Αφηρημένο

Έχουμε διευκρινιστεί πρόσφατα μια νέα λειτουργία για CD82 σε Ε-καντερίνη μεσολάβηση homocellular πρόσφυση? εξαιτίας αυτής της λειτουργίας, μπορεί να αναστείλει τον καρκίνο διαχωρισμού κυττάρων από τον πρωτογενή καρκίνο και φωλιά όριο μετάσταση. Ωστόσο, η επίδραση του CD82 επί σελεκτίνης συνδετήρα-μεσολάβηση heterocellular προσκόλληση δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε στις επιπτώσεις της μετάστασης καταστολέα CD82 /KAI1 για heterocellular προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων με στόχο την περαιτέρω διαλεύκανση της λειτουργίας των τετρασπανίνη. Η υπερ-έκφραση του CD82 σε καρκινικά κύτταρα οδήγησε στην αναστολή της πειραματικά επαγόμενης πνευμονικών μεταστάσεων σε ποντικούς και ανέστειλε σημαντικά την πρόσφυση αυτών των κυττάρων σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs)

in vitro

. Προ-επεξεργασία των κυττάρων με αντισώματα λειτουργία δημιουργεί διαταραχές κατά ΣΕΛ

Α /Χ ανέστειλε σημαντικά την πρόσφυση των CD82 αρνητικών κυττάρων σε HUVECs. Επιπλέον, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν CD82 εμφάνισαν μειωμένη έκφραση του ΣΕΛ

Α /Χ σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου CD82-αρνητικό. Σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του ST3 β-γαλακτοσίδη α-2, 3-σιαλυλτρανσφεράση 4 (ST3GAL4) ανιχνεύθηκε με cDNA microarray, σε πραγματικό χρόνο PCR, και αναλύσεις western αποτύπωση. Knockdown του

ST3GAL4

σε κύτταρα άγριου τύπου CD82-αρνητικά ανέστειλε την έκφραση του ΣΕΛ

x και μειωμένη προσκόλληση κυττάρου σε HUVECs. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι CD82 μειώνει SLE

Α /Χ έκφραση μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση του

ST3GAL4

έκφρασης και ως εκ τούτου μειώνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία, με αποτέλεσμα την αναστολή της μετάστασης.

Παράθεση: Yoshihama Ν, Yamaguchi Κ, Chigita S, M Mine, Abe Μ, Ishii K, et al. (2015) Μια νέα λειτουργία του CD82 /KAI1 στο Sialyl Lewis αντιγόνου πρόσφυση με τη μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων: Αποδείξεις για ένα αντι-Μετάσταση Επίδραση από κάτω ρύθμιση σιαλυλο Lewis αντιγόνα. PLoS ONE 10 (4): e0124743. doi: 10.1371 /journal.pone.0124743

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 24 του Δεκ του 2014? Αποδεκτές: 3 Μάρτη 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Απρ, 2015

Copyright: © 2015 Yoshihama et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Kaken Νο 23390465) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (στο Τ Sugiura). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι μια πολλαπλών βημάτων φαινόμενο που χαρακτηρίζεται από τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων από την αρχική τοποθεσία τους, την εισβολή του αίματος υποδοχής ή λεμφαγγείων, σπορά απομακρυσμένα όργανα, και η επακόλουθη ανάπτυξη των μεταστατικών όγκων. Η εξαγγείωση των κακοηθών κυττάρων περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των Ρ- και Ε-σελεκτίνη, οι οποίες είναι μόρια κυτταρικής προσκόλλησης που βρίσκονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων που ευθυγραμμίζουν τα αιμοφόρα αγγεία, με τα αντίστοιχα προσδέματα υδατάνθρακα που συμβαίνουν στην επιφάνεια των κακοήθων κυττάρων [1]. Πολλά μοριακά είδη συνδετήρων υδατάνθρακα για τις σελεκτίνες που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των σιαλυλ Lewis Χ (SLE

x) και σιαλυλ Lewis Α (SLE

α). Πολυάριθμες κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η έκφραση του ΣΕΛ

x και ΣΕΛ

ένα σχετικά βλεννίνες κύτταρο όγκου συσχετίζεται άμεσα με μετάσταση, την εξέλιξη του όγκου, και φτωχή πρόγνωση [2,3], και είναι γνωστό ότι η έκφραση του ΣΕΛ

x /a είναι σημαντικά βελτιωμένη σε συμπαγείς όγκους. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός βασίζεται η ρύθμιση του ΣΕΛ

x /a σε καρκινικά κύτταρα δεν είναι καλά κατανοητός.

Πρωτεΐνες

τετρασπανίνη, ή TM4SF, περιλαμβάνουν μια μεγάλη ομάδα πρωτεϊνών διαμεμβράνης που συμβαίνουν στην επιφάνεια του κυττάρου, η οποία μπορεί σχηματίζουν σύμπλοκα με τους υποδοχείς της μεμβράνης, όπως ιντεγκρίνες. Ορισμένα τετρασπανίνη-οικογένεια πρωτεϊνών που έχουν αναφερθεί για να διαδραματίσει έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετάσταση όγκου [4,5]. CD82 /KAI1, ένα μέλος της υπεροικογένειας τετρασπανίνη, αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα μόριο Τ-κυττάρων αξεσουάρ [6] και ακολούθως προσδιορίζονται σε μια γενετική διαλογή για γονίδια καταστολέα μετάστασης του καρκίνου [7]. Σε κακοήθεις συμπαγείς όγκους, η έκφραση του CD82 /KAI1 συσχετίζεται έντονα με μια καλύτερη πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο, ενώ κάτω ρύθμιση της βρίσκεται συνήθως σε κλινικά προχωρημένους καρκίνους. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CD82 /KAI1 είναι ένας καταστολέας της εισβολής και της μετάστασης διαφόρων τύπων συμπαγών όγκων. [8,9]. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, έχει συχνά παρατηρηθεί ότι η έκφραση του CD82 συσχετίζεται αντίστροφα με την επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό των καρκίνων του μαστού, της ουροδόχου κύστης, του παχέος εντέρου, του τραχήλου, του γαστρεντερικού σωλήνα, του δέρματος, του πνεύμονα, του προστάτη, του παγκρέατος, του ήπατος, και του θυρεοειδούς [10-13]. CD82 ρυθμίζει κυτταρική συσσωμάτωση, την κυτταρική κινητικότητα, μετάσταση καρκίνου, και την απόπτωση [14]. Έχουμε αναφέρει ότι CD82 σταθεροποιεί τα σύμπλοκα E-cadherin-β-κατενίνης με αναστολή της φωσφορυλίωσης τυροσίνης β-κατενίνης. Η λειτουργία αυτή ενισχύει την homocellular προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και εμποδίζει τα καρκινικά κύτταρα να διαφύγουν από την πρωτογενή φωλιές [15]. Αντιστρόφως, όταν τα καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν στο αίμα ή λεμφικά αγγεία, ετερόφυλα διακυτταρική προσκόλληση μεταξύ κυττάρων όγκου και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων απαιτείται ως αρχική βαθμίδα της μετάστασης σε απομακρυσμένα όργανα. Sialyl Lewis αντιγόνα επί τα καρκινικά κύτταρα που εμπλέκονται στην προσκόλληση στο σελεκτίνη σε ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων [16]. Ωστόσο, η επίδραση του CD82 επί σελεκτίνης συνδετήρα-μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Εμείς εδώ ερεύνησε τις επιπτώσεις της μετάστασης καταστολέα CD82 /KAI1 σχετικά με τη διαδικασία του heterocellular προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο του τα αιμοφόρα αγγεία, για την περαιτέρω διαλεύκανση της λειτουργίας του τετρασπανίνη. Δείξαμε πρώτα ότι η σύνθεση αντιγόνο σιαλυλ Lewis ρυθμίζεται από ένα σύστημα CD82 /KAI1 μεσολάβηση, και στη συνέχεια εξέτασαν τις επιδράσεις του μηχανισμού αυτού σε καρκινικό κύτταρο μετάσταση σε ένα μοντέλο μετάστασης του ποντικιού.

Υλικά και Μέθοδοι

αντισώματα και αντιδραστήρια

Ποντίκια μονοκλωνικά αντισώματα (G-2) και πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού (C-16) έναντι KAI1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω συνάρτηση δημιουργεί διαταραχές αντισώματα: αντι-ΣΕΛ

x (ποντίκι, μονοκλωνικά) και αντι-ΣΕΛ

α (ποντίκι, μονοκλωνικά) αντισώματα, τα οποία ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology και MILLIPORE (Temecula, CA, USA), αντίστοιχα, καθώς και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι β1 ιντεγκρίνης, το οποίο ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA).

κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή Η1299 (ένα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή καρκινώματος) και μορφομετατροπέα κυτταρικές σειρές, Η1299 /Zeo και Η1299 /CD82, καθιερώθηκαν στο εργαστήριο μας μέσω επιμόλυνσης ενός φορέα ελέγχου ή CD82 cDNA, αντίστοιχα, και ένα κύτταρο διαλογή με βάση το κλώνος τεχνική επιλογής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Sigma), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? ICN Biomedicals, Aurora, ΟΗ, USA) και 2 mM L-γλουταμίνη.

Οι δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, Η1299 /Zeo και Η1299 /CD82, έχουν περιγραφεί προηγουμένως [10]. Η1299 /Zeo είναι μια παρωδία επιμολυσμένη κυτταρική σειρά που παρουσιάζει ασθενή έκφραση CD82, ενώ Η1299 /κύτταρα CD82 υπερεκφράζουν CD82 μετά την επιμόλυνση του cDNA. Ανοσοκηλίδωση ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο της CD82 πρωτεΐνης σε Η1299 κύτταρα /CD82 ήταν 20 φορές υψηλότερη από ό, τι σε άγριου-τύπου ή κύτταρα Η1299 /Zeo, ενώ η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το επίπεδο της κυτταρικής επιφάνειας του CD82 σε Η1299 κύτταρα /CD82 ήταν περίπου 9- φορές εκείνη του άγριου τύπου ή κύτταρα Η1299 /Zeo.

Ζώα και δοκιμασία μετάστασης

Οκτώ εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών (BALBc cAJcl-ηυ) αγοράστηκαν από Kyudo (Φουκουόκα , Ιαπωνία). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και τροφοδοτείται σε αυτόκαυστο νερό και δίαιτες σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από το Πανεπιστήμιο Kyushu. Κάθε γραφείο που περιέχονται 1-4 ποντίκια για πειραματική ομάδα. Τα πειραματικά πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου Kyushu (Αριθμός Άδειας: A23-13-1).

Για τις πειραματικές μελέτες μετάσταση στους πνεύμονες, 1.0 × 10

6 κύτταρα ή όχημα (PBS) μόνο εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες 4 ομάδες: (Α) χωρίς αγωγή (έλεγχος: ένεση με PBS μόνο), (Β) Η1299, (Γ) Η1299 /Zeo, και (Δ) Η1299 /CD82. Κάθε ομάδα περιείχε τουλάχιστον 3 ποντικοί (χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 20 ποντικοί). Οκτώ εβδομάδες μετά την ένεση, οι ποντικοί θανατώθηκαν με τη χορήγηση pentobarbiturate (100-120 mg /kg) για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία και οι πνεύμονες συλλέχθηκαν. Lung μεταστατικών εστιών καταμετρήθηκαν εάν θα μπορούσαν να φαίνονται με γυμνό μάτι, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κυτταρολύματα για ανοσοκηλίδωση παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (1% Triton Χ -100, 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 10 μg /mL λευπεπτίνη, 10 μg /mL απροτινίνη, 1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,2). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), και επωάστηκαν με ειδικές πρωτογενή αντισώματα. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα και αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Οι ζώνες σαρώθηκαν με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή πυκνομετρία (ChemiDoc XRS-J? Bio-Rad) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Quantity One (Bio-Rad) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14, 15]

φθορισμού επισήμανση των ζώντων κυττάρων. και την προσκόλληση των κυττάρων δοκιμασία

Ζωντανή Η1299 κύτταρα σημαίνονται με τη χρήση Vybrant Δίωνα και από DID λύσεις σήμανσης κυττάρων (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

για την ποσοτικοποίηση των καρκινικών κυττάρων πρόσφυση σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του ομφάλιου φλέβας (HUVECs), ένα πρότυπο δοκιμασία στατικής συγκόλλησης εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. HUVECs (1,5 χ 10

4 κύτταρα) τοποθετήθηκαν σε πλάκες μικροτίτλου των 96 φρεατίων προ-επικαλυμμένες με 0,1% ζελατίνη (Sigma) και καλλιεργήθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ με 20% FBS και 0,1 μg /mL βασικό-ΡΟΡ για 2 -3 ημέρες για να δημιουργήσει συρροή μονοστιβάδες HUVEC. Σημασμένα με φθορισμό κύτταρα Η1299 (4,0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) προστέθηκαν στην ενδοθηλιακή μονοστιβάδα και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 30 λεπτά.

Για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των αντισωμάτων λειτουργία δημιουργεί διαταραχές στις προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στη μονοστοιβάδα HUVEC, Η1299 κύτταρα προ-θεραπεία με 5 μg /mL των αντισωμάτων λειτουργία δημιουργεί διαταραχές στους 37 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια εφαρμόστηκαν στη μονοστοιβάδα HUVEC.

Η φρεάτια πλύθηκαν 3 φορές με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προσκολλημένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιώντας ένα πεδίο υψηλής ισχύος (Χ 200). Για καθεμία από τις τριπλές πειράματα, ο αριθμός των κυττάρων σε 5 τυχαία επιλεγμένα πεδία προσδιορίστηκε και οι μετρήσεις έγιναν κατά μέσο όρο.

Η επιμόλυνση του μικρού RNA φουρκέτας (sh RNA)

Καλλιεργημένα Η1299 /CD82 και κύτταρα Η1299 /Zeo επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η Η1299 /CD82-sh. ελέγχου και Η1299 /κυτταρικές σειρές CD82-sh.CD82 δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων Η1299 /CD82 με τον φορέα pLKO.1-puro ελέγχου (Sigma) και pLKO.1-puro /sh.CD82: NM_002231 (Sigma), αντίστοιχα [ ,,,0],18]. Το Η1299 /κυτταρικές σειρές Zeo-sh.ST3GAL4 Η1299 /Zeo-sh.control και δημιουργήθηκαν με Lipofectamine επιμόλυνση κυττάρων Η1299 /Zeo με την pLKO.1-puro φορέα αναφοράς και pLKO.1-puro sh.ST3GAL4: NM_06081105 (Sigma), αντίστοιχα. Οι αποικίες που εμφανίζουν αντίσταση σε πουρομυκίνη (Sigma) από τα μεμονωμένα πειράματα επιμόλυνσης συνενώθηκαν. Το επίπεδο έκφρασης του CD82 και ST3GAL4 σε shRNA επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα παρακολουθήθηκε με RT-PCR και ανοσοστύπωμα. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FBS και 2 μg /mL πουρομυκίνη.

μικροσυστοιχιών DNA

Ολικό RNA εξήχθη από Η1299 /Zeo και Η1299 κύτταρα /CD82 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA υβριδισμό μικροσυστοιχιών και σάρωσης διεξήχθησαν με Affymetrix (Santa Clara, CA, USA), χρησιμοποιώντας το Affymetrix γονίδιο τσιπ HG-U133A plus2.0. GCRMA σε Bioconductor (https://www.bioconductor.org) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ανιχνευτή και την κανονικοποίηση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών.

Η στατιστική ανάλυση (Student του

t-test

) και ένα fold- αλλαγή φίλτρου (& gt? 3,0) (Η1299 /CD82 έναντι Η1299 /Zeo) πραγματοποιήθηκαν διαδοχικά για να επιλέξετε τα σημαντικά γονίδια. Χρησιμοποιώντας τη λειτουργία ορισμό γονίδιο, όλες οι τρανσφεράσες που ρυθμίζουν σιαλυλ αντιγόνα Lewis εντοπίστηκαν και παρατίθενται στους Πίνακες 1 και 2.

Η

Σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) πολυμεράση αλυσιδωτής αντίδρασης (PCR )

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας Η1299 ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA. Τα επίπεδα mRNA ποσοτικοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο με την Brilliant Kit SYBR Green qPCR (Stratagene, La Jolla, CA, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [18]. Οι ειδικοί εκκινητές για γλυκοζυλοτρανσφεράσης ήταν ως εξής: (

ST3GAL1

: 5′-GCATAACGCCCATATAGAT-3 ‘και 5′-AAGGCTCTGACTGCTCTGT-3’?

ST3GAL2

: 5′-CTGGATGCTGGGACCTAC-3 ‘και 5’-GCTACTTGGAAGGCTGAGG-3 ‘?

ST3GAL3

: 5′-TCCTGGACGCACAATATC-3′ και 5′-GGTCTGAAGACTCCTGTGTA-3 ‘?

ST3GAL4

: 5′-AGTAGAAAACAACCCAGACAC-3′ και 5 ‘ -AGAGGTTGAGAATCCGAA-3 ‘? και

ST3GAL5

: 5′-TGCCTCAGTTCACCCTCA-3′ και 5′-TGGTGGTGTTTGTGTGCTG-3 ‘

Οι συνθήκες των κύκλων PCR ήταν 10 λεπτά στους 95 ° C για 1. κύκλος ακολουθείται από 45 κύκλους κάθε 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 60 s. οι Αμπλικόνια επιβεβαίωσε ότι τα σήματα είναι μοναδικά από την καμπύλη διαστάσεως αναλύσεις. τα επίπεδα έκφρασης για το κάθε δείγμα, το οποίο λαμβάνεται από την παράλληλη προσδιορισμούς, κανονικοποιήθηκαν προς εκείνες του γονιδίου που κωδικοποιεί αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού LightCycler2.0 System (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ, USA).

Αποτελέσματα

έκτοπη έκφραση του CD82 αναστέλλει μετάσταση στους πνεύμονες σε ποντίκια

στο πρώτο πείραμα, επιβεβαίωσε τη μετάσταση-ανασταλτική δράση των CD82 που έχει ήδη αναφερθεί, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μετάστασης των ζώων [17]. Για τις πειραματικές μελέτες μετάσταση στους πνεύμονες, εμείς εγχέεται Η1299 κύτταρα στην φλέβα ουράς του 8-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Οκτώ εβδομάδες μετά την ένεση, τυχόν μεταστατικές εστίες παρατηρήθηκαν και μετρήθηκαν οπτικά. CD82 έδειξε μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στο μέγεθος και τον αριθμό των πνευμόνων μετάστασης εστιών (Σχήμα 1). Συγκεκριμένα, τα ποντίκια επιμολύνθηκαν με κύτταρα Η1299 /Zeo έδειξε 100% μετάσταση πνεύμονα (7/7), ενώ οι επιμολυντές CD82, Η1299 /CD82, παρουσίασαν μια σημαντική αναστολή της μετάστασης, με ποσοστό μετάσταση μόνο 28,5% (2/7). Δεδομένου ότι ο ρυθμός μετάσταση πνεύμονα αντανακλά άμεσα το βαθμό της κυτταρικής προσκόλλησης στα σκάφη των πνευμόνων του αίματος, το αποτέλεσμα αυτό πρότεινε ότι CD82 παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση σε αιμοφόρα αγγεία.

Οι φλέβες της ουράς γυμνών ποντικών έγινε ένεση με 1,0 × 10

6 Η1299 /Zeo ή κύτταρα Η1299 /CD82. Οκτώ εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια θανατώθηκαν και οι πνεύμονες ανακτηθεί. Μεταστατικές εστίες μετρήθηκαν με το μάτι. Η έγχυση των κυττάρων Η1299 /Zeo είχε ως αποτέλεσμα 100% μετάσταση στους πνεύμονες (7/7), ενώ Η1299 /CD82 κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό μετάστασης (28,5%? 2/7).

Η

έκτοπη έκφραση του CD82 αναστέλλει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων να HUVECs μέσω σιαλυλ Lewis αντιγόνα

Η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία, περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των Ρ- και Ε-σελεκτίνη επί των επιθηλιακών κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων με τον αντίστοιχο SLE

x και ΣΕΛ

ένας υδατάνθρακας συνδέτες στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [12]. Αναλύσαμε την επίδραση του CD82 επί προσκόλλησης κυττάρου σε αιμοφόρα αγγεία χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου που περιγράφεται προηγουμένως σε HUVECs [11]. Είχε προηγουμένως επιβεβαιώθηκε ότι HUVECs εκφράζουν τόσο Ρ- και Ε-σελεκτίνη [11]. Παρατηρήσαμε ότι περίπου το 65% των φορτωμένων κυττάρων /Zeo Η1299 προσκολλημένο στο μονοστοιβάδα HUVEC. Αντιστρόφως, τα κύτταρα Η1299 /CD82 έδειξε σημαντικά μικρότερη κυτταρικής προσκόλλησης, με μόνο 6,6% προσκόλληση στη μονοστοιβάδα HUVEC (Σχήμα 2Α και 2Β). Προ-θεραπεία με αντισώματα λειτουργία δημιουργεί διαταραχές κατά ΣΕΛ

x, ΣΕΛ

ένα ή ιντεγκρίνες β1 αναστέλλεται Η1299 /Zeo πρόσφυση σε HUVECs κατά 9,4%, 8,4% και 30,2%, αντίστοιχα (Σχήμα 2C). Σε αντίθεση, η λειτουργία δημιουργεί διαταραχές αντισώματα έναντι ΣΕΛ

x /α δεν έδειξαν σημαντική αναστολή της Η1299 /προσκόλλησης κυττάρων CD82 σε κύτταρα HUVEC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα έναν ανασταλτικό ρόλο για CD82 σε σιαλυλ Lewis-μεσολαβητική κυτταρική προσκόλληση.

σημασμένα με φθορισμό Η1299 /Zeo ή Η1299 /κύτταρα CD82 (4,0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) εφαρμόστηκαν σε HUVEC μονοστρωματική καλλιέργεια και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε θερμοκρασία 37 ° C. Προσκολλημένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετά από 30 λεπτά. Τηρούνται Η1299 /Zeo (Α) και Η1299 /κύτταρα CD82 (Β) και η επίδραση των αντισωμάτων λειτουργία δημιουργεί διαταραχές στην κυτταρική προσκόλληση στη μονοστοιβάδα HUVEC αναλύθηκαν (C). κύτταρα Η1299 προ-θεραπεία με 5 μg /ml από τα υποδεικνυόμενα αντισώματα και στη συνέχεια εφαρμόζεται στη μονοστοιβάδα HUVEC. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και ο αριθμός των προσκολλημένα κύτταρα ήταν κατά μέσο όρο. Ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

έκτοπη έκφραση του CD82 ελαττώνει σιαλυλ Lewis synthesis

Η έκφραση του σιαλυλ Lewis αντιγόνων επί Η1299 κύτταρα αναλύθηκε με ανοσοστύπωση (σχήμα 3). ΣΕΛ

α ανιχνεύθηκε ως ζώνες που αντιστοιχούν σε περίπου 97, 125 και 200 ​​kDa, και το επίπεδο έκφρασης της ήταν 5-8 φορές υψηλότερη σε κύτταρα Η1299 /Zeo ό, τι σε Η1299 κύτταρα /CD82 (Σχήμα 3Α). Ομοίως, η έκφραση του ΣΕΛ x πρωτεϊνών

ανιχνεύθηκε σε περίπου 90, 125, και 200 ​​kDa, και ήταν 5-8 φορές υψηλότερη σε κύτταρα Η1299 /Zeo ό, τι σε κύτταρα Η1299 /CD82 (Σχήμα 3Β). Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας προσκόλλησης HUVEC

Ολόκληρα λύματα κυττάρων (200 μα) του Η1299 κυττάρων (Η1299 /Zeo, Zeo?. Η1299 /CD82, CD82? Η1299 /CD82-sh.control , sh.cont? Η1299 /CD82-sh.CD82, sh.CD82) επιλύθηκαν κατά 7,5% SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση με αντι-ΣΕΛ

α (α) ή αντι-ΣΕΛ

x (Β ) αντισώματα. Τα ίδια στυπώματα απογυμνώθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν, και τα πιο αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται.

Η

Επιπλέον, επιμολυσμένα Η1299 /CD82 κυττάρων με CD82 shRNA για να επιβεβαιωθεί εάν αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω των σιαλυλο Lewis αντιγόνων είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα της η έκτοπη έκφραση του CD82.

CD82

shRNA ανέστειλε πλήρως την έκφραση CD82 (Σχήμα 3C) και, ταυτόχρονα, η παραγωγή του ΣΕΛ

α και ΣΕΛ

x ανακτηθεί στα επίπεδα έκφρασης παρατηρούνται σε κύτταρα Η1299 /Zeo.

η έκτοπη έκφραση του CD82 μειώνει τα επίπεδα του mRNA των γονιδίων γλυκοζυλοτρανσφεράσης που σχετίζονται με σιαλυλο Lewis synthesis

για την εξέταση των μηχανισμών για τη ρύθμιση προς τα κάτω του σιαλυλ Lewis αντιγόνων με CD82, πραγματοποιήσαμε μια σφαιρική ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA της πιθανής ρυθμιστές της σιαλυλ Lewis αντιγόνων (όλα τα τρανσφεράσες). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, CD82 αισθητά κάτω ρυθμισμένα (0,05-φορές μεταβολή) την έκφραση του

ST3GAL4

(υπογραμμισμένες στον Πίνακα 1). Αντίθετα, η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν άλλες ομάδες γλυκοζυλοτρανσφερασών και ομάδες μεταφορέα ζάχαρη δεν ήταν αξιοσημείωτα αλλάξει.

Εξετάσαμε επόμενο τις επιδράσεις των CD82 επί των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης ST3GALs χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 4) και ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 5), αντίστοιχα. Η έκτοπη έκφραση του CD82 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του ST3GALs, εκτός από μια αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων

ST3GAL4

mRNA και της πρωτεΐνης.

Ολικό RNA απομονώθηκε από Η1299 κύτταρα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου φθάνουν σε RT-PCR. επίπεδα του mRNA των γονιδίων που κωδικοποιούν γλυκοζυλοτρανσφεράσης-

(ST3GALs)

διορθώθηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του

GAPDH

mRNA, με Η1299 /Zeo ορίζεται σε 1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM.

λύματα ολόκληρων κυττάρων (300 μg) Η1299 κύτταρα (Η1299 /Zeo, Zeo? Η1299 /CD82, CD82? Η1299 /CD82-sh.control, sh.cont? Η1299 /CD82-sh.CD82 , sh.CD82) διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-ST3Gal πρωτογενή αντισώματα. Τα ίδια στυπώματα απογυμνώθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για β-ακτίνη και CD82. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν, και τα πιο αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται.

Η

Θα αξιολογηθεί επίσης κατά πόσον η μείωση του

ST3GAL4

σε κύτταρα Η1299 /CD82 ήταν CD82-ειδική εκδήλωση με τη χρήση CD82 νοκ ντάουν. Μετά νοκ ντάουν του CD82, το επίπεδο της πρωτεΐνης του ST3GAL4 ανακάμψει πλήρως στο επίπεδο που παρατηρείται στα κύτταρα Η1299 /Zeo.

ST3GAL4

shRNA μειώνει

sLex παραγωγής

Για να εξεταστεί αν κατάντη ρύθμιση των ST3GAL4 μειώνει την παραγωγή της sLex, εμείς γκρέμισε

ST3GAL4

από σταθερή επιμόλυνση του

ST3GAL4

shRNA. Η έκφραση του

ST3GAL4

μειώθηκε ειδικά από shRNA τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 6Α και 6Β). Το επίπεδο της πρωτεΐνης του ΣΕΛ

x ήταν σημαντικά μειωμένη σε Η1299 /κύτταρα shST3GAL4 Zeo (0,3 φορές του Η1299 /Zeo sh.cont). Αντίθετα, το επίπεδο της πρωτεΐνης του ΣΕΛ

α δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ Η1299 /κυττάρων Zeo-sh.cont και Η1299 /κύτταρα Zeo-sh.ST3GAL4. Το εύρημα που ST3GAL4 μειώνει ειδικά ΣΕΛ

x παραγωγή πρωτεϊνών πρότεινε ότι ΣΕΛ

x παραγωγή κάτω-ρυθμίζονται από την έκφραση CD82 μέσω

ST3GAL4

ρύθμιση προς τα κάτω (Σχήμα 7Α και 7Β).

Ένα. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα Η1299 και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. επίπεδα του mRNA της

Οι ST3GALs

διορθώθηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του mRNA β-ακτίνης, με εκείνες των Η1299 /Zeo ορίζεται σε 1. Δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± το SEM. Προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων Β (300 μg) του Η1299 κυττάρων (Η1299 /Zeo, Zeo? Η1299 /CD82, CD82? Η1299 /Zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4? Η1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) ήσαν επιλύονται με 10% SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-ST3GAL4 πρωτογενή αντισώματα. Τα ίδια στυπώματα απογυμνώθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για β-ακτίνη. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν, και τα πιο αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται

Η

(A) Σύνολο κυτταρικά λύματα (300 μg) Η1299 κύτταρα (Η1299 /Zeo, Zeo?. Η1299 /CD82, CD82? Η1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4? Η1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) επιλύθηκαν κατά 10% SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση με αντι-ΣΕΛ

α ή αντι-ΣΕΛ

x αντισώματα. Τα ίδια στυπώματα απογυμνώθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές, και τα πιο αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται. (Β) Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε (Α), ακολουθούμενη από κανονικοποίηση με την πυκνομετρική αξία του β-ακτίνης και υποδεικνύεται ως «Σχετική τιμή έκφρασης (β-κατενίνης /β-ακτίνης)». Οι σχετικές τιμές έκφραση από 3 μεμονωμένα πειράματα ο μέσος όρος. Μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

ST3GAL4

shRNA αναστέλλει την προσκόλληση των κυττάρων σε κύτταρα HUVEC

Τέλος, εξετάσαμε την επίδραση της shRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση του

ST3GAL4

στην κυτταρική προσκόλληση σε κύτταρα HUVEC. Η προσκόλληση κυττάρου προς HUVECs έδειξε περίπου 50% αναστολή των κυττάρων Η1299 /Zeo άγριου τύπου μετά

ST3GAL4

knockdown. Ωστόσο, το επίπεδο της αναστολής των κυττάρων shST3GAL4 Η1299 /Zeo δεν έφθασε εκείνη της Η1299 /CD82 (90% αναστολή της Η1299 /Zeo? Σχήμα 8).

σημασμένα με φθορισμό Η1299 /Zeo, Η1299 /CD82, Η1299 /Zeo-sh.ST3GAL4, και τα κύτταρα Η1299 /Zeo-sh.control (4.0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) εφαρμόστηκαν σε μία καλλιέργεια μονοστοιβάδας HUVEC και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε θερμοκρασία 37 ° C. Προσκολλημένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετά από 30 λεπτά. Η1299 κύτταρα προσκολλημένα στο μονοστιβάδα HUVEC αναλύθηκαν. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και ο αριθμός των προσκολλημένα κύτταρα ήταν κατά μέσο όρο. Μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

CD82 /KAI1 έχει αναφερθεί ότι έχει αντι-μεταστατικές ιδιότητες και έχει προηγουμένως επιβεβαιωθεί ότι είναι ένας καταστολέας της μετάστασης. Έχουμε προηγουμένως αποδειχθεί μια νέα λειτουργία του CD82 σε Ε-καδερίνης μεσολάβηση ομοφιλική διακυτταρικής προσφύσεως [15]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις της CD82 επί ετερόφιλα κυτταρική προσκόλληση στο αίμα ή λεμφικά αγγεία, το οποίο είναι το αρχικό βήμα της μετάστασης σε απομακρυσμένα όργανα? και απέδειξε την νέα ρυθμιστικό ρόλο του CD82 σε σιαλυλ Lewis-εξαρτώμενη κυτταρική προσκόλληση. Σε μας

in vivo δοκιμασία

μετάστασης, CD82 έδειξε μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στο μέγεθος και τον αριθμό των πνευμόνων μετάστασης εστιών (Σχήμα 1), μετά την άμεση ένεση των καρκινικών κυττάρων εντός της φλέβας της ουράς ποντικού. Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν έντονα έναν ανασταλτικό ρόλο για CD82 στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι αντιγόνα

Sialyl Lewis που εμπλέκονται στην αρχική βαθμίδα της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία [16]. Πολυάριθμες κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η έκφραση του ΣΕΛ

x και ΣΕΛ

ένα σχετικά βλεννίνες κύτταρο όγκου συσχετίζεται άμεσα με μετάσταση, την εξέλιξη του όγκου, και φτωχή πρόγνωση [2,3]. Μόλις αντιγόνα είναι εγκατεστημένος ο αρχικός προσκόλληση μέσω σιαλυλ Lewis, διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης ακολουθεί [19]. Δείξαμε ότι η προσθήκη ενός αντι-ιντεγκρίνης αντίσωμα ανέστειλε μόνο εν μέρει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων να HUVECs, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αρχική σιαλυλ Lewis αντιγόνου προσκόλληση είναι ουσιαστικής σημασίας για την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία (Σχήμα 2). Η έκτοπη έκφραση του CD82 ρυθμίζεται προς τα κάτω τη σύνθεση του ΣΕΛ

Α /Χ (Σχήμα 3), υποστηρίζοντας τα αποτελέσματα της δοκιμασίας προσκόλλησης HUVEC.

Η βιοσύνθεση μονοπάτι του ΣΕΛ

α και SLE

x εξαρτάται από μια ποικιλία ενζύμων, τα οποία καταλύουν την μεταφορά του σιαλικού οξέος και φουκόζης με τις ολιγοσακχαριτών πλευρικές αλυσίδες των γλυκοσυζευγμάτων. Εν συντομία,

Ν

ακετυλλακτοζαμίνης (ΟΙοΝΑο) ολιγοσακχαριτών β1 συντίθεται από ΟΙοΝΑο τρανσφεράσες. Βασισμένο σε ΟΙοΝθο υποστρώματα β1 ολιγοσακχαριτών, β1, 3-γαλακτοσυλοτρανσφεράσες (β3Gal-Μ) συνθέτουν α1 → 3 δισακχαρίτες (τύπου 1 αλυσίδες) και β1, 4-γαλακτοσυλοτρανσφεράσες (β4Gal-Μ) συνθέτουν α1 → 4 δισακχαρίτες (τύπου 2 αλυσίδες). Σιαλυλτρανσφεράσης (ST) που ανήκει στο

ST3Gal

οικογένεια περιέχει 6 υποοικογένειες των ενζύμων. Μεταξύ αυτών, ST3Gal3 sialylates τύπου 1 αλυσίδες για την παραγωγή ΣΕΛ

α, ενώ ST3Gal4 και -6 υποχρεούνται να sialylate τύπου 2 αλυσίδες για ΣΕΛ

x παραγωγής.

Η διαδοχική προσθήκη α1, 4-συνδεδεμένο φουκόζης να πληκτρολογήσετε 1 αλυσίδες και α1, 3-συνδεδεμένη φουκόζη να πληκτρολογήσετε 2 αλυσίδες από φουκοζυλτρανσφεράση (FUTs) ολοκληρώνει τη βιοσύνθεση του ΣΕΛ

α και ΣΕΛ

x, αντίστοιχα. Η έκφραση του ΣΕΛ

α και ΣΕΛ

x σχετίζεται με την καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Η έκφραση του

ST

και

FUT

γονιδίων που κωδικοποιεί τα ένζυμα που είναι απαραίτητα για τη βιοσύνθεση των αντιγόνων αυτών είναι επίσης συσχετίζεται με αυτά τα κακοήθη χαρακτήρων. Αυξημένα επίπεδα mRNA του

ST

και

Οι FUT

βρίσκονται σε διάφορους τύπους κακοήθων όγκων.

ST3GAL3

έκφραση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού συνδέθηκε έντονα με κακή πρόγνωση και μειωμένη συνολική επιβίωση [20]. Ομοίως, η αυξημένη έκφραση του

ST3GAL4

και

FUT4

αναφέρθηκε σε ορθοκολικά καρκινώματα [21]. Αντίθετα, η ρύθμιση προς τα κάτω του

ST3GAL4

έχει παρατηρηθεί σε ορθοκολικό καρκίνο και τους ιστούς ανθρώπινου καρκινώματος των νεφρικών κυττάρων [22,23]. Σε γαστρικό καρκίνο, τα επίπεδα έκφρασης του

ST3GAL3

και

FUT4

mRNA ήταν σημαντικά ενισχυμένη σε ιστούς καρκινώματος [24]. Επιπλέον, η έκφραση του

FUT4

και

FUT7

mRNA ήταν συνδεδεμένη με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [25], και η αυξημένη δραστηριότητα του α1,3 /4-FUTs παρατηρήθηκαν σε ωοθηκών καρκίνωμα σε σύγκριση με τον υγιή ιστό [26] Chandrasekaran et al., 1992 EV Chandrasekaran, Κ.Κ. Jain και Κ.Ε. Matta, καρκίνος των ωοθηκών άλφα 1,3-L-φουκοσυλοτρανσφεράσης. Διαφοροποίηση των διακριτών καταλυτικό είδος με το μοναδικό υπόστρωμα, 3′-σουλφο-Ν-ακετυλλακτοζαμίνης σε συνδυασμό με άλλα συνθετικά δέκτες,

J Biol Chem

267 (1992), σελ. 23806-23814. Δείτε Εγγραφή στο Scopus παραθέτει στο Scopus (26). Οι εκθέσεις αυτές δείχνουν ότι οι ρόλοι του

ST

και

FUT

διαφέρουν σε διάφορους τύπους καρκίνου

in vivo

.

Στο μοντέλο μας, CD82 υποβαθμίσουν τα σημαντικά ρυθμίζεται (0,05 φορές η αλλαγή), η έκφραση του

ST3GAL4

. Αντίθετα, η έκφραση των άλλων ομάδων του γλυκοζυλοτρανσφερασών και ομάδες μεταφορέα ζάχαρη δεν ήταν σημαντικά αλλάξει. Νοκ ντάουν του

CD82

mRNA από shRNA σε Η1299 /κύτταρα CD82 είχε ως αποτέλεσμα την ανάκαμψη των

ST3GAL4

έκφρασης και η σύνθεση του ΣΕΛ

a /x, υποδηλώνοντας ότι CD82 έχει συγκεκριμένες επιπτώσεις στην

ST3GAL4

έκφρασης.

Όπως προαναφέρθηκε,

ST3GAL4

συνήθως συνθέτει μόνο σΕΛ

x και μας

ST3GAL4

νοκ ντάουν μελέτη έδειξε αποτελέσματα δείχνουν μια συγκεκριμένη κάτω -Κανονισμός του ΣΕΛ

x σε Η1299 /Zeo κύτταρα shST3GAL4. Σε αντίθεση, έκτοπη έκφραση του CD82 μείωσε τη σύνθεση του ΣΕΛ

α και ΣΕΛ

x, ταυτόχρονα. Αυτό το είδος της ασυμφωνίας έχει αναφερθεί προηγουμένως. Η ενζυματική δραστηριότητα του ST3GAL4 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ήταν αποτελεσματική και για τις δύο δισακχαρίτες τύπου 1 και τύπου 2

in vitro

, ενώ

in vivo

, ήταν αποτελεσματική μόνο για τον τύπο 2 υποστρώματα [27] Sasaki et al ., 1993 Κ Sasaki, Ε Watanabe, Κ Καβασίμα, Σ Sekine, Τ Dohi και Μ Οσίμα

et al

., Έκφραση κλωνοποίηση ενός νέου Gal βήτα (1-3 /1- 4) GlcNAc άλφα 2,3-σιαλυλοτρανσφεράση με χρήση επιλογής αντίστασης λεκτίνη,

J Biol Chem

268 (1993), σελ. 22.782 – 22.787. Δείτε Εγγραφή στο Scopus | Αναφέρεται από το Scopus (113). Τα δεδομένα που παράγονται σε ανάλυση μικροσυστοιχιών μας μπορεί να παρέχει έναν άλλο μηχανισμό για να εξηγήσει αυτή την ασυμφωνία. Ένα αδύναμο κάτω ρύθμιση της β

3galT

(0,7-φορές αλλαγή, υπογραμμίζεται στον Πίνακα 1), το οποίο συνθέτει τύπου 1 δισακχαρίτες, βρέθηκε. Είναι πιθανό ότι ακόμη και αυτή η αδύναμη κάτω ρύθμιση β

3galT

μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του ΣΕΛ

a, επειδή ένας τύπος 1 δισακχαρίτης είναι το βασικό στοιχείο του πυρήνα των παραγώγων της (Le

β, Le

α, και σΕΛ

α).

Συμπεράσματα

Μαζί, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκτοπη έκφραση του CD82 μειώνει σημαντικά τα επίπεδα του σΕΛ

x /a, η οποία με τη σειρά του μειώνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία. Έτσι, προτείνουμε ότι η μειωμένη έκφραση του

ST3GAL4

mRNA διαδραματίζει καίριο ρόλο στην CD82 μεσολάβηση κάτω ρύθμιση του ΣΕΛ

x /a, ειδικά εκείνη του ΣΕΛ

x. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι CD82 ρυθμίζει προς τα κάτω ST3GAL4 και ρυθμίζει σιαλυλ Lewis αντιγόνο με τη μεσολάβηση προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία και, ως εκ τούτου, η αναστολή της καρκινικών κυττάρων της μετάστασης. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν μία νέα λειτουργία για CD82 στη ρύθμιση των αντιγόνων σιαλυλ Lewis.