Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) ή κύτταρα του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με (CSC-LCs ) έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλές κακοήθεις όγκους. Τα ΚΕΠ προτείνεται να σχετίζεται με αντοχή φαρμάκου, επανεμφάνιση του όγκου και της μετάστασης και θεωρούνται ως ένα νέο στόχο για θεραπεία του καρκίνου? Ωστόσο, υπάρχουν μόνο λίγες αναφορές σε ΚΕΠ ή CSC-LCs στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC). Διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν αναφερθεί για ταυτοποίηση CSC, αλλά δεν υπάρχουν καθολικές δείκτες για CSC. Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις, η προσέγγιση παραδοσιακή πλευρά του πληθυσμού (SP), και η ενζυμική (αφυδρογονάση αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1)) προσέγγιση για τον εντοπισμό του πληθυσμού CSC-LC σε δύο κυτταρικές γραμμές RCC, ACHN και KRC /Y. Βρήκαμε ότι ACHN και KRC /Υ περιέχει 1,4% και 1,7% τα κύτταρα SP, αντίστοιχα. κύτταρα ACHN SP παρουσίασαν υψηλότερο σφαίρα ικανότητα σχηματισμού, αντοχή φαρμάκου, και μια ελαφρώς υψηλότερη ογκογόνο ικανότητα σε ποντικούς SCID από μη SP κύτταρα NOD /(NSP), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα με ιδιότητες CSC-LC που περιλαμβάνεται σε κύτταρα ACHN SP. KRC /Υ SP και κύτταρα NSP έδειξε καμία διαφορά σε αυτές τις ιδιότητες. Ανάλυση δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ1 αποκάλυψε ότι τα κύτταρα SP ACHN εξέφρασε υψηλότερο επίπεδο δραστηριότητας από κύτταρα NSP (SP εναντίον NSP: 32,7% έναντι 14,6%). Ανάλυση ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων ACHN αποκάλυψε ότι έχουν μεγαλύτερη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας, την ικανότητα αυτο-ανανέωση, ογκογονικότητα και εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με το ακίνητο CSC-LC (π.χ. ABC γονίδια μεταφορέα, γονίδια αυτο-αντιγραφής, αντι- γονίδια απόπτωση, και ούτω καθεξής) από ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα. Η φαρμακευτική αγωγή ή έκθεση σε υποξικό κατάσταση προκάλεσε μια αύξηση 2 έως 3 φορές σε αριθμό ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΑΙ_ϋΗ1-θετικό κυτταρικό πληθυσμό παρά τα κύτταρα SP δείχνουν ιδιότητες CSC-LC σε RCC κυτταρική γραμμή, ACHN

Παράθεση:. Ueda K, Ogasawara S, Akiba J, Nakayama Μ, Todoroki Κ, Κ Ueda, et al. (2013) Αλδεΰδη αφυδρογονάσης 1 Χαρακτηρίζει Κύτταρα με Καρκίνο Stem Cell-Like Properties σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά νεφρικού καρκινώματος Cell. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10.1371 /journal.pone.0075463

Επιμέλεια: Masaharu Seno, Πανεπιστήμιο Okayama, Japan

Ελήφθη: 25 του Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 14, Αυγούστου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Ueda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Νεφρική καρκίνωμα (RCC) είναι ένα από τα. πιο συχνές κακοήθειες του ουροποιογεννητικού συστήματος, αντιπροσωπεύοντας 116.500 θανάτους το 2008, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας [1]. Η συχνότητα εμφάνισης της RCC έχει αυξάνεται σταθερά τα τελευταία 30 χρόνια [2]. Επιπλέον, επειδή μεταστατικό RCC είναι εμφανώς ανθεκτικό στις περισσότερες συμβατικές θεραπείες, όπως η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία, η πρόγνωση των ασθενών με RCC είναι κακή ως το ένα τρίτο των ασθενών έχουν ήδη μεταστατική νόσο κατά την αρχική διάγνωση και 30-40% αυτών αναπτύσσουν μακρινό μεταστάσεις μετά από εκτομή του πρωτογενούς όγκου [3]. Τα τελευταία χρόνια, τα μοριακά στοχευμένες θεραπείες που έχουν αναπτυχθεί έχουν δείξει σημαντικά αντικειμενικές αποκρίσεις [4] – [6], και τώρα αναγνωρίζονται ως οι τρέχουσες πρότυπες θεραπείες για μεταστατικό RCC. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών μοριακού στόχου είναι ανεπαρκής.

Τα δύο κυρίαρχα μοντέλα καρκινογένεσης είναι το μοντέλο στοχαστικές (κλωνική εξέλιξης) και η ιεραρχική οργάνωση του όγκου (καρκίνος των βλαστικών κυττάρων CSC) () μοντέλο. Σύμφωνα με την παραδοσιακή κλωνική μοντέλο εξέλιξης, σχηματισμό όγκου είναι η συνέπεια της συσσώρευσης τυχαία γενετικά γεγονότα σε φυσιολογικά διαφοροποιημένα κύτταρα, ενώ το μοντέλο υποθέτει CSC ότι μια ενιαία CSC δημιουργεί μια ιεραρχική οργάνωση εντός ενός όγκου [7], [8]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα ΚΕΠ μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ογκογένεση και συμβάλλουν στην αντοχή ορισμένα άτομα »στη θεραπεία του καρκίνου, η οποία οδήγησε σε υποτροπή του καρκίνου και μετάσταση [9], [10]. Ως εκ τούτου, πιστεύεται ευρέως ότι η αναγνώριση και ο χαρακτηρισμός των CSC ή καρκίνο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με κύτταρο (CSC-LC) μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών. Bussolati et al. εντόπισε πληθυσμό CD105 θετικά καρκινικά κύτταρα έναρξης στη Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης, και ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά με το ρόλο των βλαστικών κυττάρων στο ανθρώπινο RCC [11], [12]. Kim et al. ανέφεραν ότι η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων, Oct4 και CD133, μπορούν να χρησιμεύσουν, αντίστοιχα, ως μια φτωχή και ευνοϊκό προγνωστικό δείκτη, σε θηλώδη RCC [13]. Επιπλέον, πρότειναν ότι η έκφραση του CD133 είναι ένα ευνοϊκό προγνωστικό δείκτη σε σαφείς [14]

Υπάρχουν πολλές αναφορές ότι η CSC-LCs κάποιων συμπαγών όγκων είναι παρόντες στο πλευρό του πληθυσμού (SP) κύτταρα RCC. Κυττάρων [15], [16], αλλά υπάρχουν μόνο λίγες αναφορές σχετικά με το ρόλο των κυττάρων SP σε ανθρώπινα RCC [17], [18]. κύτταρα SP ταυτοποιήθηκαν αρχικά σε ροή κυτταρομετρίας αναλύσεις από την ικανότητά τους να εκρέει ζωτικής χρωστικής DNA, Hoechst 33342, με αποτέλεσμα την Hoechst-αρνητικά κύτταρα SP και Hoechst-θετικά κύτταρα Μη SP (NSP). Προηγούμενες μελέτες των καρκίνων in vitro και πρωτογενείς όγκους in vivo έχουν δείξει ότι τα κύτταρα SP είναι μοναδικά σε θέση να παράγει κυτταρικών πληθυσμών NSP τόσο SP και, εμφανίζουν ιδιότητες σύμφωνες με βλαστικά κύτταρα ή CSC. κύτταρα SP εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα μέλη της οικογένειας μεταφορέα (ABC), ιδιαίτερα ABCG2, και παρουσιάζουν περισσότερο χημειοαντοχή από κύτταρα NSP σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μερικούς ανθρώπινους κακοήθεις συμπαγείς όγκους, όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος των ωοθηκών και καρκίνο πλακωδών κυττάρων [19] – [21]

Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η αφυδρογονάση αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1) είναι υπεύθυνη για την οξείδωση της ρετινόλης στο ρετινοϊκό οξύ και παίζει καθοριστικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και ομοιόσταση. σε διάφορα όργανα [22]. Μερικοί ερευνητές έχουν αναφέρει ότι η υψηλή έκφραση της ΑΙ_ϋΗ1 συσχετίστηκε με αντοχή φαρμάκου και φτωχή πρόγνωση, και ότι ΑΙ_ϋΗ1 είναι δείκτης CSC [23], [24]. Ozbek et al. ανέφεραν ότι η έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 συσχετίστηκε με βαθμό του όγκου σε RCC [25], αλλά τα βιολογικά χαρακτηριστικά του ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε RCC είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε κύτταρα SP από δύο ανθρώπινες κυτταρικές RCC γραμμές και ερευνηθεί συστηματικά τις ιδιότητες CSC των κυττάρων SP και ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα, και η σχέση μεταξύ των κυττάρων SP και ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές και Ζώα

Χρησιμοποιήσαμε δύο κυτταρικές σειρές RCC: μία που προέρχεται από κακοήθη πλευρική έκχυση ενός ασθενή με RCC (ACHN) και το άλλο προέρχεται από πρωτογενή βλάβη ενός ασθενούς με RCC (KRC /Υ). Αυτά τα 2 κυτταρικές σειρές RCC έχουν υψηλή πολλαπλασιαστική και τις ικανότητες σχηματισμού αποικιών

in vitro

και διαθέτουν υψηλή ογκογένεσης με ακόμη γυμνά ποντίκια

in vivo

. ACHN αγοράστηκε από την American Type Culture Collection. KRC /Υ ιδρύθηκε το εργαστήριό μας [26]. Το μέσο καλλιέργειας για ACHN αποτελείτο από τροποποιημένο μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Το μέσο καλλιέργειας για KRC /Y αποτελείτο από τροποποιημένο μέσο Dulbecco (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) συμπληρωμένο με θερμο-απενεργοποιημένο (56 ° C, 30 min) ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS, Bioserum, Vic, Αυστραλία ), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg στρεπτομυκίνη (Gibco BRL /Life Technologies Inc.). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C. Θηλυκό μη παχύσαρκα διαβητικά /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) ποντικούς (ηλικίας 5 εβδομάδων) αγοράστηκαν (Clea Japan, Inc., Osaka, Japan), και στεγάζεται σε ντουλάπια στρωτής ροής κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας κριτική για τα πειράματα σε ζώα των Kurume University School of Medicine.

Η έκφραση της CSC Μαρκαδόροι σε RCC Γραμμές κυττάρων

Αναλύσαμε την έκφραση του υποτιθέμενου CSC δείκτες ABCG2, CD90, CD105, CD133 και επιθηλιακών μορίου προσκόλλησης κυττάρων (EpCAM) στην ACHN και KRC /Υ. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 4 ° C για 30 λεπτά με μονοκλωνικά αντισώματα συζευγμένα με φθορισμό, συμπεριλαμβανομένων ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CD90 συζευγμένο ποντικού (5Ε10, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και αντι-ποντικού -ανθρώπινη αντισωμάτων CD105 (ΜΕΜ-226, EXBIO, Praha, Τσεχία) και φυκοερυθρίνη (ΡΕ) CD133 /2 αντισώματα (293C3, Miltenyi Biotec, Μπέργκις-Γκλάντμπαχ, Γερμανία) και αντι-EpCAM αντίσωμα (EBA-1, BD Biosciences ). Τα κύτταρα με αντι BCRP-μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, USA) επωάστηκαν για 30 λεπτά και επωάζονται περαιτέρω στο σκότος στους 4 ° C για 30 λεπτά με FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). Τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν και αναλύθηκαν σε FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

SP τηλέφωνα Εντοπισμός και CSC Marker Έκφραση σε SP και NSP κύτταρα

Τα καλλιεργημένα κύτταρα με 80 % συμβολή αποσπάστηκαν με Accutase (Τεχνολογίες Innovative Cell, Inc., San Diego, USA) και διακόπτεται στη 1 × 10

6 κύτταρα /mL σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) συμπληρωμένο με 2% FBS και μετά επωάζονται με Hoechest 33342 βαφή μόνο (5 μg /mL για ACHN και 10 μg /mL για KRC /Y) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA) ή με 20 μg /mL ρεσερπίνη (Sigma-Aldrich) στους 37 ° C για 60 min. Τα δείγματα πλύθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 2 ml ψυχρού PBS συμπληρωμένο με 2% FBS, στη συνέχεια, 1 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (BD Biosciences) προστέθηκε και τα κύτταρα διηθήθηκαν μέσω κυτταρικού φίλτρου 40 μm (BD Biosciences). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Reserpine χρησιμοποιείται συμβατικά ως κατευθυντήρια παράμετρος για τον προσδιορισμό του ορίου μεταξύ των κυττάρων SP και NSP. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα FACSAria II (BD Biosciences). Επιπλέον, εξετάστηκε η έκφραση των CD90 και EpCAM σε ACHN, και ότι του CD105 και EpCAM στην KRC /Υ, στην SP και κύτταρα NSP. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω.

Ανάπτυξη Κυττάρων Δοκιμασία SP και NSP Cells

Ένα σύνολο 2000 SP κύτταρα και κύτταρα NSP απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργούνται σε ένα CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 24, 48, 72, 96, 120 ή 144 ώρες και ο πολλαπλασιασμός εξετάστηκε σε χρωματομετρικές αναλύσεις που χρησιμοποιούν 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ-υλ -) – τετραζολίου 2,5-διφαινυλο (ΜΤΤ ) κιτ δοκιμασίας κυτταρική ανάπτυξη (Chemicon, Temecula, CA, USA) όπως περιγράφεται αλλού [28].

αποικίας δοκιμασία σχηματισμού του SP και NSP Cells

Το μαλακό άγαρ αγκυροβόλιο ανεξάρτητη δοκιμασία κλωνογονική ανάπτυξη ήταν εκτελείται. Εν συντομία, 2 χ 10

4 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 2 ml ΕΜΕΜ ή ϋΜΕΜ που περιέχει 0.36% μαλακό άγαρ (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) και 10% FBS σε ένα πιάτο 35 mm. Το κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια επιστρώνεται σε μια presolidified 0,72% σκληρό άγαρ. Το μέσο που περιέχει 0.36% μαλακό άγαρ συμπληρώθηκε μία φορά την εβδομάδα. Αποικίες (& gt? 10 κύτταρα) που προέκυψαν μέσα σε 3 εβδομάδες παρουσιάστηκαν ως ικανότητας κλωνισμού. Πέντε πιάτα εξετάστηκαν για κάθε κυτταρικό τύπο και τυφλά μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (χ 200) σε όλους τους τομείς.

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού του SP και NSP Cells

Απομονωμένα SP και κυττάρων NSP από τα δύο κυτταρικές γραμμές (4000 κύτταρα /τρυβλίο) καλλιεργήθηκαν εντός μέσου χωρίς ορό, συμπεριλαμβανομένων 10 ng mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα /(EGF) (Sankojunyaku, Tokyo, Japan) και 20 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) (Sankojunyaku) χρησιμοποιώντας ultra -Low συνδέσεως 6 φρεατίων (Corning Inc., Corning, ΝΥ, USA) για 1 εβδομάδα, μετά από την οποία ο σχηματισμός σφαίρα αξιολογήθηκε με μέτρηση του αριθμού των σφαιρών (& gt? 3 κύτταρα). κάτω από μικροσκόπιο (χ 200)

Δοκιμασία αντίστασης φαρμάκου

Απομονωμένα SP και NSP κύτταρα φυτεύονται σε 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, και η επίδραση της αναστολέας πολλαπλών κινασών Sorafenib (2 μΜ) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, ΜΑ, USA) και ΙΡΝα (4000 IU /mL) (OIF, εξετάστηκε Otsuka Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan). αντίσταση φαρμάκου προσδιορίστηκε μετά τη θεραπεία για 72, 96 ή 144 ώρες με την δοκιμασία ΜΤΤ.

Ογκογονικότητα Αναλύσεις των SP και NSP κύτταρα in vivo

Για να εξερευνήσετε ογκογόνο ικανότητα, SP και κύτταρα NSP (1, 10 ή 100 × 10

3) απομονώθηκαν από τις δύο κυτταρικές γραμμές RCC, τοποθετήθηκαν σε 100 μικρόλιτρα μέσου, και ξεχωριστά ενέθηκαν στον υποδόριο χώρο στο πλευρό του πέντε-εβδομάδων θηλυκά NOD ποντίκια /SCID υπό αναισθησία. Ογκογόνο ικανότητα κρίθηκε 8 εβδομάδες μετά την ένεση.

cDNA Προετοιμασία και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR για την έκφραση γονιδίων Δοκιμασία

Μετά την SP και NSP κύτταρα ACHN και KRC /Υ απομονώθηκαν, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), και συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR) διεξήχθη για να εξεταστεί η έκφραση γονιδίων ιδιοκτησίας που σχετίζονται CSC-LC (π.χ., γονίδια ABC μεταφορέα (ABCB1 και ABCG2), γονίδια αυτο-αντιγραφής (BMI1 και c-MYC), γονίδια αντι-απόπτωση (BCL2 και CFLAR), τα γονίδια που σχετίζονται με υποξία (υποξία διεγέρσιμο παράγοντα 1α (HIF1α) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα-Α (VEGFA)) και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ)-σχετικών γονιδίων (σαλιγκάρι και Twist) ) με ένα ΑΒΙ PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης και μείγματα εκκινητών και ανιχνευτών χρησιμοποιήθηκαν για ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, BMI1, c-myc, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, σαλιγκάρι, Twist, και β-ακτίνη (αναγνωριστικά δοκιμασία (Hs 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, και Hs99999903_m1, αντίστοιχα? Applied Biosystems), και συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν ως ακολούθως: αρχική επώαση στους 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλους εναλλασσόμενης κατά σειρά με 95 ° C για 10 s, 60 ° C για 20 s, και 72 ° C για 15 s, και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους 72 ° C για 10 λεπτά.

Συγκριτική ανάλυση έκφρασης γονιδίου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

(- ΔΔCt) μεθόδους με κανονικοποίηση προς το επίπεδο της γονιδιακής εσωτερικού ελέγχου, β-ακτίνη

ΑΙ_ϋΗ1 έκφραση σε SP και NSP κύτταρα και σε κύτταρα υπό συνθήκες Παθολογικός

έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 διερευνήθηκε σε. δείγματα που παρασκευάζονται από SP και κύτταρα NSP, κύτταρα αγωγής με φάρμακο, και τα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από υποξικές συνθήκες. Εν συντομία, SP και NSP κύτταρα απομονώθηκαν από ACHN και κύτταρα KRC /Y καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω. Γονικών κυττάρων και απομονωμένα SP και τα κύτταρα NSP χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα. κύτταρα ACHN καλλιεργήθηκαν με ΕΜΕΜ που περιέχει Sorafenib (1 μΜ) ή ΙΡΝα (4000 IU /m) για 48, 72 ή 96 ώρες και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό υποξικές (1% O

2) συνθήκες για 48, 72 ή 96 ώρες ήταν χρησιμοποιούνται επίσης ως δείγματα. Τα δείγματα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ALDEFLUOR υπόστρωμα που περιέχει ΑΙ_ϋΗ, ΒΑΑΑ (Bodipy-αμινοακεταλδεΰδης) (50 μg ξηρού αντιδραστηρίου), με ή χωρίς 5 μΐ του ειδικού diethylaminobenzaldehyde αναστολέα ΑΙ_ϋΗ (ϋΕΑΒ 1.5 mM σε 95% διάλυμα αποθέματος αιθανόλης), ως αρνητικό ελέγχου, και επωάστηκαν για 60 λεπτά στους 37 ° C (ALDEFLOUR KIT, βλαστικά κύτταρα τεχνολογιών, Vancouver, BC, Canada), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FCM).

Βιολογική Χαρακτηριστικά του ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ALDH1- αρνητικά κύτταρα

δοκιμασία σχηματισμού

Σφαίρα πραγματοποιήθηκε σε ACHN και κύτταρα KRC /Υ. δοκιμασία Ογκογονικότητα και προσδιορισμός γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν για να εξετάσει βιολογικά χαρακτηριστικά του ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα ACHN. Για να συγκριθεί η ικανότητα αυτο-ανανέωσης μεταξύ ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και αρνητικών ΑΙ_ϋΗ1 κύτταρα ACHN, εξετάσαμε μια ικανότητα σχηματισμού σφαίρας με τρεις διαδοχικές σειριακές διελεύσεις των κυττάρων μονού διασπώνται σύμφωνα με τη μέθοδο του Lim et al. [29]. Εν συντομία, μετά διαχωρίζοντας την πρώτη σφαίρα πέρασμα με 0,25% θρυψίνη, τα κύτταρα μονής διασπώνται σε ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα του ACHN επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μία εβδομάδα αργότερα, ο αριθμός των σφαιρών μετρήθηκε και η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε άλλη μια φορά. δοκιμασία Ογκογονικότητα και προσδιορισμός γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω, εκτός από τη σύγκριση σε 1 × 10

3 κύτταρα δεν εκτελέστηκε στην δοκιμασία ογκογονικότητας.

Στατιστική Ανάλυση

Σύγκριση της κυτταρικής ανάπτυξης δοκιμασίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο παράγοντα παραγοντική ANOVA, και εκείνων της δοκιμασίας αποικίας σχηματισμού, δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας, και δοκιμασία ανθεκτικότητας στα φάρμακα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. Οι άλλες συγκρίσεις δεδομένα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U. Η τιμή του

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση της CSC Μαρκαδόροι

ACHN εξέφρασε CD90 (96,9%) και EpCAM (. 87,7%), αλλά η έκφραση του CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) και ABCG2 (0,9%) παρέμεινε σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Από την άλλη πλευρά, KRC /Υ εκφράζεται CD105 (28.9%) και EpCAM (93,0%), αλλά η έκφραση του CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), και ABCG2 (2,9%) ήταν πολύ χαμηλή.

SP Cells ανάλυση και η έκφραση της CSC Μαρκαδόροι σε SP και NSP κύτταρα

Τα κλάσματα κυττάρων SP σε ACHN και KRC /Υ ήταν 1,4% και 1,7%, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση των δεικτών CSC, όπως CD90 και EpCAM σε ACHN, και CD105 και ΕρΟΑΜ σε KRC /Υ, σε SP και τα κύτταρα NSP. Δεν υπήρχε εμφανής διαφορά σε CD90 και της έκφρασης EpCAM μεταξύ SP και κύτταρα NSP στο ACHN. Παρά το γεγονός ότι δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση EpCAM μεταξύ SP και κύτταρα NSP στην KRC /Υ, έκφραση CD105 σε κύτταρα SP (24,6%) ήταν πολύ υψηλότερο από ό, τι στα κύτταρα NSP (4,6%) (Εικ. 1Β).

(Α) και ACHN KRC /Υ σημάνθηκαν με Hoechst 33342, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με FCM. Τα ποσοστά SP κυττάρων σε ACHN και KRC /Υ ήταν 1,4% (Α-Α) και 1,7% (Α-C), αντίστοιχα, η οποία μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του ρεσερπίνης (Α-Β, Α-δ). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές για κάθε κυτταρική σειρά και σχεδόν ελήφθησαν τα ίδια αποτελέσματα. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των πειραμάτων μας παρουσιάζεται. (Β) Δεν υπήρχε καμία εμφανής διαφορά σε CD90 και της έκφρασης EpCAM μεταξύ SP και κύτταρα NSP στο ACHN. Στην κυτταρική σειρά KRC /Υ, αν και δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση EpCAM, τα κύτταρα SP εξέφρασε υψηλότερο ποσοστό CD105-θετικών κυττάρων από κύτταρα NSP (SP vs NSP: 24,6% έναντι 4,6%). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές και σχεδόν ελήφθησαν τα ίδια αποτελέσματα. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των πειραμάτων μας παρουσιάζεται.

Η

Βιολογικές Λειτουργίες των SP και NSP κύτταρα σε ACHN και KRC /Υ in vitro

Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων και κλωνογενοποιήσεως μεταξύ SP και κύτταρα NSP στο ACHN. Από την άλλη πλευρά, μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες, τα κύτταρα SP σε KRC /Υ είχαν σημαντικά υψηλότερη πολλαπλασιαστική ικανότητα από ό, τι τα κύτταρα NSP (

P

& lt? 0,0001) (Εικ. 2Α). Αν και SP κύτταρα σε KRC /Υ είχαν σημαντικά υψηλότερο κλωνογενοποιήσεως από τα κύτταρα NSP (

P

& lt? 0,01) (Εικ. 2Β), δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη σφαίρα ικανότητα σχηματισμού μεταξύ SP και κύτταρα NSP στην KRC /Y. Αντίθετα, τα κύτταρα SP σε ACHN είχαν σημαντικά υψηλότερη ικανότητα σχηματισμού σφαίρα από κύτταρα NSP (Σχ. 2C). Μετά από 72, 96 ή 144 ώρες επίδρασης Sorafenib ή ΙΡΝα, η ευαισθησία σε κάθε φάρμακο εκτιμήθηκε με την ΜΤΤ δοκιμασία. Δεν υπήρχε διαφορά στην ευαισθησία μεταξύ των κυττάρων SP και κύτταρα NSP στην KRC /Υ κατά Sorafenib ή ΙΡΝα θεραπεία. Ωστόσο, τα κύτταρα SP σε ACHN είχαν σημαντικά υψηλότερη αντίσταση ΙΡΝα (

P

& lt? 0,0001). (Εικ. 2D)

(Α) καμπύλες ανάπτυξης των SP και κυττάρων NSP. SP κύτταρα σε KRC /Υ έδειξε μεγαλύτερη πολλαπλασιαστική ικανότητα σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP (*

P

& lt? 0,0001). (Β) Η clonogenity ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα SP στην KRC /Υ (*

P

& lt? 0,01). (Γ) Σφαίρα ικανότητα σχηματισμού ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα SP σε ACHN (*

P

& lt? 0,05). (Δ) Η αντοχή στα φάρμακα των SP και κυττάρων NSP θεραπεία με sorafenib ή ΙΡΝα. SP κύτταρα σε ACHN είχαν μεγαλύτερη αντοχή ΙΡΝα (*

P

& lt? 0,0001). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές και ελήφθησαν σχεδόν τα ίδια αποτελέσματα.

Η

Ογκογονικότητα Δοκιμασίες in vivo σε SP και NSP Cells

Τόσο SP και κυττάρων NSP έδειξαν καρκινικά ικανότητα σχηματισμού σε κάθε ένα από τα δύο κυτταρικές γραμμές RCC. Η αναλογία μεταξύ ογκογονικότητας SP και NSP κύτταρα σε ACHN και KRC /Υ δεν ήταν σημαντικά διαφορετική, αλλά η ογκογονικότητα των κυττάρων SP ήταν ελαφρώς υψηλότερο από εκείνο των κυττάρων NSP σε ACHN (Πίνακας 1).

Η

ανάλυση της CSC-LC Ακίνητα που σχετίζονται με Gene Expression στο SP και NSP κύτταρα από qRT-PCR

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του mRNA των γονιδίων μεταφορέα ABC (ABCB1 και ABCG2), γονίδια αυτο-αναπαραγωγή (BMI- 1 και c-myc), τα γονίδια αντι-απόπτωση (BCL2 και CFLAR), τα γονίδια που σχετίζονται με υποξία (VEGFA και HIF1α), και ΕΜΤ-σχετιζόμενα γονίδια (σαλιγκάρι και Twist) μεταξύ SP και κυττάρων NSP στις κυτταρικές γραμμές 2. SP κύτταρα σε ACHN εξέφρασαν ελαφρώς υψηλότερο επίπεδο από ό, τι ALDH1A1 mRNA κυττάρων NSP, αλλά καμία εμφανής διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε KRC /Υ (Εικ. 3).

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του mRNA των γονιδίων μεταφορέα ABC (ABCB1 και ABCG2), γονίδια αυτο-αναπαραγωγή γονίδια (ΒΜΙ-1 και C-MYC), αντι-απόπτωση (BCL2 και CFLAR), γονίδια υποξία που σχετίζονται με (VEGFA και HIF1α), και ΕΜΤ-σχετιζόμενα γονίδια (σαλιγκάρι και Twist) μεταξύ SP και κυττάρων NSP στις κυτταρικές γραμμές 2. SP κύτταρα σε ACHN εξέφρασαν ελαφρώς υψηλότερο επίπεδο ALDH1A1 mRNA από κύτταρα NSP, αλλά καμία εμφανής διαφορά παρατηρήθηκε στην KRC /Υ. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τέσσερις φορές για κάθε κυτταρική σειρά και σχεδόν ελήφθησαν τα ίδια αποτελέσματα.

Η

Έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, και βιολογικά χαρακτηριστικά του ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και αρνητικών ΑΙ_ϋΗ1-RCC Cells

το ποσοστό των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 θετικά στα κύτταρα KRC /Υ ήταν 6,5%. Δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 μεταξύ SP και κυττάρων NSP. Σε κύτταρα ACHN, το ποσοστό των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1-θετική ήταν 15,3%. Επίσης, ο αριθμός των κυττάρων SP ΑΙ_ϋΗ1-θετικά (32.7%) ήταν υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων NSP (14,6%) (Σχ. 4Α). Η ανάπτυξη των κυττάρων ήταν σημαντικά κατέστειλε σε κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή ΙΡΝα και σε κύτταρα που εκτίθενται σε υποξία, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4Β). Όσον αφορά την έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, δεν υπήρχε εμφανής διαφορά στα ποσοστά των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1-θετικά μεταξύ των κυττάρων ελέγχου, κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή ΙΡΝα, και τα κύτταρα που εκτίθενται σε υποξικά προϋπόθεση για 48 ώρες. Ωστόσο, το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων αυξήθηκε κατά χρονολογική σειρά, ειδικά σε κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή εκτεθεί σε συνθήκες υποξίας. Συγκεκριμένα, μετά από έκθεση σε Sorafenib ή ΙΡΝα ή υποξία για 96 ώρες, τα ποσοστά των ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων ήταν 40,0%, 19,2% και 37,1%, αντίστοιχα (Εικ. 4C).

(Α) Η έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 στα κύτταρα SP και κύτταρα NSP στο ACHN και KRC /Υ. Τα ποσοστά των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 θετικά στην ACHN και KRC /Υ ήταν 15,3% και 6,5%, αντίστοιχα. (Β) Σύγκριση της ανάπτυξης των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων ελέγχου, κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή ΙΡΝα, και τα κύτταρα που εκτίθενται σε υποξία σε ACHN. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε στα 48, 72 ή 96 ώρες μετά τη φαρμακευτική αγωγή ή έκθεση σε υποξία. Η ανάπτυξη των κυττάρων μετά από φαρμακευτική αγωγή ή έκθεση σε υποξία κατεστάλη σημαντικά σε σύγκριση με τον έλεγχο (*

P

& lt? 0.005, **

P

& lt? 0,0001 έναντι του ελέγχου). (Γ) Το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή ΙΡΝα ή κύτταρα που εκτέθηκαν σε υποξία για 48, 72 ή 96 ώρες. Το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε κύτταρα κατεργασμένα με Sorafenib ή ΙΡΝα ή κύτταρα που εκτέθηκαν σε υποξία για 96 ώρες ήταν υψηλότερες σε σύγκριση με την κανονική κατάσταση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές και σχεδόν ελήφθησαν τα ίδια αποτελέσματα. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των πειραμάτων μας παρουσιάζεται. (D) Σφαίρα ικανότητα σχηματισμού μεταξύ ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα. Ο σχηματισμός σφαίρα του ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε ACHN και KRC /Υ ήταν υψηλότερη από εκείνη των ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικών κυττάρων. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές και ελήφθησαν σχεδόν τα ίδια αποτελέσματα.

Η

Η σφαίρα ικανότητα σχηματισμού ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων στις δύο ACHN και KRC /Υ ήταν υψηλότερη από εκείνη των ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικών κυττάρων. Επιπλέον, ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε ACHN δημιουργούνται σημαντικά μεγαλύτερα μεγέθη σφαίρα από ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα (Σχ. 4D). Επίσης, βρήκαμε ότι τα κύτταρα μονής διασπώνται σφαίρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 4000 κυττάρων ανά φρεάτιο προκάλεσαν δευτερογενή και τριτογενή σφαίρες μέσα σε 1 εβδομάδα από τη σπορά. Αν και ο αριθμός των σφαιρών αποδείχθηκε ότι ελαττώνει στο δεύτερο και τρίτο διόδους σε σύγκριση με την πρώτη δίοδο, η σφαίρα ικανότητα σχηματισμού ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε ACHN διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια του δεύτερου και τρίτου περάσματα. Από την άλλη πλευρά, ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα σχηματίζονται μερικά δευτεροβάθμιας σφαίρες (Εικ. 5).

Η σφαίρα ικανότητα σχηματισμού ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων σε ACHN διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια του δεύτερου και τρίτου δίοδοι (*

P

& lt?. 0.0001)

η

σχηματισμό όγκων παρατηρήθηκε σε τρεις από τις πέντε και πέντε πέντε ποντίκια ένεση με 10 × 10

3 και 100 × 10

3 ALDH1- θετικών κυττάρων, αντίστοιχα, στις 8 εβδομάδες. Ωστόσο, ΑΙ_ϋΗ1 αρνητικών ένεση κυττάρων αναπτύχθηκε κανένα ορατό όγκων σε όλους τους ποντικούς από αυτή τη φορά (Πίνακας 2).

Η

qRT-PCR σε ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα ACHN

πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR για να συγκρίνετε την έκφραση του γονιδίου ιδιοκτησίας που σχετίζονται με CSC-LC σε ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα ACHN. ΑΙ_ϋΗ1-θετικών κυττάρων εξέφρασαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του mRNA σε όλα τα γονίδια, εκτός από Σαλιγκάρι ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα. Τα επίπεδα της αύξησης ήταν ως ακολούθως: ABCB1, 4,9-φορές? ABCG2, 2.5 φορές, ALDH1A1, 4,8 φορές? BCL2, 5,0 φορές? CFLAR, 4,1 φορές? ΒΜΙ-1, 3,9-φορές? c-myc, 3.9-φορές? HIF1α, 3,4 φορές? VEGFA, 2,7 φορές? Twist, 4,0 φορές (Εικ. 6).

ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα έδειξαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του mRNA του ALDH1A1, τα γονίδια που σχετίζονται με μεταφορέα (ABCB1 και ABCG2), γονίδια αυτο-αντιγραφής (ΔΜΣ-1 και C- MYC), τα γονίδια αντι-απόπτωση (BCL2 και CFLAR), τα γονίδια που σχετίζονται με υποξία (HIF1α και VEGFA) και ΕΜΤ-σχετιζόμενα γονίδια (Twist) από ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα σε ACHN. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA του σαλιγκαριού μεταξύ ΑΙ_ϋΗ1-θετικών και ΑΙ_ϋΗ1-αρνητικά κύτταρα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τέσσερις φορές, και σχεδόν ελήφθησαν τα ίδια αποτελέσματα.

Η

Συζήτηση

Δεδομένου ότι η έννοια CSC προτάθηκε για να εξηγήσει την ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων, ΚΕΠ ή CSC- LCs έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου. Σε γενικές γραμμές, ΚΕΠ κατέχουν τόσο αυτο-ανανέωσης και δυνατότητες διαφοροποίησης επιτρέποντας CSC να αναδημιουργήσει μερικώς την κυτταρική ετερογένεια της γονικής όγκου. Ένας αριθμός μελετών έχουν αναφέρει ότι η αδυναμία των συμβατικών θεραπειών για την πρόληψη της επανεμφάνισης ή μεταστάσεις οφείλεται στην παρουσία μικρών υποσύνολα των ανθεκτικών κυττάρων, δηλαδή ΚΕΠ [8], [30]. Τα τελευταία χρόνια η τεχνική SP έχει γίνει ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα μεθόδους απομόνωσης CSC-LCs. Από τη λεπτομερή μέθοδο χρώσης και μέτρηση του Goodell et al. εισήχθη για πρώτη φορά, πολλοί ερευνητές έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα SP είναι ένα υποσύνολο των κυττάρων με υψηλότερο βαθμό κακοήθειας, και τα χαρακτηριστικά CSC-LCs [15], [16], [31]. Όσον αφορά το RCC, Addla et al. ανέφεραν ότι τα κύτταρα SP αντιπροσώπευαν το 4-6% του συνόλου των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, τα κυτταρικά χαρακτηριστικά των κυττάρων SP δεν είναι καλά κατανοητοί [17].

Στην παρούσα μελέτη μας διαπιστώσαμε ότι τα κλάσματα SP σε ACHN και KRC /Υ ήταν 1,4% και 1,7%, αντίστοιχα. Δεν υπήρχε διαφορά μεταξύ KRC /Υ SP και κυττάρων NSP σε ογκογονικότητας, σχηματίζοντας σφαίρα ικανότητα, ή σε αντίσταση σε Sorafenib ή ΙΡΝα, τα οποία χρησιμοποιούνται συμβατικά για τη θεραπεία του προχωρημένου RCC. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα KRC /Υ SP δεν έχουν τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ-LCs. Σε αντίθεση, ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων ACHN SP και NSP στις in vitro δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου ή το σχηματισμό αποικιών, τα κύτταρα SP έδειξε μια υψηλότερη σφαίρα ικανότητα σχηματισμού, υψηλότερη αντοχή ΙΡΝα και υψηλότερες καρκινογέννεση σε NOD /SCID ποντικούς από κύτταρα NSP , υποδηλώνουν κύτταρα με ιδιότητες CSC-LC περιλαμβάνονται στα κύτταρα SP ACHN. Επί του παρόντος, η προσέγγιση SP είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό των δεικτών CSC, ωστόσο πολλοί ερευνητές εξακολουθούν να αμφισβητούν τη σχέση μεταξύ των κυττάρων SP και ΚΕΠ [32] – [34]. Επιπλέον, Ibrahim et al. μελέτησαν τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης χρώση Hoechst και ο χρόνος επώασης και ανέφερε ότι η συγκέντρωση χρώση Hoechst είχε επίδραση στην κυτταρική βλάβη [35]. Στη παρούσα μελέτη μας, προκειμένου να εντοπιστούν τα κύτταρα SP στον ACHN και KRC /Υ χρησιμοποιήσαμε χρώση Hoechst σε συγκέντρωση 5 μg /mL και 10 μg /mL, αντίστοιχα. χρώση Hoechst γενικά διεξάγεται σε συγκέντρωση 5 μg /mL, αλλά στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε μία υψηλότερη συγκέντρωση στα κύτταρα KRC /Y [36]. Έτσι, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε εντελώς το ενδεχόμενο ότι κυτταρικές βλάβες που οφείλονται σε χρώση Hoechst ήταν υπεύθυνος για τη διαφορά σε βιολογικά χαρακτηριστικά που παρατηρούνται μεταξύ των κυττάρων KRC /Υ in vivo και in vitro στην τρέχουσα μελέτη μας.

Bussolati et al. έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σε μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή RCC που CD105-θετικά κύτταρα αντιπροσώπευε μια ομάδα κυττάρων με υψηλή κλωνογονικότητας και υψηλή ογκογονικότητα? Ωστόσο, παρούσα μελέτη μας διαπίστωσε ότι ενώ τα κύτταρα KRC /Υ SP περιείχε περίπου πέντε φορές περισσότερα CD105-θετικών κυττάρων, όπως κύτταρα KRC /Υ NSP, δεν υπήρχαν διαφορές στις ιδιότητες CSC-LC μεταξύ KRC /Υ SP και κύτταρα NSP. Επιπλέον, η έκφραση CD105 βρέθηκε σε λίγα κύτταρα στο ACHN. Έτσι, η σημερινή αποτελέσματά μας έρχονται σε σύγκρουση με τα ευρήματα της Bussolati et al., Και υποδηλώνουν την πιθανότητα ότι CD105 δεν μπορεί να είναι μια καθολική δείκτη CSC στο RCC.

Πολλές πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα SP δείχνουν μια υψηλότερη έκφραση της ABC μεταφορείς, ιδιαίτερα ABCG2, από ό, τι τα κύτταρα NSP σε πολλούς συμπαγείς όγκους και κυτταρικές γραμμές, και ότι αυτό μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην εκροής φαρμάκου και την αντίσταση του φαρμάκου. Η έκφραση των μεταφορέων ναρκωτικών μέσω ABCG2 είναι ένας σημαντικός δείκτης για τον εντοπισμό και την ανάλυση των κυττάρων SP [19], [20], [31], [37]. Στη παρούσα μελέτη μας, παρατηρήσαμε καμία διαφορά στην έκφραση ABCG2 στο επίπεδο του mRNA μεταξύ SP και κυττάρων NSP σε καμία από τις δύο κυτταρικές γραμμές RCC που μελετήθηκαν. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα SP εκφράζουν άλλους μεταφορείς, όπως ABCB1 και ABCB5, εκτός από ABCG2 [38], [39]. Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να οφείλεται στην έκφραση των άλλων μεταφορέων στα κύτταρα SP, ή μπορεί να είναι επειδή οι λειτουργίες του ABCB1 και ABCG2 δεν αντανακλάται από την έκφραση του mRNA αυτών των γονιδίων. Το σημείο αυτό πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω.

Στη συνέχεια, προκειμένου να μελετήσουν άλλους δείκτες CSC, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία Aldefluor. ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστηριότητα έχει αναγνωριστεί τα τελευταία χρόνια ως γενικός δείκτης, τόσο φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων και ΚΕΠ [40], [41]. ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα έχουν χαρακτηριστικά CSC-LC, όπως την ικανότητα να αυτο-αναπαραγωγή και να σχηματίσουν όγκους, έτσι ένας αριθμός ερευνητών έχουν χρησιμοποιήσει ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστηριότητα ως δείκτη CSC σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του ήπατος, του παγκρέατος , του προστάτη, της ουροδόχου κύστης, του μαστού και κακοήθους μελανώματος [42] – [46]. Έχει επίσης αναφερθεί σε μαστού και διάφορα άλλα είδη καρκίνου που έκφραση υψηλού ΑΙ_ϋΗ1 συνδέεται στενά με την κακή κλινική πρόγνωση [23]. Πρόσφατα, αναλύσεις σχηματισμού σφαίρας έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση της ικανότητας αυτο-ανανέωση της CSC-LCs.