Αφηρημένο

Η ανάπτυξη και η καθοδήγηση των πολλών αξόνων στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος απαιτούν νετρίνη μεσολάβηση ενεργοποίηση των διαγράφεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου (DCC) και άλλα ακόμα άγνωστη συνθήματα σηματοδότησης. Commissural ελαττώματα καθοδήγηση νευραξόνων είναι πιο σοβαρή σε

DCC

μεταλλαγμένα ποντίκια από

Οι νετρίνη-1

μεταλλαγμένα ποντίκια, προτείνοντας επιπλέον σήματα ενεργοποίησης DCC εκτός νετρίνη-1 που εμπλέκονται στην σωστή ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων. Εδώ αναφέρουμε ότι οθόνες αλληλεπίδρασης στην εξωκυττάρια μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών που αντιπροσωπεύουν πάνω από 1.000 πρωτεΐνες που εξατομικεύονται σερεμπελίνη 4 (CBLN4), ένα μέλος του παράγοντα νέκρωσης C1q-όγκου (TNF) της οικογένειας, και νετρίνη-1 ως εξωκυττάριο εταίρους DCC-δεσμευτική. μελέτες δέσμευσης ανοσοφθορισμού και ραδιο-συνδετήρα καταδεικνύουν ότι νετρίνη-1 ανταγωνίζεται με δεσμευτικές CBLN4 σε επικαλυπτόμενη θέση εντός των περιοχών φιμπρονεκτίνης πλησίον της μεμβράνης (FN) 4-6 DCC και προσδένεται με ~ 5-φορές υψηλότερη συγγένεια. CBLN4 συνδέεται επίσης με τον ομόλογο DCC, νεογενίνη-1 (NEO1), αλλά με χαμηλότερη συγγένεια σε σύγκριση με DCC.

CBLN4

-null ποντίκια δεν παρουσιάζουν κάποιο ελάττωμα στο commissural άξονες της ανάπτυξης του νωτιαίου μυελού, αλλά έκανε εμφανίσει μια παροδική αύξηση του αριθμού των περιπλάνηση νευραξόνων στο βραχιόνιο πλέγμα, σύμφωνα με έναν ρόλο στην καθοδήγηση του νευράξονα. Συνολικά, τα δεδομένα στερεοποιείται CBLN4 ως καλόπιστη συνδέτη DCC και ενισχύει την εμπλοκή της στην καθοδήγηση άξονα

Παράθεση:. Haddick PCG, Τομ Ι, Luis Ε, Quiñones G, Wranik BJ, Ramani SR, et al. (2014) Ο καθορισμός της ρίζας Ιδιαιτερότητα της διαγράφεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου Receptor (DCC). PLoS ONE 9 (1): e84823. doi: 10.1371 /journal.pone.0084823

Επιμέλεια: Brian Key, Σχολή Βιοϊατρικών Επιστημών, το Πανεπιστήμιο του Κουίνσλαντ, Αυστραλία

Ελήφθη: 9, Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 20, Νοεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Haddick et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Όλα χρηματοδότηση για την έρευνα αυτή είχε προβλεφθεί από την Genentech, ένα μέλος της ομάδας Roche. Ο χρηματοδότης είχε ρόλους στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Όλοι οι συγγραφείς είναι ή έχουν απασχοληθεί από την Genentech /Roche και μπορεί να κατέχει μετοχές της εταιρείας. Όλες οι χρηματοδοτήσεις για την έρευνα αυτή δόθηκε από την Genentech /Roche. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Επέκταση των νευραξόνων προς τον τελικό στόχο τους, αποτελεί βασική προϋπόθεση για τη σωστή ανάπτυξη του νευρικό σύστημα. Νευράξονες αντιμετωπίζουν συνθήματα καθοδήγησης κατά μήκος των οδών ανάπτυξή τους, συμπεριλαμβανομένων των τεσσάρων μεγάλων οδών κανονικά σηματοδότησης: DCC-UNC5-νετρίνη-1, σχισμή-Roundabout (Robo), Σημαφορίνης-Plexin-νευροπιλίνη, και Ephrin-Εφεσ [1] – [3]. Ωστόσο, υπάρχει αυξανόμενη εκτίμηση ότι επιπλέον μόρια συμβάλλουν σε αυτή τη διαδικασία, καθώς και [4], [5]. Για να κατανοήσουμε καλύτερα την ανάπτυξη νευραξόνων και καθοδήγηση, θα είναι σημαντικό να καθοριστεί το ρεπερτόριο των πρωτεϊνών που δεσμεύουν και να αλληλεπιδρούν με αυτά τα βασικά συστατικά της σηματοδότησης.

Εδώ θα επικεντρωθούν στον προσδιορισμό πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν για DCC. DCC είναι μέλος 175-190 kDa της Ig υπεροικογένειας αποτελείται από ένα μόνο διαμεμβρανική περιοχή και μία μεγάλη εξωκυτταρική περιοχή (ECD) που περιέχει τέσσερις C2 τομείς που ομοιάζουν της Ig και έξι ΡΝΙΙΙ τομείς [6] – [8]. DCC έχει πρόσφατα αναφερθεί δεσμεύοντας την εκκρίνεται Draxin συνδέτη στην μεσολάβηση των νευραξόνων αναστολή έκφυσης [9]. Ωστόσο, η καλύτερη χαρακτηρισμένη συνδέτη του DCC είναι νετρίνη-1, μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη που αποτελείται από μια σφαιρική επικράτεια VI, έναν τομέα V με τρία EGF επαναλήψεις, και ένα Ο-τερματικό πεδίο της άγνωστης λειτουργίας [10]. Αν και η ακριβής θέση νετρίνης-1 σύνδεση προς DCC δεν είναι γνωστή, είναι απαραίτητη η πέμπτη επανάληψη του ΡΝΙΙΙ DCC [11], [12].

Drosophila

, μεταλλάξεις του DCC ομόλογο

εξοντώσει

να οδηγήσει σε πιο σοβαρές ατέλειες καθοδήγηση άξονα μεσαία γραμμή από το

netrinAB

μεταλλάξεις και αυτό είναι εν μέρει διασωθεί από

commissureless

ανεξάρτητα από νετρίνης και υποδηλώνουν ένα επιπλέον εξοντώσει συνδέτη [13 ]. Ομοίως, knock-out είτε

DCC

ή

νετρίνη-1

σε ποντίκια οδηγεί σε μια αποτυχία της commissural άξονες για να διασχίζουν τη μέση γραμμή της σπονδυλικής στήλης, αλλά η σοβαρότητα των ελαττωμάτων commissural άξονα στην ανάπτυξη του νωτιαίου μυελού είναι μεγαλύτερες σε

DCC

knock-out ποντίκια σε σύγκριση με το

νετρίνη-1

μεταλλαγμένα ποντίκια [14], [15]. Αν και δεν υπάρχει ένα ομόλογο θηλαστικών του

commissureless

, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την άποψη ότι υπάρχουν επιπλέον συνδέτες που ρυθμίζουν δραστηριότητα DCC σε σπονδυλωτά.

Εδώ αναφέρουμε, χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη μεγάλης κλίμακας σε πρωτεΐνες οθόνη μικροσυστοιχίας, ότι εκτός από την νετρίνη-1, CBLN4 είναι ένα εξαιρετικά ειδικό συνδέτη για DCC. Τα τέσσερα μέλη της οικογένειας CBLN, CBLN1-4, εκκρίνονται, γλυκοσυλιωμένες πρωτεΐνες που περιέχουν μια C-τερματική σφαιρική περιοχή χαρακτηριστικές C1q του C1q-TNF υπεροικογένειας [16], και εκφράζονται στις αναπτυσσόμενες και ενήλικο εγκέφαλο [17] . CBLN1 και CBLN2 είναι τα καλύτερα κατανοητά τα μέλη της οικογένειας CBLN και έχουν βρεθεί να σταθεροποιεί συνάψεις δρώντας ως trans-συναπτική σύνδεση, δέσμευση με β-Neurexins νευρώνων κοκκίων και δέλτα 2 υποδοχέων γλουταμινικού των κυττάρων Purkinje στην παρεγκεφαλίδα [18] – [21]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για το λειτουργικό ρόλο της CBLN4 και δεν υπάρχει στρέφω συμπεριφοράς φαινότυπο σε ένα

CBLN4

knock-out του ποντικιού [22]. Πρόσφατα, μια ανεξάρτητη μελέτη προσδιόρισε επίσης DCC ως δεσμευτική πρωτεΐνη CBLN4 χρησιμοποιώντας μια πιο περιορισμένη υποψήφιο που βασίζεται οθόνη [22]. Έχουμε χαρακτηρίζεται περαιτέρω την αλληλεπίδραση DCC-CBLN4 και προσδιόρισε μια παροδική περιπλάνηση-άξονα φαινότυπο στο βραχιόνιο πλέγμα του ποντικού

CBLN4

knock-out.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση ηθικής

Η Genentech Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και χρήση Επιτροπή ενέκρινε όλες τις μελέτες σε ζώα.

Κλωνοποίηση και έκφραση πρωτεΐνης

κατασκευάσματα έκφρασης παράχθηκαν με πρότυπες μεθόδους PCR χρησιμοποιώντας ένα in-house συλλογή κλώνο ή cDNA αγοράστηκε από ΟηΟεηε ως εκμαγείο και υποκλωνίστηκε μέσα σε φορέα pRK5 που περιέχει το κατάλληλο Ν-τερματικό ή C-τερματικό επισύναψη επιτόπου. Οι μεταλλάξεις για μελέτες χαρτογράφησης τομέα DCC έγιναν με την XL τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κιτ γρήγορης αλλαγής II (Stratagene). Όλες οι κατασκευές ήταν ακολουθία επαληθεύεται πριν από τη χρήση. Ν-τερματική Flag-ετικετοποιημένη (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKDYKDDDDKLE), πλήρους μήκους και διαγραφή κατασκευάσματα για ανθρώπινη DCC είναι ως ακολούθως: Flag-DCC πλήρους μήκους (H26-I1442)? Σημαία-DCC Ig1-4 (H26-S425-BamH1-L1098-I1442)? Σημαία-DCC FN1-6 (S426-I1442), σημαία-DCC FN4-6 (E722-I1442). κατασκευάσματα έκφρασης πρωτεΐνης δημιουργήθηκαν με τη διαλυτή (Ο-τερματικό πεδίο διαγράφεται) [7] ανθρώπινα νετρίνη-1 (G25-K453) με ένα Ν-τερματικό gD-tag (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLLE), ανθρώπινο CBLN4 (Μ1-L201) με ένα Ο-τερματικό FC tAG και την εξωκυτταρική περιοχή του ανθρώπινου DCC (Μ1-N1097) με ένα C-τερματικό Fc ετικέτα. Πλήρεις αλληλουχίες αμινοξέων παρέχονται στον Πίνακα S1.

Οι πρωτεΐνες εκφράστηκαν σε κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) και καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες καθαρίστηκαν από παροδική διαμόλυνση media με προσρόφηση κατά παρτίδες επάνω σε αντι-Flag ή ρητίνη αντι-αϋ αγαρόζης που ακολουθείται από τη συσκευασία της ρητίνης σε στήλες για πρότυπο χρωματογραφίας. Επισύναψη Fc πρωτεΐνες καθαρίστηκαν με φόρτωση σε μια πρωτεΐνη A-Sepharose στήλη (Amersham Biosciences). Μετά από πλύση με ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού (PBS) με την αρχική τιμή, πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 0.1 Μ οξικό οξύ ρΗ 3 και εξουδετερώθηκε αμέσως με 1.5 Μ Tris ρΗ 8.6. Μια στήλη δευτερεύουσα διήθησης γέλης τρέχθηκε ως τελικό στάδιο στίλβωσης. καθαρότητα πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με SDS-PAGE χρωματισμένο με Coomassie Blue και ήταν & gt?. 90% καθαρό

πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες

μικροσυστοιχίες Protein κατασκευάστηκαν με γυάλινες πλάκες επικαλυμμένες εποξυσιλανίου (Schott) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],24]. Χρησιμοποιήθηκαν δύο εκκρινόμενης βιβλιοθήκες πρωτεϊνών. Βιβλιοθήκη 1 περιελάμβανε 1334 καθαρισμένα δείγματα, που αντιπροσωπεύει 686 εκκρίνεται ή εξωκυτταρικούς τομείς του μονού διαμεμβρανικών πρωτεϊνών [25]. Το δεύτερο που εκκρίνεται βιβλιοθήκη πρωτεΐνη, Βιβλιοθήκη 2, αποτελούνταν από 624 δείγματα, που αντιπροσωπεύουν 562 γονίδια (92 γονίδια ήταν παρούσα σε δύο βιβλιοθήκες) (Πίνακας S2). Οι λεπτομέρειες των μεθόδων διαλογής έχει περιγραφεί προηγουμένως [24]. Εν συντομία, πολυσθενή μικροσφαιρίδια πρωτεΐνης-Α (Miltenyi Biotech) παρασκευάστηκαν από ένα 1:01 μείγμα DCC-Fc και Cy5-σημασμένο-hIgG και επωάστηκαν με τους ολισθητήρες μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σταθμό υβριδοποίησης aHyb (Miltenyi Biotech). Τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS-T (PBS + 0,1% Tween20), ξηραίνονται και στη συνέχεια σαρώνονται για Cy5 φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή GenePix 4000B (Molecular Devices). Διαφάνειες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GenePix Pro 6.0 λογισμικό (Molecular Devices). Αναφέρθηκαν εντάσεις σήματος κανονικοποιήθηκαν με το μέσο σήμα φθορισμού σε όλα τα δείγματα στη διαφάνεια.

πειράματα σύνδεσης

κύτταρα COS-7 (ATCC) διαμολύνθηκαν με cDNA που κωδικοποιούν DCC ή, ως έλεγχο, υποδοχέα Nogo (NgR) χρησιμοποιώντας PolyFect (Qiagen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (1% απενεργοποιημένο με θερμότητα φυσιολογικό ορό κατσίκας (Hings), 0.05% αζίδιο νατρίου, 2 μg /ml ηπαρίνης σε PBS) και επωάστηκαν με 20 ηΜ αλκαλικές Phasphatase (AP), CBLN4-ΑΡ, ή Nogo 66-ΑΡ από ρυθμισμένα μέσα για 90 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό σύνδεσης, σταθερό για 7 λεπτά σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε PBS, πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμισμένο με HEPES διάλυμα (HBS -20 mM HEPES, ρΗ 7,0, 150 mM NaCl), θερμικά απενεργοποιημένο για 30 λεπτά στους 65 ° C, και πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ ρυθμιστικό -100 mM Tris, ρΗ 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl

2). Το σήμα ΑΡ αναπτύχθηκε με νιτρο-μπλε χλωριούχο τετραζόλιο (ΝΒΤ) /5-βρωμο-4-χλωρο-3′-indolyphosphate π-τολουϊδίνη άλας (BCIP) διαλύματος (Roche) αραιωμένο 50 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα ΑΡ στο σκοτάδι επί τουλάχιστον 1 ώρα μέχρι κατέστη ορατό το εξαρτώμενο σχηματισμός AP μπλε ΝΒΤ /ΒΟΙΡ ίζημα.

συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων

συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα Biacore 3000 (GE Healthcare) σε 25 ° C χρησιμοποιώντας ένα τσιπ αισθητήρα CM5 σε 0,01 Μ HEPES, ρΗ 7.4, 0.15 Μ NaCl, 0.005% Surfactant Ρ20 (HBS-Ρ) τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα με ρυθμό ροής 30 μΐ /λεπτό. Πλήρους μήκους Ν-τερματικά ΗΑ-tagged CBLN1 και CBLN2 αγοράστηκαν από την R & amp? Συστήματα D. Η εξωκυτταρική περιοχή του Robo3 συντηγμένη με Fc (Robo3-Fc) και πλήρους μήκους CBLN3-Fc και CBLN4 C-τερματικό His παρήχθησαν με ανασυνδυασμό (Πίνακας S1) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπη χρωματογραφία συγγένειας όπως περιγράφεται ανωτέρω. τα μέλη της οικογένειας σερεμπελίνη (CBLN1, CBLN2, CBLN3, CBLN4) εγχύθηκαν διαδοχικά σε μια συγκέντρωση 10 μg /ml για 3 λεπτά πάνω αμίνη-συζευγμένο DCC-Fc ή Robo3-Fc επί του τσιπ αισθητήρα. Διάστασης αφέθηκε για 3 λεπτά σε HBS-Ρ.

Κυτταρομετρία Ροής

ΗΕΚ293Τ κύτταρα (ATCC) διαμολύνθηκαν παροδικά με Flag-tagged μεταλλάξεις ανθρώπινο τομέα DCC ή DCC χρησιμοποιώντας Fugene-6 (Promega) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Πειράματα πρόσδεσης κυτταρομετρίας ροής εκτελέστηκαν σε PBS που περιείχε 2% FBS στους 4 ° C. Έκφραση Flag-tagged DCC και το domain μεταλλάξεις στην επιφάνεια των κυττάρων ΗΕΚ293Τ επιβεβαιώθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση είτε με ένα αντίσωμα αντι-Flag Μ2 (Sigma) ή αντι-DCC αντίσωμα (Calbiochem) που ακολουθείται από επώαση με IgG αντι-κουνελιού ή IgG φυκοερυθρίνη αντι-ποντικού (ΡΕ) – ή αντι-ποντικού IgG αλλοφυκοκυανίνη (APC) -σημασμένου δευτερογενές αντίσωμα. δέσμευση με Flag-tagged DCC, μεταλλάξεις τομέα ή μη επιμολυσμένα κύτταρα πρωτεΐνη εκτιμήθηκε με επώαση των κυττάρων για 30 λεπτά με ανασυνδυασμένη CBLN4-Fc, UNC5C-Fc, gD-νετρίνη-1 ή gD-BTLA στα 10 μg /ml. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και δεσμευτική ανιχνεύθηκε είτε με αντι-ανθρώπινη IgG-ΡΕ- ή αντι-ανθρώπινη IgG-ΑΡΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα ή αντι-αϋ και αντι-ποντικού IgG-ΡΕ- ή αντι-ποντικού IgG-ΑΡΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντισώματος.

Πλάκα-based τηλέφωνα Binding και Domain χαρτογράφηση

μελετών χαρτογράφησης τομέα DCC πραγματοποιήθηκαν σε 384-καλά απεικόνισης και πλάκες δοκιμασίας (Aurora Βιοτεχνολογίες). Για COS-7 επιμολύνσεις, DNA για τον τομέα DCC μεταλλαγμένο κατασκευάσματα και αρνητικού ελέγχου διανεμήθηκαν σε φρεάτια σε 60 ng ανά φρεάτιο. Fugene αντιδραστήριο 6 (Promega) επιμόλυνσης παρασκευάστηκε σε αναλογία 3 μΐ Fugene σε 1 μg DNA σε Opti-ΜΕΜ (Invitrogen), επωάστηκαν για 5 λεπτά, και αναμιγνύεται με το DNA στην πλάκα 384 φρεατίων και επωάστηκαν για 15- 45 λεπτά για να επιτραπεί ο σχηματισμός συμπλόκου. κύτταρα COS-7 διανεμήθηκαν σε μια πυκνότητα 3000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε πλάκες 384-φρεατίων και επωάστηκαν για 48 ώρες. Τα επιμολυσμένα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές και αποκλείστηκαν με PBS που περιείχε 1% BSA για 1 ώρα πριν από την επώαση με CBLN4-Fc πρωτεΐνη ή αντι-Flag Μ2 αντίσωμα (Sigma) για 1 ώρα πάνω σε πάγο. Μετά την πλύση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και η δέσμευση στις πρωτεΐνες ανιχνεύθηκε με Alexa Fluor-488 σημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (Invitrogen) ή έκφραση ανιχνεύθηκε με Alex Fluor-647 σημασμένο αντι-ποντικού IgG (Invitrogen ) για 1 ώρα. Σήμα φθορισμού για ολόκληρη την πλάκα αποκτήθηκε και αναλύθηκε σε μια εικόνα Express Βέλος (Molecular Devices). Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης για την εικόνα Express Βέλος. Θετικά χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν όπως αυτές υπερβαίνουν το ανώτατο όριο έντασης φόντο φθορισμού και εντός των παραμέτρων του φίλτρου σωματιδίων για την περιοχή και η μέση ένταση του σήματος. Εικόνες για λόγους δημοσίευσης συλλέχθηκαν από το ίδιο πιάτο χρησιμοποιώντας ένα INCell Analyzer 2000 (GE Healthcare). Η οθόνη υποψήφιος αλληλεπίδραση εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας το ανωτέρω πρωτόκολλο χρώσης.

Radio-συνδέτη Κυττάρων Δοκιμασία Σύνδεσης

δοκιμασίες σύνδεσης ραδιο-συνδέτη εκτελέστηκαν με ανασυνδυασμένο CBLN4-Ρο και gD-νετρίνη-1 πρωτεΐνη με DCC εκφράζοντα κύτταρα ΗΕΚ293Τ σε 96-φρεατίων υ-πυθμένα πλάκες σε μέσο DMEM που περιείχε 2% FBS, 50 mM HEPES, ρΗ 7,2 και 0,1% αζίδιο του νατρίου. CBLN4-Fc και gD-νετρίνη-1 ιωδιώθηκαν με

125Ι-Na χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ιωδογόνο. Αντιδράσεις ανταγωνισμού τέθηκαν-up εις τριπλούν με μια σταθερή συγκέντρωση του ιωδιωμένου συνδέτη προαναμιγνύεται με 3-φορές σειριακές αραιώσεις μη επισημασμένου συνδετήρα που αρχίζει στα 500 nm που ακολουθείται από προσθήκη κυτταρικού εναιωρήματος DCC σε πυκνότητα 250.000 κύτταρα ανά 200 μΐ για να δώσει μία τελική αντίδραση όγκο 250 μΙ. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τον διαχωρισμό του ελεύθερου από το δεσμευμένο ιωδιωμένο πρόσδεμα χρησιμοποιώντας Millipore πλάκες φίλτρου πολλαπλών οθόνη (Billerica, ΜΑ). Τα φίλτρα ξηραίνονται με αέρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Wallac Οδηγό 1470 μετρητή γάμμα (PerkinElmer Life Sciences). Τα δεδομένα δέσμευσης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό NewLigand (Genentech), το οποίο χρησιμοποιεί την τοποθέτηση αλγόριθμο των Munson και Rodbard για να προσδιοριστεί η συγγένεια δέσμευσης [26]. Για τις μελέτες ανταγωνισμού, οι δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω εκτός του ότι η μη επισημασμένου συνδετήρα υποκαταστάθηκε με μη επισημασμένο ανταγωνιστή. Για τις μελέτες αποκλεισμού, κύτταρα ΗΕΚ293Τ ελέγχου ή κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν DCC προ-μπλοκαριστεί με μη σημασμένο gD-νετρίνη-1 (1 μΜ) ή CBLN4-Fc (2 μΜ) επί 1,5 ώρες σε πάγο. Στη συνέχεια,

125Ι CBLN4-Fc (300 ρΜ) ή

125Ι gD-νετρίνη-1 (52 ρΜ), αντίστοιχα, προστέθηκε και αφήνεται να προσδεθεί για 1 ώρα στους 4 ° C πριν από το πλύσιμο και καταμέτρηση.

Βητα-γαλακτοσιδάσης Χρώση

Ολόκληρο εμβρύου (Ε11.5) ή 200 micron τμήματα vibratome (Ε13.5), που σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA σε PBS πλύθηκαν τρεις φορές (20 λεπτά η κάθε μία) στο πλύσιμο ρυθμιστικού διαλύματος (2 mM MgCl

2, 5 mM EGTA, 0,02% Nonidet Ρ-40, και 0,01% δεοξυχολικό νάτριο σε PBS) και η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης χρώση αναπτύχθηκε σε ρυθμιστικό πλύσεως με 5 mM σιδηροκυανιούχο κάλιο, και 1 mg /ml X-gal σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) στους 37 ° C στο σκοτάδι.

ανοσοχρώση

TAG-1 ανοσοχρώση τομών του νωτιαίου μυελού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [27] χρησιμοποιώντας τον κλώνο 4D7 ( Αναπτυξιακή Μελέτες Hybridoma bank) στο 1:200 και Alexa Fluor 594-συζευγμένο αντι-ποντικού IgM (Invitrogen) σε 1:500. Εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα Zeiss Αχίορίαπ 2 μικροσκόπιο. Για επίπεδη mount ανοσοχρώση, εκσπλαχνισμένα έμβρυα Ε11.5 μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA σε PBS για 2 ώρες, πλένονται τρεις φορές με PBS, μπλοκάρει σε 2,5% Hings και 0,2% Triton Χ-100 σε PBS, και επωάζονται σε 1:2000 νευρονηματίου (NF-M) αντίσωμα (Covance) αραιωμένο σε διάλυμα αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα έμβρυα πλύθηκαν έξι φορές (1 ώρα το καθένα) σε διάλυμα αποκλεισμού στους 4 ° C και επωάστηκαν για μία νύχτα προστατευμένο από το φως στους 4 ° C σε 1:200 Alexa Fluor-594-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού (Invitrogen) αραιωμένο σε διάλυμα φραγμού. Τα έμβρυα στη συνέχεια πλύθηκαν έξι φορές (1 ώρα το καθένα) σε 0.2% Triton σε PBS στους 4 ° C και στη συνέχεια εκκαθαρίζονται σε μια σειρά από 30%, 50%, και 80% γλυκερόλη σε PBS πλύσεις για τουλάχιστον 6 ώρες κάθε μία. Το έμβρυο στη συνέχεια ισοπέδωσε ανάμεσα σε δύο γυάλινες καλυπτρίδες και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Ποντίκι Στελέχη

νετρίνη-1

[15] και

CBLN4

[28] ποντίκια knock-out διατηρήθηκαν σε CD-1 παρασκήνιο και ο γονότυπος όπως περιγράφεται.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση DCC δεσμευτική συνεργάτες

για την αναγνώριση δεσμευτική υποψήφιος εταίρους για DCC, μία εξωκυτταρική πρωτεΐνη microarray [24], [25] υποβλήθηκε σε διαλογή με ένα πολυσθενούς πρωτεΐνης-Α συγκρότημα μικροσφαιρίδιο που παράγεται από ένα 1:01 μείγμα επισημανθεί δια φθορισμού (Cy5) ανθρώπινο IgG και η εξωκυτταρική περιοχή του DCC (αμινοξέα 1- 1097) συντηγμένο με το τμήμα Fc της ανθρώπινης IgG. Από τα δείγματα 1334 πρωτεϊνών, που αντιπροσωπεύει 686 γονίδια, στη μικροσυστοιχία, μόνο κηλίδες που αντιστοιχούν σε CBLN4-Fc και CBLN4-His έδειξε ισχυρή σήματα φθορισμού (Σχήμα 1Α). Μία δεύτερη βιβλιοθήκη πρωτεΐνη που αποτελείται από 624 δείγματα πρωτεΐνης (Πίνακας S2), που αντιπροσωπεύει 562 γονίδια που ταυτοποιούνται gD-νετρίνη-1 και νετρίνη-1-His ως τα κορυφαία χτυπήματα, αν και με χαμηλότερο σήματος προς θόρυβο αναλογίες σε σχέση με CBLN4 (Σχήμα 1Β) . Νετρίνης-1 ήταν παρούσα μόνο στο δεύτερο αρχείο ανάγνωσης, ενώ CBLN4 ήταν παρούσα μόνο στο πρώτο βιβλιοθήκη. Σχετικές μέλη της οικογένειας, CBLN2 και CBLN3, εκπροσωπήθηκαν αλλά δεν έδειξε σύνδεση με DCC. Επιπλέον, τρεις παρτίδες Draxin (C1orf187) συμπεριλήφθηκαν κατά την πρώτη βιβλιοθήκη αλλά δεν ταυτοποιήθηκαν ως επιτυχίες. Σε μελέτες παρακολούθησης, δοκιμάσαμε DCC-Fc για δέσμευση σε αυτές τις τρεις δείγματα Draxin πρωτεΐνη μαζί με ένα εμπορικό δείγμα (R &? D Systems) με SPR. Δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουν άμεση πρόσδεση της ανασυνδυασμένης ECD του Draxin να DCC-Fc με οποιοδήποτε από αυτά τα δείγματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα οικόπεδα διασταύρωση δείχνουν δεδομένα από δύο πανομοιότυπα οθόνες (Array 1 και 2 Array) του DCC-Fc έναντι δύο εξωκυτταρικής βιβλιοθήκες πρωτεΐνη-microarray, που αντιπροσωπεύουν 686 γονίδια σε βιβλιοθήκη 1 (Α) και 562 γονιδίων σε Βιβλιοθήκη 2 (Β). Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει δείγμα πρωτεΐνης και το ωοειδές αντιπροσωπεύει την αποκοπή για επιλεγμένες επιτυχίες. CBLN4-Ρο, CBLN4-His, νετρίνη-1-His και gD-νετρίνη-1 πρωτεϊνών ήταν οι κορυφαίες επιτυχίες βαθμολόγησης σε κάθε βιβλιοθήκη.

Η

Για να επιβεβαιώσετε την αλληλεπίδραση DCC-CBLN4 στην επιφάνεια του κυττάρου, αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) δοκιμασία σύνδεσης διεξήχθη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CBLN4-ΑΡ δεσμεύεται σε COS-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με DCC, αλλά όχι σε κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με NgR που δεσμεύονται με Νοαο66-ΑΡ (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσε πρόσδεση του CBLN4-Fc σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν DCC σχέση με τον έλεγχο ΗΕΚ293Τ κύτταρα (Σχήματα 2Β, S1).

Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του CBLN4-ΑΡ πρωτεΐνη σύνδεση προς κύτταρα COS-7 διαμολυσμένα με DCC, αλλά όχι την έκφραση NgR κατασκευάσματα (άνω πάνελ). Nogo 66-ΑΡ πρωτεΐνη δεσμεύεται σε NGR, αλλά να μην DCC επιμολυσμένα κύτταρα (μεσαίο πάνελ). AP δεν αλληλεπιδρούν είτε με DCC ή NgR (κάτω πάνελ). Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής επιβεβαίωσαν την έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του παροδικά επιμολυσμένα Flag-tagged DCC επί HEK239T κυττάρων (πάνω πάνελ). Η CBLN4-Fc και gD-νετρίνη-1 πρωτεΐνες που δεσμεύονται με DCC κύτταρα που εκφράζουν, όπως αποδεικνύεται από τη μετατόπιση στην ένταση φθορισμού σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα (κάτω πάνελ).

Η

Για να προσδιορίσετε αν το DCC συνδέεται αποκλειστικά με CBLN4 , αξιολογήσαμε την ικανότητα του DCC να αλληλεπιδρούν με άλλα μέλη της οικογένειας CBLN με SPR. Οι sensograms για τα μέλη της οικογένειας CBLN εγχύθηκαν στο ακινητοποιημένο DCC ή αρνητικό μάρτυρα, Robo3, φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Μια απότομη αύξηση σε μονάδες απόκρισης (RU) ακολουθούμενη από μια αργή διάσπαση παρατηρήθηκε για CBLN4-His δέσμευση με DCC, αλλά όχι να Robo3. Αντίθετα, CBLN1, CBLN2 και CBLN3 δεν αλληλεπιδρούν είτε με DCC ή Robo3, αποδεικνύοντας επιλεκτική αλληλεπίδραση DCC με CBLN4. Οι σχετικές συγγένειες δέσμευσης CBLN4 και νετρίνη-1 προς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν DCC προσδιορίστηκαν από μία δοκιμασία σύνδεσης κυττάρου ράδιο-συνδεσμικού χρησιμοποιώντας

125Ι-επισημασμένο CLBN4-Fc και gD-νετρίνη-1. Η σταθερά διάστασης ισορροπίας,

K

D

, για CBLN4 υπολογίστηκε να είναι 117 ± 34 ηΜ σε σύγκριση με μια σταθερά διάστασης 22 ± 6 ηΜ για νετρίνη-1 (Σχήμα 3Β).

Α) Sensograms φαίνονται από SPR ανάλυση των ακινητοποιημένων DCC-Ρο (αριστερά? 15.082 μονάδες απόκρισης) και αρνητικό μάρτυρα Robo3-Ρο (δεξιά? 9.833 μονάδες απόκρισης) με CBLN1, CBLN2, CBLN3 και CBLN4 ένεση ως αναλυτών σε 10 μg /ml. Στιβαρή σύνδεση ανιχνεύθηκε σε CBLN4 (μαύρο ίχνος), ενώ κανένα σήμα δέσμευσης ανιχνεύθηκε για τα άλλα μέλη της οικογένειας σερεμπελίνη (γκρι ίχνη). Β) Μία δοκιμασία ραδιο-lignad χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγγένεια των CBLN4-Fc (αριστερά) και gD-νετρίνη-1 (δεξιά) για να DCC παροδικά επιμολυσμένα εντός κυττάρων ΗΕΚ293Τ.

125Ι-επισημασμένο συνδετήρα αφέθηκε να συνδεθεί επιμολυσμένα κύτταρα παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων μη επισημασμένου συνδετήρα. Υπολογίζεται

K

D Οι τιμές

αναφέρεται στις γραφικές παραστάσεις και είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Αναγνώριση CBLN4 Δεσμευτική Συνεργάτες

Για να προσδιορίσετε αν υπήρχαν άλλους υποδοχείς CBLN4 εκτός DCC, μία οθόνη πρωτεΐνη-microarray διεξήχθη με αντίστροφη όπου CBLN4-Fc χρησιμοποιήθηκε ως δόλωμα, ωστόσο, υπάρχουν σαφείς επιτυχίες βρέθηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Περιέργως, η ίδια DCC δεν αναγνωρίστηκε ως ένα χτύπημα. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες είναι σε μεγάλο βαθμό ενεργές επί του υποστρώματος μικροσυστοιχία [24], αν και υπάρχει η πιθανότητα ότι DCC είναι ευαίσθητο σε αυτό το είδος της ακινητοποίησης. Στη συνέχεια, δεκατέσσερα νευρωνικές πρωτεΐνες, γνωστές για το συντονισμό νευρώνα νευραξόνων μονοπάτι εύρεση παρόμοια με λειτουργία DCC, υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας δοκιμασία σύνδεσης κυττάρου. Η δέσμευση του CBLN4-Fc αξιολογήθηκε έναντι COS-7 κύτταρα επιμολυσμένα με κλώνους που αντιστοιχούν σε μη επισημασμένη υποψήφια γονίδια πλήρους μήκους. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει κατ ‘ανάγκη τον υποψήφιο αλληλεπίδραση δεδομένου ότι οι εκφράσεις πρωτεΐνης ήταν ανεπιβεβαίωτες. Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού για CBLN4-Fc χρώση σε αυτές επιμολυσμένων κλώνων προσδιορίζονται DCC και δύο άλλες πιθανές συνδέτες, νετρίνη-1 και NEO1 (Σχήμα 4Α). Το σήμα που παρατηρήθηκε για νετρίνη-1 σύνδεση, ωστόσο, παρέμεινε σταθερό ανεξάρτητα από τις αλλαγές στη συγκέντρωση CBLN4 και επίσης με δευτερεύον αντίσωμα ανίχνευσης μόνο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενδεικτικό ενός ψευδώς θετικά στην οθόνη. NEO1, έχει ενδιαφέρον, είναι μια paralogue DCC και επίσης λειτουργεί ως υποδοχέας ενός νετρίνη -1 [29]. Τόσο DCC και NEO1 έχουν παρόμοιες δομές τομέα και μοιράζονται 54% ταυτότητα πάνω από την περιοχή ECD. Για να αξιολογηθεί ποσοτικά τις δεσμευτικές δυνάμεις για να νετρίνη-1 και NEO1, DCC εκφράζουν COS-7 κύτταρα μεμονωμένα αξιολογήθηκαν με μία σειρά τιτλοδότησης φθίνουσας CBLN4-Fc. Η αλληλεπίδραση μεταξύ CBLN4 και NEO1 θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε συγκεντρώσεις CBLN4-Fc των 25 μg /ml (280 ηΜ) ή υψηλότερη. Σε αντίθεση, CBLN4-Fc πρόσδεση σε DCC εκφράζουν κύτταρα έδειξαν ισχυρή σήματα με συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0,78 μg /ml (8,7 ηΜ) (Σχήμα 4Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η σύνδεση της NEO1 να CBLN4 αντιπροσωπεύει μια πολύ χαμηλότερη αλληλεπίδρασης συγγένεια σε σύγκριση με DCC CBLN4 δεσμευτική. Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση CBLN4-NEO1, NEO1 παροδική κύτταρα που εκφράζουν ΗΕΚ293Τ αναλύθηκαν για πρόσδεση σε CBLN4-Fc πρωτεΐνη με κυτταρομετρία ροής και δοκιμασία σύνδεσης ραδιο-συνδετήρα χρησιμοποιώντας

125Ι-επισημασμένου CBLN4. Ωστόσο, CBLN4 δεν αλληλεπιδρά με NEO1 κύτταρα που εκφράζουν με οποιαδήποτε από αυτές τις προσεγγίσεις, πιθανόν λόγω της πολύ χαμηλής συγγένειας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) ποσοτικοποίηση της CBLN4-Fc πρόσδεση σε COS-7 κύτταρα επιμολυσμένα με οι αναφέρεται πρωτεΐνες καθοδήγηση άξονα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πλάκες επαναληπτικές καθένα περιέχει φρεάτια εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Β) Flag-DCC και Flag-NEO1 εκφράστηκαν παροδικά στην επιφάνεια των COS-7 κυττάρων όπως ανιχνεύεται με αντι-Flag χρώσης (άνω πλαίσιο). Το κατώτερο πάνελ δείχνει μια σειρά τιτλοδότηση του CBLN4-Fc πρόσδεση σε DCC ή NEO1. Τριπλά ανεξάρτητα πειράματα και μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

CBLN4 δεσμεύεται με την περιοχή FN4-6 του DCC

DCC είναι μια ενιαία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που περιέχει τέσσερις Ig επαναλήψεις και έξι ΡΝΙΙΙ επαναλήψεις στην ECD. Για να αξιολογηθεί ποια πεδία σε DCC είναι απαραίτητα για την πρόσδεση CBLN4, διαγραφή κατασκευάσματα του DCC παρήχθησαν και επιμολύνθηκαν σε COS-7 κύτταρα για ανάλυση δέσμευσης. Τέσσερις DCC κατασκευάσματα δοκιμάστηκαν, συνιστώντας είτε με ολόκληρο το ECD (DCC.FL), ο Ig1-4 επαναλήψεις (DCC.Ig), ο FN1-6 επαναλήψεις (DCC.FN1-6), ή μόνο το Ο-τερματικό FN4-6 επαναλήψεις (DCC.FN4-6). Η Ig1-4 επαναλήψεις (DCC.Ig) δεν έδειξε δέσμευση σε CBLN4-Fc, γεγονός που υποδηλώνει ότι πρωταρχικός πρόσδεσης εξαρτάται από τις επικράτειες FN (σχήματα 5Α-Β). Σύμφωνα με αυτή την ερμηνεία, η έκφραση μόνο του FN επαναλαμβάνει (DCC.FN1-6) ή μόνο τα τελευταία τρία FN τομείς (DCC.FN4-6) διατήρησε ισχυρή δέσμευση CBLN4-Fc. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι DCC-FN4-6 είναι επαρκής για να μεσολαβήσει δέσμευση με CBLN4.

Α) μια σχηματική αναπαράσταση του DCC δείχνεται με τις περιοχές Ig σε μαύρο και τομείς FN σε πράσινο. Αντιπροσωπευτικά φθορίζουσες εικόνες παρουσιάζεται για δέσμευση CBLN4-Fc να COS-7 κύτταρα που εκφράζουν πλήρους μήκους DCC, DCC Ig1-4, DCC FN1-6, DCC FN4-6, και αρνητικός ΑΡΡ ελέγχου. Ανίχνευση της πρόσδεσης CBLN4-Fc ήταν μέσω αντι-ανθρώπινο Alexa Fluor-488 (πράσινο). Ανίχνευση της έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια όλων των μεταλλαγμάτων διαγραφής DCC flag-tagged επιβεβαιώθηκε με Alex Fluor-647 σημασμένο αντι-ποντικού IgG (κόκκινο). Β) ποσοτικός προσδιορισμός των CBLN4-Fc δέσμευση στα DCC κατασκευάσματα διαγραφής τομέα. Τριπλά ανεξάρτητα πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

νετρίνη-1 ανταγωνίζεται με CBLN4 Binding

Προηγουμένως δημοσιευμένες εκθέσεις εμπλέκουν την περιοχή FN4-6 DCC σε νετρίνης-1 σύνδεση [11], [12]. Η παρατήρησή μας ότι CBLN4 πρόσδεση χαρτογραφηθεί στην ίδια περιοχή επί DCC μας οδήγησε να εξετάσει αν νετρίνη-1 και CBLN4 ανταγωνίζονται για δέσμευση DCC ή εάν οι τρεις πρωτεΐνες θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα τριαδικό σύμπλοκο. Χρησιμοποιώντας μελέτες συν-ανοσοκαταβύθισης, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι CBLN4 σύνδεση με DCC μπορεί να ανταγωνίζεται από την νετρίνη-1 [22]. Για να επαληθεύσετε αυτά τα αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε ένα ευαίσθητο ραδιο-συνδέτη προσέγγιση που βασίζεται. Τα στοιχεία δείχνουν ότι το

125Ι-επισημασμένο CBLN4-Fc (300 μΜ) δεσμεύεται ειδικά με DCC κύτταρα που εκφράζουν ΗΕΚ293Τ και ότι η σύνδεση έχει αποκλειστεί από προ-επώαση των κυττάρων με νετρίνη-1 (1 μΜ) σε σύγκριση με μη θεραπεία ελέγχου ( Σχήμα 6Α). Ατελής μπλοκάρισμα

125Ι-επισημασμένο νετρίνη-1 (52 ρΜ) με CBLN4-Fc (2 μΜ) παρατηρήθηκε κατά την αντίστροφη πείραμα και πιθανότατα μπορεί να αποδοθεί στην ~ 5-πλάσια διαφορά στη συγγένεια του CBLN4 και Netrin- 1 για DCC. Μια τιτλοδότηση με αυξανόμενες συγκεντρώσεις νετρίνης-1 έδειξε σαφή μετατόπιση μιας σταθερής συγκέντρωση

125Ι CBLN4-Fc να DCC κύτταρα που εκφράζουν ΗΕΚ293Τ (Σχήμα 6Β). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι θέσεις δέσμευσης CBLN4 και νετρίνη-1 χάρτη για την ίδια περιοχή FN στο DCC και στερικά επικάλυψη.

Α) ποσοτικοποίηση της ποσότητας του

125Ι-ραδιοσημασμένο CBLN4-Ρο ή gD-Netrin- 1 συνδέεται προς κύτταρα που εκφράζουν DCC ΗΕΚ293Τ, ή μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, προεπωάζονται με μη επισημασμένη gD-νετρίνη-1 ή CBLN4-Fc, αντίστοιχα. Τα δεδομένα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει 3 τεχνικής επαναλήψεις εκφράζονται ως μέσοι ± SD.

t

τεστ μονόπλευρο Μαθητή εφαρμόστηκαν: *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001. Β) οικόπεδο μετατόπιση, εκπρόσωπος τριπλούν ανεξάρτητα πειράματα, παρουσιάζεται για αϋ-νετρίνη-1 που ανταγωνίζονται με δέσμευση του

125Ι-ραδιοσημασμένο CBLN4-Fc στο DCC κύτταρα που εκφράζουν ΗΕΚ293Τ.

Η

Χαρακτηρισμός CBLN4 Λειτουργία κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη

έχει προηγουμένως δειχθεί ότι DCC και νετρίνη-1 είναι αναγκαία για τη σωστή καθοδήγηση και ανάπτυξη των νευραξόνων κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης [7], [15]. Προκειμένου να εξεταστεί η συμβολή CBLN4 μπορεί να έχει στο DCC-νετρίνη-1 σηματοδότηση, μελετήθηκαν οι νευρωνικές προβλέψεις του

CBLN4

knock-out ποντίκια. Γενιά του

CBLN4

knock-out ποντίκι περιλαμβάνεται ένα χτύπημα σε μια κασέτα έκφρασης LacZ που επιτρέπει χρώση β-γαλακτοζιδάσης του

CBLN4

+/-

ποντίκια για να απεικονίσει τον εντοπισμό των CBLN4 έκφραση. Το πρότυπο έκφρασης β-γαλακτοσιδάσης σε ποσοστό

CBLN4

+/-

ποντικούς είναι διακριτές, συμπεριλαμβανομένων έκφραση στα μπουμπούκια ραχιαίο άκρο στο Ε11.5 και τη στήλη μοτέρ του νωτιαίου μυελού στο Ε13.5 (Σχήμα 7Α ). Ένας από τους σημαντικούς ρόλους για DCC και νετρίνη-1 είναι η εξασφάλιση της ορθής διάβαση άξονα συμμετρίας του commissural νευραξόνων στον αναπτυσσόμενο νωτιαίο μυελό. Για να εξεταστεί εάν CBLN4 παίζει ένα ρόλο στην καθοδήγηση της μέσης γραμμής, προ-διέλευση commissural νευράξονες έγιναν ορατές με TAG-1 ανοσοχρώση σε εγκάρσιες τομές του Ε11.5 ποντικών (Σχήμα 7Β

)

. Ενώ οι commissural άξονες μπορεί να δει την επίτευξη και διασχίζοντας την πλάκα δαπέδου σε ποντίκια άγριου τύπου, πολύ λίγοι, αν υπάρχουν, commissural άξονες φθάσει και να διασχίσει την πλάκα δαπέδου στο

νετρίνη-1

– /-

ποντίκια. TAG-1 ανοσοχρώση της commissural άξονες του

CBLN4

– /-

ποντίκια δείχνουν ότι θα φθάσουν και να περάσουν τα άξονες παρόμοια με άγριου τύπου και δεν υπάρχει αισθητή διαφορά στην ανοσοχρώση μεταξύ

νετρίνη-1

– /-

?

CBLN4

+ /+

και

νετρίνη-1

– /-

?

CBLN4

– /-

ποντίκια ή

νετρίνη-1

+/-

?

CBLN4

+ /+

και

νετρίνη-1

+/-

?

CBLN4

– /-.

Ποντίκια

Α) Lac-Z έκφρασης ρεπόρτερ της CBLN4 στην Ε11.5

CBLN4

+/-

ποντίκια (κορυφή πάνελ) δείχνει χαρακτηριστική έκφραση στα άκρα, συμπεριλαμβανομένων έκφραση ραχιαίο άκρο. Lac-Z χρώση ρεπόρτερ της CBLN4 στην Ε13.5

CBLN4

+/-

ποντίκια (κάτω πάνελ) δείχνει έκφραση στη στήλη του νωτιαίου μυελού κινητήρα. Β) commissural άξονες της Ε11.5 νωτιαίου μυελού οπτικοποιούνται με TAG-1 ανοσοχρώση σε συνδυασμούς του

CBLN4

και

νετρίνη-1

γονότυπους. Γ) Εκπρόσωπος εικόνες και ποσοτικοποίηση της περιπλάνησης άξονες (λευκά βέλη) στο βραχιόνιο πλέγμα των Ε11.5

CBLN4

– /-

ποντίκια. Tukey έρχεται σε αντίθεση? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001? n είναι αριστερά και δεξιά forelimb ένθετα σε ποντίκι? n = 4

CBLN4

+ /+

? n = 5

CBLN4

+/-

? n = 6

CBLN4

– /- καλής

Η έκφραση της CBLN4 στις αναπτυσσόμενες μπουμπούκια άκρων μας οδήγησε να αξιολογήσει την πορεία των αξόνων του κινητικού νευρώνα σε αυτό το στάδιο.. Αυτές οι νευράξονες εκφράζουν DCC [7] και την πλοήγηση από τη στήλη μοτέρ του νωτιαίου μυελού στον τελικό τους στόχους που νευρώνουν τους μυς στο σκέλος [30] και είναι γνωστό ότι μπορεί να ανταποκρίνεται στις νετρίνη-1 [31], [32].