικής νόσου, σύμφωνα με τα κριτήρια της Διεθνούς Ομοσπονδίας Μαιευτήρων Γυναικολόγων και [25]. Λιγότερο από 10% των δείγματος αποκλείστηκαν για την ποιότητα, και αυτό δεν συσχετίστηκε με την ηλικία του δείγματος. Κλινικά δεδομένα για διάστημα χωρίς εξέλιξη ορίστηκαν σύμφωνα με την απεικόνιση σάρωσης και το επίπεδο του CA125 αίματος [26]. Η συνολική επιβίωση ορίστηκε ως ο χρόνος από τη χειρουργική επέμβαση στο θάνατο από καρκίνο των ωοθηκών. Οι ασθενείς που είναι γνωστό ότι είναι ακόμα ζωντανός κατά τη στιγμή της ανάλυσης περικόπηκαν κατά το χρόνο της τελευταίας παρακολούθησή τους. νόσος του ασθενούς ελεύθερη επιβίωση (DFS) υπολογίστηκε από το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης μέχρι την πρώτη εξέλιξη. κριτήρια επιλεξιμότητας για ένταξη στη μελέτη ήταν ως εξής: καμία προεγχειρητική χημειοθεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών, με βάση την πλατίνα θεραπεία μετεγχειρητικής χημειοθεραπείας, υψηλής ποιότητας όγκους, ορώδες υποτύπου histopatholgy και ολοκληρώθηκε ενημερωμένη συγκατάθεση. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία με βάση την πλατίνα ως αρχική θεραπεία μετά την επέμβαση με εξαιρέσει των ασθενών που πέθανε λίγο (& lt? 3 μήνες) μετά την επέμβαση. Οι ασθενείς που έχασαν τη ζωή τους από μια άλλη ασθένεια περικόπηκαν κατά το χρόνο της τελευταίας παρακολούθησης. Ένας γυναικολόγος ογκολόγος επανεξέτασε τα κλινικά δεδομένα για όλους τους ασθενείς. Για τη μελέτη της εξέλιξης της νόσου χωρίς, συμπεριλήφθηκαν μόνο ασθενείς με κλινική παρακολούθηση τουλάχιστον 18 μήνες ή έως την υποτροπή της νόσου. Τα χαρακτηριστικά των όγκων και την έκβαση των ασθενών για τα σύνολα δειγμάτων συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

καλλιέργειες κυττάρων και σφαιρίδια κυττάρων σε Histogel

Για να επαληθευτεί η εξειδίκευση των αντισωμάτων BT3.2 , κύτταρα TOV-112D και κυτταρικές σειρές που προέρχονται καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΟΣΕ (50:50 μείγμα από 199 και 105 Sigma διάμεσα) συμπληρωμένο με 0.5 μg /mL της αμφοτερικίνης Β, 50 μg /mL γενταμυκίνης και 10% FBS (εμβρυϊκό βόειο ορρός). Κύτταρα προερχόμενα media επίσης συμπληρωμένο με 0.5 μg /mL πουρομυκίνης. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν μέσα σε έναν επωαστήρα υγροποιημένο στους 37 ° C με μια ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2, ουσιαστικά όπως περιγράφεται [27]. Κύτταρα σβώλο ενσωματωμένο σε παραφίνη παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28].

πλασμίδια

Ο BT3.1, BT3.2 και BT3.3 αλληλουχίες υποκλωνοποιήθηκαν στους φορείς pef6v5 και ήταν μια γενναιόδωρη δώρο του Δρ Ρόδου (Cambridge, UK) [7]. Όλα τα πλασμίδια επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Οι αλληλουχίες ισομορφή BT3 ενισχύθηκαν με PCR και υποκλωνοποιήθηκαν στην pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια ανασυνδυάζονται στο Plenti-CMV /TO-puoDest (AbGene) [29]. Λεντοϊού παραγωγή σωματιδίων και τη μόλυνση των κυττάρων έγινε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30].

επιλεγμένο ιστό μικροσυστοιχιών

Τομείς του όγκου με βάση την επισκόπηση του αιματοξυλίνη-ηωσίνη-βάφονται διαφάνεια. μπλοκ όγκου FFPE στη συνέχεια βιοψία χρησιμοποιώντας ένα 0,6 χιλιοστά arrayer διαμέτρου του ιστού και την επακόλουθη πυρήνες διατάσσονται σε ένα πλέγμα σε μια ομάδα αποδέκτη παραφίνης. Η συστοιχία ιστός αποτελείται από 260 δείγματα καρκίνου των ωοθηκών και 11 δείγματα από φυσιολογικά περιοχών σάλπιγγες των ασθενών με καρκίνο. Μετά από επανεξέταση των κλινικών δεδομένων 61 ασθενείς εξαιρέθηκαν από την τελική ανάλυση, καθώς δεν πληρούν τα κριτήρια ένταξης. Αυτή η σειρά των ιστών στη συνέχεια χωρισμένο, χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και έλαβε μια άλλη αναθεώρηση παθολογίας για επιβεβαίωση του περιεχομένου του όγκου.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη όγκοι χωρισμένο σε 4 μm και η πλάκες χρωματίζονται χειροκίνητα στον πάγκο ή χρησιμοποιώντας το σημείο αναφοράς XT αυτοματοποιημένη χρώσης (Ventana Medical System Inc.). Για τη χειροκίνητη μέθοδο, τμήματα ιστού θερμάνθηκαν σύντομα στους 50 ° C για 15 λεπτά, αποπαραφινοποιήθηκαν σε τολουόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια κλίση αιθανόλης. Τα πλακίδια βυθίστηκαν σε ρυθμιστικό Tris-EDTA (10 mM Tris βάση, 1 mM EDTA ρυθμισμένο σε ρΗ 9,0) και η πίεση μαγειρεύεται επί 15 λεπτά για να ξεσκεπάσει αντιγόνα. Ένα 0,6 ή 3% Η

2O

2 θεραπεία χρησιμοποιήθηκε για την εξάλειψη της ενδογενούς δραστηριότητας της υπεροξειδάσης. Οι τομές αποκλείσθηκαν με ένα μπλοκάρισμα πρωτεΐνη αντιδραστήριο χωρίς ορό (DakoCytomation Inc., ΟΝ, Canada) και επωάζονται με διαφορετικά αντισώματα για 60 ή 120 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η βέλτιστη συγκέντρωση για κάθε πρωτογενές αντίσωμα προσδιορίστηκε με σειριακές αραιώσεις. Τα αντισώματα και οι συνθήκες IHC παρατίθενται στον Πίνακα S1. Ιστοί επωάστηκαν με ένα αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με HRP (1:150) (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Για BT3.2, οι ιστοί επωάστηκαν με ένα δευτερεύον βιοτινυλιωμένο αντίσωμα (DakoCytomation Inc., ΟΝ, Καναδάς) για 30 λεπτά που ακολουθείται από επώαση με στρεπταβιδίνη υπεροξειδάσης (DakoCytomation Inc., ΟΝ, Canada) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη περιέχει 0.3% Η

2O

2 ως υπόστρωμα υπεροξειδάσης. Οι πυρήνες με αιματοξυλίνη. Με την αυτοματοποιημένη χρώσης, ανάκτηση αντιγόνου για CD206 και CD4 διεξήχθη με Κυττάρων Ρύθμιση 2 (VMSI? # 950-123). Προ-αραιωμένο αντίσωμα αυτόματα διανεμηθεί, και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. κιτ Ultraview DAB ανίχνευσης (VMSI? # 760-091). Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη (VMSI? # 760-2021). Όλες οι τομές παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός στα 400 × μεγέθυνση. Υποκατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος.

Immunofluxorescence (IF)

Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη τομές παραφίνης όγκων βάφτηκαν χειροκίνητα μετά την ανάκτηση αντιγόνου σε Tris-EDTA (10 mM Tris βάση, 1 mM EDA ρυθμίζεται σε ρΗ 9.0) για 15 λεπτά σε pressur κουζίνα. Οι τομές αποκλείσθηκαν με ένα αντιδραστήριο δέσμευσης άνευ ορού πρωτεΐνης (DakoCytomation Inc., ΟΝ, Canada) και επωάστηκαν με τις αντι-CD68 αντισώματα για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ιστοί μετά επωάστηκαν με κατσίκα αντι-ποντικού Cy5 (1/200) επί 45 λεπτά. αντισώματα ποντικιού IgG μετά φράχθηκαν όλη τη νύκτα με αντιδραστήριο M.O.M. ™ (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Αντι-CD206 αντισώματα επωάστηκαν για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ιστοί στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού Alexa Fluor Α488 (1/250) για 45 λεπτά πριν το πλύσιμο και η θεραπεία με 0,1% Sudan Black Β για 10 λεπτά για να μειωθεί αυτοφθορισμό. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με ProLong® χρυσό αντιξεθωριάσματος φθορισμού μέσα στερέωσης με DAPI (Molecular Probes). Η ανάγνωση διεξήχθη με ανάλυση μικροσκόπιο σε υψηλή ισχύ και στη συνέχεια χρώση διπλής immunoflourescent αξιολογήθηκε για επικύρωση.

Χρώση Ποσοτικοποίηση

τομές όγκων σαρώθηκαν και ψηφιακά οπτικοποιούνται. Για BT3.2, επιθηλιακά ζώνες βαθμολογήθηκαν ανάλογα με την ένταση χρώσης της επιθηλιακής μεμβράνης (τιμή 0 για την απουσία, 1 για την αδύναμη, 2 για μέτριο, 3 για την υψηλή ένταση) όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Σε πυρήνες όπου χρώση ήταν μεταβλητής έντασης η μέση ένταση αναφέρθηκε. Η ποσοτικοποίηση των διηθητικών λεμφοκυττάρων διεξήχθη με μέτρηση του αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων με θετική χρώση σε ενδοεπιθηλιακή νησίδες. Τα αποτελέσματα τότε κατηγοριοποιούνται ως 0 (χωρίς κύτταρα), 1 (0 & lt? Ν & lt? 10), 2 (10 & lt? Ν & lt? 90) και 3 (n & gt? 90) αναλόγως του αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν. Η ποσοτικοποίηση των μακροφάγων διεξήχθη με αξιολόγηση του ποσοστού χρωματισμένων κυττάρων στην ενδοεπιθηλιακή περιοχή. Η σχετική πυκνότητα των κυττάρων CD206 + υπολογίστηκε από την αναλογία CD206 + /CD68 + χρωματισμένα κύτταρα. Κάθε συστοιχία ανεξάρτητα αναλύθηκε σε μια τυφλή μελέτη από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές. συσχέτιση μεταξύ βαθμολόγηση ήταν & gt? 75%. Όταν συνέβη μεγάλες διαφορές στο σκορ μεταξύ των δύο παρατηρητές (πάνω από 1 μονάδα ανά πυρήνα) ο πυρήνας επαναξιολογήθηκε να επιτευχθεί μια σύμφωνη βαθμολόγησης μεταξύ των δύο παρατηρητές. Ο μέσος όρος όλων των πυρήνων με τον καρκίνο από τον ίδιο ασθενή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

A. ανάλυση Western κηλίδας της συνολικής πρωτεΐνης αποσπάσματα από TOV112D γραμμή κυττάρων που έχουν μολυνθεί με Plenti (έλεγχος φορέα), BT3.1, BT3.2 ή ιογενείς κατασκευές BT3.3. Εκχυλίσματα φορτώθηκαν εις τριπλούν σε 10% SDS /PAGE πηκτής και μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν με αντι-CD277 (eBioscience), αντι-BT3.3 (Atlas αντισώματα) και αντι-BT3.2 (SDIX Inc.) όπως υποδεικνύεται στο κάτω μέρος της η εικόνα. B. Ανοσοϊστοχημεία ανάλυση των εγκλεισμένων σε παραφίνη κυττάρων σφαιρίδια από TOV112D κυτταρική γραμμή μολύνθηκαν είτε με Plenti (έλεγχος φορέα), BT3.1, BT3.2 ή ο BT3.3 ιικό κατασκευάσματα. Μόνο κύτταρα επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα BT3.2 χρωματίζονται θετικά με το αντι-BT3.2 (SDIX Inc.). Γ Ανοσοϊστοχημεία του ξενομοσχεύματος όγκους από TOV112D επιμολυσμένα με είτε κενό φορέα ή κατασκεύασμα BT3.2. Μόνο τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με το κατασκεύασμα BT3.2 χρωματίζονται θετικά με το αντι-BT3.2 (SDIX Inc.). Δ Εκπρόσωπος χρώση για ανοσοϊστοχημεία της BT3.2 σε ένα υψηλής ποιότητας ορώδες EOC TMA. Από αριστερά προς τα δεξιά:. Αρνητικός, χαμηλή, μέτρια και υψηλή ένταση

Η

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT /1 mM NaF /0.5% ΝΡ-40 και /πρωτεΐνη αναστολείς) και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στις 13.000 rpm. Clear προϊόντα λύσης στη συνέχεια ζέση σε ρυθμιστικό φόρτωσης, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες κορεσμένο με 5% γάλα /ΡΒδ /0.1% Tween 20. Ανοσοανίχνευση έγινε όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κιτ ECL (Amersham Pharmacia): δηλαδή επωάστηκε 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή ο /η στους 4 ° C με τη συγκεκριμένη αντίσωμα, πλύθηκαν με PBS /Tween 0,01% και επωάστηκαν για άλλα 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology-Inc.). ανάλυση Western blot-διεξήχθη με βήτα-ακτίνης AC-15 (ab6276 από Abcam inc. ΜΑ, USA), αντι-CD277 /BT3.1 (# 14 έως 2.779 από eBioscience, San Diego, CA, USA), αντι-BT3 0.2 (SDIX, Newark DE, USA), αντι-BT3.3 (HPA007904, Atlas Αντισώματα, Στοκχόλμη, Σουηδία). Τα πειράματα γίνονται εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Η δοκιμή συσχέτισης Pearson (two-tailed) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συσχέτιση με τις μεταβλητές κλινικο- παθολογικά και δεικτών ως συνεχείς μεταβλητές. Οι καμπύλες επιβίωσης απεικονίζονται χρησιμοποιώντας την ανάλυση καμπύλης Kaplan-Meier και η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για σημαντικές διαφορές. Δέκτης λειτουργική χαρακτηριστική (ROC) καμπύλες χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί η τιμή κατωφλίου για κάθε δείκτη που αντιστοιχεί στην καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα για την εξέλιξη του ασθενούς πριν από 18 μήνες (εξέλιξη πρώιμο στάδιο της νόσου) ή μετά από 20 μήνες (εξέλιξη αργά ασθένεια) από την αρχική διάγνωση (ρ & lt? 0.05 και περιοχή & gt? 0.60), όπως έχει ήδη αναφερθεί [5]. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική Cox αναλογικά μοντέλα κινδύνου χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της αναλογίας κινδύνου για κάθε δείκτη ως συνεχείς μεταβλητές. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός σταδιακή μοντέλο κινδύνου στην μονοπαραγοντική ανάλυση που απαιτείται για την είσοδο στο μοντέλο. Μόνο τέσσερις μεταβλητές μεταξύ άλλων στο πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης κατά Cox για να αποφευχθεί η υπερβολική τοποθέτηση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια εισάγετε μοντέλο κινδύνου. Το μέγεθος του δείγματος (n & gt? 100 όπου n = 10k /p) και κανονική κατανομή της έκφρασης BT3.2 θεωρήθηκαν πριν από την εφαρμογή του μοντέλου Cox. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου για την έκδοση του λογισμικού Κοινωνικές Επιστήμες 11.0 (SPSS, Inc.), και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

η έκφραση της BTN3A2 /BT3.2 στην EOC ιστοί

Για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BT3.2 στα κύτταρα EOC και την επιβίωση των ασθενών, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ανοσοϊστοχημείας σε μία ομάδα από 199 υψηλής ποιότητας ορώδες ωοθηκικό ασθενείς με καρκίνο. Κατ ‘αρχάς, αξιολογήσαμε την εξειδίκευση των διαθέσιμων αντισωμάτων έναντι ισομορφές BT3. Βρήκαμε 3 διαφορετικά αντισώματα διαθέσιμα στο εμπόριο: anti-CD277 (eBioscience Inc.), αντι-BT3.3 (Atlas) και αντι-BT3.2 (από SDIX Inc.). Αντισώματα δοκιμάστηκαν από δυτικές-κηλίδωση σε κυτταρικά εκχυλίσματα από την κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών TOV112D μολυνθεί είτε με BT3.1 ή BT3.2 ή BT3.3 σωματίδια ρετροϊού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, το αντι-CD277 αναγνωρίζονται BT3.1 και BT3.2 ισομορφών. Όπως αναμενόταν, το αντίσωμα αντι-BT3.3 αναγνωρίζεται αποκλειστικά την ισομορφή BT3.3 και το αντι-BT3.2 ειδικά αναγνώρισε την ισομορφή BT3.2. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αντισώματος αντι-BT3.2 επί παραφίνη παραφίνη ιστούς, αναλύσαμε επίσης την χρώση των κυτταρικών σφαιριδίων εγκλεισμένων σε παραφίνη και ξενομοσχεύματος ιστοί από κύτταρα 112D TOV επιμολυσμένα με είτε ένα άδειο φορέα ή BT3 κατασκευάσματα ισομορφή. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Β και 1Γ, το αντίσωμα αντι-BT3.2 μπόρεσε να χρωματίσει μόνο το σφαιρίδιο BT3.2 κυττάρων και BT3.2 ξενομοσχεύματος όγκου.

μεμβράνης και κυτταροπλασματική έκφραση του BT3.2 στον καρκίνο των ωοθηκών ιστούς παρατηρήθηκε και βαθμολογήθηκε σύμφωνα με την ένταση της χρώσης ως απών, χαμηλή, μέτρια ή έντονη (0, 1, 2, 3 αντίστοιχα) (Σχήμα 1 D). Παρουσία του BT3.2 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα και σε μερικές πυρήνες ιστού, θα μπορούσε επίσης να βρεθεί στο στρώμα. Σχεδόν όλοι EOC πυρήνες (n = 193, 97,5%) έδειξε έκφραση του BT3.2. Στις επιθηλιακά κύτταρα, τόσο κυτταροπλασματική μεμβράνη και χρώση παρατηρήθηκε (Σχήμα 1 D) και ποικίλη από απούσα σε ισχυρά (Σχήμα 1 D, Πίνακας 1). Τα επίπεδα έκφρασης επιθηλιακά BT3.2 δεν συσχετίζεται σημαντικά με την ηλικία των ασθενών κατά τη διάγνωση ή βαθμό του όγκου. Σε αντίθεση, οι ασθενείς με υψηλότερο επίπεδο των επιθηλιακών BT3.2 τείνουν να έχουν χαμηλότερο επίπεδο υπολειμματικής νόσου και κάτω στάδιο της νόσου (p = 0,058 και ρ = 0,043, αντίστοιχα, Πίνακας 2).

Η

BT3. 2 έκφραση πρωτεΐνη συνδέεται με τη συνολική επιβίωση και ελεύθερη νόσου Πρόοδος

Έχουμε ερευνηθεί στο παρελθόν τη σχέση ανάμεσα στην έκφραση BT3.2 mRNA και του καρκίνου των ωοθηκών πρόγνωση του ασθενούς. Kaplan-Meier και Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνου χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ BT3.2 mRNA και πρόγνωση, όπως ορίζεται από τη συνολική επιβίωση ή την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) εντός 18 μηνών μετά την επέμβαση [5]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε εάν BT3.2 πρωτεΐνη θα μπορούσε επίσης να είναι προγνωστική αξία. Για το σκοπό αυτό, η πρωτεΐνη έκφρασης BT3.2 αναλύθηκε σε 199 υψηλής ποιότητας ορώδες ασθενείς και οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε σχέση με τη συνολική επιβίωση και DFS. Τα χαρακτηριστικά ομάδα που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

Καμπύλες κατά Kaplan-Meier έδειξε ότι υπήρχε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των υψηλών έκφραση BT3.2 πρωτεϊνών και αυξημένη συνολική επιβίωση των ασθενών (p = 0,014? log rank = 6,03) ( Σχήμα 2Α). Η μέση διάστημα επιβίωσης ήταν 85 μήνες για τους ασθενείς με υψηλότερο επίπεδο BT3.2 σε σύγκριση με 59 μήνες για τους ασθενείς με χαμηλό επίπεδο BT3.2. Παρομοίως, οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του BT3.2 είχαν μέση διάστημα εξέλιξη της 86 μήνες σε σύγκριση με 55 μήνες για τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση του BT3.2 (p = 0.002, log rank = 9,65) (Σχήμα 2Β).

Kaplan-Meier καμπύλες συνολική επιβίωση (Α) και την επιβίωση ελεύθερη νόσου (Β) σε 194 και 171 ασθενείς, αντίστοιχα. Σημαντικότητας (p) υποδεικνύεται από βαθμίδα καταγραφής.

Η

Στην μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox, η συνεχής επίπεδο BT3.2 πρωτεΐνης αξιολογήθηκε ώστε να αντικατοπτρίζει τη σχέση μεταξύ της αύξησης επίπεδο έκφρασης BT3.2 και τη βελτίωση της πρόγνωσης . Σε αυτή την ανάλυση, η αυξημένη έκφραση του BT3.2 συσχετίστηκε με κίνδυνο σχετικά υψηλή κινδύνου (HR) για την επιβίωση (HR = 0,651, 95% CI 0,479 έως 0,884, ρ = 0,006, Πίνακας 3). Ομοίως, η αυξημένη έκφραση BT3.2 συσχετίστηκε σημαντικά με τις μετέπειτα εξέλιξη της νόσου (HR = 0,642,% 95CI 0,483 – 0,853, p = 0,002) (Πίνακας 3).

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox, όταν τυπική προγνωστικές μεταβλητές έγιναν (ηλικία, το στάδιο και υπολειμματικής νόσου), BT3.2 παρέμεινε ανεξάρτητη μεταβλητή πρόβλεψης υψηλό κίνδυνο επιβίωσης (HR = 0,597,% 95CI 0,415 – 0,859, p = 0,005) και αργά κίνδυνο εξέλιξης σε αυτό το πολυπαραγοντικό μοντέλο (HR = 0,675, 0,487 έως 0,935% 95CI, p = 0,018) (Πίνακας 3).

η

σχέση μεταξύ BT3.2 έκφρασης και του ανοσοποιητικού Διεισδύσουν

Υποθέσαμε ότι η σχέση μεταξύ των επιθηλιακών BT3. 2 έκφραση και μια καλή πρόγνωση οφείλεται στην επίδραση επί ενδοδιηθητικά όγκου κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, αφού είναι γνωστό ότι Β7 οικογένεια μόρια έχουν συν-ρυθμιστικών λειτουργιών σε Τ κύτταρα. Επιπλέον, το επίπεδο των ενδοογκική διείσδυση ανοσοκυττάρων έχει συσχετισθεί με την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [31]. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, αξιολογήσαμε με ανοσοϊστοχημεία η παρουσία των Τ κυττάρων με CD3 +, CD4 + και CD8 + χρώση στην ίδια ΤΜΑ χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση BT3.2. Εκτιμήσαμε επίσης τη σημασία της εντός του όγκου των κυττάρων Β (CD20 +) και μακροφάγων (CD68 +) διείσδυση. Δύο τάξεις των μακροφάγων έχουν περιγραφεί, καταπολέμησης των όγκων (Μ1) και προ-καρκινικές (Μ2). Δεδομένου ότι στις περισσότερες όγκους, τα μακροφάγα σχετίζονται με τον όγκο (ΤΑΜ) έχουν M2-φαινότυπο [32], [33], θα προσδιορίζεται η πυκνότητα των διηθητικών CD206 + κύτταρα ως υποκατάστατος δείκτης της εναλλακτικής προ-καρκινικές μακροφάγα M2 δεδομένου ότι τείνουν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδο δείκτη CD206 πλην της M1 μακροφάγα. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της έκφρασης CD206 από μακροφάγα σε όγκους EOC, πραγματοποιήσαμε μια διπλή χρώση ανοσοφθορισμού ελέγχου σε έναν περιορισμένο αριθμό ιστών (Σχήμα S1). έκφραση CD206 σχεδόν πάντοτε συν-εντοπισμένη με έκφραση CD68 υποδηλώνοντας μακροφάγων έκφραση.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 και Σχήμα 4Α-Β, το ανοσοποιητικό διήθηση των Τ κυττάρων, Β κυττάρων και ΤΑΜ παρατηρήθηκε σε ιστούς EOC σε διάφορες πυκνότητες σε οι ενδοεπιθηλιακή περιοχές. Η ενδοεπιθηλιακή διείσδυση των κυττάρων Τ, CD3 +, CD4 + ή CD8 +, είχε υψηλή συσχέτιση με την παρουσία του CD20 + Β κυττάρων (ρ & lt? 0.001) και CD68 + μακροφάγα (Ρ & lt? 0.001), συμπεριλαμβανομένων και των + κύτταρα CD206 (Πίνακας 4). Η ενδοεπιθηλιακή διείσδυση των Β κυττάρων συνδέθηκε επίσης με την παρουσία του CD68 + και + κύτταρα CD206 (r = 0,364 και r = 0,171, ρ & lt? 0,001 και ρ = 0,022, αντίστοιχα). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναλογία των CD206 + κυττάρων σε σχέση με την συνολική πυκνότητα των μακροφάγων CD68 +, η αναλογία CD206 + /CD68 + έκφραση, ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με την παρουσία του CD3 + Τ κυττάρων και έτειναν να συσχετίζεται με την παρουσία των Β κυττάρων (r = -0.216, ρ = 0,005 και r = -0.141, p = 0,063, αντίστοιχα) (Πίνακας 4).

σημαντικά, η έκφραση του BT3.2 από κύτταρα ΕΓΚ συσχετίστηκε με την ενδοεπιθηλιακή διείσδυση των CD3 + κυττάρων (r = 0,174 , ρ = 0,018), συμπεριλαμβανομένων των CD8 + κύτταρα (r = 0.176, p = 0,018) και τα κύτταρα CD4 + (r = 0,272, ρ & lt? 0.001). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης BT3.2 και την παρουσία κυττάρων ή των μακροφάγων CD20 + παρατηρήθηκε (ρ = 0,137, Πίνακας 4).

υψηλής και χαμηλής πυκνότητας του CD3 + (κύτταρα Τ), CD4 + (Τ κύτταρα), CD8 + (Τ κύτταρα) και CD20 + (Β κύτταρα) που φαίνονται στην αριστερή και μεσαία πάνελ. Μια μεγέθυνση στην περιοχή υψηλής διείσδυσης εμφανίζεται στο δεξιό πίνακα για κάθε χρώση.

Η

Σύλλογος ενδονεοπλασματική λεμφοκυττάρων, μακροφάγων και EOC Ασθενής πρόγνωση

Όπως αναφέρθηκε από άλλους [ ,,,0],31], η παρουσία των κυττάρων CD4 + ήταν επίσης αντιστρόφως ανάλογη με την εξέλιξη της νόσου νωρίς (r = -0.187, p = 0,021, Πίνακας 5). Ανάλυση Kaplan-Meier καμπύλη και συνδεθείτε τεστ κατάταξης επιβεβαίωσε ότι η υψηλή ενδοεπιθηλιακή πυκνότητα των CD4 + συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση (Πίνακας S2). Το μέσο διάστημα εξέλιξη των ασθενών με ενδο-επιθηλιακά κύτταρα υψηλής CD4 + ήταν 69 μήνες σε σύγκριση με 59 μήνες για τους ασθενείς με χαμηλά ενδοεπιθηλιακή CD4 + πυκνότητα (ρ = 0,011, log rank = 6.5). Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ενδοεπιθηλιακής πυκνότητα των CD3 + ή CD8 + κυττάρων και την πρόγνωση των ασθενών (Πίνακας 5 και Πίνακας S2). Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της διείσδυσης των κυττάρων CD20 + και τη συνολική επιβίωση (log rank p = 0,039), ενώ αποκτήθηκε μόνο μια τάση προς μια καλύτερη ελεύθερη νόσου επιβίωση (log rank p = 0,0677). Ωστόσο, η σχέση με τη συνολική επιβίωση δεν παρατηρήθηκε όταν το CD20 + θεωρήθηκε ως συνεχής μεταβλητή στην μονοπαραγοντική μοντέλο παλινδρόμησης Cox (p = 0,21).

Αν και δεν παρατηρήσαμε συσχέτιση μεταξύ της πυκνότητας των CD68 + ή CD206 + κύτταρα και την πρόγνωση των ασθενών (Πίνακας 5), η αυξημένη αναλογία των CD206 + σε σχέση με κύτταρα CD68 + συσχετίστηκε θετικά με την εξέλιξη της νόσου (r = 0,157, ρ = 0,049, Πίνακας 5). Η σχέση αυτή επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης Kaplan-Meier (p = 0,005, log rank = 7.83, Σχήμα 4D, Πίνακας S2) και μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox (HR = 1,355, 95% CI 1,223 έως 5,332, p = 0,044). Επιπλέον, το CD206 + σχετική πυκνότητα τείνει να συνδέσει με κακή συνολική επιβίωση (log rank = 3,53, p = 0,06) (Εικόνα 4C, Πίνακας S2) με αναλογία κινδύνου 2.077 (% CI 95, 0,947 – 4,558, p = 0,068).

Υψηλή και χαμηλή πυκνότητα των CD68 + (μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους, TAM) (Α) και CD206 + (Μ2 υπότυπος του TAM) κύτταρα (Β). Μεγέθυνση στην υψηλή περιοχή διήθησης παρουσιάζεται στο δεξί πίνακα για κάθε χρώση (κορυφή). C και D. Kaplan-Meier ανάλυση της αναλογίας των διηθητικών ενδοεπιθηλιακής + /CD68 + κυττάρων CD206 που αντιπροσωπεύει τη σχετική πυκνότητα του CD206 + M2 ΤΑΜ πάνω από την συνολική πυκνότητα του CD68 + ενδοεπιθηλιακή που διηθούν μακροφάγα. Kaplan-Meier καμπύλες συνολική επιβίωση (C) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (Δ) σε 180 και 174 ασθενείς, αντίστοιχα. Σημαντικότητας (p) υποδεικνύεται από βαθμίδα καταγραφής.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε χρώση BTN3A2 /BT3.2 σε υψηλής ποιότητας ΕΓΚ ορώδες όγκους από 199 ασθενείς. Η έκφραση ανιχνεύθηκε σε υψηλή συχνότητα (97,5%), σύμφωνα με τα προηγούμενα δεδομένα αναλύοντας την έκφραση του mRNA σε ορώδες EOC ιστούς [5]. Η σημαντική πτυχή αυτής της μελέτης είναι η επιβεβαίωση του BT3.2 ως δυνητικό προγνωστικός δείκτης για υψηλής ποιότητας ορώδες EOC σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η αρχική μελέτη εντοπισμό BT3.2 mRNA ως προγνωστικός δείκτης περιορίστηκε σε ένα σχετικά μικρό σύνολο των 52 περιπτώσεων. Εδώ, όχι μόνο εμείς επιβεβαίωσε τη σχέση μεταξύ BT3.2 και ένα καλύτερο αποτέλεσμα σε μια μεγάλη ομάδα, αλλά και σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία. Αυτό αποτελεί μια πιο εύκολα μπορεί να μεταφερθεί τεχνική σε ένα τμήμα παθολογίας κλινική από την ανίχνευση του mRNA, όπως η Q-PCR. Οι ασθενείς με υψηλό επιθηλιακά χρώση BT3.2 είχαν 1,53 φορές μικρότερο κίνδυνο θανάτου από τη νόσο από ό, τι ασθενείς με χαμηλό επίπεδο έκφρασης BT3.2. Η ένωση των BT3.2 για την επιβίωση και την εξέλιξη της νόσου ήταν μια ανεξάρτητη παράμετρος εντός πολυμεταβλητή ανάλυση Cox-παλινδρόμησης (Πίνακας 3). Συνδυασμός με άλλες ανεξάρτητες μοριακών δεικτών μπορεί να βελτιώσει την κλινική επίδοση της ως σήμερα δεν υπάρχει επιμέρους δείκτης έχει επιδείξει επαρκή ευαισθησία και ειδικότητα.

Ένας περιορισμός της μελέτης μας είναι ο μικρός αριθμός των ασθενών χωρίς υπολειμματική νόσο (n = 23) , η οποία δεν μας επιτρέπουν να τα αναλύσουμε ως ανεξάρτητη ομάδα. Ιδανικά debulked ασθενείς, συνολικά έχουν καλύτερη πρόγνωση από τους ασθενείς με υπολειπόμενη νόσο [34], για τα οποία προγνωστικό βιοδείκτη μπορεί να είναι λιγότερο κατατοπιστική.