Αφηρημένο

Μόνο ένας μικρός αριθμός των πολλά υποσχόμενων φαρμάκων στοχεύουν καρκίνο του παγκρέατος, η οποία είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο με 5-ετή επιβίωση μικρότερη του 5%. Στόχος μας είναι να αναπτύξει ένα νέο βιοθεραπευτικές παράγοντα στην οποία μια λυσοσωματική πρωτεΐνη (σαποσίνης C, SAPC) και ένα φωσφολιπίδιο (διολεοϋλφωσφατιδυλοσερίνη, DOPS) συναρμολογούνται σε nanovesicles (SAPC-DOPS) για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό γνώρισμα του SAPC-DOPS nanovesicles είναι υψηλή συγγένειά τους για φωσφατιδυλοσερίνη (PS) πλούσια μικροπεδία, τα οποία είναι ασυνήθιστα εκτεθειμένη στην επιφάνεια της μεμβράνης των ανθρώπινων κυττάρων παγκρεατικού όγκου. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της εξωτερικής κυτταρικής PS,

in vitro

δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να συσχετίζονται έκθεση PS και την κυτταροτοξική δράση του SAPC-DOPS σε ανθρώπινο όγκο και μη καρκινογενής παγκρεατικά κύτταρα. Στη συνέχεια, του παγκρέατος ξενομοσχεύματα όγκου (ορθοτοπική και υποδόρια μοντέλα) χρησιμοποιήθηκαν για στόχευση όγκων και θεραπευτικές μελέτες αποτελεσματικότητας με συστημική αγωγή SAPC-DOPS. Παρατηρήσαμε ότι οι nanovesicles επιλεκτικά σκοτώθηκαν ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

με επαγωγή αποπτωτικού θανάτου, ενώ μη μετασχηματισμένα κύτταρα παρέμειναν ανεπηρέαστα. Αυτή η

in vitro

κυτταροτοξική επίδραση συσχετίζεται με το επίπεδο έκθεσης επιφάνεια PS επί των κυττάρων του όγκου. Χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα, τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με ΚΕΣΣ-DOPS έδειξε σαφή οφέλη επιβίωσης και οι όγκοι τους συρρικνώθηκαν ή εξαφανίστηκαν. Περαιτέρω, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο διπλής παρακολούθησης σε ζώντα ποντίκια, δείξαμε ότι οι nanovesicles ήταν ειδικά στοχεύει ορθοτοπικά-εμφυτευμένα, βιοφωταύγειας παγκρεατικών όγκων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το όξινο φωσφολιπίδιο PS είναι ένας βιοδείκτης για τον καρκίνο του παγκρέατος που μπορούν να στοχεύονται αποτελεσματικά για τη θεραπεία του καρκίνου χρησιμοποιώντας επιλεκτικό nanovesicles SAPC-DOPS. Αυτή η μελέτη παρέχει πειστικές αποδείξεις για τη στήριξη της ανάπτυξης μιας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Chu Ζ, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad Α.Ε., Φράνκο RS, Qi Χ (2013) Στόχευση και κυτταροτοξικότητα της ΚΕΣΣ-DOPS Nanovesicles σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10.1371 /journal.pone.0075507

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 14, Αυγούστου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Chu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ /NCI Επιχορηγήσεις Αριθμός 1R01CA158372-01 (με Qi), 1R43CA117283-01 (σε Qi και Xu), και νέο φάρμακο μέλος Key Πρόγραμμα επιχορήγησης Αριθμός 009ZX09102-205 (με Qi). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει τα εξής ενδιαφέροντα: Xiaoyang Qi σε εισηγμένες ως εφευρέτης για την δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία (SAPC-DOPS), που αποτελεί το αντικείμενο της παρούσας έρευνας. Συνεπής με τις τρέχουσες πολιτικές Νοσοκομείο Ιατρικό Κέντρο Σινσινάτι των παιδιών, την ανάπτυξη και την εμπορευματοποίηση αυτής της τεχνολογίας έχει την άδεια να Bexion Pharmaceuticals, LLC, στην οποία ο Δρ Qi κατέχει ένα μικρό (& lt? 5%) το ενδιαφέρον της καθαρής θέσης. Ο Δρ Qi είναι ένας εφευρέτης της επιστημονικής έρευνας που βρίσκεται σε προ-κλινικό στάδιο για Bexion Pharmaceuticals. Αυτή τη στιγμή, Bexion Pharmaceuticals δεν προσφέρει καμία εμπορεύσιμα θεραπείες ή φάρμακα. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο, με επιβίωση 5 ετών μικρότερη από 5% [1], [2], [3]. Είναι συνήθως ασυμπτωματική στα αρχικά στάδια, ενώ συχνά εισβάλλουν περιφερειακών λεμφαδένων και ήπατος, και λιγότερο συχνά τους πνεύμονες και σπλαχνικά όργανα. Τρέχουσες στρατηγικές πολλαπλών μέσων, συμπεριλαμβανομένων χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, έχουν αποτύχει να βελτιώσει τη μακροπρόθεσμη επιβίωση. Το τρέχον πρότυπο της θεραπείας, ο νουκλεοζίτης ανάλογο γεμσιταβίνης [4], παρατείνει την επιβίωση μόνο κατά μερικούς μήνες. Παρά τις εξαντλητικές προσπάθειες για να χαρτογραφήσει τις γενετικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος, έχουν λίγες υποσχόμενους στόχους φαρμάκων έχουν αναφερθεί, και οι νέες, αποτελεσματικές θεραπείες χρειάζονται επειγόντως. Πειραματικές θεραπευτικές στρατηγικές περιλαμβάνουν μικρές και μεγάλες αναστολείς μόριο του ογκογόνου οδών, αντι-αγγειογόνοι παράγοντες, ο εμβολιασμός /ανοσοθεραπεία, γονιδιακές θεραπείες, και πολλές άλλες, αλλά όχι σαφώς ανώτερη θεραπείες έχουν προκύψει.

Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η κυτταρική μεμβράνες έχουν γίνει στόχοι για φάρμακα κατά του καρκίνου. Πολλές γραμμές αποδείξεως έχουν προτείνει ένα δεσμό μεταξύ ανωμαλιών της κυτταρικής μεμβράνης και κηραμιδίου-μεσολαβούμενη επαγωγή της απόπτωσης σε όγκους [5], [6], [7], [8], [9]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, παράγοντες που παρεμβαίνουν κυτταρικές μεμβράνες έχουν αναπτυχθεί για να ρυθμίζουν την οργάνωση μεμβράνη, η ρευστότητα, το μεταβολισμό, και την μεταγωγή σήματος [10], [11], [12]. Λίγα είναι γνωστά, ωστόσο, των υποκείμενων οδών σηματοδότησης που επηρεάζονται από αντι-νεοπλασματικών παραγόντων μεμβράνη-στόχο.

Έχουμε εργαστεί για την ανάπτυξη ενός νέου βιοθεραπευτικής φάρμακο που μπορεί να στοχεύσει επιλεκτικά την κυτταρική μεμβράνη των παγκρεατικών όγκων και αποτελεσματικά να καταστρέψουν κακοήθη παγκρεατικά κύτταρα χωρίς να βλάπτουν τους κανονικούς ιστούς και τα κύτταρα. Αυτός ο παράγοντας αποτελείται από δύο καθαρισμένων φυσικών κυτταρικών συστατικών – μια μικρή φυσική πρωτεΐνη (σαποσίνης C, SAPC) και ένα φυσικό λιπίδιο (διολεοϋλφωσφατιδυλοσερίνη, DOPS) – την οποία συγκροτούνται σε καρκίνο επιλεκτικό nanovesicles (SAPC-DOPS). SAPC είναι ένα μικρό μη ενζυματική γλυκοπρωτεΐνη που υπάρχει σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς που δρα ως ένα βιολογικό ενεργοποιητή του λυσοσωματικών ενζύμων [13]. Η λειτουργική οργάνωση του SAPC περιλαμβάνει μια περιοχή σύντηξης μεμβράνης και μία περιοχή για την ενεργοποίηση των λυσοσωμικών ενζύμων [14], [15]. Η

N

-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης δεν είναι απαραίτητη για την δραστηριότητα SAPC [16], [17]. SAPC ενισχύει αποικοδόμηση του γλυκοσυλοκεραμιδίου, σφιγγομυελίνη, και γαλακτοζυλκεραμίδιο να κεραμίδιο μέσω οξύ β-γλυκοσιδάση, όξινης σφιγγομυελινάσης και οξύ β-galacotsylceramidase, αντίστοιχα [13], [18], [19]. Σε ασθενείς με νόσους λυσοσωματικής αποθήκευσης, SAPC συσσωρεύεται μαζί με γλυκοσφιγγολιπιδίων στα μακροφάγα [20] και φαίνεται ότι η υπερβολική SAPC και λιπίδια μπορεί να είναι τοξική για τα κύτταρα αυτά.

Μια γενική ιδιότητα του σαποσινών είναι δραστικότητας πρόσδεσης των λιπιδίων της μεμβράνης τους [ ,,,0],21], δεδομένου ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταφορά λιπιδίων [22], τη συναρμολόγηση των λιπιδίων μικροπεριοχή [23], και την αναδιοργάνωση των βιολογικών μεμβρανών [24], [25], [26]. SAPC αλληλεπιδρά προνομιακά με ακόρεστα, αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια (όπως DOPS), σε όξινο ρΗ [15], [21]. Αυτή η αλληλεπίδραση απαιτείται για την ενεργοποίηση SAPC των λυσοσωμικών ενζύμων.

Υποθέσαμε ότι επειδή φωσφατιδυλοσερίνη (PS) είναι σχετικά άφθονα επί της επιφανείας των καρκινικών κυττάρων και ιστών [27], [28], θα παρέχει ένα από όγκο συγκεκριμένο στόχο για ΚΕΣΣ. Σε σύγκριση με τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα, νεοπλασματικά κύτταρα είναι υπερμεταβολικές και έτσι παράγουν σημαντικές ποσότητες οξέος και διοξειδίου του άνθρακα (CO

2) ως υποπροϊόντα της αναερόβιας γλυκόλυσης και αερόβια αναπνοή, αντίστοιχα. ιόντα υδρογόνου συσσωρεύονται σε ιστούς όγκων και ως αποτέλεσμα, η μέση εξωκυτταρικό ρΗ σε συμπαγείς όγκους είναι χαμηλότερη (ρΗ ~ 6) απ ‘ότι σε φυσιολογικούς ιστούς (ρΗ ~ 7) [29], [30]. Καρκινικών κυττάρων εμφανίζουν επίσης και άλλα μοναδικές ιδιότητες, όπως η γενικευμένη μεταβολές μεμβράνη [31], [32], [33] και «διαρροή» των λυσοσωμικών ενζύμων [31]. Περιέργως, αρκετές λυσοσωμικών υδρολασών αυξημένα σε καρκινικούς ιστούς [34], [35]. Ως εκ τούτου, ένα μοναδικό όξινο μικροπεριβάλλον με εξωκυτταρικά διαρροή λυσοσωματικών ενζύμων καθιστά καρκινικό ιστό ένα βέλτιστο στόχο για SAPC [9].

Σε προηγούμενη μελέτη βρήκαμε ότι SAPC-DOPS επαγόμενη απόπτωση σε πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων νευροβλάστωμα, κακόηθες περιφερικών νεύρων θήκη του όγκου, και κύτταρα καρκίνου του μαστού, ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα και τους ιστούς [36]. Ο μηχανισμός της ΚΕΣΣ-DOPS επαγωγή απόπτωσης προσδιορίστηκε να είναι, εν μέρει, μέσω της αύξησης της ενδοκυτταρικής ceramides, που ακολουθείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης. Διερευνήσαμε επίσης την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου και συστημική βιοκατανομή SAPC-DOPS nanovesicles σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του [9], [36], [37]. Βρήκαμε ότι SAPC-DOPS nanovesicles σημαντικά στοχευμένη και ανέστειλε την ανάπτυξη των προκλινικών ξενομοσχευμάτων νευροβλαστώματος, του κακοήθους περιφερικού νευρικού ελύτρου του όγκου, και ο καρκίνος του δέρματος και δεν παρουσίαζαν τοξικά αποτελέσματα σε μη όγκου ιστούς [9], [36], [37].

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το βοηθητικό πρόγραμμα κατά του καρκίνου του ΚΕΣΣ-DOPS, και του

in vitro

και

in vivo

καρκίνο στόχευση και αντι-νεοπλασματική δράση έναντι της ανθρώπινης καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και του παγκρέατος ξενομοσχεύματα όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Πολιτισμών

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές του παγκρέατος (MiaPaCa-2, PANC-1, BxPC-3, Capan- 1, AsPC-1, ΗΡΑΡ-ΙΙ, Hs766T) από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) καλλιεργήθηκαν με κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες πενικιλίνης /ml, και 10 mg στρεπτομυκίνης /ml. Ανθρώπινη παγκρεατική επιθήλιο πόρου (HPDE) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Α Lowy (Moores UCSD Κέντρο Καρκίνου, La Jolla, CA), και αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στην βιβλιογραφία [38]. Ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρική γραμμή cfPac1-Luc3 παρασχέθηκε ευγενώς από τον O. Wildner (Ruhr Πανεπιστημίου Bochum, Bochum, Γερμανία) [39]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Καμία διασταυρούμενη μόλυνση βρέθηκε σε αυτά τα κύτταρα.

παρασκευή πρωτεϊνών και Nanovesicles

SAPC παρήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17] με τροποποιήσεις. Εν συντομία, ανασυνδυασμένη σαποσινών εκφράστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ρΕΤ σε

E. Coli

κύτταρα. Οι εκφρασμένες πρωτεΐνες καθαρίστηκαν επί στήλης νικελίου και εντελώς αφαλατώθηκαν με υγρό C4 αντίστροφης φάσης υψηλής απόδοσης χρωματογραφία (HPLC). Μετά τη λυοφιλοποίηση, σαποσίνη σκόνη χρησιμοποιήθηκε και η συγκέντρωση του προσδιορίστηκε με το βάρος του. Όλα τα φωσφολιπίδια αγοράστηκαν από την Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Λουτρό υπερήχων χρησιμοποιήθηκε για να σχηματίσουν SAPC-DOPS nanovesicles όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [40]. Μετά την απομάκρυνση του διαλύτη υπό αέριο άζωτο, φωσφολιπίδια αναμίχθηκαν με καθαρές πρωτεΐνες σαποσίνης σε 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος οξέος (ρΗ 5) και γρήγορα αραιωμένο σε 50Χ όγκο φυσιολογικού υδατικού διαλύματος. Το μείγμα πρωτεΐνης-λιπιδίου ακολούθως ήπια επεξεργασία με υπερήχους και τα δύο συστατικά συναρμολογούνται εύκολα σε nanovesicles. Οι σε επεξεργασία με υπερήχους nanovesicles μπορούν να χρησιμοποιηθούν μετά από αποθήκευση στους 4 ° C για τουλάχιστον μια εβδομάδα. Για μακροχρόνια αποθήκευση, σταθερό λυοφιλοποιημένο δείγματα ΚΕΣΣ-DOPS παρασκευάστηκαν με νερό-οργανικό σύστημα συν. Μετά την απομάκρυνση του διαλύτη, ξηραίνεται DOPS διαλύθηκε σε 80% τ-βουτυλική αλκοόλη. (/Ml 10 mg) διάλυμα SAPC και σακχαρόζη έγιναν σε νερό. DOPS και SAPC /σακχαρόζη (όγκο: όγκο = 1:0.6) μίγμα λυοφιλοποιήθηκε σε ένα κέικ σκόνη σε ένα ξηραντήρα κατάψυξης (VirTis Unitop, The Virtis Co., Gardiner, ΝΥ). Για ένεση ζώο, ο πλακούντας επανυδατώνεται σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για να σχηματίσει SAPC-DOPS nanovesicles. Αυτές οι nanovesicles έδειξε το ίδιο όγκο στόχευση και κυτταροτοξικότητα

in vitro

και

in vivo

.

ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles χαρακτηρίστηκαν και παρακολουθείται από το Ν4 συν το μέγεθος των σωματιδίων αναλυτή ως προηγούμενα περιγράφεται [9], [36]. Σταθερό nanovesicles SAPC-DOPS έχουν μέση διάμετρο περίπου 200 nm με μία μέση ζήτα δυναμικό σε -42. SAPC δεσμεύει τα μόρια των λιπιδίων και αυθόρμητα ενσωματώνει στη λιπιδική διπλοστοιβάδα των λιποσωμάτων κατά την κατεργασία με υπερήχους. Μετά κατεργασία με υπερήχους και υπερφυγοκέντρηση για να σφαιροποιηθούν SAPC-DOPS συζευγμένο λιποσώματα, δεν SAPC ανιχνεύθηκε στο υπερκείμενο κλάσμα, εμπλέκοντας μια απόδοση πολύ υψηλή φόρτωση /σύζευξης [9]. Ξηρό SAPC διαλύθηκε σε διάλυμα PBS για θεραπεία SAPC χωρίς DOPS. DOPS χωρίς ΚΕΣΣ παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία προετοιμασίας για ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles.

Ζωντανή Απεικόνιση

φθορισμού επισήμανση της ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles.

Σε μερικά τμήματα του πειράματος , οι nanovesicles SAPC-DOPS είχαν επισημανθεί διά φθορισμού με μια βαφή σταθερή και υψηλή ένταση, CellVue® Maroon (CVM, Molecular Στόχευση Technology Inc., Exton, ΡΑ – Διέγερση max = 647 nm? Εκπομπή max = 677 nm [9], [36 ]). CVM απέδειξε χρησιμότητα στην απεικόνιση υποδόριους όγκους, καθώς και κρύβονται, ορθοτοπικά εμφυτευμένων, και μεταστατικούς όγκους. Η τύχη της βαφής θα μπορούσε να ακολουθηθεί στις ζωντανά ποντίκια χρησιμοποιώντας μια συσκευή απεικόνισης ολόκληρου του ζώου [IVIS-200X (φίλτρο Cy5.5), Xenogen]. Για όλες απεικόνισης, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν ήπια με ισοφλουράνιο και τοποθετείται σε ένα θερμό πλατφόρμα στη συσκευή απεικόνισης.

Ένα κλάσμα του CVM σε αιθανόλη αναμίχθηκε με φωσφολιπίδιο διαλύτης για παρασκευή ηχοβολισμό με τη διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω. CVM επισημασμένο SAPC-DOPS nanovesicles διαχωρίστηκαν από το ελεύθερο φθοροφόρο CVM χρησιμοποιώντας μια στήλη Sephadex ™ G25 (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

βιοφωταύγεια των παγκρεατικών κυττάρων όγκου.

Για να παρακολουθήσετε τα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήθηκαν λουσιφεράσης που εκφράζουν ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα cfPac1-Luc3. Μετά την ένεση της λουσιφερίνης, η ίδια συσκευή ζωντανής απεικόνισης (IVIS-200X, Xenogen) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση και τον εντοπισμό της βιοφωτισμός.

In vitro

Μελέτες

Επίδραση της SAPC-DOPS nanovesicles σε κύτταρα όγκου.

Τρεις ευρέως χρησιμοποιούμενες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού (MiaPaCa-2, PANC-1, και BxPC-3) και μη μετασχηματισμένα κύτταρα (HPDE) σπάρθηκαν (10

4 /100 μl /φρεάτιο) σε πλάκες 96 φρεατίων με επίπεδο πυθμένα καλλιέργειας ιστού (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) και καλλιεργήθηκαν στα αντίστοιχα μέσα ανάπτυξης τους για 24 ώρες, μετά τις οποίες SAPC-DOPS (0,14 mg) ή PBS όχημα προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας. Για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα κυττάρου, ένα πρότυπο 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) -dye (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [9], [36] τρεις ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας. Μικροσκοπική αξιολόγηση των καρκινικών κυττάρων και των κυττάρων HPDE διεξήχθη.

Για να αξιολογηθεί για την απόπτωση, MiaPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SAPC-DOPS, PBS, ή ϋΝΑάση (θετικός έλεγχος), και στη συνέχεια αξιολογείται με τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας χρησιμοποιώντας In Situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, POD (Roche Applied Science, Γερμανία), όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

για να επιβεβαιωθεί ότι ήταν η συναρμολογούνται nanovesicles SAPC-DOPS που προκάλεσε κυτταρικό θάνατο, MiaPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα και HPDE έλαβαν θεραπεία είτε με SAPC-DOPS, SAPC μόνο, ή DOPS μόνο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ-χρωστική.

Για να καθοριστεί εάν SAPC-DOPS επαγόμενη απόπτωση που διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης, πρωτεΐνες από τα κύτταρα nanovesicles επεξεργασμένα MiaPaCa-2 αναλύθηκαν με western blots. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με SAPC-DOPS, DOPS, PBS, ή σταυροσπορίνη (θετικός έλεγχος) και, στη συνέχεια, υποβάλλονται σε λύση για ανάλυση πρωτεΐνης με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας NuPAGE Novex Bis-Tris Gels (4-12%), και η διαδικασία ηλεκτροφόρησης ανά κατασκευαστής (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε χρησιμοποιώντας ένα Semi-Dry μονάδα αποτύπωση (FB-SDB-2020, Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) σε μεμβράνη Hybond-ECL νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Αντι-ανθρώπινη κασπάση-9 και αντι-ακτίνης αντισώματα (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των δραστικών κασπασών και ακτίνη (έλεγχος), αντίστοιχα.

Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν εις τετραπλούν και τα δεδομένα ήταν αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). ανάλυση Τ-test ή αμφίδρομη δοκιμή ANOVA Tukey χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα για πειράματα με δύο ή μεγαλύτερος από δύο ομάδες, αντίστοιχα. Οι αναλύσεις έγιναν με SPSS 12.0.

Συσχέτιση μεταξύ θανάτωση επίδραση του SAPC-DOPS και PS έκθεση επί των παγκρεατικών κυτταρική επιφάνεια.

Μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με FITC επισημασμένο αννεξίνης V διεξήχθη στις 8 κυτταρικές γραμμές (Hs766T, AsPC-1, cfPac1-Luc3, Capan-1, BxPC-3, MiaPaCa-2, ΗΡΑΡ-ΙΙ, και PANC-1) για να προσδιοριστεί το επίπεδο της έκθεσης PS στην κυτταρική επιφάνεια. Οι κυτταρικές γραμμές στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε δύο ομάδες: η ομάδα «High-PS» περιείχε εκείνα που είχαν μέση φθορισμού (MF) πάνω από 50 (αυθαίρετες μονάδες) και η ομάδα «Low-PS» περιέχεται εκείνους με MF λιγότερο από 50. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SAPC-DOPS nanovesicles και το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίσθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία. Πειράματα ΜΤΤ διεξήχθησαν εις τετραπλούν και τα δεδομένα αναλύθηκαν με ANOVA. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι ο αριθμητικός μέσος όρος ± SEM.

In vivo

Μελέτες

δήλωση Δεοντολογίας της χρήσης ζώων.

Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από το ιδρυματική φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής του Πανεπιστημίου του Σινσινάτι (IACUC πρωτόκολλο Αριθμός: 11-05-05-02) και Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών (IACUC πρωτόκολλο Αριθμός: 1E03031). Τα ζώα αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο ή πεντοβαρβιτάλη για αυτοσυγκράτηση πριν από ενέσεις των καρκινικών κυττάρων για την ελαχιστοποίηση του πόνου και αγωνίας. Το βάθος της αναισθησίας παρακολουθήθηκε με τον έλεγχο της αντίδρασης του πόνου (toe ή σφιξίματος της ουράς), των μυών και το σαγόνι χαλαρότητα, και την παρουσία των τακτικών αναπνοές. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν οι όγκοι έφθασαν το 20% της μάζας του σώματος (δηλαδή το μέγεθος του κεφαλιού), ελκωτική ή νεκρωθεί. φέροντα όγκο ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με διοξείδιο του άνθρακα κατά την απομείωση κανονικές φυσιολογικές λειτουργίες όπως το φαγητό και το ποτό, την ούρηση και αφόδευση. Τα πρώτα κριτήρια απομάκρυνση οφείλεται σε επιπλοκές της χειρουργικής επέμβασης περιλαμβάνονται απαλλαγή από το site της χειρουργικής επέμβασης, απώλεια της όρεξης, απώλεια βάρους, και η αποτυχία να γαμπρό. κριτηρίων πρόωρης απομάκρυνσης, ως αποτέλεσμα της αύξησης του όγκου περιλαμβάνονται ημιπληγία, καμία απάντηση σε ερεθίσματα, όπως ο θόρυβος ή αφής για διάστημα μεγαλύτερο των 12 ωρών μετά την αναλγητική διοίκηση, η απώλεια βάρους είναι μεγαλύτερη από το 20% με εβδομαδιαίο ζύγισμα, αφυδάτωση, αδυναμία να καλλωπίσει, ή λήθαργο για περισσότερο από 24 ώρες. Τα κριτήρια αυτά αντιμετωπίστηκαν από συνεννόηση με τον θεράποντα κτηνίατρο.

In vivo

μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η εξειδίκευση, η δράση κατά των όγκων και ευαισθητοποίηση ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles στη στόχευση του παγκρέατος κύτταρα όγκου. Για όλες τις

in vivo

μελέτες, γυναικείο γυμνό /γυμνά αθυμικά ποντίκια (Taconic Farms, Germantown, ΝΥ, συνολικής 98) που ζυγίζουν περίπου 20-25 γραμμάρια χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα του όγκου εγχύθηκαν είτε υποδορίως είτε ορθοτοπικά (Σχήμα S1, Υλικά S1). Όλες οι ενέσεις IV διεξήχθησαν σε φλέβα της ουράς. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία της ανθρώπινης παγκρεατικής όγκων, αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) χρώση ξενομόσχευμα όγκων εκτελέσθηκε? Τα παραδείγματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα S2.

αξιολόγηση της δόσης για την αναστολή της ανάπτυξης παγκρεατικού όγκου με SAPC-DOPS.

Ποντίκια (σύνολο 24) εμβολιάσθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με ένα εναιώρημα PANC- 1 καρκινικά κύτταρα (10

7cells /ποντίκι). Είκοσι τέσσερις ημέρες μετά τον εμβολιασμό, το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας παχύμετρο και τον τύπο V = (π /6) LW

2 (V = όγκος, L = μήκος, W = πλάτος) [36]. Την επόμενη ημέρα (ημέρα 1), ομάδες ποντικών που φέρουν όγκο (η = 6 /ομάδα) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως με SAPC-DOPS (1, 4, ή 8 mg /kg σε όγκο 0,2 ml δόσης) ή ελέγχου του οχήματος ( 0.2 ml PBS). μετρήσεις μεγέθους όγκου εκτελέστηκαν καθημερινά και ενέσεις συνεχίστηκαν κάθε δεύτερη μέρα έως ότου οι μεγαλύτεροι όγκοι έφθασαν & gt? 2000 mm

3 μέγεθος (18 ημέρες). Οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν και ένα πραγματικό βάρος όγκου μετρήθηκε. Στατιστικές αναλύσεις σε αυτό το τμήμα της μελέτης έγιναν με λογισμικό GraphPad Prism® V4. Οι διαφορές στο τελικό βάρος των όγκων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ANOVA με πολλαπλές Test Σύγκριση Δημοσίευση Dunnett.

Αξιολόγηση της ικανότητας της ΚΕΣΣ-DOPS να στοχεύσετε επιφάνεια PS σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Για να προσδιορίσετε αν SapC- DOPS nanovesicles ειδικώς στοχεύουν παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vivo

, MiaPaCa-2 κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα) ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ποντικών. Μετά από 5 εβδομάδες, όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, ένα από τα ακόλουθα ήταν IV ένεση σε κάθε ποντικό: φθοριζόντως επισημασμένο nanovesicles SAPC-DOPS (6 mg /kg), μη-συμπλοκοποιημένη SAPC και σημασμένα με φθορισμό DOPS, σημασμένο με φθορισμό DOPS μόνο ή PBS ελέγχου (5 ποντίκια /ομάδα, σύνολο 20). Αξιολόγηση του

in vivo

διανομή του φθορισμού διεξήχθη με τη συσκευή απεικόνισης ζώντα ζώα. Εικόνες ελήφθησαν σε πολλαπλές χρονικά διαστήματα από 5 λεπτά έως 100 ώρες μετά την ένεση.

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του αποκλεισμού πρόσδεσης PS, χρησιμοποιήθηκαν λουσιφεράσης που εκφράζουν cfPac1-Luc3 κύτταρα παγκρεατικού όγκου. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με δεσμευτικό το PS πρωτεΐνες lactadherin-C2 [41] και β2-γλυκοπρωτεΐνης [42] (0,1 mg /ml), ή προς τα αριστερά σε μέσο χωρίς θεραπεία σαν ένας έλεγχος για μία ώρα και στη συνέχεια με ένεση υποδορίως στην κορυφή του επικεφαλής άτριχων ποντικών (σύνολο 8). Η βιοφωταύγεια απεικόνιση διεξήχθη για να απεικονίσει τα κύτταρα του όγκου. Σε μία ώρα μετά την εμφύτευση, σημασμένο με φθορισμό nanovesicles ΚΕΣΣ-DOPS ήταν IV ένεση, και το σήμα φθορισμού τεκμηριώθηκε με τη χρήση του συστήματος ζωντανής απεικόνισης.

Για να διερευνήσουν την εκκαθάριση ΚΕΣΣ-DOPS από φυσιολογικό ιστό του ποντικιού, σημασμένο με φθορισμό ΚΕΣΣ-DOPS είχε IV ένεση σε 5 ποντικούς. Οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν και το ήπαρ, σπλήνα, πνεύμονα, καρδιά, τα νεφρά και απομακρύνθηκαν και απεικονίστηκαν στις 1, 12 και 24 ώρες μετά την ένεση για να αξιολογηθεί για την παρουσία του επισημασμένου με φθορισμό SAPC-DOPS.

Επίδραση της ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles στην ανάπτυξη του παγκρέατος όγκου.

MiaPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα), τα οποία θα τεκμηριώνονται στα

in vitro

μελέτες ήταν ευαίσθητα στην ΚΕΣΣ -DOPS θεραπεία (& gt? 80% κυτταρικό θάνατο), ενέθηκαν υποδορίως στην άνω πλάτη των ποντικών. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε 3 ημέρες και ο όγκος υπολογίστηκε. Όταν ο μέσος όγκος του όγκου αυξήθηκε σε -500 mm

3, οι ποντικοί IV ένεση είτε με SAPC-DOPS (6 mg /kg) ή μόνο PBS (5 ποντικοί /ομάδα, σύνολο 10). Οι ενέσεις επαναλήφθηκαν την ημέρα 3, 6, 12, 15, 18, 21, και 24, και οι μετρήσεις των όγκων συνεχίστηκε μέχρι την ημέρα 30. Τ-test ανάλυση ή αμφίδρομη δοκιμή ANOVA Tukey χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα για πειράματα με δύο ή μεγαλύτερος από δύο ομάδες, αντίστοιχα. Οι αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα SPSS 12.0.

Παρακολούθηση της βιοφωταύγεια όγκου και φθορισμού ΚΕΣΣ-DOPS σε ποντίκια με ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος.

Για να καταδείξει πώς ΚΕΣΣ-DOPS στοχεύει επιλεκτικά ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος, του ανθρώπου cfPac1- Luc3 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του παγκρέατος του γυμνού ποντικού. Μετά την ορθοτοπική παγκρεατικού όγκου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ζωντανά απεικόνισης σε 6 ημέρες, σημασμένο με φθορισμό SAPC-DOPS nanovesicles, σημασμένο με φθορισμό SAPC, σημασμένο με φθορισμό DOPS, ή PBS (έλεγχος) ήταν IV εγχύθηκε (6 ποντίκια /ομάδα, σύνολο 24).

επιβίωση του SAPC-DOPS αγωγή ποντικών με ορθοτοπικά εμφυτευμένων παγκρεατικών όγκων.

Ομάδες ποντικών (η = 6 έκαστη, σύνολο 12), με ορθοτοπικά εγχέεται παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (λουσιφεράση εκφράζουν cfPac1-Luc3 γραμμή) επιβεβαιώθηκε από βιοφωταύγεια σε ζωντανά απεικόνιση είχαν IV ένεση με πολλαπλές δόσεις (ημέρες 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) του SAPC-DOPS (6 mg /kg σε 30 μι PBS) ή όχημα ελέγχου (PBS 30 μL). Τα σημασμένα με φθορισμό nanovesicles SAPC-DOPS στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ζωντανής απεικόνισης. Τα επιζώντα ζώα παρακολουθήθηκαν μέχρι τη λήξη όλοι οι ποντικοί στην ομάδα ελέγχου. Οι καμπύλες επιβίωσης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan και Meier με λογισμικό GraphPad Prism. Οι όγκοι bioluminescent παρακολουθήθηκαν με τη συσκευή ζωντανά απεικόνισης για 23 εβδομάδες.

Μακροχρόνια παρακολούθηση του όγκου και βιοφωταύγειας φθορισμός SAPC-DOPS σε ποντικούς με ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος.

λουσιφεράσης που εκφράζουν cfPac1- Luc3 κύτταρα του παγκρέατος όγκου ορθοτοπικά εγχύονται στο πάγκρεας ποντικού. Μετά από 110 ημέρες, η κατανομή των βιοφωταύγειας όγκων παρακολουθήθηκε με τη χρήση της συσκευής απεικόνισης ζώντα ζώα. Μετά την βιοφωταύγεια διαλυθεί, σημασμένο με φθορισμό nanovesicles SAPC-DOPS εγχύθηκαν (6 mg /kg) και οι ποντικοί απεικονίστηκαν ξανά.

Στόχευση των κρυμμένων ορθοτοπικά-εμφυτεύονται και μεταστατικούς όγκους με φθορισμό σημασμένο nanovesicles SAPC-DOPS.

ορθοτοπική παγκρέατος όγκοι που δημιουργούνται από την εμφύτευση μιας γραμμής λουσιφεράσης που εκφράζουν παγκρεατικών όγκων (cfPac1-Luc-3) σε ποντίκια. Μετά από 6 εβδομάδες, τα ποντίκια απεικονίστηκαν να προσδιορίσει όλες τις καρκινικές περιοχές. Μόλις ο βιοφωτισμός είχε διαλυθεί, σημασμένο με φθορισμό ΚΕΣΣ-DOPS ήταν IV ένεση.

Αποτελέσματα

In vitro

Μελέτες

Επίδραση της ΚΕΣΣ-DOPS nanovesicles για καρκινικών κυττάρων.

Σε προηγούμενες μελέτες, βρέθηκε ότι η βέλτιστη μοριακή αναλογία SAPC και DOPS ήταν από την 1:3 να 1:10 για μέγιστη κυτταροτοξική δράση κατά ανθρώπινου νευροβλαστώματος και του καρκίνου του δέρματος κυττάρων [36], [37 ]. Έχουμε διαπιστώσει ότι αυτή η μοριακή φάσμα SAPC: λόγος DOPS είχε επίσης σημαντική επίδραση επί θανάτωση ανθρώπινων παγκρεατικών (MiaPaCa-2) καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1Α). Όταν τα τρία παγκρεατικού κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία HPDE με SAPC-DOPS, τα περισσότερα από τα κύτταρα του όγκου πέθαναν, ενώ τα κύτταρα παρέμειναν βιώσιμα HPDE (Σχήμα 1Β). Μικροσκοπική επιθεώρηση του SAPC-DOPS-κατεργασμένων κυττάρων έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα είχαν μορφολογικά χαρακτηριστικά συνεπή με αποπτωτικό θάνατο, ενώ τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα HPDE εμφανίστηκαν φυσιολογικά (Σχήμα 2). ανάλυση TUNEL αποκάλυψε ότι ΚΕΣΣ-DOPS όντως επάγει απόπτωση (Σχήμα 1C). Σε αντίθεση με ΚΕΣΣ-DOPS και το θετικό ϋΝΑάση ελέγχου, ο αρνητικός μάρτυρας PBS δεν είχε καμία αποπτωτικό αποτέλεσμα. Και τα δύο συστατικά του SAPC-DOPS ήταν απαραίτητες για τη βέλτιστη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Εάν μόνο η πρωτεΐνη (SAPC) ή τα φωσφολιπίδια (DOPS) συστατικά ξεχωριστά προστίθενται σε κύτταρα, δεν υπήρχε επαγωγή της απόπτωσης και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν συγκρίσιμη με τον έλεγχο PBS (Σχήματα 1Β και 1D). Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η διάσπαση του προενζύμου προ-κασπάσης-9 στη δραστική μορφή συνέβη μόνο στα SAPC-DOPS-κατεργασμένα κύτταρα και τα σταυροσπορίνη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1 Ε).

(Α) Ο ρόλος της μοριακή αναλογία SAPC και DOPS για κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινα παγκρεατικά (MiaPaCa-2) καρκινικά κύτταρα. (Β) Ο κυτταρικός θάνατος (%) στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (MiaPaCa-2, PANC-1, και BxPC-3) και υγιών μαρτύρων (HPDE) μετά από έκθεση σε SAPC-DOPS. (Τα δεδομένα σε 1Β-1ϋ αναφέρονται ως αριθμητικός μέσος όρος ± SEM.) (C) απόπτωση (%) σε MiaPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με είτε SAPC-DOPS, PBS (αρνητικός έλεγχος), ή ϋΝΑάση (θετικός έλεγχος). (D) κυτταρικού θανάτου (%) στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και HPDE μετά από έκθεση σε SAPC-DOPS, SAPC μόνο, ή DOPS μόνο. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western καταδεικνύει ότι κατεργασία του MiaPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα τόσο με την SAPC-DOPS και σταυροσπορίνη θετικού μάρτυρα (Ρ) είχε σαν αποτέλεσμα τη διάσπαση του προ-κασπάσης-9 στην ενεργό κασπάση-9, ενώ η θεραπεία με DOPS, PBS , και αρνητικός έλεγχος (Ν) δεν προκάλεσε ένζυμο ενεργοποίησης.

Η

Τα κύτταρα όγκου (PANC-1, Capan-1 και MiaPaCa-2 στο (Β), (C), και (D) , αντίστοιχα) είχαν μορφολογικά χαρακτηριστικά συνάδουν με αποπτωτικό θάνατο μετά από θεραπεία με ΚΕΣΣ-DOPS, ενώ τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα HPDE (Α) φαίνονται φυσιολογικά.

η

Συσχέτιση μεταξύ σκοτώνοντας επίδραση της ΚΕΣΣ-DOPS και την έκθεση PS στο παγκρέατος κυτταρική επιφάνεια.

το ιστόγραμμα φθορισμού στο Σχήμα 3Α δείχνει ότι το εξωτερικό επίπεδο PS σε κύτταρα PANC-1 ήταν υψηλότερη από ό, τι για κύτταρα AsPC-1. Η σχετική έκφραση PS στην κυτταρική επιφάνεια των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών επιδεικνύεται στο Σχήμα 3Β. Μεταξύ αυτών των κυτταρικών γραμμών, MiaPaCa-2, ΗΡΑΡ-ΙΙ, και PANC-1 είχε MF πάνω από 50 και ως εκ τούτου αποτελούσε το «High-PS» ομάδα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, τα κύτταρα στην ομάδα υψηλού PS έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα σε απόκριση SAPC-DOPS από τα κύτταρα στην ομάδα χαμηλής PS (ρ & lt? 0,05).

(Α) ιστόγραμμα φθορισμού των επιπέδων PS στο PANC-1 και AsPC-1 κυτταρικές επιφάνειες μετρήθηκαν με Annexin V-FITC. (Β) Η έκφραση PS απόκλιση στην ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρική επιφάνεια του 9 κυτταρικές σειρές. (C) Συνδυασμένη ποσοστό της επιβίωσης των κυττάρων και στις δύο ομάδες των κυτταρικών σειρών που έλαβαν θεραπεία με SAPC-DOPS όπως προσδιορίζεται με ΜΤΤ δοκιμασία (p = 0,0032)

Η

In vivo

Μελέτες.: Υποδόρια παγκρέατος όγκου Μοντέλο

αξιολόγηση της δόσης για την αναστολή της ανάπτυξης παγκρεατικού όγκου με SAPC-DOPS.

Τα μεγέθη των όγκων μετά τη χορήγηση του SAPC-DOPS σε δόσεις των 4 mg /kg και 8 mg /kg κάθε άλλες ημέρες ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου και της ομάδας αγωγής 1 mg /kg (ρ = 0.003 * και 0,00015 **) μετά από 18 ημέρες θεραπείας (Σχήμα 4). Με βάση αυτά τα δεδομένα, επιλέξαμε μια θεραπευτική δόση των 6 mg /kg για τις μελέτες αποτελεσματικότητας.

PANC-1 όγκων ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή κάθε δεύτερη ημέρα με 1, 4, ή 8 mg /kg του ΚΕΣΣ -DOPS, ή με έλεγχο PBS. Τα μεγέθη των όγκων σε υψηλές δόσεις (4 mg /kg και 8 mg /kg) ήταν σημαντικά μικρότερη από τον έλεγχο και την kg ομάδων 1 mg /(p = 0.003 * και 0,00015 **, αντιστοίχως).

Η

Αξιολόγηση της ικανότητας του SAPC-DOPS να στοχεύουν επιφάνεια PS στο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Ζωντανές απεικόνισης έδειξαν ότι φθοριζόντως επισημασμένο nanovesicles SAPC-DOPS ταχέως στοχεύουν στο ψηλαφητών όγκων μέσα σε 5 λεπτά (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ο φθορισμός συνεχίστηκε για πάνω από 4 ημέρες (Σχήμα 5). Ο φθορισμός από την συναρμολογημένη SAPC-DOPS nanovesicles στοχεύουν σε καρκινικές περιοχές, ενώ δεν φθορισμός του όγκου παρατηρήθηκε μετά συν-ένεση του μη συμπλοκοποιημένου SAPC και σημασμένα με φθορισμό DOPS, ή μετά την ένεση με επισήμανση φθορισμού DOPS μόνες ή ελέγχου PBS (Σχήματα 6Α και 6Β). Ενώ φθοριζόντως επισημασμένο SAPC-DOPS σημειώθηκε να συσσωρεύεται στο ήπαρ νωρίς (2 ώρες μετά την ένεση), δεν υπήρχε ίχνος του φθορισμού του ήπατος σε ζώντα απεικόνιση μετά από 24 ώρες (Σχήμα 6Α). Ομοίως, η μη-συμπλοκοποιημένου SAPC και σημασμένα με φθορισμό DOPS, και μόνος ο σημασμένα με φθορισμό DOPS, εντοπίστηκαν στο ήπαρ σε 0,5 ώρες σε ζωντανή απεικόνιση, αλλά γρήγορα διαχέεται (Σχήμα 6Β).

Τα nanovesicles ταχέως στοχοθετημένη με την ψηλαφητή όγκου μέσα σε 5 λεπτά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο φθορισμός συνεχίστηκε για πάνω από 1 (Α) και 4 (Β) ημέρες. SAPC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, CVM = 6 μΜ.

Η

Ετεροτοπική MiaPaCa-2 όγκοι (σε ​​κύκλο) δημιουργήθηκαν με υποδόρια ένεση στο άνω πλευρό γυμνών ποντικών. (Α) Ποντίκια 1 & amp? 2 ήταν τα ποντίκια που φέρουν όγκο, εγχύθηκαν με σημασμένο με φθορισμό SAPC-DOPS nanovesicles? Mouse 3 ήταν μη-που φέρει όγκο, PBS εγχέονται. Ποντίκια 1 και 2 και οι δύο επιδεικνύουν εντοπισμός του φθορίζοντος σήματος στη θέση του όγκου. Ο φθορισμός εντοπίζεται επίσης στο ήπαρ από 2 ώρες, αλλά έχει φύγει από 24 ώρες. (Β) ποντικούς που φέρουν όγκο 4, 5, και 6 εγχύθηκαν με μη συμπλεγμένο SAPC και σημασμένα με φθορισμό DOPS, μόνο σημασμένο με φθορισμό DOPS, και PBS, αντίστοιχα. Δεν υπάρχει φθορισμός εντοπίζεται σε όγκου σε οποιοδήποτε από αυτά τα ποντίκια.