Αφηρημένο

Ιστορικό

καθοριστεί πρόσφατα ότι οδοντίνη sialophosphoprotein (DSPP), ένα μέλος της ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ (Small ιντεγκρίνη δέσμευσης συνδέτη Ν-συνδεδεμένες γλυκοπρωτεΐνες) οικογένεια των phosphoglycoproteins, είναι ιδιαίτερα ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ανθρώπινη στοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (OSCCs) όπου προς τα άνω ρύθμιση συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου. Να διερευνήσει τις επιπτώσεις της

DSPP

-silencing στις ογκογόνο προφίλ της στοματικής κυτταρική σειρά καρκίνου, OSC2, μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) παρεμβολή χρησιμοποιείται για να φιμώσουν

DSPP

στο OSC2 κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Πολλαπλές περιοχές της DSPP μεταγραφής έγιναν στόχος για shRNA παρεμβολές χρήση HDSP-shRNA λεντοϊού σωματίδια έχουν σχεδιαστεί για να φιμώσουν την έκφραση του γονιδίου DSPP. Έλεγχος shRNA πλασμίδιο που κωδικοποιεί ένα κωδικοποιημένο ακολουθία ανίκανο αποικοδόμησης οποιουδήποτε γνωστού κυτταρικού mRNA χρησιμοποιήθηκε για αρνητικό έλεγχο. Μετά πουρομυκίνη επιλογή σταθερών γραμμών

dSsp

-silenced OSC2 κύτταρα, χαρακτηριστικά φαινοτυπική του στόματος καρκινογένεσης αναλύθηκαν με κηλίδα western και αναλύσεις RT-PCR, ΜΤΤ (κύτταρο-βιωσιμότητα), αποικίας σχηματισμός, τροποποιημένο θάλαμο Boyden (μετανάστευση και εισβολή), και κυτταρομετρία ροής (του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση) αναλύσεις.

DSPP

-silenced κύτταρα OSC2 έδειξε αλλαγμένη μορφολογία των κυττάρων, μειωμένη βιωσιμότητα, μειωμένη ικανότητα αποικίας σχηματισμός, μειωμένη μετανάστευση και εισβολή, G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων του όγκου στη σισπλατίνη απόπτωση. Επιπλέον, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9, VEGF, Ki-67, ρ53, και EGFR ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Υπήρξε μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του βαθμού

DSPP

-silencing και καταστολή ΜΜΡ, όπως υποδεικνύεται από παλινδρόμηση ελαχίστων τετραγώνων: MMP-2 {(y = 0.850x, σ & lt? 0.001) (y = 1.156x, σ & lt ? 0.001)}, ΜΜΡ-3 {(y = 0.994x, ρ & lt? 0.001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, και ΜΜΡ-9 {(y = 1.248x, ρ = 0.005, γ = 0.809, p = 0,013)}.

Συμπεράσματα /Σημασία

DSPP

-silencing στο OSC2 κυττάρων μειώθηκε κυριότερα χαρακτηριστικά της προφορικής ογκογένεσης και παρέχει την πρώτη λειτουργικές ενδείξεις μιας πιθανής βασικό ρόλο για DSPP στην προφορική βιολογία του καρκίνου. Η προς τα κάτω ρύθμιση των ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9, ρ53 και VEGF σε

DSPP

-silenced κύτταρα OSC2 παρέχει μια σημαντική λειτουργική /μοριακό πλαίσιο για την αποκρυπτογράφηση των μηχανισμών των δραστηριοτήτων DSPP σε στοματική βιολογία του καρκίνου .

Παράθεση: Joshi R, Tawfik Α, Edeh Ν, McCloud V, Looney S, Lewis J, et al. (2010) Η οδοντίνη Sialophosphoprotein (DSPP) Gene-κατασιγάσει Αναστέλλει Key Ογκογονικά Δραστηριότητες στην ανθρώπινη στοματική Γραμμή Cancer Cell, OSC2. PLoS ONE 5 (11): e13974. doi: 10.1371 /journal.pone.0013974

Επιμέλεια: Torbjorn Ramqvist, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 1 Ιουνίου 2010? Αποδεκτές: 12η Οκτωβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 12 Νοεμ 2010

Copyright: © 2010 Joshi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας (NIDCR) /Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) Grant # K23DE017791-01A1 (KUEO)? Ιατρικό Κολέγιο της Γεωργίας Research Institute (MCGRI), Inc. Grant # STP00105W005 (KUEO)? και με την Wendy Will Ίδρυμα υπόθεση Καρκίνο (KUEO). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η οδοντίνη sialophosphoprotein (DSPP) είναι μέλος του ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ (Small ιντεγκρίνη συνδέτη Ν-συνδεδεμένη γλυκοπρωτεΐνης) οικογένεια εξωκυττάριας μήτρας glycophosphoproteins [1]. Άλλα μέλη της οικογένειας είναι σιαλοπρωτεϊνη οστών (BSP), πρωτεΐνη μήτρα οδοντίνης 1 (DMP1), οδοντίνη sialophosphoprotein (DSPP), οστεοποντίνη (OPN), και φωσφογλυκοπρωτεΐνης εξωκυτταρικού πλέγματος (ΜΕΠΕ) [1]. Η έκφραση των αδελφών αρχικά πιστεύεται ότι περιορίζονται σε οστών και των δοντιών, όπου λειτουργούν για να διευκολύνουν την οδοντίνη και μήτρα ανοργανοποίησης οστού [1] – [3]. Πρόσφατες αναφορές όμως δείχνουν ότι τα αδέλφια είναι επίσης παρούσα σε μη mineralizing μεταβολικά ενεργός πόρου επιθηλιακά κύτταρα των σιελογόνων αδένων, νεφρώνες, και ιδρωτοποιούς αδένες eccrine όπου η λειτουργία τους μπορεί να σχετίζεται με την επισκευή των περικυτταρική και εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) πρωτεΐνες καταστραφεί από ελευθέρων ριζών που δημιουργούνται μέσα από την έντονη μεταβολική δραστηριότητα [4] – [6].

προηγούμενες εκθέσεις έχουν εντοπίσει το πάνω ρύθμιση ορισμένων μελών των αδελφών σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα και καρκίνοι του προστάτη [7] . OPN όμως είναι η ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ για το οποίο υπάρχει αναμφισβήτητη απόδειξη για το ρόλο της στην πολλά από τα βήματα της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου [6] – [8]. Τα Συσσωρευμένα στοιχεία αρχίζουν να εμπλέξει άλλα μέλη της οικογένειας, κυρίως BSP και DSPP, με ρόλους σε συγκεκριμένα στάδια εξέλιξης του όγκου συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, προσκόλληση, μετανάστευση, και /ή μετάστασης [6] – [8]. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα την αυξητική ρύθμιση του BSP, DSPP, και ΟΡΝ, σε ανθρώπινη στοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (OSCCs) [9] και σε ορισμένα ανθρώπινα επιθηλιακά δυσπλασία του στόματος (OEDs) [10]. Οι εκθέσεις αυτές δείχνουν ότι DSPP είναι ιδιαίτερα up-ρυθμίζονται σε φτωχά διαφοροποιημένο και ιστολογικά επιθετική OSCC [9]. Σημαντικά, OEDs εκφράζοντας DSPP με ή χωρίς BSP παρουσίασαν 4 φορές τάση για μετάβαση σε OSCC σε σύγκριση με OEDs εκφράζοντας BSP μόνη της, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση DSPP αυξημένο τον κίνδυνο της τοπικής πρωτογενούς OSCC ενώ BSP έκφραση μειώθηκε ο κίνδυνος αυτός [10]. Ωστόσο, επί του παρόντος δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με τη λειτουργική και μηχανιστική ρόλο της DSPP στην ανάπτυξη του καρκίνου του στόματος και της εξέλιξης.

Στην παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να δημιουργήσει λειτουργικές συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης DSPP και τη βιολογική συμπεριφορά των OSCC, μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) παρεμβολή χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή αποσιώπηση του

DSPP

στο OSCC κυτταρική σειρά OSC2.

DSPP

-silenced κύτταρα OSC2 στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για να προσδιοριστεί η έκταση στην οποία φίμωση καταστέλλει ή καταργεί βασικά κακοήθη φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των OSC2 κύτταρα χρησιμοποιώντας διάφορα πρότυπα

in vitro

τεχνικές.

Αποτελέσματα

DSPP υπερεκφράζεται σε καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές, OSC2 και SCC25, και δυσπλαστικών στόματος επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, DOK

OSC2 και SCC25 είναι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από OSSC περιφερειακή μετάσταση στους λεμφαδένες του τραχήλου της μήτρας λεμφαδένες ενός πρωτογενούς ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα ανθρώπινης γλώσσας, και ένα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων πρωτογενούς γλώσσα, αντίστοιχα [11] – [13]. DOK είναι μια ανθρώπινη στοματική επιθηλιακών δυσπλαστικών κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ραχιαία γλώσσα [14]. Για την αξιολόγηση των ενδογενών επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης DSPP και mRNA σε OSC2, SCC25, και τα κύτταρα DOK, western blot και ημιποσοτική-αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) -PCR αναλύσεις διεξήχθησαν σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου και εκχυλίσματα ολικού RNA, αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στο Υλικό και Μέθοδοι. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι αποτελούνταν από λύματα ολόκληρων κυττάρων και το συνολικό RNA εκχυλίσματα από MCF-7 κυττάρων (που προέρχονται από μαστικό αδενοκαρκίνωμα) και κύτταρα HOK (προέρχονται από πρωτογενή καλλιέργεια ανθρώπινων κερατινοκυττάρων από το στόμα), αντίστοιχα. DSPP σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε OSC2, SCC25, και σε DOK σύγκριση με κύτταρα HOK στο μεταφραστικό (Σχήμα 1Α) και τα επίπεδα της μεταγραφής (Σχήμα 1Β). Αυτές

in vitro

ευρήματα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών μας δείχνει την ανοδική ρύθμιση των DSPP σε OSCC από ασθενείς, και πλήρης απουσία της στην κανονική του στοματικού βλεννογόνου επιθηλίου [9].

(Α) κηλίδας Western (WB) και πυκνομετρικές αναλύσεις δείχνουν σημαντική αυξητική ρύθμιση των DSPP στο OSC2, SCC25, και τα κύτταρα DOK σε σύγκριση με HOK αρνητικούς μάρτυρες. Υπάρχει μια βασική (& lt? 10%) επίπεδο έκφρασης DSPP σε πρωτογενή κύτταρα HOK. MCF7 κυτταρική γραμμή γνωστή ότι εκφράζει DSPP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ομαλοποίηση με β-ακτίνη. (Β) ανάλυση ποσοτικαί RT-PCR δείχνει έκφραση DSPP-mRNA σε OSC2, SCC25, και τα κύτταρα DOK συνεπής με WB αποτελέσματα στο (Α) με μη ανιχνεύσιμα επίπεδα DSPP-mRNA σε HOK κύτταρο. Εξομάλυνση ήταν με GAPDH. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη: OSC2, μία ανθρώπινη κυτταρική γραμμή που προέρχεται από OSCC περιφερειακές τραχηλικό λεμφαδένα μετάσταση του πρωτογενούς καρκινώματος πλακωδών κυττάρων ανθρώπινης γλώσσας? SCC25, ένα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων πρωτοβάθμια γλώσσα? DOK, ένας άνθρωπος από του στόματος επιθηλιακών δυσπλαστικών κυτταρική γραμμή που προέρχεται από την ραχιαία γλώσσα? και MCF7 (ακρωνύμιο του Μίσιγκαν Ιδρύματος Καρκίνου – 7)., μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού που απομονώνεται από ένα 69-year-old καυκάσιος θηλυκό

Η

Παροδική DSP-shRNA αποτελέσματα διαμόλυνση με αλλαγμένη μορφολογία του OSC2 κυττάρων

Αφού διαπιστώθηκε αρχικά επίπεδα έκφρασης των DSPP σε δύο κυτταρικές σειρές OSCC, προχωρήσαμε να διερευνήσει τον τρόπο σταθερό

DSPP

-silencing μέσω λεντοϊού μεσολάβηση μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) παρεμβολή επηρεάζει τα ογκογόνο προφίλ κύτταρα OSC2. Επιλέξαμε OSC2 κύτταρα πάνω SCC25 ομόλογό τους εξαιτίας των αποδεδειγμένα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του DSPP σε OSC2 κύτταρα τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA (Σχήμα 1) και επίσης επειδή τα κύτταρα OSC2 εμφανίζουν πολύ ισχυρή επεμβατικές φαινοτύπου, όπως αποδεικνύεται σε πειραματικά γυμνά μοντέλα ποντικού [11 ] – [13]. Προκειμένου να αξιολογηθούν τα άμεσα αποτελέσματα της DSP-shRNA διαμόλυνση στη μορφολογία OSC2 κυττάρων, επιμολυσμένων κυττάρων μαζί με τους ελέγχους φωτογραφήθηκαν σε 24- και 48-ώρες μετά την επιμόλυνση (παροδική φάση) πριν από την έναρξη της επιλογής πουρομυκίνης από σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2C και 2F (επεξηγηματικός περιοχές φωτογραφήθηκε), DSP-shRNA επιμολυσμένα OSC2 κύτταρα παρουσίασαν ένα κατά πολύ μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων με σημαντική απώλεια της επαφής κυττάρου-κυττάρου και μια πιο ωοειδή και ακανόνιστη περίγραμμα σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα OSC2 κύτταρα (Εικόνα 2Α) ή ως κωδικοποιημένο ελέγχους αλληλουχίας (Σχήματα 2Β, 2Ε). Μικροσκοπία φθορισμού του παροδικά επιμολυσμένων κλώνων coGFP-shRNA έδειξε μια ισχυρή πράσινο φθορισμό ενδεικτική υψηλού ποσοστού αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (Σχήμα 2D). Προχωρήσαμε στην καθιέρωση σταθερών DSP-shRNA-σιγήσει κύτταρα OSC2 μέσω επιλογής πουρομυκίνης, προκειμένου να διερευνηθεί η έκταση της τυχόν αλλαγές σε άλλα βασικά χαρακτηριστικά φαινοτυπικά της OSCC.

(Α) κύτταρα OSC2 πριν λεντοϊού μεταγωγή επιμόλυνση με DSP-shRNA εμφανίζουν χαρακτηριστική μορφολογία βιώσιμων επιθηλιακών κυττάρων όγκου σε καλλιέργεια. (Β, Ε) Κωδικοποιημένα (έλεγχος) αλληλουχία-επιμολυσμένα κύτταρα OSC2 σε 24- και 48 ώρες που εμφανίζουν βιώσιμα επιθηλιακά κύτταρα και μορφολογία συγκρίσιμη με (Α). (C, F? Επεξηγηματικά περιοχές) DSP-shRNA επιμόλυνση τα κύτταρα OSC2 εμφανίζουν σημαντικά αυξημένο αριθμό κυττάρων με απώλεια επαφής κυττάρου-κυττάρου, πιο στρογγυλεμένη και ακανόνιστο περίγραμμα, εξέχοντες πυρηνική διόγκωση και την κυτταρική αποσύνθεση συνεπή με εκείνα του εξαντλημένος και πεθαίνουν τα κύτταρα στο 24- και 48-h, αντίστοιχα. (D) copGFP επιμολυσμένα OSC2 κύτταρα επιβεβαιώνουν πολύ υψηλή απόδοση επιμόλυνσης (πράσινο φθορισμό).

Η

Δημιουργία ενός σταθερού

DSPP

-silenced OSC2 κυτταρική σειρά

Σταθερή γραμμές του DSP-φιμώνονται και κωδικοποιημένα έλεγχοι ακολουθία επιλέχθηκαν μέσω των αντιβιοτικών πουρομυκίνης όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η αποτελεσματικότητα του DSP-shRNA βραδέος κατασκεύασμα σε σταθερά φίμωση DSPP σε κύτταρα OSC2 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) αναλύσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, western blot και πυκνομετρική ανάλυση έξι διαφορετικών DSP-shRNA επιμολυσμένα OSC2 σταθερές γραμμές έδειξαν DSPP σίγηση που κυμαίνονται από περίπου 5% [γραμμή (L) 4] για -95% σε σύγκριση με το L2 σταθερό shRNA-κωδικοποιημένο αλληλουχία (SHC ) έλεγχος (Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ανοσοφθορισμό συνεστιακή μικροσκοπία δείχνει σημαντικά μειωμένη σήμα DSPP (πράσινο φθορισμό) στον L2 σταθερές γραμμές σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 3C).

Σταθερό επιλογή γραμμές λεντοικής μεταγωγή shRNA επιτεύχθηκε μέσω επιλογής Πουρομυκίνης. (Α) WB και το αντίστοιχο πυκνομετρική ανάλυση του επιπέδου του DSPP-φίμωση μετά την επιλογή των έξι σταθερές γραμμές δείχνουν το επίπεδο της φίμωσης που κυμαίνονται από περίπου 5% (γραμμή [L] 4) σε -95% (L2) σε σύγκριση με ομελέτα ακολουθία (SHC) έλεγχος. (Β) ανάλυση qRT-PCR δείχνουν μείωσε σημαντικά DSPP-mRNA σε DSPP-σιγήσει L1 (& gt? 90%)? Κύτταρα (που εμφανίζουν την πλέον knockdown σε WB) σε σύγκριση με τον έλεγχο SHC και L2 (95% & gt). (C) ανοσοφθορισμός συνεστιακή μικροσκοπία επαληθεύει DSPP-φίμωση ως σημαντικά μειωμένο σήμα DSPP (πράσινο φθορισμό) στον L2.

Η

Παράλληλα, επαλήθευσε την αποτελεσματικότητα του DSP-shRNA στη καταστρέφουν DSPP mRNA σε lentivirally μολυσμένα κύτταρα με qRT-PCR χρησιμοποιώντας L1 και L2 που παρουσιάζουν την πιο knockdown από τις έξι γραμμές (βλέπε Εικόνα 3Α) σε στύπωμα western. Τα αποτελέσματα δείχνουν μειωμένη σημαντικά τα επίπεδα DSPP mRNA σε L1 (& gt? 99%) και L2 (& gt? 95%) σε σύγκριση με τη γραμμή ελέγχου shRNA SHC (Σχήμα 3Β). Οι C

τιμές Τ λαμβάνονται από την ανάλυση qRT-PCR των σχετικών επιπέδων DSPP mRNA σε έλεγχο SHC και

DSPP

-silenced L1 και L2 ομαλοποιήθηκαν με το γονίδιο οικοκυρική GAPDH. Αυτό shRNA μεσολάβηση επίδραση ήταν ειδική, καθώς τα επίπεδα GAPDH δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των DSP-shRNA επιμολυσμένα κύτταρα και τους ελέγχους.

DSPP

-silencing μειώνει ρ53, Ki-67 και PCNA, και αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αποικιών σχηματισμό σε OSC2 κύτταρα

τα αποτελέσματα του

DSPP

-silencing για τα επίπεδα του πολλαπλασιασμού δείκτη, Ki-67, PCNA, και ο ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου p53 αναλύθηκαν με Western blot για όλες τις έξι

DSPP

-silenced OSC2 σταθερές γραμμές. Σε σύγκριση με τη γραμμή ελέγχου Shc, τα επίπεδα του Ki-67, PCNA και ρ53 μειώθηκαν σημαντικά, δείχνοντας ότι μπορεί να ενισχύσει DSPP πολλαπλασιασμό σε στοματική καρκινικών κυττάρων μέσω των μηχανισμών που αφορούν ρ53, Ki-67, και PCNA (Σχήμα 4Α).

(Α) WB του Ki-67, PCNA και ρ53 εξής

DSPP

-silencing σε OSC2 κύτταρα δείχνουν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω για καθένα από αυτές τις πρωτεΐνες. (Β) Το καθεστώς πολλαπλασιασμός του

DSPP

-silenced OSC2 κυττάρων σε σύγκριση με τη γονική OSC2 και έλεγχος SHC διενεργείται μέσω shows ΜΤΤ δοκιμασία μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του 53% για το L2 (αποδεικνύοντας την πιο βαθμό αποσιώπησης) σε σύγκριση με & lt ? 5% για L4 (τουλάχιστον αποσιώπηση) και ~ 30% για L6 (μέτρια σίγηση) και έλεγχος SHC (ρ & lt? 0,05? η = 3). (C) κύτταρα L2 σχηματίζονται μικρότερα και σημαντικά λιγότερες (& lt? 25%) αποικίες σε μαλακό άγαρ σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ελέγχου SHC OSC2 και (* p & lt? 0,05).

Η

Για να προσδιοριστεί η έκταση στην οποία

DSPP

αποσιώπηση επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων OSC2, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ΜΤΤ για τρεις από τις έξι

DSPP

-silenced σταθερές γραμμές που περιλαμβάνονται L2 αποδεικνύοντας τον υψηλότερο βαθμό

DSPP

-silencing, L4 επιδεικνύοντας το λιγότερο αποσιώπηση και L6 καταδεικνύοντας μέτρια αποσιώπηση. Σε σύγκριση με τον έλεγχο SHC και τη γονική OSC2 κυτταρικές σειρές, αποσιώπηση του

DSPP

συνδέθηκε με έναν μέσο όρο 53% μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων την ημέρα 6 σε L2 (Εικόνα 4Β? Ρ & lt? 0,05? Η = 3). Όσον αφορά την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες, κύτταρα L2 σχημάτισαν αποικίες σε μαλακό άγαρ που ήταν σημαντικά μικρότερα και λιγότερα από εκείνα από ελέγχους Shc, και από γονικά κύτταρα OSC2 (Σχήμα 4C). Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε κύτταρα L2 ήταν σημαντικά μειωμένη (& lt? 25% των κυττάρων μητρικής OSC2 και περίπου 20% του ελέγχου SHC), όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Γ ραβδόγραμμα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν σημαντικό ρόλο για DSPP στον καρκίνο του στόματος κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό. κύτταρα L2 αποδεικνύοντας την πιο σημαντικό βαθμό

DSPP

-silencing των έξι γραμμές που χρησιμοποιούνται για τις έρευνες των επιπτώσεων της φίμωση για τη μετανάστευση και την εισβολή, και σχετικά με τις δραστηριότητες του κυτταρικού κύκλου.

DSPP

-silencing μειώνει τη μετανάστευση OSC2 και εισβολή

Όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς εισβολής και της μετανάστευσης, χρησιμοποιώντας πειράματα τροποποιημένων Boyden Επιμελητήριο προκειμένου να προσδιοριστεί ο βαθμός στον οποίο

DSPP

σίγηση επηρεάζει τη μετανάστευση και την εισβολή των OSC2 κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, αποσιώπηση του

DSPP

(L2) μειώθηκε εισβολή (Σχήμα 5Α) και τη μετανάστευση (Σχήμα 5Β) του OSC2 κυττάρων κατά 25% σε κάθε περίπτωση, σε σύγκριση με τον έλεγχο SHC και γονικά κύτταρα OSC2 (ρ & lt ? 0.05 για κάθε σύγκριση χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Dunn του πολλαπλές συγκρίσεις). Με βάση αυτά τα ευρήματα υποθέτουμε ότι DSPP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση και διεισδυτικότητα εντός OSCC μικροπεριβάλλον για τουλάχιστον υποβοήθηση τοπική εξάπλωση του όγκου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτών των in vitro αναλύσεις μας επιτρέπουν να υποθέσουμε ότι DSPP μπορεί να παίξει ένα ρόλο στη μακρινή περιοχή μετάσταση του πρωτογενούς OSCCs.

(Α, Β) Τροποποιημένο Boyden-Επιμελητήριο πείραμα δείχνει ότι

DSPP

-silencing σε (L2) μειώθηκαν εισβολή (Α) και τη μετανάστευση (Β) των κυττάρων OSC2 κατά ~ 25%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο SHC και γονικά κύτταρα OSC2 (για κάθε σύγκριση με τη χρήση μεθόδων Dunn των πολλαπλών συγκρίσεων).

Σταθερή

DSPP

-silencing στο OSC2 κύτταρα προκαλεί G

0 /G

1 σύλληψης

Για να επαληθεύσετε τα αποτελέσματα των

DSPP

καταστολής σχετικά με τις δραστηριότητες OSC2 κυτταρικού κύκλου, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του

DSPP

-silenced OSC2 σταθερή γραμμή, L2, διεξήχθη. Η αναλογία των κυττάρων L2 στο G

0 /G φάση

1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου Shc και εκείνη των γονικών κυττάρων OSC2 (Σχήμα 6). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, 79.51% των κυττάρων L2 συσσωρεύεται στο G

0 /G

1 φάση σε αντίθεση με 44,77% και 45,98 γονικής OSC2 και ελέγχων SHC, αντίστοιχα. Οι αναλογίες των κυττάρων στην S και G

2 /M φάσεις των κυττάρων L2 ήταν 14,62% ​​και 5,88%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 30,74% (S) και 24,49% (G

2 /Μ) για τη γονική OSC2 κύτταρα και 32,92% (S) και 21,11% (G

2 /Μ) για κύτταρα ελέγχου SHC. Ωστόσο, δεν υπήρχαν ανιχνεύσιμες διαφορές σε αποπτωτικά ποσοστό μεταξύ των κυττάρων L2 και SHC έλεγχοι επιβεβαιωθεί ως περαιτέρω με πειράματα τμήση DNA (Σχήμα 6Β), υποδεικνύοντας ότι

DSPP

-silencing μόνος δεν αυξάνει το ποσοστό απόπτωσης σε OSC2 κύτταρα.

(Α) ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δείχνει ποσοστό των DSPP-αθόρυβη κύτταρα L2 στο G

0 /G

1 φάση αυξήθηκε σημαντικά (79,51%) σε σχέση με τη γονική OSC2 (44,7%) και των ελέγχων SHC (45,98%). (Β) Αντίθετα, DNA laddering πειράματα δεν δείχνει σημαντική διαφορά στο ρυθμό της απόπτωσης μεταξύ κυττάρων L2 και ελέγχων. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι

DSPP

-silencing μόνη της δεν αυξάνει το ρυθμό της απόπτωσης σε κύτταρα OSC2.

Η

Σταθερή

DSPP

-silencing ευαισθητοποιημένα κύτταρα OSC2 με σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση

κεφαλής και τραχήλου πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (HNSCC), συμπεριλαμβανομένων των OSCCs, αναπτύσσουν επίκτητο ή ενδογενή ανθεκτικότητα σε σισπλατίνη με βάση το συνδυασμό χημειοθεραπείας [15], [16]. Έχει προταθεί ότι ο μηχανισμός παρεμβολής με σισπλατίνη απόπτωση σε HNSCCs είναι με ρύθμιση προς τα άνω του EGFR [15]. Ως εκ τούτου, επιδιώκεται να προσδιοριστεί η επίδραση του

DSPP

-silencing στην έκφραση EGFR, καθώς και την έκταση των επιπτώσεων της

DSPP

-silencing με την ανταπόκριση των κυττάρων σε OSC2 σισπλατίνη απόπτωση.

Μετά τη θεραπεία του

DSPP

-silenced OSC2 (L2) κύτταρα και τους ελέγχους (γονική OSC2 και SHC) με διάφορες δόσεις cisplatin σε ένα πείραμα χρονικής πορείας, όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι, ποσοστό απόπτωσης σε κύτταρα L2 αναλύθηκε με Annexin V /FITC κυτταρομετρία ροής, και σε σύγκριση με τα ποσοστά σε ελέγχους. Με σχεδόν το 100% των κυττάρων περιφραγμένο και FACS ταξινομημένο, Το Σχήμα 7Α δείχνει ότι το κλάσμα αποπτωτικό κυτταρικό ήταν σημαντικά αυξημένη από 41,28% σε γονικά κύτταρα OSC2 (και 43,69% σε ελέγχους SHC) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 υΜ σισπλατίνη για 24 ώρες για να 56,19% σε L2 κύτταρα κατεργασμένα με ίση δόση σισπλατίνης. Από την άλλη πλευρά, τα αποπτωτικά κλάσματα κυττάρων χωρίς σισπλατίνης για OSC2 (9,63%), του ελέγχου SHC (12,81%), και τα κύτταρα L2 (13,99%) δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές. Παρομοίως, τα αποτελέσματα της χρώσης trypan blue δείχνουν εξίσου σημαντική αύξηση στο ρυθμό απόπτωσης σε κύτταρα L2 αγωγή με σισπλατίνη σε σύγκριση με τον έλεγχο SHC και γονικών κυττάρων OSC2 αγωγή με σισπλατίνη σε διάφορες δόσεις (Σχήμα 7Β).

(Α) θεραπεία του

DSPP

-silenced L2, γονική OSC2 και SHC κύτταρα ελέγχου με 50 μΜ για 24 ώρες που ακολουθείται από Annexin V /FITC ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δείχνουν μια αύξηση 56.19% σε αποπτωτικά ποσοστό (που μετράται από υπο-G1 κυτταρική περιεχόμενο DNA) για κύτταρα L2 σε σύγκριση με 41,28% σε γονικά με σισπλατίνη και OSC2 και 43,69% σε SHC ελέγχου με σισπλατίνη. (Β) Trypan blue χρώση ραβδόγραμμα ποσοτικοποίηση δείχνει συγκρίσιμα ποσοστά αποπτωτικών με εκείνη στο (Α). (C) WB παρουσιάζει σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR σε

DSPP

-silenced κύτταρα OSC2, συμπεριλαμβανομένων των L2. Σύμβολα: κις = σισπλατίνη? L2 =

DSPP

-silenced κύτταρα OSC2 γραμμή 2? OSC2 = γονική (χωρίς νοκ ντάουν) κύτταρα OSC2, Μ1 = ζωντανά κύτταρα? Μ2 = συμφωνία κύτταρα.

Η

Επιπλέον, το επίπεδο του EGFR ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα L2 σύγκριση με τους μάρτυρες SHC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή του EGFR απαιτείται για τη σισπλατίνη απόπτωση σε OSC2 κύτταρα (Σχήμα 7C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι DSPP αποσιώπηση στα κύτταρα OSC2, ενώ με αποτέλεσμα G

0 /G

1 σύλληψη (βλέπε Εικόνα 6Α) και συνεπώς μειωμένη πολλαπλασιαστική δραστηριότητα, δεν αυξάνει την απόπτωση? Ωστόσο, η καταστολή DSPP μπορεί να ενισχύσει σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων OSC2 να σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται μέσω μηχανισμού που περιλαμβάνει τη μειορύθμιση του EGFR.

Σταθερό

DSPP

-silencing σε OSC2 κύτταρα καταστέλλει ΜΜΡ-2, ΜΜΡ -3, και ΜΜΡ-9 εκφράσεις

Προγενέστερες μελέτες έχουν προσδιορίσει συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ ορισμένων μελών της οικογένειας ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ πρωτεϊνών με ειδικές μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs). Συγκεκριμένα, BSP συνεργάζεται με προΜΜΡ-2, ΟΡΝ με προΜΜΡ-3, και DMP-1 με ProMMP9 προκειμένου να ενεργοποιηθούν οι αντίστοιχες πρωτεάσες [4], [17]. Ωστόσο, ο εταίρος (ες) ΜΜΡ προς DSPP και ΜΕΠΕ, αν υπάρχουν, δεν έχουν ταυτοποιηθεί. Παρ ‘όλα αυτά, επιδιώξαμε να καθορίσει το καθεστώς έκφραση αυτών των τριών γνωστών ΜΜΡ ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ-συνεργαζόμαστε σε όλα τα έξι δημιουργείται

DSPP

-silenced γραμμές OSC2.

Όπως φαίνεται από τις αναλύσεις blot και πυκνομετρικές δυτικό, τα επίπεδα της τόσο προ- και ενεργοποιημένη ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-9 επίπεδα μειώθηκαν σε όλες εκτός από μία από τις έξι

DSPP

-silenced γραμμές OSC2 σύγκριση με τους ελέγχους SHC (Σχήματα 8Α, 8Β). Εξίσου σημαντική είναι μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του βαθμού

DSPP

-silencing και καταστολή ΜΜΡ, όπως υποδεικνύεται από ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων παλινδρόμησης μέσω της προέλευσης: ΜΜΡ-2 {(y = 0.850x, ρ & lt? 0.001) (y = 1.156x, ρ & lt? 0.001)}, ΜΜΡ-3 {(y = 0.994x, ρ & lt? 0.001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, και ΜΜΡ-9 {(y = 1.248x, ρ = 0.005 , y 0,809, p = 0,013)? Εικόνα 8C)}. Ωστόσο, το επίπεδο της καταστολής ΜΜΡ δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ προ- και διασπάστηκε μορφές. Ομοίως, μείωση στα επίπεδα VEGF σε σταθερές

DSPP

-silenced γραμμές κυμάνθηκε από & lt? 5% (L4) έως 86% (L2) με το επίπεδο της καταστολής ευθέως ανάλογη με το βαθμό της

DSPP

-silencing (Εικόνα 8D), υποδηλώνοντας μια δοσο-εξαρτώμενη σχέση ανάμεσα στην έκφραση DSPP και αγγειογόνο δραστικότητα σε OSCCs. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ένα ρυθμιστικό ρόλο για DSPP στην προς τα πάνω ρύθμιση και ενεργοποίηση των MMPs ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ-συνεταιρισμό καθώς και την αγγειογένεση στον καρκίνο του στόματος.

(Α) WB και (Β) που αντιστοιχεί πυκνομετρικές αναλύσεις δείχνουν σημαντική καθοδική ρύθμιση των προ- και ενεργοποιημένη ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-9 σε όλες εκτός από μία (L4) από τα έξι

DSPP

-silenced σταθερές γραμμές. (C) ελαχίστων τετραγώνων παλινδρόμησης αναλύσεις δείχνουν σημαντικά μειωμένα επίπεδα της προ-και ενεργοποιημένο ΜΜΡ-2 {(y = 0.850x, σ & lt? 0.001) (y = 1.156x, σ & lt? 0.001)}? ΜΜΡ-3 {(y = 0.0.994x, ρ & lt? 0.001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, και ΜΜΡ-9 {(y = 1.248x, ρ = 0.005, γ = 0.809, p = 0,013) }, και μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του βαθμού

DSPP

-silencing και καταστολή ΜΜΡ? Ωστόσο, το επίπεδο της καταστολής ΜΜΡ δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ προ- και διασπάστηκε μορφές. (D) πυκνομετρική ανάλυση WB των επιπέδων VEGF έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση που κυμαίνονται από & lt? 5% (L4) έως 86% (L2) με το επίπεδο της κάτω ρύθμιση ευθέως ανάλογη με το βαθμό της

DSPP

– φίμωση.

Η

In vivo

αποτελέσματα κατά των όγκων του

DSPP

-silencing στα κύτταρα OSC2

Η αντικαρκινική δράση των DSPP- σίγηση σε OSC2 κύτταρα δοκιμάστηκε σε δύο Balb /c γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν υποδόρια με DSPP-σιγήσει κύτταρα OSC2 (γραμμές L2) στο αριστερό πλευρό, ενώ το περιπλεγμένο ελέγχου αλληλουχίας (γραμμές SHC) εμφυτεύτηκε υποδορίως στη δεξιά πλευρά. Όπως φαίνεται στο συμπληρωματικό σχήμα S1, παρατηρήθηκε μια τάση προς επιβραδυμένη ανάπτυξη του όγκου και την ανάπτυξη με αποτέλεσμα ένα συνολικό μικρότερο όγκο του όγκου για L2 όγκου σε σύγκριση με όγκους ελέγχου SHC σε μία περίοδο 6 εβδομάδων [Σχήματα S1A και S1G (διάγραμμα διασποράς]. Η ιστολογική αξιολόγηση hematoxylene και ηωσίνη (η &? Ε) τομές έδειξαν καλά διαφοροποιημένα και επιθετικά ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα που συνδέεται με την SHC (έλεγχος) που προέρχονται όγκους (Σχήμα S1B) σε σύγκριση με τις λιγότερο διαφοροποιημένες L2 προέρχονται όγκοι (Σχήμα S1c) Επιπλέον, L2. προέρχονται οι όγκοι τείνουν να σχηματίσουν μικρές συρρίκνωση νησιά με πιο ορατό νέκρωσης των όγκων από SHC προέρχεται όγκους (Σχήμα S1c). σημαντικά, immuostain για DSPP επαληθεύεται μείωση DSPP στο L2 προέρχονται όγκους (Σχήμα S1E) σε σύγκριση με το υψηλό επίπεδο DSPP σε SHC προέρχονται όγκους (Σχήμα S1D). Σχήμα S1F είναι μία αντιπροσωπευτική προ-άνοση IgG αρνητικός έλεγχος. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι μειωμένες ογκογόνο χαρακτηριστικά της OSCC εξής

DSPP

-silencing παρατηρήθηκε στα

in vitro

πειράματα που περιγράφονται ανωτέρω είναι επαναλήψιμη

in vivo

.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη, με στόχο την απόκτηση γνώσεις σχετικά με το λειτουργικό ρόλο της DSPP στη βιολογία του καρκίνου του στόματος, σχεδιάστηκε ως λογική συνέχεια προηγούμενες εκθέσεις μας δείχνουν ότι DSPP είναι ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά στην επιθετική ανθρώπινο OSCCs [6], καθώς και σε εκείνες OEDs με σημαντικά υψηλή τάση για μετάβαση στην επεμβατική OSCC [10]. Για το καλύτερο της γνώσης μας, παρούσα έκθεση μας αντιπροσωπεύει την πρώτη επίδειξη της προς τα πάνω ρύθμιση DSPP σε δύο προφορικές καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με, στην καλύτερη περίπτωση, βασικό επίπεδο στην πρωτοβάθμια κανονικά από το στόμα κερατινοκύτταρα (ΝΟΚ). Πιο σημαντικά, αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με μια μελέτη που διερεύνησε τις επιδράσεις των

DSPP

-silencing στις ογκογόνο προφίλ μιας καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά.

DSPP

, το μεγαλύτερο μέλος της οικογένειας γονιδίων ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ, κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη ~1300 αμινοξέων μετα-μεταφραστικώς διασπάται σε δύο κύριες πρωτεΐνες, οδοντίνη σιαλοπρωτεϊνη (DSP) και την οδοντίνη φωσφοπρωτεΐνη (DPP, που ονομάζεται επίσης phosphorin) [2], [18] – [ ,,,0],20]. Η έκφραση του DSP και DPP πιστευόταν αρχικά να περιορίζεται σε οδοντίνη (και odontoblasts), όπου παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην ανοργανοποίηση, με DPP είναι η πιο άφθονη των δύο πρωτεϊνών [2], [19], [21]. Ωστόσο, μετέπειτα μελέτες έδειξαν ότι χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης DSPP είναι παρούσα στα οστά [1] – [3]. Πρόσφατες μελέτες επίσης έδειξαν σημαντικά επίπεδα έκφρασης του DSPP (και άλλα μέλη της οικογένειας ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ) σε μεταβολικά ενεργές πόρου επιθηλιακά κύτταρα [4] – καρκίνους [6], και προς τα πάνω ρύθμιση του σε ένα υποσύνολο του μαστού, του στόματος, του πνεύμονα και του προστάτη [6] – [9]. Επειδή DSPP περιέχει το εντόνως διατηρημένο MQXDPP μοτίβο που έχει αποδειχθεί σε DMP1 ότι εμπλέκεται στην πρωτεολυτική επεξεργασία, έχει υποτεθεί ότι τα ίδια tolloid σχετίζονται πρωτεάσες (ιδιαίτερα BmP1) διασπούν DSPP σε DSP και DPP [19], [20]. Η πρωτεολυτική επεξεργασία του DSPP με ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-20, και καλλικρεΐνης-συναφή πεπτιδάσης 4 έχει αναφερθεί [19].

Το μονοκλωνικό αντίσωμα, LF-Mb21, που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αναγνωρίζει τόσο το πλήρους μήκους (DSPP) και το τμήμα DPP αλλά όχι το DSP. Η 97 kDa πρωτεϊνική ζώνη στο Σχήμα 1Α είναι ενδεικτική ενός προϊόντος διάσπασης, DPP, αλλά χαμηλότερες ζώνες μοριακού βάρους που θα αντιπροσώπευε DSP δεν είναι παρόντες. Επιπλέον, το συγκρότημα μοριακό βάρος που προσεγγίζει εκείνο του πλήρους μήκους DSPP απουσίαζε. Μετά φίμωση με ένα σχέδιο κατασκεύασμα που απευθύνονται σε όλο το μήκος

DSPP

, μόνο πολύ χαμηλά επίπεδα της μπάντας 97KD παρατηρήθηκε στις περισσότερες από τις σταθερές γραμμές, υποδεικνύοντας την αποσιώπηση του

DPP

και πλήρους μήκους

DSPP

. Ενώ είναι κατανοητό ότι η στρατηγική νοκ ντάουν μας, επίσης, θα μπορούσε να έχει μειωμένα επίπεδα DSP, δεν μπορούμε να καθορίσουμε, με βάση τα σημερινά δεδομένα μας, έστω και αν οι διάφορες επιδράσεις του νοκ ντάουν στην ογκογόνο προφίλ των OSC2 κύτταρα που περιγράφονται ήταν το αποτέλεσμα των μειωμένων επιπέδων της DPP, DSP, ή και τα δύο (ή ακόμη και ανέπαφο DSPP). Είναι, ωστόσο, πολύ ενδεικτικά σε αυτό το σημείο ότι, το λιγότερο, DPP ή τις τροποποιημένες μορφές του μπορεί να παίζουν ρόλο στην ογκογόνο ρυθμιστικές δραστηριότητες του στόματος καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω μελέτες, συμπεριλαμβανομένων των στρατηγικών (π.χ. προσθήκη ορισμένων φουρίνη αναστολείς? Βλ. Ref [20]) που προκαλεί τα κύτταρα να εκκρίνουν μόνο πλήρη DSPP μήκους που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως θα απαιτηθεί ένα πρότυπο για μετέπειτα έρευνες αντιμετώπιση καμία ειδική μηχανιστική ρόλο για DPP, DSP ή το πλήρες μήκος DSPP στη βιολογία των στοματικών καρκίνων.

Κριτικές των συγκεκριμένων γονιδίων προϊόντα προφίλ σε αυτή τη μελέτη, μετά από

DSPP

αποσιώπηση, δείχνουν ότι κανένα από αυτά δεν έχουν, μέχρι τώρα, έχουν συσχετιστεί με τον δυνητικό ρόλο της DSPP στον καρκίνο του στόματος. Ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη DSPP αντιπροσωπεύει έναν ιδανικό στόχο για ένα shRNA μεσολάβηση σίγηση, και αναλύοντας τις λειτουργικές επιδράσεις του

DSPP

-silencing σε OSC2, δείχνουμε ότι

DSPP

-silencing μειορυθμίζει κλειδί πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου, αγγειογένεση, και την τοπική εισβολή. Συγκεκριμένα, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αποσιώπηση του

DSPP

στην προφορική καρκινικών κυττάρων σχετίζεται με σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των MMPs ΑΜΦΙΘΑΛΗΣ-συνεταιρισμό, VEGF, p53, και οι δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67 και PCNA. Up-κανονισμούς της ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9, VEGF, και ρ53 με τα επίπεδα που συσχετίζεται με αποτέλεσμα και προγνωστικές παραμέτρους, όπως προχωρημένο στάδιο της νόσου, την εισβολή και μετάσταση έχουν προηγουμένως σχετίζεται με τον καρκίνο του στόματος [22] – [ ,,,0],24]. Έτσι, τα αποτελέσματα μας δείχνουν μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9, VEGF, και ρ53 ακόλουθες σταθερές

DSPP

-silencing σε OSC2 κύτταρα υποδηλώνει ότι DSPP μπορεί να λειτουργεί προς την αντίθετη κατεύθυνση από αυτές τις πρωτεΐνες προϊόντα. Επιπλέον, η ρύθμιση προς τα κάτω της ρ53 υποδεικνύει ότι DSPP μπορούν άμεσα, ή τουλάχιστον εξ αποστάσεως, ρυθμίζουν πτυχές της δραστηριότητας του κυτταρικού κύκλου.

Πρόσφατες αναφορές δείχνουν επίσης ότι η ΜΜΡ-μεσολαβούμενη αναδιαμόρφωση εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) είναι , πράγματι, μία από τις πολλές εκδηλώσεις για την έναρξη επιτρέποντας κύτταρα OSCC να εισβάλουν στη γύρω στρώμα [25]. Λαμβάνεται ως δεδομένο ότι η πρώιμη έκφραση των ΜΜΡ από όγκο ή περιβάλλοντα στρωματικά κύτταρα διευκολύνει την αναδιαμόρφωση του ECM, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των αυξητικών παραγόντων για να εξασφαλιστεί μια βιώσιμη nidus για την ανάπτυξη πρωτογενούς όγκου [26], [27]. Με τη σειρά του, την ανάπτυξη του όγκου οδηγεί σε αγγειογόνους διακόπτης κατά την οποία το υπόλοιπο του προ-αγγειογόνος παράγοντες όπως VEGF υπερνικά την έκφραση αγγειογόνων αναστολέων [28]. VEGF-διαμεσολαβούμενη αγγειογένεση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του OSCC εξέλιξης [25], [29], και ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και οι δύο έχουν εμπλακεί στην επαγωγή της αγγειογόνου διακόπτη σε διάφορα μοντέλα [26], [27].